dna 限制性内切酶消化
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DNA 限制性内切酶消化. 实验原理. 限制性内切酶: 识别回文序列,产生粘性或平性末端,具有相同粘性或平性末端的不同 DNA 片段可连接起来形成重组 DNA 分子,故 DNA 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 影响酶活性的因素有很多,温度、 pH 值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性. 实验原理. 每种酶有其最适的缓冲体系(低盐、中盐、高盐等) 单酶切反应 双酶切反应. 酶反应体系:. 底物 DNA 限制性内切酶: 1-5U/ μgDNA pH TRis-HCl 缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度 :37 ℃ - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
DNA 限制性内切酶消化
实验原理•限制性内切酶:识别回文序列,产生
粘性或平性末端,具有相同粘性或平性末端的不同 DNA 片段可连接起来形成重组 DNA 分子,故 DNA 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。
•影响酶活性的因素有很多,温度、 pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性
实验原理•每种酶有其最适的缓冲体系(低盐、
中盐、高盐等)•单酶切反应•双酶切反应
酶反应体系:• 底物 DNA 限制性内切酶: 1-5U/μgDNA pH TRis-HCl 缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度 :37℃ 时间: 1-2h
实验步骤pBR322 2 μlPstⅠ 2 μlEcoRⅠ 2 μl10×Buffer 2 μlddH2O 12 μl
总体积 20 μl
封口膜封口 ,
瞬时离心
37℃ 水浴, 2h
65℃ 加热灭活终止反应
冰水浴
DNA 琼脂糖凝胶电泳•原理: 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛
效应分离不同分子量大小的 DNA ,相同分子量的 DNA 分子若构型不同电泳速度亦不同。
•琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的典型方法,特点是制备简单、快捷,灵敏
•溴化乙锭为DNA荧光染料,可插入DNA 双螺旋结构的两个碱基之间,与与核酸结合成荧光复合物,在紫外线 254 ~ 365nm 照射下呈桔红色荧光。电泳时所需 DNA 样品量仅 0.5 ~ 1μg.
线性 DNA 片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系
琼脂糖凝胶的百分浓度 分离线性 DNA 片段分离的有效范围 (kb)
0.3 60 ~ 50.6 20 ~ 10.7 10 ~ 0.80.9 7 ~ 0.51.2 6 ~ 0.41.5 4 ~ 0.22.0 3 ~ 0.1
实验步骤
⒈ 琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度 0.5μg/mL⒉ 凝胶板的制备⒊上样⒋电泳 电压 10v/cm,溴酚蓝移出 2/3 的距离
时,取出凝胶紫外灯下观察结果
实验结果