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Diagnostik infektiöser Durchfallerkrankungen bei
Saug- und Absetzferkeln in der Steiermark
Gemeinschaftsprojekt des TGD Steiermark und der AGES (IVET Graz, IVET Mödling, IMED Wien)
TGD Themenabend Retzhof, 19.6.2013
Projektziele
• Hilfestellung für TGD-Betriebe und TGD-TÄ bei der Diagnostik und der Bekämpfung von infektiösen Durchfällen bei Saug- und Absetzferkeln bis zu einem Alter von 9 Wochen.
• Durch Pathohistologie kombiniert mit dem Erregernachweis soll sich ein klareres Bild der Ursache der Durchfälle ergeben.
• Mittels Elektronenmikroskopie können viele für Durchfallerkrankungen entscheidende virale Enteritiserreger detektiert werden (Rota-, Corona-, Circo-, Calici-, Adeno-, Entero-, Parvo-, Toroviren).
• Untersuchung der verschiedenen Darmabschnitte erkrankter Ferkel verglichen mit Untersuchung des Enddarmkotes soll über den Grad der Effizienz der Virusdiagnostik bei lebenden Ferkel anhand von ausgeschiedenem Kot Auskunft geben.
• Auf Basis eines detaillierten Vorberichtes soll auch die Rolle von E. coli, Clostridium perfringens Typ A und C, Clostridium difficile, Rotaviren und Isospora suis abgeklärt werden.
• Festlegung eines definiertes diagnostisches Vorgehens (Diagnostikprotokoll) bei Durchfallerkrankungen auf Basis der Ergebnisse dieser Studie, damit in Zukunft diese betrieblichen Probleme von den Betreuungstierärzten gezielt behandelt werden können
• Die isolierten Bakterienstämme werden einer Resistenztestung unterzogen, um Hinweise für die Behandlung und über die Resistenzlage zu erhalten.
Probenaufkommen • Probenziehung aus 20 ausgewählten TGD-Betrieben • Auswahl erfolgt durch TGD-Tierärzte • Probennahme (Tupfer- und Kotproben, Auswahl lebender
Ferkel) durch TGD-TA • Lebende Ferkel werden am IVET Graz euthanasiert und
anschließend die Proben entnommen. • Es werden nur so viele Proben entnommen bzw.
Untersuchungen durchgeführt als für einen aussagekräftigen Befund nötig sind.
• Die Tiere dürfen nicht vorbehandelt sein. • Es werden nur lebende Ferkel oder Läuferschweine für
die Untersuchung herangezogen. • 3 Ferkel/Betrieb mit Symptomen unterschiedlicher
Ausprägung • 6 Kottupfer/Kotproben von erkrankten Tieren für bakt. u.
parasit. Untersuchung
Probenarten
Proben euthanasierter Tiere
Formalinfixierung (10% gepuffert) bzw. nativ:
• 2 x 3 cm Colon
• 6 x 3 cm Dünndarm
• Lunge bei Bedarf
• Gehirn bei Bedarf Nativ für EM
• 1 x 3 Magen mit Inhalt
• 2 x 3 cm Dünndarm (Jejunum) mit Inhalt
• 2 x 3 cm Dickdarm mit Inhalt
• 1 x 3 cm Enddarm mit Inhalt Bakteriologische Untersuchung
• 2/3 vom Colon
• 2 x 20 cm Jejunum
• 1 x 20 cm Ileum
• Gehirn bei Bedarf
• Lunge bei Bedarf
Pathohistologische Untersuchung
Bakteriologische Untersuchung
Histologie, Bakteriologie, IHC
Histologie, Bakteriologie, PCR
Elektronenmikroskopische Untersuchung
Rektaltupfer oder Kotproben weiterer erkrankter Tiere: Bakteriologische Untersuchung
Probenbearbeitung Magen: 2x2 cm Histo 1: DUDA
3x3 cm ELMI/TP1 nativ
3x3 cm ELMI/TP1 Karnovsky
Duodenum: 1x3 cm Histo 1: DUDA
Jejunum: 2x3 cm; Anfang 2. und 3.Drittel Histo 1: DUDA
1x3 cm; 3. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP2 nativ
1x3 cm; 3. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP2 Karnovsky
Ileum: 1x3 cm ELMI/TP3 nativ
1x3 cm ELMI/TP3 Karnovsky
Ileum-Zäkum (Übergang): 4 cm; Histo 2: DIDA
Zäkum halb aufschneiden
Colon: 2x4 cm; 2. und 3. Drittel Histo 2: DIDA
1x3 cm; 2. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP4 nativ
1x3 cm; 2. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP4 Karnovsky
1x3 cm; 3. Drittel vor Histoprobe ELMI/TP5 nativ
1x3 cm; 3. Drittel nach Histoprobe ELMI/TP5 Karnovsky
5 cm PCR/einfrieren
Rectum: 1x3 cm; nahe Anus ELMI/TP6 nativ
1x3 cm; angrenzend ELMI/TP6 Karnovsky
Daten
• 19 Betriebe, je Betrieb 1-3 Tiere, bis zu 6 Tupfer • 23.4.2012 bis 6.3.2013 • Vorbericht BTA, BT-Protokoll, Sauenplaner • Pathohistologische Untersuchung • ELMI • Kultur auf E.coli, Clostridium perfringens und Cl
difficile • Typisierung von Cl perfringens, Cl difficile • Gramfärbung auf Brachyspira • Flotation für Parasitennachweis
Methodik, Vorgangsweise
Bakteriologie: • Kultur aerob (E.coli) und anaerob (Clostridium perfringens) • Dünndarm • Dickdarm • Selektivagar
• Kultur inklusive Anreicherung (Clostridium difficile) • Dickdarm • Selektivagar • Gram - Färbung (Brachyspira sp)
• Typisierung (Clostridium difficile, perfringens) • Ribotypisierung • Bestimmung des Toxintypes
Methodik, Vorgangsweise
Histologie: • Schnitte durch alle GI-Lokalisationen • Magen • Dünndarm (kraniale, mittlere und kaudale Abschitte) • Ileozäkaler Übergang • Dickdarm
• HE-Färbung • selektive PAS- und Versilberungsfärbungen, Polarisation
• Beurteilung • Magen • Dünndarm • Dickdarm
Methodik, Vorgangsweise
Elekronenmikroskopie: • Negative Staining
Virusdiagnostik mittels Elektronenmikroskopie - Sensitivität ELISA Elektronenmikroskopie (EM)
Negative Staining
PCR
Konz.: 5-10ng/ml
bis zu Verdünnung:
< 1: 1 000
Virusart !
Dauer 1d
Konz.: 5-10ng/ml
bis zu Verdünnung:
< 1:100 000 (UZ)
Virusfam. /Virusart mittels
Seren
Dauer ½-1d
Konz.: 5-10ng/ml
bis zu Verdünnung:
< 1: 500 000
Virusart !
Dauer: 1d
1:1000 1:500 000
EM
Vorteile:
• „Offener Blick („Open View)“ • Mehrfachinfektionen in einem Test (Schweinediarrhoe: 8 verschied. Viren möglich)
Nachteile: geschultes Personal, Gerätekosten
Kosten: 30€ /Probe
Ausg
angsm
ate
rial
Grundlagen der Diagnostik
Einfachinfektionen
Mehrfachinfektionen
„Symptom bestimmte“ Testsysteme = Tsy. basierend auf ein ziel-gerichtetes Agens (PCR, ELISA)
Ja/Nein Ergebnis „Offene Sicht“ Testsysteme = Tsy. ohne Agens (Pathohistologie, bak-
terielle Kultur, Elektronenmikroskopie, ... Qualitatives Ja/Nein Ergebnis / Betriebsstruktur
Wahl des
Testsystem
Resultat
Primärinfektion Sekundärinfektion Erreger
„Blindstudie“
4 Cluster (A,B,C,D) inkl. Graduierung (1=ggr. 2=mgr. 3=hgr.)
• A = lymphoplasmozytäre Infiltration der Propria, Ödemisierung in der Submukosa/Subserosa Läsionen ohne besondere Spezifität (Viren, Bakterien, sekretorische Diarrhoe durch (bakterielle) Toxine...)
• B = neutrophile Granulozyten und Detritus im Bereich der lymphoglandulären Komplexe, neutrophile Infitrate in der Propria Läsionen durch Bakterien bzw. –toxine
• C = Zottenverkürzungen und –fusionen virale Läsionen
• D = Nekrosen im Bereich der Zotten(spitzen), Ulzerationen bakterielle Läsionen
Mischformen auch möglich, z.B. A1B2
Beurteilungsschema Histologie
Ergebnisse
A
B
C
D
C
A
B
D
Unspezifisch Bakterien Viren Nekrosen - Bakt
• Saugferkel 0-4 Wo.
• Aufzuchtferkel I 4-8 Wo.
• Aufzuchtferkel II 8-12 Wo.
Altersschema
Ergebnisse
C D
B
C
A
B
C
A
B
D
Saugferkel Aufzucht I
Aufzucht II
Saugferkel 0-4 W Aufzucht I 4-8 W Aufzucht II 8-12 W
• Viren Corona (19) Rota (18) Circo (11) Calici-like (5)
• Bakterien Clostridium perfr. A (40) Cl. difficile (9) haem. E.coli (26)
Brachyspira sp. (17) E.coli (44) sonstige (11)
• Parasiten Kokzidien (5) Trichuris suis (1)
Erregerspektrum
Auswertung Projekt Ferkeldiarrhoe
Virusbefall n %
Coronav. geringer Befall 12 20 33,3%
Coronav. mittlerer Befall 8
Rotav. geringer Bef. 7
18 30,0% Rotav. mittlerer Bef. 5
Rotav. starker Bef. 6
Circov. geringer Bef. 10
17 28,3% Circov. mittlerer Bef. 6
Circov. starker Bef. 1
Caliciv. geringer Bef. 2
5 8,4% Caliciv. mittlerer Bef. 1
Caliciv. starker Bef. 2
55 Tiere von 19 Betrieben
pro Tier 6 Proben:
a) Magen,
b) vorderer Dünndarm,
c) hinterer Dünndarm,
d) vorderer Dickdarm,
e) hinterer Dickdarm,
f) Rectum
Virusbefall/Betriebe n %
Negative 13 23,6%
Positive 42 76,4%
Einfachinfektion 26 47,3%
Mehrfachinfektionen 16 29,1% 2-fach 14 25,5%
3-fach 2 3,6%
Rotavirus: Serogruppe A-, B-, C-, E-type nur A-type genau beschrieben z.B. Typ C: Epidemien in Saugferkel, bei frisch entwöhnte Ferkel und ältere Schweine; Anstieg von Typ E zu erwarten ? wie TGE aber schwächerer Verlauf, Kot wässrig-pastös, geringe Mortalität
Coronavirus: PRCV, HEV, TGEV, PEDV PRCV: als Primärerreger wenig bedeutsam; PRCV/TGEV HEV: 4-14 Tage, Auftreiben der Magengegend, Erbrechen + Kümmern,
ne. Encephalitis, Diarrhoe +/-
TGEV: jede Altersgruppe, bes. Saugferkel bis 10 Tage graugelber übelriechender Kot, hohe Mortlität, Düdarm-Zottenatrophie
PEDV: hochansteckend, jede Altersgr., bes. Mast betroffen, 20-30% (80%) Mortal. wässrig, grünlich-gelber Durchfall, Erbrechen, Düdarm-Zottenatrophie,
Caliciförmige Viren: Sapovirus-Gruppe, Norovirus-Gruppe Norovorus-Gruppe: erwachsenen Schweine ohne klinische Symptome Sapovirus-Gruppe: jede Altersgruppe (21% Saugferkel, 85% frisch entwöhnte Ferkel;
18% 0-9Wo, ), Diarrhoe, z.B. Coinfektion mit Rotav. Hepeviren (Hepatitis E-Viren): Schweine im Alter 1-3 Monate: 8-16% Befall (Reisp-IVET
MOE Projekt)
Circovirus: PCV1 (4-8%), Rest PCV2 bis zu 95% Durchseuchung in D (Tischler et al. 1987): keine klin. Symptome; placentale Transmission, Nasenkontakt, fecal-orale Route PCV2 in Zusammenhang mit PMWS (Postweaning multisystemic wasting syndrome): Diarrhoe
Ø 50-80nm
Ø 80-120nm
Ø 30-40nm
Ø 20-30nm
Auswertung Projekt Ferkeldiarrhoe
2. vor. Dünndarm
1. Magen
3. hint. Dünndarm 5. hint.
Dickdarm
4. vor. Dickdarm
6. Rectum/Kot
Coronav. 1x
Coronav.+ Rotav.+ Circov.+
Coronav.++ Rotav.+++ Circov.+
Coronav.+(+) Rotav.+++ Circov.+ Coronav.+
Rotav.++ Circov.+
1. 2. 3.
Probenahme
totes Tier lebendes Tier
Kot
Bakteriologie
• Clostridium perfringens Typ A (CptA): Durchfall cremig, pastös, oder gelb und schaumig. Morbidität ist hoch, Mortalität niedrig.
• Cl. Difficile (Cd) ist von Infektionen mit CptA und E.coli nicht immer unterscheidbar. RT: AI-12, 005, 078, 241, 598
• E. coli: Durchfall klar-wässrig, weiß-gelb, ev. Erbrechen, ev hohe Mortalität bei schlechten Bedingungen
Clostridium difficile beim Menschen
• Im Darm von Mensch, Tier. In Umwelt
• Nosokomialer Erreger: im Krankenhaus erworben
• Hypervirulenter Stamm: RT 027
• Schaden in EU-KH: 3 Mia €
• Durchfall nach Antibiotikagabe
• AAD: antibiotika-assoziierter Durchfall
• AAC: antibiotika-assoziierte Colitis,
• Toxin-A, Toxin-B.
• In Ö seit 2002 3x
Referenzzentrale 2012
• Anzahl der typisierten Isolate
Übersicht
Be/A Klinik E.Coli Clost Coc Brach Rota Coro Circ Cali Histo
1 / 1 w N A - - - + + - A1, D2
2 / 1 ö H , N A,diff - - - + - + A1, A0
3 / 34 w s H, N - - + + - + + B1,B2,C2
4 / 5 w s H, N A - + + + - - A2,CD2,AD1
5 / 50 w s b N A - + + + - - CB2,CB3,A1
6 / 50 w H, N - - + + + + - CB3,C3,
7 / 21 N A + - - - + + CB1,CB2,D2
8 / 7 w H, N A - - - - - - A2, A1
9 / 25 s p H, N A - - + + - - A2,CB2,C3
10/ 3 w s N A - - + + A1,D2,D3
11/ 2 w H, N A,diff - - - - + + A2,AD2,
Übersicht
Be/A Klinik E.Coli Clost Cocc Brach Rota Coro Circ Cali Histo
12/ 1 w N A,diff - - - - + - A2,AC1,CD2
13 80 w s N A +, Tr + - + + - A3,CB1,CB2
14 20 w c N A + + + - + - CB2,A2
15 18 w s N A - - - + - - AC2,CB1,2
16 /3 N A,diff - - - - - - A1
17 40 ö H - - + - + - - CB2,B2
18 11 w H, N A,diff - - - - + - B2,B3
19 /3 w s N A - + - - A1
Cl difficille 1 Düda 1 Dida 2 Düda 2 Dida 3 Düda 3 Dida 4 Tupfer 5 Tupfer 6 Tupfer 7 Tupfer 8 Tupfer 9 Tupfer
Betrieb 2 neg neg neg pos
Ribotyp AI-12
Betrieb 11 neg neg pos neg pos neg pos neg neg neg neg neg
Ribotyp RT005 AI-12 RT005
Betrieb 12 pos pos neg neg pos neg neg neg neg pos pos neg
Ribotyp R078 AI-12 R078 R078 R078
Betrieb 16 neg neg neg pos neg pos neg pos neg pos neg pos
Ribotyp AI-12 598 241 AI-12 AI-12
Betrieb 18 neg pos neg pos neg pos pos pos pos pos
Ribotyp 598 598 598 598 598 598 598
Düda: Dünndarm, Dida: Dickdarm
Detailergebnisse Clostridium difficile
Detailergebnisse Brachyspira spp. Betrieb Ferkel 1 Ferkel 2 Ferkel 3
3 pos. pos. pos.
4 pos. pos.
5 B.i.i. B. i.i. pos.
6 pos. pos. pos.
13 B.i.i. pos. pos.
14 pos. pos.
17 pos. pos. pos.
Pos: Mikroskopie spricht für Brachyspira spp. PCR neg. B.i.i.: PCR pos auf Br. Intermedia/Innocens
Antibiogramme E.coli nicht hämolysierend 2009 2010 2011 2012 Projekt
N=13 N=8 N=12 N=14 N=15
Antibiotika I R S I R S I R S I R S I R S
Amoxicillin 3 8 2 1 6 1 3 9 5 8 1 11 4
Ampicillin 2 9 2 2 6 4 8 5 8 1 9 4 2
Apramycin 13 5 1 1 10 4 9 2 11
Cefquinom 2 11 1 7 2 10 4 10 15
Ceftiofur 1 3 9 2 2 4 1 2 9 2 4 8 1 14
Colistin 3 6 4 3 3 3 4 5 3 1 9 3 1 10
Doxycyclin 11 2 1 7 12 4 9 5 9 1
Enrofloxacin 1 1 11 1 7 6 6 3 3 8 1 14
Lincom/Spectinom 5 8 2 2 4 3 7 2 2 8 3 4 7 4
Marbofloxacin 1 12 8 6 6 3 11 15
Neomycin 2 7 4 4 3 1 1 6 5 1 12 2 13
Tetracyclin 1 10 2 7 12 4 9 1 3 9 3
Tiamulin 13 7 11 1 1 11 1 1 12 1
Trimethoprim 7 6 5 2 7 5 5 9 2 13
Tulathromycin 13 1 6 4 6 2 1 11 1 2 13
Antibiogramme E.coli hämolysierend 2009 2010 2011 2012 Projekt
N=19 N=20 N=10 N=17 N=22
Antibiotika I R S I R S I R S I R S I R S
Amoxicillin 2 12 5 6 12 2 4 4 2 5 9 3 14 7 1
Ampicillin 5 12 2 6 14 4 4 2 6 10 1 12 9 1
Apramycin 2 17 20 2 8 2 14 3 19
Cefquinom 1 18 1 19 10 2 15 22
Ceftiofur 2 2 15 1 19 10 1 2 14 1 21
Colistin 6 4 9 9 4 6 1 3 6 1 3 12 7 5 10
Doxycyclin 1 12 6 6 13 1 3 5 2 5 11 1 8 12 2
Enrofloxacin 2 2 14 1 19 1 9 3 2 12 2 1 19
Lincom/Spectinom 4 6 9 3 5 12 1 9 5 4 8 5 17
Marbofloxacin 1 18 20 10 1 16 1 21
Neomycin 3 9 7 6 9 5 2 1 7 2 14 1 5 14 3
Tetracyclin 1 13 5 1 17 2 6 4 2 12 3 3 12 7
Tiamulin 1 18 3 13 4 2 5 3 1 16 22
Trimethoprim 8 11 6 14 3 7 4 13 2 6 14
Tulathromycin 2 17 1 1 18 2 3 5 2 15 2 19 1
Zentrum für lebensmittelassoziierte Infektionskrankheiten,
Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Graz,
Beethovenstrasse 6
• Abteilung Veterinärmikrobiologie
• Puchstrasse 11, 8020 Graz
• Telefon 050555 62110, Fax 05055562119