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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（２）：９６～１００

侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物 ＣＰ基因序列分析

牛立霞　牛胜鸟　王健华　刘志昕（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热带作物生物技术国家重点实验室　海口　５７１１０１）

摘要　通过间接酶联免疫法（ＩＤ?ＥＬＩＳＡ）检测到染病落葵病样中存在黄瓜花叶病毒（ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）。从病叶中提取总 ＲＮＡ，用 ＲＴ?ＰＣＲ方法扩增得到６５７ｂｐ的 ＣＭＶＣＰ基因片段，将扩增产物与Ｔ载体连接并进行测序。用ＤＮＡＭＡＮ将得到的ＣＰ基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ收录的黄瓜花叶病毒两亚组部分株系或分离物的ＣＰ基因序列进行比较，结果表明该ＣＰ基因与ＣＭＶ亚组Ⅰ、亚组Ⅱ之间的核苷酸序列同源性分别为９１．１７％～９５．４３％和７５．３０％～７５．７６％，推导氨基酸序列同源性分别为９５．４１％ ～９７．７１％和８１．２８％ ～８１．７４％，表明 ＣＭＶ?Ｂａ与亚组Ⅰ同源关系密切。

关键词　落葵　黄瓜花叶病毒　ＣＰ基因　序列分析中图分类号　Ｑ７８

收稿日期：２００７１０１２　　修回日期：２００７１１２３国家“十一五”科技支撑计划资助项目（２００７ＢＡＤ４８Ｂ０１）通讯作者，电子信箱：ｔｐｍｖｐｌａｂ＠１６３．ｃｏｍ

　　落葵（ＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａＬ．）属落葵科植物，为一年生

藤本植物，俗名木耳菜、藤菜、承露、胭脂菜、御菜等，在

我国各地均有栽培，亚洲其它地区、非洲、美洲也有分

布［１］。落葵不仅具有质地嫩滑、味道鲜美、营养丰富等

特点，而且还具有一定的清凉解热、解毒缓泄功能，可

算是一类药菜两用的蔬菜，深受广大人民的青睐，而且

成为宾馆饭店餐桌上具有新口味的高档蔬菜［２］。

　　但在生产过程中，无论采用何种栽培模式，落葵都

或轻或重受到多种病害的危害。已见报道的有顶套菌

属［３］、炭疽菌属和叶点霉属［２］、尾孢属［２，４～７］、琏格孢属

和色二孢属［８］以及短小杆菌属［９］真菌引起的叶斑病，

腐霉属真菌引起的霜霉病［２，６］，葡萄孢属真菌引起的灰

霉病［２，５，６］，根结线虫引起的根结线虫病［１０］，而落葵病

毒病，仅见２００６年Ｈｕａｎｇ等［１１］报道马铃薯Ｙ病毒引起

的皱缩花叶病。这些病害严重影响了落葵的品质和产

量，制约了农民栽培的积极性。其中，近几年落葵花叶

病发生普遍，种植效益随之下降。为了确定海南落葵

花叶病的病原，为以后的防治工作打下基础，作者从症

状为全株发病，叶片变小皱缩，叶面泡状突起，叶背脉

明显突起，甚至变形弯曲，叶色呈浓淡不均的花叶斑驳

状的落葵植株上采集了病叶，得到病毒分离物（ＣＭＶ?Ｂａ），并将克隆得到的ＣＭＶ?Ｂａ外壳蛋白 （ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，

ＣＰ）基因与已报道的 ＣＭＶ２个亚组的部分成员的 ＣＰ

基因进行了序列分析和比较。

１　材料与方法

１．１　材　料

１．１．１　材料　罹病材料采自海南海口的菜地，置于 －

２０℃冰箱保存备用。

１．１．２　抗血清和酶标抗体　一抗为本实验室制备的

ＣＭＶ亚组Ⅰ多克隆抗血清 Ｂ３，酶标记羊抗兔 ＩｇＧ为博

士德生物工程有限公司生产的碱性磷酸酯酶标记的

二抗。

１．１．３　酶与试剂　ＡＭＶ逆转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂

（Ｒｎａｓｉｎ）、ｄＮＴＰｓ为ＴａＫａＲａ公司产品，ＴａｑＤＮＡ聚合酶

购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＰＣＲ产物回收试剂盒为 ＴＩＡＮＧＥＮ

公司产品。

１．１．４　载体与菌株　ｐＭＤ１８?Ｔ载体购自 ＴａＫａＲａ公

司，大肠杆菌ＤＨ５α菌种由本实验室保存。

１．１．５　合成引物　根据 ＣＭＶ亚组Ⅰ外壳蛋白基因序

列设计引物，由上海生工合成。５′端同源引物：５′?ＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧ?３′，３′端互补引物：５′?ＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧ?３′。

２００８，２８（２） 牛立霞 等：侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物ＣＰ基因序列分析

１．２　方　法

１．２．１　间接酶联免疫吸附法检测　用液氮研磨采集

的样品，以间接酶联免疫法（ＩＤ?ＥＬＩＳＡ）进行检测［１２］。

ＣＭＶ亚组Ⅰ多克隆抗血清 Ｂ３的工作浓度为１∶３００，酶

标记羊抗兔ＩｇＧ的工作浓度为１∶３０００。

１．２．２　总ＲＮＡ的提取　称取０．２ｇ病叶用液氮研磨成

粉，迅速加入两倍体积的水饱和酚／氯仿／异戊醇（２５∶

２４∶１）混合液和两倍体积的 ＬｉＣｌ提取缓冲液

（１００ｍｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ?ＣｌｐＨ８．０，１０ｍｍｏｌ／Ｌ

ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，１％ Ｎａ２ＳＯ３），混 匀，冰 浴 １０ｍｉｎ，

１２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２０ｍｉｎ，上清转移至离心管中，加

入等体积４ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ，混匀后置４℃沉淀过夜，４℃离心

２０ｍｉｎ，沉淀用７０％的乙醇漂洗，吹干，用适量 ＤＥＰＣ处

理水悬浮。

１．２．３　单链ｃＤＮＡ的合成　按 ＴａＫａＲａ公司的操作说

明，２０μｌ的反应体系中，加入上述提取的 ＲＮＡ１μｇ，３′

端互补引物１μｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１μｌ，５×Ｂｕｆｆｅｒ４μｌ，

ＲＮＡ酶抑制剂 ２０Ｕ，ＡＭＶ逆转录酶 １００Ｕ，４２℃反应

６０ｍｉｎ后，７０℃保温１５ｍｉｎ，然后置－２０℃保存。

１．２．４　ＰＣＲ体外扩增　在２０μｌ反应体系中加入１０×

ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μｌ，加３′端互补引物和５′端同源引物各０．

５μｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．５μｌ，Ｔａｑ聚合酶２Ｕ，补加双蒸

水至２０μｌ。在 ＰＣＲ仪上进行反应，扩增反应条件为：

９４℃，２ｍｉｎ；然后９４℃变性４５ｓ，５８℃退火５０ｓ，７２℃延伸

６０ｓ，从变性到延伸完成３５个循环后，７２℃保温７ｍｉｎ。

用１％的琼脂糖凝胶电泳检查分析。

１．２．５　ＣＰ基因的克隆和序列分析　ＰＣＲ扩增产物经

ＤＮＡ回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收，回收的 ＰＣＲ产

物和 Ｔ载体经 Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后，转化大肠杆菌

ＤＨ５α感受态细胞，涂布在 ＬＢ固体培养基（含氨苄青

霉素１００μｇ／ｍｌ，Ｘ?ｇａｌ、ＩＰＴＧ），３７℃过夜培养，挑取白色

菌落接种于含１００ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素的 ＬＢ培养液中，

３７℃，２５０ｒ／ｍｉｎ震荡培养３ｈ，取少量菌液进行 ＰＣＲ检

测，将阳性菌系进行穿刺培养，送北京三博远志生物技

术有限责任公司测序。用 ＤＮＡＭＡＮ软件比较所克隆

的ＣＰ基因与 ＧｅｎＢａｎｋ中部分已收录的 ＣＭＶＣＰ基因

的核苷酸和推导氨基酸的序列同源性。

２　结　果

２．１　间接酶联免疫吸附法检测

　　以ＣＭＶ香蕉分离物为阳性对照（ＣＫ＋），以健康落

葵为阴性对照（ＣＫ?），０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸盐缓冲液为空

白对照（Ｂｌａｎｋ），用本实验室制备的 ＣＭＶ亚组Ⅰ多克

隆抗血清Ｂ３血清检测，反应结果见表１。由表１可以

看出，病样１和病样２与阳性对照一样，检测的ＯＤ４０５值

明显高于阴性对照２倍，也就是说它们都与本实验室

制备的ＣＭＶ亚组Ⅰ多克隆抗血清呈阳性反应，都属于

亚组Ⅰ。表１　病毒分离物的ＩＤ?ＥＬＩＳＡ测定（Ａ４０５吸收值）

Ｔａｂｌｅ１　ＩＤ?ＥＬＩＳＡｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｓ

（ａｂｓｏｒｂｉｎｇｖａｌｕｅｏｆＡ４０５）

Ｓａｍｐｌｅｓ

ＡｎｔｉｓｅｒｕｍＢ３

ＲｅａｄｓⅠ Ⅱ Ａｖｅｒａｇｅ

Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ

Ｂｌａｎｋ ０．４３９ ０．４３３ ０．４３６ －ＣＫ＋ ２．２５２ ２．４４８ ２．３５０ ＋ＣＫ－ ０．５４６ ０．５３３ ０．５３９ －Ｓａｍｐｌｅ１ １．２２７ １．２３８ １．２３３ ＋Ｓａｍｐｌｅ２ ２．０５２ ２．１３３ ２．０９２ ＋

２．２　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因的克隆

　　ＲＴ?ＰＣＲ扩增产物的电泳结果显示，在１％的脂糖

凝胶上，２个病样的扩增产物均呈现一条分子量约为

６５０ｂｐ的ＤＮＡ条带（图１），其大小与已报道的ＣＭＶＣＰ

基因分子量基本相同。将扩增得到的基因片段克隆于

ｐＭＤ１８?Ｔ载体后，转化大肠杆菌 ＤＨ５α。挑取白色菌

落，进行菌落ＰＣＲ检测，获得部分ＰＣＲ阳性克隆。

图１　ＣＭＶＣＰ基因ＲＴ?ＰＣＲ扩增产物

Ｆｉｇ．１　ＲＴ?ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＭＶＣＰｇｅｎｅＭ：ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；

２：Ｄｉｓｅａｓｅｄｓａｍｐｌｅ１；３：Ｄｉｓｅａｓｅｄｓａｍｐｌｅ２

２．３　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因的序列分析

　　分别随机挑取２个病样的 ＰＣＲ阳性菌系穿刺培养，进行双向测序序列。测定结果表明，２个病样的 ＣＰ基因序列完全一致。所得ＣＭＶ落葵分离物 ＣＰ基因全长６５７ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ上登陆号为 ＥＦ４２４７７６），编码 ２１８

个氨基酸（图２）。

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．２２００８

图２　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因核苷酸序列以及推导的氨基酸序列

Ｆｉｇ．２　ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＭＶ?ＢａｉｓｏｌａｔｅＣＰｇｅｎｅ

２．４　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因与 ＣＭＶ两亚组部分 ＣＰ基因

序列的比较

　　将ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因与其它２２个ＣＭＶ株系或分离

物的ＣＰ基因序列进行同源性比较（表２），并根据它们

的核苷酸序列同源性，绘制系统进化树（图３）。从表

２，可以看出ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因与亚组Ⅰ各株系或分离物

ＣＰ基因之间的核苷酸序列同源性为 ９１．１７％ ～

９５．４３％，推导氨基酸序列的同源性为 ９５．４１％ ～

９７．７１％。与亚组Ⅱ各株系或分离物 ＣＰ基因之间核苷

酸序列同源性为７５．３０％ ～７５．７６％，推导氨基酸序列

的同源性为８１．２８％～８１．７４％。表明 ＣＭＶ?Ｂａ与亚组

Ⅰ株系或分离物同源性关系更密切，因而属于亚组Ⅰ。

表２　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因与ＣＭＶ两亚组部分株系或分离物ＣＰ基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性

Ｔａｂｌｅ２ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＣＰｇｅｎｅａｍｏｎｇＣＭＶ?Ｂａａｎｄ

ｓｏｍｅＣＭＶｓｔｒａｉｎｓｏｒｉｓｌａｔｅｓｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐⅠ ａｎｄｓｕｂｇｒｏｕｐⅡ

ＳｔｒａｉｎｏｒＩｓｏｌａｔｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ． Ｏｒｉｇｉｎ ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨｏｍｏｌｏｇｙ（％） ＡｍｉｎｏａｃｉｄＨｏｍｏｌｏｇｙ（％） Ｓｕｂｇｒｏｕｐ

ＢＸ ＤＱ３９９５５０ Ｃｈｉｎａ ９１．１７ ９５．８７ ⅠＣＳ ＡＹ４２９４３７ Ｃｈｉｎａ ９１．６３ ９５．４１ ⅠＦｎｙ ＮＣ＿００２０３４ ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ ９２．８５ ９６．７９ ⅠＫ ＡＦ１２７９７７ ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ ９２．２４ ９７．７１ Ⅰ

ＫＰＳ１０ ＥＦ６０８４６１ Ｔｈａｉｌａｎｄ ９４．９８ ９７．２５ ⅠＭａｈａｒａｓｔｒａ ＤＱ６４０７４３ Ｉｎｄｉａ ９５．１３ ９６．３３ ⅠＰｈｙ ＤＱ４１２７３２ Ｃｈｉｎａ ９３．３０ ９６．７９ ⅠＰｌ?１ ＡＭ１８３１１６ Ｓｐａｉｎ ９３．１５ ９６．７９ Ⅰ

Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ＤＱ９１４８７７ Ｉｎｄｉａ ９５．４３ ９７．２５ ⅠＳＤ ＡＦ０７１５５１ Ｃｈｉｎａ ９３．４６ ９７．２５ ⅠＳＧ１５ ＡＹ５６０５５６ Ｔｈａｉｌａｎｄ ９５．１３ ９７．２５ ⅠＬＹ ＡＦ１９８１０３ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ７５．３０ ８１．７４ ⅡＱ Ｍ２１４６４ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ７５．７６ ８１．７４ ⅡＴＮ ＡＢ１７６８４７ Ｊａｐａｎ ７５．４５ ８１．７４ ⅡＷＬ Ｄ００４６３ ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ ７５．３０ ８１．２８ ⅡＸｂ ＡＦ２６８５９８ Ｃｈｉｎａ ７５．６１ ８１．２８ Ⅱ

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２００８，２８（２） 牛立霞 等：侵染落葵的黄瓜花叶病毒分离物ＣＰ基因序列分析

图３　ＣＭＶ?ＢａＣＰ基因与ＣＭＶ两亚组部分株系或分离物ＣＰ基因的核苷酸序列同源图示

Ｆｉｇ．３　ＳｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＣＰｇｅｎｅ

ａｍｏｎｇＣＭＶ?ＢａａｎｄｓｏｍｅＣＭＶｓｔｒａｉｎｓｏｒｉｓｌａｔｅｓｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐⅠａｎｄｓｕｂｇｒｏｕｐⅡ

３　讨　论

　　植物病毒 ＥＬＩＳＡ血清学反应在病毒鉴定上被广泛采用，并主要用于快速测定病毒病的发生，而核苷酸序

列分析方法则可更准确检测病毒，将具有极其微小差别

的２个或多个株系区分开，确定病毒的分类，是区分和鉴定病毒株系的最可靠的方法［１３］。由于ＣＭＶ基因组序列变异较大，株系繁多，分离自不同地区、不同寄主的

ＣＭＶ在生物学和分子生物学特征上均具很大差别，使得抗ＣＭＶ工作难度大为增加，因此对病毒所属亚组进行

鉴定是很有必要的。为此，作者采用 ＥＬＩＳＡ血清学反应和核苷酸序列分析方法相结合，对落葵花叶病病原进行

分析。

　　ＣＭＶ是雀麦花叶病毒科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）黄瓜花叶病

毒属（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）的典型成员，是分布最广的植物病毒之一，基因组包括３个正单链 ＲＮＡ和第４个亚基因组ＲＮＡ。根据血清学关系和核苷酸序列分析等可将 ＣＭＶ

分为２个亚组（亚组Ⅰ和Ⅱ）［１４］。ＣＭＶ核苷酸序列和氨基酸序列同源性在亚组间的株系中为７６％ ～８４％，而在亚组内株系间却达９０％以上［１５］。通过 ＣＰ基因序列同源性比较，ＣＭＶ?Ｂａ与印度分离物ＣＭＶ?Ｒａｕｖｏｌｆｉａ的核苷

酸序列和氨基酸序列同源性相对较高，核苷酸序列同源

性为９５．４３％，氨基酸序列同源性为９７．２５％，与 ＥＬＩＳＡ

血清学检测结果一致，验证其属于亚组Ⅰ。　　国内外至今对由黄瓜花叶病毒引起的落葵花叶病

未见有报道，本文是首次对此病害及其病原进行了比较

系统地研究和报道，确定其属于 ＣＭＶ亚组Ⅰ的成员，为

本地区ＣＭＶ流行学研究奠定了基础。

参考文献

　［１］周淑荣，魏国先．落葵的栽培与利用．特种经济动植物，２００１，

（８）：２９

ＺｈｏｕＳＲ，ＷｅｉＧＸ．ＳｐｅｃｉａｌＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌａｎｄＰｌａｎｔ，２００１，

（８）：２９

　［２］张宝棣，彭庆平．广州地区落葵病害初步调查．广东农业科

学，１９９６，（２）：２９～３１

ＺｈａｎｇＢＬ，ＰｅｎｇＱＰ．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９６，

（２）：２９～３１

　［３］ＡｌｖａｒｅｚＧａｒｃｉａＬＡ．ＡｃｒｏｔｈｅｃｉｕｍｌｅａｆｓｐｏｔｏｆＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａＬ．Ｊｏｕｒ

ＡｇｒｉｃＵｎｉｖＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ，１９４３，２７（４）：１４９～１６４

　［４］周晓燕．落葵紫斑病的防治．云南农业科技，２０００，（６）：２９

ＺｈｏｕＸＹ．ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｉｏｇｙ，２０００，

（６）：２９

　［５］雷文标．落葵主要病虫害的发生与综合防治技术．福建热作

科技，２００４，２９（１）：１９～２０

ＬｅｉＷＢ．ＦｕｊｉａｎＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，２００４，

２９（１）：１９～２０

　［６］卢隆杰，苏浓，岳森，等．落葵常见病虫害的防治．植物医生，

２００６，１９（１）：１４～１６

ＬｕＬＪ，ＳｕＮ，ＹｕｅＳ，ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＤｏｃｔｏｒ，２００６，１９（１）：１４～１６

　［７］姜海平，桑芝萍，孙建东，等．落葵蛇眼病的发生与综合防治

技术．植保技术与推广，２０００，２０（２）：１９

ＪｉａｎｇＨＰ，ＳａｎｇＺＰ，ＳｕｎＪＤ，ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ，２０００，２０（２）：１９

　［８］刘文珍，高振江，吕佩珂，等．落葵的几种叶部病害（下）．长江

蔬菜，１９９６，（８）：１３～１４

ＬｉｕＷ Ｚ，ＧａｏＺＪ，ＬｕＰＫ，ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈａｎｇｊｉａｎｇ

Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，１９９６，（８）：１３～１４

　［９］陈永芳，郭坚华，方中达，等．落葵上发现短小杆菌属

９９

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．２２００８

（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）一个新的致病变种．植物病理学报，２０００，３０

（２）：１７１～１７５

ＣｈｅｎＹＦ，ＧｕｏＪＨ，ＦａｎｇＺＤ，ｅｔａｌ．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ

Ｓｉｎｉｃａ，２０００，３０（２）：１７１～１７５

　［１０］赖贝元．落葵新病害根结线虫病初步鉴定．广东农业科学，

１９９７，（２）：３８～３９

ＬａｉＢＹ．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７，（２）：３８～３９

　［１１］ＨｕａｎｇＣＨ，ＣｈａｎｇＹＣ．Ｂａｓｅｌｌａｒｕｇｏｓｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ａｎｅｗ

ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００６，５５：８１９

　［１２］ＫｏｅｎｉｇＲ．ＩｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｂｒｏａｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ，１９８１，５５：５３～６２

　［１３］李志勇，夏蕙娟，董金皋，等．北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花

叶病毒ＣＰ基因序列分析及亚组鉴定．河北农业大学学报，

２００５，２８（４）：８９～９２

ＬｉＺＹ，ＸｉａＨ Ｊ，ＤｏｎｇＪＧ，ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕａｌ

ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｂｅｉ，２００５，２８（４）：８９～９２

　［１４］ＢｈａｔＡＩ，ＨａｒｅｅｓｈＰＳ，ＭａｄｈｕｂａｌａＲ，ｅｔａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｃｏａｔ

ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｏｆａｎｉｓｏｌａｔｅｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇｂｌａｃｋ

ｐｅｐｐｅｒ（Ｐｉｐｅｒｎｉｇｒｕｍ Ｌ）ｉｎＩｎｄｉａ．ＪＰｌａｎｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，１４：３７～４０

　［１５］崔连民，张福进，刘学春，等．黄瓜花叶病毒山东分离物外壳

蛋白基因的克隆及序列分析．山东农业科学，２００５，（４）：３～６

ＣｕｉＬＭ，ＺｈａｎｇＦＪ，ＬｉｕＸＣ，ｅｔａｌ．ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ

Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，（４）：３～６

ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏａｔＰｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＩｓｏｌａｔｅＩｎｆｅｃｔｉｎｇＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａＬ．

ＮＩＵＬｉ?ｘｉａ　ＮＩＵＳｈｅｎｇ?ｎｉａｏ　ＷＡＮＧＪｉａｎ?ｈｕａ　ＬＩＵＺｈｉ?ｘｉｎ（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｉｋｏｕ　５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｆｒｏｍｉｎｆｅｃｔｅｄＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａＬ．ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｄｉｒｅｃｔｅｎｚｙｍｅ?ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ．ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｉｎｆｅｃｔｅｄｌｅａｖｅｓａｎｄｔｈｅｃＤＮＡｓｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｏｆＣＭＶ?ＢａｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ?ＰＣＲ．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＭＤ１８?Ｔｖｅｃｔｏｒａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣＰｇｅｎｅｗａｓ６５７ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｌｅｎｇｔｈ．ＴｈｉｓｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄＣＰｇｅｎｅａｎｄｓｏｍｅＣＭＶｓｔｒａｉｎｓｏｒｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐⅠ ａｎｄｓｕｂｇｒｏｕｐⅡ ｉｎＧｅｎＢａｎｋｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮｓｏｆｔｗａｒｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＣＭＶ?Ｂａｓｈａｒｅｄ９０．９％ ～９３．８％ ａｎｄ７６．１％ ～７６．９％ ｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｋｎｏｗｎＣＰｇｅｎｅｓｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐⅠ ａｎｄⅡ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｅｖｅｌ，ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｄｅｄｕｃｅｄｆｒｏｍＣＭＶ?ＢａＣＰｇｅｎｅｓｈａｒｅｄ９２．７％ ～９７．７％ ａｎｄ７２．４％ ～７８．１％ ｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｋｎｏｗｎＣＰｐｒｏｔｅｉｎｏｆｓｕｂｇｒｏｕｐⅠ ａｎｄⅡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＣＭＶ?ＢａＣＰｇｅｎｅｂｅｌｏｎｇｓｔｏＣＭＶｓｕｂｇｒｏｕｐⅠ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＢａｓｅｌｌａｒｕｂｒａＬ．　Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ　Ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ

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