EXPRESION Y PURIFICACION IN VITRO DE LA THERMUS AQUATICUS ADN POLIMERASA

EXPRESSION AND PURIFICATION IN VITRO OF THERMUS AQUATICUS DNA POLYMERASE

Inti C. Monge Romero1

1Departamento de Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota, Bogota-Colombia. Correo

electrónico icmonger@unal.edu.co

Resumen

La Thermus aquaticus ADN polimerasa (EC 2.7.7.7) es una enzima ampliamente utilizada en biología

molecular, cuyo costo es relativamente alto. En este trabajo se optimizaron las condiciones de

expresión de la Taq polimerasa recombinante en E. coli. Condiciones que permitirán la expresión y

purificación a gran escala de esta enzima. Los parámetros evaluados fueron la concentración de IPTG,

la temperatura de inducción, la densidad óptica del cultivo a inducir y el tiempo de incubación, siendo

los valores más óptimos los siguientes: 1 mM de IPTG, 37°C de incubación, absorbancia de 0,6 y 16

horas de inducción. La expresión de la Taq polimerasa en E. coli dio un producto final de 21,02 mg de

enzima a partir de 1,4972 g de células inducidas, con una actividad enzimática de 10U/μl. Este último

parámetro se determino por comparación de la cantidad de ADN amplificado por PCR entre una Taq

comercial y la purificada, señalando la calidad de la proteína obtenida.

Abstract

The Thermus aquaticus ADN polymerase (EC 2.7.7.7) is an enzyme widely used in molecular biology, it

is an expensive enzyme. In this work the production conditions of the Taq polymerase recombinant in E.

coli were optimized. These conditions will allow the production and purification in great scale of this

enzyme. The parameters evaluated were the concentration of IPTG, the induction temperature, the

optic density and time of incubation, being the optimum values these: 1mM of IPTG, 37 °C of incubation,

absorbance of 0,6 and 16 hours of induction. The production of the Taq polymerase in E. coli gave a

final product of 21,02 mg of enzyme from 1,4972 g of inducted cells, with an enzymatic activity of

10U/μl. This last parameter was determined by comparison of the amount of amplified ADN by PCR

between a commercial Taq and the purified, highlighting the quality of the protein obtained.

Palabras Claves: ADN polimerasa, amplificación, expresión, optimización, in Vitro, clon, actividad

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy importante para la clonación,

la directa secuenciación, diagnosis clínica y otros usos en la biología molecular (1). Fue

inicialmente propuesta por Ghobind Khorana y sus colegas (2) hacia 1970 como un procedimiento

para disminuir la complicada labor envuelta en la síntesis química de genes. Sin embargo, esta

idea no era factible por múltiples razones principalmente envueltas en el contexto tecnológico de

la época: el secuenciamiento de genes aun no era posible, la ADN polimerasa termoestable no

había sido descubierta y la síntesis de oligonucleotidos era más un arte que una ciencia. Solo 15

años después, Kary Mullis y colegas pudieron realizar una amplificación de un gen de mamífero

usando la ADN polimerasa I de Escherichia coli. El proceso envuelve la amplificación o replicación

in Vitro de un fragmento de ADN (3) enmarcado por oligonucleotidos (Primers) que permiten la

fijación de la ADN polimerasa. El descubrimiento de la Taq ADN polimerasa aislada de la bacteria

Thermus aquaticus permitió un incremento en la eficiencia del PCR y abrió la puerta a un método

automático ya que después de cada ciclo no había la necesidad de adicionar polimerasa como si

ocurría cuando de utilizaba la de E. coli. La Taq ADN polimerasa puede ser expuesta

repetidamente a temperaturas altas sin que pierda su conformación y actividad (~95ºC), las altas

temperaturas son necesarias para lograr la separación de las hebras del ADN y que se puedan

fijar los primers sobre ellas en el anillaje.

La bacteria Thermus aquaticus YT1 (4), es un termófilos capaz de crecer a 70 o 75ºC, fue aislado

de aguas termales en el parque nacional Yellowstone. La Taq ADN polimerasa presenta un peso

molecular de 93,910Da (~94kDa), con una aparente temperatura optima entre 75 a 80ºC, y puede

insertar 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima. Además, cuenta con una alta

fidelidad que es dependiente de la concentración de los dNTP, el número de ciclos en el PCR y la

simetría de los Primers con el templet.

La Taq polimerasa es estructural y funcionalmente homologa a la ADN polimerasa I de E. coli (5),

con un dominio 5´ con actividad nucleasa y un dominio 3´ con actividad exonucleasa o

proofreading (Fig 1), que es inactivo en la Taq. La termo estabilidad de la Taq polimerasa se debe

a una disminución de desfavorables interacciones electrostáticas, por una reorganización global

de la distribución de la carga en la proteína (6) y un aumento en el número de puentes disulfuro

dentro de la enzima. Además, como en la mayoría de la polimerasas presenta una estructura en

forma de mano derecha, que se cierra y se abre a medida que ocurre la amplificación del ADN. La

Taq contiene una O-Helice (7) que funcional y estructuralmente es esencial para la catálisis in vivo

en la familia de las Pol I, los residuos R659, K663, F667 y Y671 son altamente conservados

dentro de esta estructura y permiten el contacto de los dNTP con le templet/primers.

Fig 1. Estructura de la Taq ADN polimerasa. A Esquematización de los diferentes dominios en la enzima. B Estructura

tridimensional en forma de mano derecha de la Taq polimerasa.

En este trabajo se expreso y purifico la Taq polimerasa recombinante en E. coli, una vez

optimizadas las condiciones de inducción, tales como la concentración de IPTG, temperatura,

cepas de expresión y temperatura.

Materiales y Métodos

Medio de Cultivo y Cepas

El clon codificante de la Taq polimerasa es la E. coli JM109 (pTTQ18), que es crecido en medio

LB suplementado con 100µg/ml de ampicilina a 37°C, y en la inducción con isopropil-β-D-tio-

galactósido (IPTG). Para la transformación se utilizaran células competentes de E. coli BL21.

Optimización de la Temperatura de expresión de la Taq polimerasa

Inicialmente debe inocularse 10ml de medio de LB más ampicilina con las cepas recombinantes y

permitir que crezcan durante toda la noche a 37°C. Con este medio saturado se inocula un nuevo

medio de LB más ampicilina para la inducción. La inducción del cultivo se realiza cuando este

haya alcanzado una densidad óptica (OD600) de ∼ 0.6, la cual corresponde a la parte terminal en la

fase logarítmica de crecimiento. Cuatro diferentes cultivos con la E. coli JM109 recombinante son

inducidos (8) con 1.0mM de IPTG he incubado cada uno a 24, 30, 37 y 40ºC, durante 5 horas para

determinar la temperatura óptima de expresión, manteniendo una buena aireación y agitación

(estas dos últimas condiciones deben mantenerse en todos los ensayos). En cada ensayo, las

A B

muestras analizadas deben tener la misma densidad óptica, ya que se busca observar como es el

cambio de la expresión dentro un mismo número de células.

Optimización de la concentración del inductor para expresión de la Taq polimerasa

La concentración del inductor, IPTG, se determina observando la expresión en cuatro cultivos

donde a cada uno le corresponde una concentración de 0.5, 1.0, 2.5 y 5.0mM del inductor

manteniendo una temperatura de incubación de 37ºC durante 5 horas.

Optimización del tiempo y densidad óptica de inducción

Los cambios en la expresión variando el tiempo de incubación, puede realizarse tomando

muestras de un cultivo inducido de 10ml, en intervalos de 0, 3, 5, y 6 horas; además, dos

muestras deben ser inducidas durante toda la noche, una con OD600 de 0.6 y otra de 0.2. Para

este ensayo la concentración de IPTG debe ser de 1.0mM y 37ºC en la incubación.

La expresión de la Taq polimerasa se evalúo en un gel de poliacrilamida SDS-Page 10%, las

muestras son preparadas con el buffer de carga 1x SDS y corridas aplicando un voltaje de 100V,

la tinción se realiza con Coomassie Brilliant Blue, y sobre ellos puede medirse la expresión de

forma cualitativa con el equipo de The Discovery Series of BIORAD por densitometría de las

bandas correspondientes a la Taq polimerasa.

Evaluación del clon recombinante

Con el fin de observar la expresión de la Taq polimerasa en otra cepa de E. coli, se realiza una

extracción del ADN plasmídico de las JM109 por el método de lisis alcalina y posteriormente se

utilizan en la transformación de BL21 (de invitrogen) por choque térmico. La expresión se realiza

bajo las condiciones óptimas preestablecidas para las JM109 para observar las diferencias entre

ellas.

Expresión y Purificación de la Taq polimerasa

La expresión de la Taq polimerasa se llevo acabo empleando las condiciones óptimas

previamente determinadas y para la purificación se empleo el procedimiento Standard del artículo

(9), el cual se realiza como se detalla a continuación. Se emplean 250ml de medio LB

suplementado con ampicilina, para ser inoculado con 1ml de medio saturado de las células. Una

vez hayan alcanzado una densidad óptica (OD600) entre 0.5 y 0.6 se adiciona IPTG hasta una

concentración final de 1.0mM. El cultivo debe ser incubado a 37°C con aireación durante toda la

noche (~ 16h). Las células son recogidas por centrifugación a 8000rpm por 10min, y lavadas con

40ml de buffer A (50mM Tris-HCl, pH 7.9, 50mM de glucosa y 1mM de EDTA), las células son

nuevamente colectadas por centrifugación a 8000rpm por 10min, el pellet puede ser mantenido a -

20°C hasta que sea usado. Se emplean 20ml del buffer A en la resuspensión del pelllet, y se

adiciona lisozima en una proporción de 4mg/g de células, la solución es incubada a 37°C por

30min. En este punto, debe observarse un aumento en la viscosidad del cultivo, y apariencia de

agregado. Luego, se adiciona un volumen igual de buffer B(10mM Tris-HCl, pH 7.9, 50mM de KCl,

1mM de EDTA, 1mM fenilmetilsulfonil fluoride(PMSF), 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P40), y la

mezcla es incubada en un baño de agua a 75°C por 1 hora. El lisado celular es centrifugado por

15min a 8000rpm para separar la fracción insoluble. El sobrenadante transparente contiene la Taq

y debe mantenerse a 4°C durante su manipulación.

El extracto de proteína soluble es sometido a cromatografía de intercambio iónico empleando una

columna con 50ml de BioRex (para intercambio catiónico), esta es equilibrada con el buffer

C(20mM de HEPES, pH 7.9, 1mM de EDTA, 0.5mM PMSF, 0.5% Tween 20, 0.5% Triton X100,

50mM de KCl), aproximadamente con 6 volúmenes de la columna. El extracto conteniendo la Taq

es cargado en la columna manteniendo una velocidad de flujo de 0.5ml/min. Una vez que todo el

extracto haya pasado por la columna, esta debe ser lavada con 100ml del buffer C y

posteriormente eluir las proteínas, la Taq, con buffer C conteniendo 400mM de KCl. Las fracciones

colectadas deben medírseles la actividad y la densidad óptica para determinar la fracción que

contiene la Taq pura. La enzima es dializada por 12h contra dos cambio de 1l de buffer D (20mM

HEPES, pH 7.9, 100mM de KCl, 0.1mM de EDTA, 0.5mM de PMSF, 1mM de ditiotreitol, y 50% de

glicerol) y almacenada a -70°C. No hay la necesidad de adicionar gelatina al buffer de

almacenamiento, ya que la ADN polimerasa es lo suficientemente concentrada para almacenar

Evaluación de la actividad enzimática de la Taq

La Taq polimerasa es evaluada tanto en el extracto crudo como las muestras recogidas durante la

elusión, esto permite tener un seguimiento de la Taq durante la purificación. Se realizara un PCR

con el fin de comprobar la actividad, los primers usados para este análisis son: Calmodulina ( As

5’-cccgggccgtctaatttacctcc- 3’ y S 5’-ggatccggacgtagcagatggag-3’), ubiquitina ( As 5’-

ccttctggatggagtagt-3’ y S 5’-gagctcatgcagatcttcgtcaa-3’) y Nmnat Humana ( S 5’-

tggatccatgacagccctcata-3’ y As 5’- atgtcgacttagctgtagtggg-3’). La Taq purificada debe ser

comparada con una comercial (AmpliTaq gold de Biosystem) con el fin de determinar la

concentración óptima para ser usada en cualquier ensayo de PCR. Esta optimización debe

realizarse igualmente realizando un PCR utilizando como Primers los ya antes mencionados y

cuantificando el ADN amplificado midiendo la absorbancia a 260nm y siguiendo la relación de

1A260 Unidad de dsDNA = 50µg/ml de H2O. Para visualizar el ADN amplificado se usan geles de

agarosa al 1.5%, y tinción con bromuro de etidio al 10%

Fig 2. Programa térmico estándar usado para la amplificación por PCR.

Resultados y Discusión

Determinación de las condiciones óptimas de expresión

El tiempo de expresión más adecuado para la inducción es conseguido cuando la incubación es

mantenida durante toda la noche (~ 16h) ya que se observa un mayor aumento en la expresión de

la Taq polimerasa en tal punto (fig 3).

APW 0h 3h 6h Tn1 Tn2

B

0

500

1000

1500

2000

2500

D Cursor 943 1515 1927 2062 1425

0h 3h 6h Tn1 Tn2

Fig 3. Determinación del tiempo optimo de inducción. A Gel de poliacrilamida, recuadro rojo corresponden a las bandas

de la Taq a diferentes horas de inducción. B Diagrama de cajas para la densidad de cursor(Eje y) de las bandas

correspondientes a la Taq para diferentes horas de incubación (Eje x). 1.0mM de IPTG y 37°C, Tn1 es partiendo de la

inducción en un OD600 de 0.6, Tn2 de un OD600 de 0.2.

95kDa

Para las densidades ópticas de 0.2 y 0.6 puede verse que la expresión es mayor para el segundo

caso, ya que a OD inferiores a 0.6 la expresión entraría en competencia con el estado de

replicación o de crecimiento celular (la fase logarítmica) el cual es proceso que requiere de un

gran esfuerzo de la célula, dando por lo tanto una menor expresión. Para el segundo OD (que

equivale aproximadamente a 1*107celulas/ml) se tiene una optima expresión por estar cerca de la

saturación (2*109celulas/ml) del medio de cultivo (11), en este punto las células gastan mas

energía en la expresión que en la replicación. Un cultivo saturado empieza a carecer de los

nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias, por lo cual ellas se concentran más en

mantenerse en un estado de menor gasto energético.

La temperatura óptima de expresión se encuentra entre 30 y 37ºC como puede observarse en la

fig 4, donde los valores de la densidad de cursor tienen un máximo en dichos puntos, las bandas

enmarcadas en el recuadro rojo corresponden a la Taq a las diferentes temperaturas de inducción.

La expresión a 24 y 40°C es menor debido a que la E. coli (10) en ambas temperaturas no puede

desarrollar de manera rápida sus procesos metabólicos, o que no son las condiciones optimas

para las proteínas o enzimas envueltas en dichos procesos funcionen adecuadamente. Además,

la E. coli es un microorganismo que se encuentra generalmente en el intestino de mamíferos y

que se desarrolla de forma óptima a 36°C dentro de estos.

APW 30°C 37°C 40°C 24°C

B

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

D Cursor 1623 1603 1268 1036

30°C 37°C 40°C 24°C

Fig 4. Determinación de la temperatura optima de expresión. A Gel de poliacrilamida, recuadro rojo las bandas

pertenecientes a la Taq a diferentes temperaturas de inducción. B Diagrama de cajas para la densidad de cursor(Eje y)

de las bandas correspondientes a la Taq para diferentes temperaturas de incubación (Eje x). Condiciones constantes de

1mM de IPTG y 5h de inducción.

95kDa

La concentración más adecuada del inductor IPTG para la expresión de la polimerasa es de

1.0mM, pero a concentraciones mas altas la expresión se tiene en un menor grado, como puede

verse en la Fig 5. Un factor determinante de la concentración del IPTG es el número de copias del

plásmido recombinante que tenga insertado la célula ya que estas determinan la cantidad de la

Taq expresada. Otro hecho importante, es que el IPTG no es metabolizado por la E. coli lo que

permite que este se encuentre siempre disponible dentro del parasito y produzca por lo tanto la

inhibición del represor lac, de esto, se podría esperar que el IPTG en diferentes concentraciones

en exceso produjeran una cantidad constate de la Taq, lo cual es algo que no observamos en la

fig 5, en el diagrama de cajas, donde a una mayor concentración del inductor se ve reducida la

expresión. Si el análisis abarcara un intervalo más amplio de concentraciones de IPTG, debería

esperarse que se presentase un comportamiento similar al de la Isoterma de Langmuir (12).

APW 0.5mM 1.0mM 2.5mM 5.0mM

B

1250

1300

1350

1400

1450

1500

1550

1600

1650

D Cursor 1547 1627 1558 1401

0,5mM 1,0mM 2,5mM 5,0mM

Fig 5. Concentración optima de inductor IPTG y condiciones constantes de 37°C y 5h de inducción. A Gel de

poliacrilamida, recuadro rojo las bandas de la Taq con diferentes concentraciones de IPTG. B Diagramas de caja para la

densidad de cursor (Eje y) de las bandas correspondientes a la Taq para diferentes concentraciones de IPTG (Eje x).

Evaluación de Actividad polimerasa de la Taq

La fig 6 corresponde al resultado de PCR usando fracciones de 1.5µl del lisado celular(pozos 2, 3

y 4), y la adición de 0.5µl de una Taq comercial (pozos 5, 6 y 7). Se uso como templet 100ng de

ADN genómico de Giardia lamblia y 0.5µM de primers de ubiquitina, calmodulina y Nmnat de

Giardia. La comprobación de la actividad del lisado celular tratado a altas temperaturas (70°C)

muestra que la Taq polimerasa conserva su actividad después de tal proceso, como se observa

95kDa

en la fig 6, esto es de esperarse debido a la termo estabilidad de la Taq. También aparecen otras

bandas que no están en el control positivo, estas pueden ser el resultado de contaminación con

ADN bacterial, lo cual permite la amplificación de los fragmentos que están por fuera de los

recuadros rojos. Este ADN no sufre daño por las altas temperaturas, en cambio la presencia de

DNasas posiblemente se ha visto reducida por efecto del calentamiento, por lo cual durante el

PCR este ADN sirvió como plantilla. Las bandas que si están presentes tanto en el control y el

extracto de la Taq para el caso de la Nmnat de Giardia son inespecificidades que se tienen por la

temperatura de anillaje. Los resultados obtenidos aquí permiten afirmar que la proteína esta en la

fracción soluble y es catalíticamente activa, es decir, no forma cuerpos de inclusión.

Fig 6. Producto de PCR utilizando el extracto de células lisas y desnaturalizadas conteniendo la Taq (pozos 2, 3 y 4) y

de una Taq comercial (pozos 5, 6 y 7). Se tomaron 1.5l del extracto, y 0.5l de la comercial. El pozo 1 corresponde al

marcador de peso molecular, el 2 y 5 a Ubiquitina (200bp), 3 y 6 a calmodulina(569bp), y 4 y 7 a Nmnat Giardia(750bp).

Evaluación del clon recombinante

La extracción del vector pTTQ18 de las células de E. coli JM109 por lisis alcalina dio como

resultado 100μl de ADN plasmídico a una concentración de 863.75ng/μl. La transformación de las

células de E. coli BL21 puede verse en la fig 7, donde existe una alta eficiencia en la transfección

con el vector, ya que hay un gran número de colonias que crecieron sobre el medio de cultivo. Los

niveles de expresión, Fig 8, muestran que la Taq polimerasa no se expresa de forma notable ya

que no existe una gran diferencia con la expresión de las proteínas constitutivas, igualmente esto

lo observamos en el caso de la E. coli JM109. Que la expresión Taq polimerasa sea similar entre

las células de E. coli BL21 y las de E. coli JM109 es debido a que el numero de replicas del

plásmido que fue insertado en las células estarían siendo similares, esto es de esperarse ya que

ambas cepas de E. coli fueron transfectadas por el mismo método (choque térmico).

Fig 7. Eficiencia en la transformación de E. coli BL21 con el vector pTTQ18 codificante de la Taq polimerasa. Medio LB

sólido suplementado con ampicilina en el cual fueron extendidas 50μl de células transformadas por choque térmico.

APW 1 2 3

B

0

50

100

150

200

250

300

D. cursor 206 248 223

Sin Induccion Induccion 1 Induccion 2

Fig 8. Expresión de la Taq polimerasa en E. coli BL21. El pozo 1 son las células sin inducir. El pozo 2 y 3 son las células

inducidas, pertenecientes a dos conjuntos diferentes de colonias transformadas. La inducción se realizo con 1mM de

IPTG, 37ºC y 5 horas de incubación.

Purificación de la Taq polimerasa

Una vez que se confirmo la presencia de la proteína activa en la fracción soluble se procedió a

realizar la purificación de la enzima en una escala mayor. Las células fueron recolectadas por

centrifugación de los 250ml de medio con los clones de E. coli, después de haber inducido durante

95kDa

toda la noche (∼16h) con 1mM de IPTG e incubación a 37°C. Las células recolectadas

presentaron un peso de 1.4972g. Ellas fueron lisadas, tratadas por calentamiento y purificadas por

cromatografía de intercambio iónico como se describe en la metodología. Durante la elución se

recogieron fracciones de 4ml de solución, en la fig 9 puede observarse el perfil de elución de las

primeras 32 fracciones. De la fig 9, igualmente puede verse que la absorbancia es relativamente

baja, esto es de esperarse debido a las concentraciones tan bajas que se tienen de las proteínas,

cumpliendo con la Ley de Beer.

Perfil de Elución

-0,03

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 5 10 15 20 25 30 35

Fracción

Abso

rban

cia

Fig 9. Perfil de Elución del Extracto de Taq polimerasa, la enzima es eluida de la columna BioRex 70 usando como

eluyente el buffer C conteniendo 400mM de KCl. La absorbancia (eje y) es medida a 280nm y las fracciones (eje x)

tienen 4ml de elución cada una.

Paralelo al perfil de elución se realizaron PCRs para ubicar la Taq aprovechando su actividad

polimerasa. La fig 10 muestra los dos geles correspondientes a la ubicación de la Taq dentro de

las fracciones de elución. De estos resultados se encuentro que la Taq estaba presente en la

fracción 3 y 4 de la elución.

A diferencia del resultado obtenido cuando se evalúo la actividad al extracto tratado con calor,

puede notarse que en estos geles no hay inespecificidades que se hayan amplificado, lo que

quiere decir que las fracciones que contienen a la Taq polimerasa están libres de la impureza que

se tenia con el ADN genómico de la E. coli. Otro hecho importante, es que puede observarse que

en la fracción 5 (fig 10, F5) existe la formación de dímeros, los cuales son un producto secundario

del PCR cuando existe complementariedad entre los primers y la temperatura de anillaje no es la

más óptima. Esta fracción se incluyo ya que los dímeros también son el producto de la

amplificación de la Taq; además, este hecho puede verse medianamente corroborado en la curva

de elución, donde las fracciones 3, 4 y 5 forman un pequeño pico de absorbancia, correspondiente

a la Taq polimerasa.

Fig 10. Ensayo de actividad de la Taq polimerasa para determinar su ubicación en las fracciones de elución. Se utilizo

ADN genómico de Giardia como templet y se amplifico un fragmento de calmodulina. El gel superior es un conjunto de

mezclas de fracciones, donde cada pozo es la mezcla de 10fracciones consecutivas. El gel inferior, es el análisis de las

fracciones que componen la mezcla de fracciones que dan actividad en el gel superior. El recuadro rojo es donde

debería observarse la banda de la calmodulina, las bandas de calmodulina por fuera de este recuadro son del control

positivo usando una Taq comercial.

En la fig 11 se presenta el resultado de la purificación de la Taq polimerasa, pasando del extracto

crudo (pozo 1, fig 11) a la Taq purificada (pozo 4, fig 11). No se incluyen las demás fracciones de

elución ya que las proteínas en ellas se encuentran muy diluidas y no pueden observarse en el gel

de poliacrilamida. Para que la Taq polimerasa pudiera verse en este gel después de la elución, se

realizo una reconcentración de la enzima (de 10 a 1) por precipitación con acido tricloroacético y

lavados del pellet con acetona. En el carril 4 es de notar que existe una alta pureza de la enzima

ya que es la única banda predominante, aun así haya sido reconcentrada; en el carril 3 donde se

tiene el extracto no retenido se presenta un gran número de proteínas, estas al no ser retenidas

hace suponer que presentan una carga neta negativa, ya que la resina es de intercambio catiónico.

Igualmente, tendremos que el ADN genómico de la E. coli tampoco seria retenido ya que la doble

hélice tiene carga negativa por los grupos fosfatos ubicados hacia la parte externa de la hebra.

La Taq polimerasa una vez purificada se cuantifico por Bradford, siendo la concentración de

proteína disuelta en el buffer de almacenamiento de 0.876mg/ml. La cantidad de Taq polimerasa

extraída corresponde a 21.02mg en los 1.4972 gramos de células inducidas, esto equivale al 1.4%

de la masa total de las proteínas en las células. En procesos similares que envuelven la

transformación e inducción de E. coli recombinantes, se ha logrado obtener proteínas foráneas

hasta en un 30% de la masa total, pero como ya antes se había mencionado, esto depende del

F1 F2 F3 F4 F5 F6

número de copias del plásmido que hayan sido insertados dentro de la célula. Este número de

copias depende del método que se haya utilizado para la transfección. Para determinar la

actividad de la enzima se comparo la actividad con una Taq polimerasa comercial, y se encontró

que la Taq comercial producía 17.59μg de ADN de calmodulina y la Taq purificada producía

36.11μg, aproximadamente el doble, que esto en unidades enzimáticas equivale a 5U/µl de la

comercial y 10.26U/µl de la extraída, lo cual hace relación a la calidad de la enzima producida.

PW 1 2 3 4

Fig 11. Evaluación global de la purificación de la Taq polimerasa. El pozo 1 corresponde a un pellet de células inducidas

y mezcladas con el buffer de carga 1x SDS, el pozo 2 es el lisado celular desnaturalizado por calentamiento, el pozo 3

corresponde a la muestra no retenida en la columna y el pozo 4 corresponde a la Taq purificada en la columna.

El proceso de optimización de la expresión y purificación llevado a cabo en este estudio permitió

obtener una Taq polimerasa de buena calidad y en buena cantidad para su uso en biología

molecular. Además, esto solo pudo ser posible gracias a las técnicas de recombinación, las cuales

son de gran importancia ya que facilitan la síntesis a una gran escala y a bajo costo de proteínas

que pueden ser útiles en la investigación.

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