Antioksidan Kapasite Tayinlerinin Kimyası

Yrd. Doç. Dr. Kubilay GÜÇLÜ

DPPH SERBEST KÖK BAĞLAMA YÖNTEMİ

Hazırlayan: Sercan TÜRKOĞLU

ANTİOKSİDAN• Canlılarda, kimyasal süreçler, özellikle oksitlenme, serbest radikallerin

oluşmasına neden olur. Yüksek derecede reaktif olan serbest radikaller farklı moleküller ile kolayca reaksiyona girebilir ve böylece hücrelere, canlıya zarar verebilir.

• Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek hücrelere zarar vermelerini önler. Bu özellikleriyle hücrelerin anormalleşme ve sonuç olarak tümör oluşturma risklerini azalttıkları gibi, hücre yıkımını da azalttıkları için, daha sağlıklı bir hayat yaşama şansını yükseltir.

• İnflamasyonlar, aldığımız besin maddeleri, normal metabolizma, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek oksijen basıncı (pO2), ozon (O3), azot dioksit (NO2), kimyasal maddeler, sigara ve ilaçlar gibi birçok uyarıların etkisiyle, oksidan adı verilen moleküller ortaya çıkar.

• Oksidanlar hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine zarar vererek kanser, kalp hastalıkları, barsak hastalıkları, depresyon, damarlarda yapı bozuklukları ve erken yaşlanma gibi onlarca önemli soruna yol açarlar.

• Birçok hastalığın temelinde veya kötüleşmesinde, ortaya çıkmasında asıl neden bu oksidanlardaki artışın, vücuttaki antioksidan kapasitenin gücünü aşmasıdır.

Antioksidan Türleri

• Antioksidan özelliği keşfedilen birçok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını diyetimizde (özellikle bitkilerden) alırken, bir kısmını vücut kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir.

• Vücudumuzun kendi ürettiği antioksidanlar endojen, dışarıdan aldığımız antioksidanlar ise eksojen antioksidanlar olarak adlandırılır.

Endojen Antioksidanlar;

• Süperoksit dismutaz (SOD) • Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) • Glutatyon S-Transferazlar (GST) • Katalaz (CAT)• Melatonin• Miyoglobin • Hemoglobin • Glutatyon • Sistein • Albümin

Eksojen Antioksidanlar;

• α-tokoferol (vitamin E) • β-karoten • Askorbik asit (vitamin C) • Folik asit (folat) • Butilat hidroksitoluen (BHT) • Butilat hidroksianisol (BHA) • Sitokinler • Sodyum benzoat

• Antioksidan özellikleri kapasite, etkinlik, güç, aktivite gibi birçok terimle tanımlanır.

• Antioksidan aktivitesi reaksiyon koşullarına bağlıdır. Her yöntem kendine özgü koşullara sahip olduğundan ve her koşuldaki kimyasal reaktivite değeri farklı olacağından, uygulanan yöntemdeki sonuçlar toplam antioksidan aktivite değerini vermeyebilir. Bu yüzden farklı yöntemlerle elde edilen sonuçların “kapasite” terimiyle değerlendirilmesi daha doğrudur.

DPPH SERBEST KÖK BAĞLAMA YÖNTEMİ

• Bu yöntem ilk kez Stanford Üniversitesi’nde çalışan Marsden Blois tarafından 1958 yılında, 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH) radikallerinin antioksidan moleküllerinin tayininde kullanılabileceğinin önerilmesi ile ortaya çıkmıştır.

• Antioksidan kapasite ölçümlerinin yoğunlaştığı yıllarda Brand-Williams ve arkadaşları yöntemi geliştirmiş ve bu yöntem pek çok araştırmacı tarafından referans olarak kullanılmıştır.

• DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) ticari olarak elde edilebilen stabil organik nitrojen radikalidir. 515 nm’de maksimum absorbansa sahiptir. Molekülde bir serbest elektronun yer değiştirmesi menekşe renginin oluşmasına neden olur. DPPH solüsyonu hidrojen atomu verebilen madde (antioksidan) ile karıştırıldığı zaman koyu menekşe rengin kaybı ile indirgenmiş form oluşur.

• DPPH(1,1-difenil-2-pikril hidrazil) serbest kök bağlama metodu, lipid oksidasyonunu önleyen antioksidanlar için genel olarak kabul edilmiş bir mekanizmadır.

• Diğer metodlarla karşılaştırıldığında; DPPH serbest kök bağlama metodu, antioksidan kapasitelerin belirli koşullara bağlı olarak kısa zamanda belirlenmesini sağlamaktadır. Antioksidanların DPPH serbest kökünü bağlama kapasitelerinin, bunların hidrojen (H) iyonu verme yeteneklerinden kaynaklandığı düşünülmektedir.

• DPPH serbest kök bağlama metodunda, örneklerin H iyonu verme kapasiteleri, stabil bir serbest kök DPPH kullanılarak araştırılmaktadır. H iyonu verme yatkınlığı olan bir bileşiğin varlığında DPPH kökü indirgenir ve stabil indirgenmiş formu oluşur.

• Yöntemin esası, DPPH içeren çözelti ile hidrojen atomu verme eğilimi olan bir molekülün (antioksidan) çözeltisinin karıştırılması sonucu DPPH radikalinin indirgenmesine ve çözeltinin başlangıçta mor olan renginin kaybolmasına dayanır.

• Mor renkli çözeltinin UV-Görünür bölge spektrometresinde 515 nm civarındaki absorbansının azalması ölçülerek reaksiyon takip edilir.

• Başlangıç DPPH konsantrasyonunu % 50 azaltmak için gereken örnek konsantrasyonu (EC50), antioksidan kapasiteyi hesaplamakta sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Düşük EC50 değeri yüksek antioksidan kapasiteyi gösterir.

• Diğer bir parametre ise antiradikal etkinlik (AE=1/EC50) veya antiradikal güçtür (ARP). Antiradikal etkinliğin yüksek olması antioksidan kapasitenin yüksek olması anlamına gelmektedir.

• DPPH molekülü stabil bir serbest radikal olarak, serbest elektronları delokalize etmesiyle nitelendirilir. Bir örnek, DPPH çözeltisi ile karıştırıldığında indirgenir ve bu indirgenmiş form mor renk kaybına neden olur.

• DPPH radikalini Z• İle ve örnek molekülü AH ile gösterecek olursak ilk aşamada

Z• + AH = ZH + A• [1]

tepkimesi gerçekleşir. Bu tepkimede indirgenmiş ZH molekülü ve A•

radikali oluşur. Bu ikinci radikal genel stokiyometri kontrolünde ilave reaksiyonlar geçirir.

• Kalan DPPH radikali aşağıdaki formülden hesaplanır.

% DPPHKalan=([DPPH.]t / [DPPH.]t0) x 100

• DPPH yöntemi teknik olarak basit olmasına karşın bazı dezavantajları bulunmaktadır. Birçok antioksidan bileşik lipid peroksidasyonunda rol oynayan peroksil radikalleri ile çok hızlı tepkime verirken DPPH ile yavaş tepkime vermektedir.

• Örneğin Askorbik asit ile 1,15 dakika ve rutin ile 103 dakikada tepkime vermektedir. Sonuç olarak antioksidan kapasitenin doğru bir şekilde ifade edilemediği düşünülebilir.

• Ayrıca, DPPH ile antioksidan bileşik arasındaki reaksiyon kinetiğinin DPPH derişimi ile her zaman doğrusallık göstermediği de bilinmektedir.

EC50-Etkin Konsantrasyon Değeri

• DPPH yöntemi sonuçlarının yorumlanması için etkin konsantrasyon değeri(efficient consentration value-EC50) adında bir parametre ortaya konulmuştur.

• Bu parametre DPPH derişimini %50 oranında azalmasına neden olan substrat konsantrasyonu olarak tanımlanır.

Zeytin ve Çay Örneklerinden Ekstrakte Edilen Fenolik Bileşiklerin Antioksidan Özelliklerinin Değerlendirilmesi

• Bu deneyde, zeytin ve çay örneklerinden elde edilen fenolik ekstraktların DPPH serbest kökünü bağlama kapasiteleri, sentetik bir antioksidan olan BHT (Butilat Hidroksitoluen) ile karşılaştırılmıştır.

• Zeytin ve çay örneklerinden elde edilen ve metanol içinde çözündürülen fenolik ekstraktların 0.1 mL’si yine metanolle hazırlanan 6x10-5 mol/L konsantrasyondaki DPPH çözeltisinin 2.9 mL’sine eklenmiştir. Absorbanstaki düşüş 515 nm’de ölçülmüş ve reaksiyon sabitlenene kadar ölçüme devam edilmiştir.

• Fenolik ekstraktların DPPH ile reaksiyona girme hızlarındaki farklılıktan dolayı; çay örneklerinden elde edilen fenolik ekstaktlar 0.18, 0.9, 1.8 ve 3.6 x 10-4 mol/L, zeytin örneklerinden elde edilen fenolik ekstraktlar ve BHT ise 1.8; 3.6; 5.4 ve 9 x 10-4 mol/L konsantrasyonlarında test edilmiştir.

• Zeytin ve çay örneklerinden elde edilen fenolik ekstraktların ve BHT’nin DPPH kökünü 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanındaki bağlama kapasiteleri çizelge 4.1’de gösterilmiştir.

Antioksidan Kaynağı

Konsantrasyon(x10-4mol/L)

DPPH Kökünü Bağlama Kapasiteleri30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zamanı

Sabitlenme Zamanı

Çay Ekstraktı 1.8

3.6

27.485

79.065

42.612

84.512

51.557

87.905

100

100

Zeytin Ekstraktı

1.8

3.6

19.663

37.840

21.057

42.494

22.907

50.425

150

150

BHT1.8

3.6

8.026

13.139

13.152

22.453

14.151

24.469

70

70

Çizelge 4.1 Fenolik ekstraktlar ve BHT’nin 1.8, 3.6x10-4 M konsantrasyonlarında DPPH kökünü 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanındaki bağlama kapasiteleri (%)

• 1.8x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ekstraktı içeren örnekler 30. ve 60. dakikalarda DPPH’in % 19.663 ve % 21.057’sini tutabilirken; bu oran aynı konsantrasyondaki çay ekstraktı içeren örnek için % 27,485 ve % 42.612 ve aynı konsantrasyonda BHT içeren örnek için % 8.026 ve % 13.152 olmuştur (Çizelge 4.1).

• Sabitlenme zamanlarına bakıldığında, 3.6x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ve çay ekstraktı içeren örnekler sırasıyla % 50.425 ve % 87.905 oranında DPPH tutabilirken; bu oranın aynı konsantrasyonundaki BHT içeren örnek için % 24.469 olduğu görülmektedir (Çizelge 4.1).

• Zeytin ve çaydan elde edilen fenolik ekstraktları ve BHT’nin , kök bağlama kapasitelerine ilişkin verilerin istatistiksel analizlerine göre 30. dakika, 60. dakika ve sabitlenme zamanında çay ekstraktı> zeytin ekstraktı > BHT olarak bulunmuştur.

• Buna ilaveten; 5.4 ve 9.0x10-4 mol/L konsantrasyonlarındaki zeytin ekstraktlarının ve BHT örneklerinin DPPH kökünü bağlama kapasiteleri ölçülmüştür. 9.0x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ekstraktı içeren örnek sabitlenme zamanında, DPPH’in % 87.461’ini tutabilirken; bu oran BHT içeren örnek için ancak % 43.569 olmuştur (Çizelge 4.2).

Antioksidan Kaynağı Konsantrasyon

(x10-4 mol/L)

DPPH Kökünü Bağlama Kapasiteleri30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zamanı

Sabitlenme Zamanı(Dakika)

Zeytin Ekstraktı

5.4

9.0

35.780

57.457

49.414

70.637

64.235

87.461

150

150

BHT5.4

9.0

12.966

19.206

29.147

37.762

31.833

43.569

70

70

Çizelge 4.2 Zeytin ekstraktları ve BHT’nin 5.4, 9.0x10-4 M konsantrasyonlarında DPPH kökünü 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanındaki bağlama kapasiteleri

• Çizelge 4.3’teki antioksidan aktivite sonuçlarının istatistiksel analizlerine göre, 30. dakika için EC50 değerleri BHT > zeytin > çay olarak bulunurken; 60. dakika için BHT > zeytin > çay; sabitlenme zamanı için zeytin ≥ BHT > çay olarak bulunmuştur. Daha düşük EC50 değerleri daha yüksek antioksidan etkinlik anlamına geldiğinden örneklerin antioksidan etkinlikleri en fazla çayda, en az BHT’de bulunmuştur.

Antioksidan Kaynağı

Başlangıçtaki DPPH Konsantrasyonunu %50 Azaltmak İçin Gereken Antioksidan Miktarı (EC50) (x10-4 mol/L)

30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zamanı

Zeytin 0.186±0.004 0.396±0.007 0.901±0.049

Çay 0.070±0.002 0.142±0.001 0.225±0.001

BHT 0.939±0.166 0.860±0.126 0.860±0.096

Çizelge 4.3 Fenolik Ekstraktların ve BHT’nin EC50 Değerleri

• Fenolik esktraktlar ve BHT’nin Antiradikal Etkinlik (ARP) verilerine ilişkin istatistiksel analizlerine göre; 30. ve 60. dakikalar için ARP değerleri çay > zeytin > BHT olarak bulunurken; sabitlenme zamanı için çay > zeytin ≥ BHT olarak bulunmuştur. Daha yüksek ARP değeri daha yüksek antioksidan etkinlik anlamına gelmektedir. Sabitlenme zamanında en iyi antioksidan etkinlik çay ekstraktlarında bulunmuştur.Antioksidan

KaynağıAntiradikal Etkinlik (ARP=1/EC50)

30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zamanı

Zeytin 5.383±0.102 2.529±0.050 1.112±0.058

Çay 14.862±1.346 7.037±0.062 4.452±0.028

BHT 0.947±0.190 1.174±0.172 1.170±0.131

Çizelge 4.4 Fenolik Ekstraktların ve BHT’nin Antiradikal Etkinliği (ARP=1/EC50)