ff ĐẠi hỌc huẾ trần thị Ái luyến nghiÊn cỨu …...sơ đồ biểu diễn các...
TRANSCRIPT
FF ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
Trần Thị Ái Luyến
NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH
CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ
Lactobacillus fermentum
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HUẾ - NĂM 2019
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
Trần Thị Ái Luyến
NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH
CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ
Lactobacillus fermentum
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9440114
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy
HUẾ - NĂM 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa
học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích
trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo
đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do
tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách
quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết
quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu
nào khác.
Nghiên cứu sinh
Trần Thị Ái Luyến
ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt
BMM basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản
C Carbon Cacbon
CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL
COSY Correlated Spectroscopy
DMSO Dimethyl sulfoxide
DPPH 1, 1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl
EPS Exopolysaccharide
EPS-TC13 Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC13
EPS-TC16 Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC16
EPS-TC21 Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC21
EPS-MC3 Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum MC3
EtOH Ethanol Cồn etylic
FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ
Fruc Fructose
FTF fructosyltransferase
HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp
HMBC Heteronuclear multiple - Bond
Correlation
HoPS homopolysaccharide Polysaccharide thuần
HPLC High-performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HSQC Heteronuclear Spectroscopy-
Quantum Coherence
Gal galactose
GalNAc N-acetyl-D-galactosamine
GalT galactose 1-phosphate-
uridyltransferase
GC-MS Gas Chromatrography Mass
Spectometry
Sắc ký khí ghép khối phổ
GDP guanosine diphosphate
Glc glucose
Glc-1-P glucose-6-phosphate
Glc-6-P glucose-1-phosphate
GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
iii
GlcA glucuronic acid
GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn
GTF glycosyltransferase
La. Lactococcus
LAB Lactic Acid bacteria Vi khuẩn lactic
Lac Lactose
Lb. Lactobacillus
Leu. Leuconostoc
Man-6-P Mannose-6-Phosphate
Man-1-P Mannose-1-Phosphate
MeOH Methanol
MRS Man Rogosa Sharpe
MTTH Môi trường thích hợp
N Nitrogen Nitơ
NDP diphosphate nucleoside
NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
NOESY Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy
P. Pediococcus
PEP-PTS phosphoenolpyruvate-
phosphotransferase
PGM phosphoglucomutase
PMM phosphomannomutase
PS Polysaccharide
Rha Rhamnose
S. Streptococcus
Suc Sucrose
TCA trichloroacetic acid
TDP tyrosine diphosphate
TFA Trifluoroacetic acid
TGP TDP-glucose
pyrophosphorylase
TMS Tetramethylsilan
UDP Uridine diphosphate
WPC whey protein concentration
iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIÊU ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về polysaccharide ........................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide .......................................................... 3
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ................................................................... 4
1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ........................................................... 5
1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ........................................ 6
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................. 6
1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa .......................................... 6
1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng ........................................................... 14
1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB .................................... 20
1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS ....................................................... 20
1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS .................................................. 23
1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc ..
........................................................................................................................... 24
1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................ 34
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 37
3.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 37
3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ....................................................................... 37
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................... 37
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 37
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 38
2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật
độ quang (OD)................................................................................................... 38
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................ 38
2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................ 39
2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận
EPS từ một số chủng Lb. fermentum ................................................................ 40
2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] ........ 43
2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........ 44
v
2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm ................................................................................................. 45
2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS
........................................................................................................................... 47
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 50
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................................... 52
3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb.
fermentum .............................................................................................................. 52
3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao .
........................................................................................................................... 52
3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh
tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ................................... 54
3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của
các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 ........................................ 66
3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................ 82
3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước .................................................................. 89
3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu .................................................. 91
3.2.3. Khả năng chống oxy hóa ......................................................................... 95
3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các
EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 ........................................................... 99
3.3.1. Khối lượng phân tử ................................................................................. 99
3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 ..................................................... 103
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 128
1. Kết luận ........................................................................................................... 128
2. Kiến nghị ......................................................................................................... 130
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
................................................................................................................................................. 131
TÀI LIÊU THAM KHẢO ................................................................................................. 133
PHỤ LỤC
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các
loài Lactobacillus đã được công bố .......................................................................... 22
Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng ................... 27
Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã
được công bố ............................................................................................................. 29
Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp
từ LAB đã được công bố ........................................................................................... 35
Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS .......... 50
Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong
luận án ....................................................................................................................... 81
Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb.
fermentum trong luận án ............................................................................................ 89
Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum ................. 90
Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................ 92
Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum ......................... 93
Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.
fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) .................................................................... 96
Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb.
fermentum MC3 ...................................................................................................... 103
Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng
hợp bởi Lb. fermentum MC3 ................................................................................... 103
Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết
glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3................... 110
Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong
DMSO ..................................................................................................................... 118
Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC
................................................................................................................................. 119
Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã
công bố và của EPS-MC3 của luận án .................................................................... 123
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose
(b) của fructose ............................................................................................................ 3
Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum .......................................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS .............. 7
Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan .............................. 7
Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB ..... 9
Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............ 10
Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ........................... 11
Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-
glactose ...................................................................................................................... 12
Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB
................................................................................................................................... 14
Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB .... 15
Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ........................................................... 38
Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS ..................................................................... 39
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS ................... 40
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng
trong công nghệ thực phẩm ....................................................................................... 45
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside
................................................................................................................................... 48
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS ........................................ 49
Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic .............. 53
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi
trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ................. 55
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến
khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ............................................. 61
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp
EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................ 66
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng
Lb. fermentum ........................................................................................................... 69
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các
chủng Lb. fermentum ................................................................................................. 72
viii
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các
chủng Lb. fermentum ................................................................................................. 77
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 ............................................. 83
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 ............................................. 83
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 ............................................. 83
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 .............................................. 84
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS
................................................................................................................................... 87
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS ....... 88
Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký
thẩm thấu gel ........................................................................................................... 100
Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR ................................................... 111
Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ............................................................... 112
Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 .............................................................. 113
Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 ....................................................... 116
Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ............................................................... 117
Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 ............................................................. 118
Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................ 119
Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một
phần ......................................................................................................................... 120
1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong
nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận
exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các
polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS
tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy,
nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng
như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel,
... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả
năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng
được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …
Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học
nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây
là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ
vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB
được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc
cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để
sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng
LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc
cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó,
nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con
người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so
với EPS từ các loài khác.
Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết
trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp
bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và
thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],….
Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên
quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình
2
lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những
ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng
trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc
biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS
sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus
fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát
cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus
fermentum”.
Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:
1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất;
2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;
3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một
số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên
cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng
hợp hóa học.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIÊU
1.1. Tổng quan về polysaccharide
1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide
Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường
được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là
nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực
vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh
vật),... [29].
Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside.
Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên
chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide
hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là
heteropolysaccharide hoặc heteroglycan.
Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy,
hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon
dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn
vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên
thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng
α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có
thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh
(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình
1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật.
(b) (a)
a) b)
Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose
(b) của fructose [29]
4
Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học
và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể
được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó,
các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì
chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học
với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học,
tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể
kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS)
của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan,
schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan
thương mại từ nấm men bia [67].
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide
Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần
giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm,
dược phẩm, mỹ phẩm,…
Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia
được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc
thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt,
từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước
trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67].
Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang
đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm
và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối
thuốc tinh vi [67], [114].
Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,
tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công
cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử
dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố
định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất
5
chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối
phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography (HPLC)) [67], [114].
Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo
gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất
PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong
nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp
các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng
tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS.
1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi
Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên
men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng
phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc),
fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển,
chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …),
các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể
tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn
lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi
bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi
được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp
xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không
di động [143].
a) b)
Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143]
6
Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên
men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các
loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là
acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc
biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại
lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong
thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng
probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132].
Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý
Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận
là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung
đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật
ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên
và an toàn.
Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm
PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều
hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB
thuộc loài Lb. fermentum.
1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic
1.3.1. Khái niệm
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều
loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào
hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại
bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng
bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường
như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân
nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của
chúng [87].
1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa
7
Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các
EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và
các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi
các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào.
Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme
[69], [90].
- Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS)
HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như D-
glc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.),
Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS.
a)
b)
Màng plasmid
Phần ngoại bào
Tế bào chất
Chất
xúc tác
Tín hiệu
xuất
Glc Fruc
Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13]
Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]
8
Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các
enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase
(FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ
tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên
kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc
fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59].
Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS.
Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất
mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên
các PS [27].
Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh,
độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy
vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc
mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5)
[13], [92], [106].
Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các
monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các
liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28].
9
HoPS
105 – 106 Da
Fructan: liên kết β
- Lb. panis
- Lb. pontis
- Lb. frumenti
Glucan
Các liên kết α Các liên kết β
- Lb. suebicus
- Lb. G77
Mutan α-(1,3)
- Lb. reuteri ML1
Dextran α-(1,6)
- Lb. fermentum
- Lb. sakei
- Lb. parabuchneri
- Lb. hilgardii
Reuteran α-(1,4)
- Lb. reuteri 121
- Lb. reuteri ATCC
55730
Fructosyltransferase Glucansucrase
Inulin: liên kết β-
(1,2)
Mạch thẳng hoặc
phân nhánh
- Lb. reuteri
Levan: liên kết β-(2,6)
Mạch thẳng
- Lb. reuteri 121
- Lb. sanfranciscensis
Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]
10
- Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS)
Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ
monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm
cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6).
Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis,
La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa
nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S.
thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27]
[29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một
chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường
trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và
(c) quá trình tổng hợp PS [59], [66].
(1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a)
Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và
disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu
hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp
lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một
hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình
vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS)
của LAB [98].
(2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển
hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai
đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường.
Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]
11
Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]
12
- Sự tổng hợp glucose-1-phosphate
Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là
chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp
EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường. Trước hết, dưới tác dụng của
hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dưới tác dụng của
phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P.
- Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường:
Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như
Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP-
glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose
pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP).
Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm
Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng
của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa
từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase. Bên cạnh đó, Glc-1P
cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc
tác của enzyme phosphomannomutase (PMM). Từ Man-6P tiếp tục hình thành các
TDP-glucose UDP-glucose
TDP-rhamnose UDP-galactose
Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-
glactose [27]
13
hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự
xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP-
mannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P
thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase.
Man-6P được hình thành từ fruc-6P nhờ sự xúc tác của enzyme
phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose.
Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai
trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS. Chúng chính là tiền thân của các đơn
vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn.
Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của
quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí. Pyruvate này theo
chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng
cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào.
(3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c). Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi
lặp lại monosaccharide. Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDP-
glc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi
lặp lại trong phân tử HePS. Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế
bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng
periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài.
Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên
các tiền chất đã được kích hoạt. Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu
là các loại NDP [42]. Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và
các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của
chúng [27], [59].
Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các
dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh. Nhìn chung, sự phân
nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là
do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc
ba monosaccharide). Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với
các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể
14
là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose). Trong đó, D-galactose (Gal)
có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose. D-Glc chỉ có ở
dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29].
Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các
monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh
nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn
vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn
có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29]. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể
hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông
qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18].
1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng
HePS
Khối lượng phân tử:
từ 1x104 – 6x106 Da - Phân nhánh liên kết
α, β nhánh (ở vị trí
C2, C3, C4, C6)
- Không phân nhánh
Gồm 3 – 8 phân tử
monosaccharide cấu
tạo thành
Các monosaccharide
dạng: pyranose hoặc
furanose
Được tổng hợp từ các
loài Lactobacillus ưa
nhiệt và ưa ẩm
Các monosaccharide chủ yếu gồm:
- D-Glucose
- D-Galactose
- L-Rhamnose
Ngoài ra:
+ Mannose, fructose, glucuronic acid
+ Phosphate, glucosamine, dạng acetyl,
galactosamine
Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ
LAB [13]
15
Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã
tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn
vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87]. Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên
quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng
của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh
dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát
triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng
về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27].
1.3.3.1. Chức năng liên quan đến sức khỏe
Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp
nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trong phạm vi tổng quan của luận
án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB
được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống
ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm
cholesterol (Hình 1.10) [106], [107].
- EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic
Ruột Prebiotic và
probiotic
Hoạt động chống
khối u (ung thư)
Tham gia hệ
miễn dịch
- Kích thích hoạt động của đại thực bào
- Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết
- Sản sinh tế bào
Chống viêm, loét
dạ dày
Làm giảm cholesterol
trong máu
Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]
16
Prebiotic được biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không
tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột. Chúng thường là các
oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; được
chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để
chống lại những mầm bệnh [13]. EPS là hợp chất PS. Vì vậy sự có mặt của EPS trong
đường ruột có vai trò như là prebiotic. Bên cạnh tính năng prebiotic, nhiều chủng vi
khuẩn thuộc LAB cũng đã được nghiên cứu và công bố về tiềm năng probiotic của
chúng bao gồm Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei,
Lb. reuteri, Lb. rhamnosus, Lb. parasei, Lb. fermentum và Lb. helveticus. Đây cũng
chính là nguồn sinh tổng hợp nên các EPS [13], [90].
Như vậy, khi sử dụng các chủng LAB trong các sản phẩm lên men lactic, một
mặt chúng sinh ra EPS để làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, mặt khác chúng
cũng góp phần tạo nên tính probiotic cho sản phẩm. Bên cạnh đó, sự có mặt của các
EPS này còn mang lại tính năng prebiotic giúp hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa [131].
- Chống viêm, loét dạ dày và tác động làm giảm cholesterol
Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ
các chủng S. thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS
đã được công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh tổng
hợp EPS [105]. Tương tự, khả năng chống loét nhất định của EPS được sinh tổng hợp
từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacilli, và Streptococcus cũng được công bố bởi
Nagaoka và cộng sự (1994) [84]; EPS tổng hợp từ Lb. rhamnosus GG có tác dụng
chống lại các yếu tố miễn dịch bẩm sinh trong ruột [70].
Sự hấp thụ cholesterol của các PS đã được ghi nhận trong điều kiện in vitro bởi
nhiều nhóm nghiên cứu độc lập khác nhau như Soh và cộng sự (2003) [113]; Tok và
Aslim (2010) [117]…
- Hoạt tính chống ung thư (kháng u), kích thích hệ miễn dịch
Một số LAB và các hợp chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của chúng được
chứng minh là có tác động làm tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng sản sinh
tế bào T (là tế bào trung gian của miễn dịch tế bào) và hoạt động tiêu diệt khối u [24],
[50]. Tác động điều hòa hệ miễn dịch của các phân đoạn EPS gồm EPS trung tính và
17
EPS acid (APS) sinh tổng hợp bởi La. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 lên
chuột đã được Makino và cộng sự (2006) nghiên cứu [78]. Oda và cộng sự (1983) đã
kết luận rằng EPS sinh tổng hợp bởi Lb. helveticus ssp. jugurti có khả năng chống
ung thư khi thực hiện thử nghiệm trên chuột bằng cách tiêm các chế phẩm EPS vào
màng bụng của chuột đã xuất hiện tế bào ung thư. Kết quả cho thấy, tuổi thọ của loài
chuột này đã được tăng lên 144% khi tiêm 20 mg EPS/kg trong chín ngày liên tiếp.
Khi tăng liều lượng EPS tiêm tương ứng với 40 hoặc 80 mg EPS/kg, tuổi thọ của
chuột đã tăng lên hơn 233% [88]. Tương tự, kết quả nghiên cứu của Kitazawa và
cộng sự (1992) đã cho thấy rằng chất nhờn được tổng hợp từ La. Lactis ssp. cremoris
KVS20 có hoạt tính chống ung thư [64].
Như vậy, thông qua một số nghiên cứu trên động vật và trong thử nghiệm in
vitro đã gợi ý về tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường
xuyên các EPS sinh tổng hợp từ LAB. Những nghiên cứu này đã cho thấy EPS xứng
đáng là mục tiêu nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng nhằm phục vụ về sức khỏe của
con người cũng như các ứng dụng liên quan như về y tế, mỹ phẩm và dược phẩm,…
Đồng thời, các EPS từ LAB có thể mở ra một hướng mới cho việc phát triển các sản
phẩm thực phẩm chức năng góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ các thực phẩm với
những đặc tính tự nhiên do chính các vi khuẩn này mang lại.
1.3.3.2. Tính chất chức năng công nghệ của EPS trong thực phẩm
Các polyme từ thực vật, động vật là những thành phần không thể thiếu trong
một số loại thực phẩm. Từ lâu, chúng đã được sử dụng như là những thành phần giúp
hoàn thiện kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm như sự tạo gel, sự ổn định, sự nhũ
tương hóa, ngăn ngừa sự kết tinh. So với các PS phân lập từ nguồn thực vật (như
carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), các PS từ vi sinh vật có lợi thế
hơn với quy trình kiểm soát tốt, được sản xuất với một quy mô lớn trong một không
gian và thời gian tương đối hạn chế, các đặc tính hóa học thu được ổn định và đặc
biệt là đáp ứng được những yêu cầu về tính an toàn của thị trường. Việc định hướng
sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng
trực tiếp LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho quá trình sản
xuất sản phẩm thực phẩm lên men được coi là an toàn, thành phẩm thu được là tự
18
nhiên [90]. Bên cạnh đó, các EPS cũng có những tác động quan trọng đến sự phát
triển của các sản phẩm thực phẩm mới (cả về thực phẩm lên men và không lên men),
trong đó phải kể đến các sản phẩm thực phẩm cần được tăng cường các đặc tính lưu
biến, cải thiện kết cấu và sự ổn định cũng như khả năng giữ nước [29]. Đây là những
vấn đề cần giải quyết trong cấu trúc của thực phẩm và EPS từ LAB có thể giải quyết
được các vấn đề này.
- EPS là tác nhân tạo kết cấu
Các EPS được sử dụng trong thực phẩm với chức năng chính là tác nhân làm
đặc sinh học tạo nên sự ổn định và hạn chế hiện tượng tách nước của các thành phẩm
trong thực phẩm lỏng phổ biến nhất là sữa chua. Khả năng này của EPS có được là
nhờ sự tương tác của chúng với protein, các ion và những thành phần khác trong sản
phẩm do đó giúp làm giảm hiện tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ
đó giúp thực phẩm có tính đồng nhất cao và tăng giá trị cảm quan. Bên cạnh đó, các
EPS từ một số chủng LAB cũng được kết luận là góp phần cải thiện kết cấu của bột
nhào trong quá trình chế biến các loại bánh sản xuất từ bột mì [16], [90]. Chính vì
vậy, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu một số tính chất hóa lý của
EPS có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm.
- EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến của các sản phẩm lên men [13].
Độ đàn hồi và độ nhớt là hai biến quan trọng trong tính chất lưu biến của thực
phẩm. Chúng có ảnh hưởng lớn đến các tính chất lý hóa của sản phẩm thực phẩm đặc
biệt là sản phẩm lên men. Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện các tính chất lưu biến
của sản phẩm là điều rất cần thiết. Trong các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi
động quá trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt là các loài Lactobacilli được
biết đến là có khả năng sinh tổng hợp EPS. Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp bởi
LAB là không cao, tuy nhiên chúng cũng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men
mà không cần bổ sung thêm các chất ổn định trong quá trình sản xuất [29].
Tác động hỗ trợ tích cực trong việc cải thiện kết cấu và giảm khả năng tách nước
của sản phẩm sữa chua tạo thành bởi các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB sử
dụng để lên men sữa đã được kết luận như EPS từ Lb. delbrueckii bulgaricus và S.
thermophilus [14]; EPS từ L. lactis subsp. cremoris LC330 [79]; EPS từ Lb
19
delbrueckii ssp. bulgaricus [60]. Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, các EPS được giải phóng ra bởi các loài Lactobacilli như Lb. delbrueckii
bulgaricus, Lb. helveticus và Lb. casei có tác dụng thúc đẩy khả năng giữ nước và cải
thiện kết cấu tổng thể của các loại pho mát khác nhau trong giai đoạn chín tới do đó
giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định hơn [13], [92], [144]. Coeuret và cộng sự
(2003) kết luận rằng, quá trình hình thành pho mát phụ thuộc vào sự liên hệ giữa các
chủng Lactobacilli với nhau cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của các EPS sinh
tổng hợp được [23].
Từ các công bố trên cho thấy rằng, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men trong chế biến thực
phẩm. Quá trình này được thực hiện trong điều kiện in situ. EPS được sử dụng theo
điều kiện này sẽ có tác động như là các tác nhân ổn định tự nhiên, có khả năng làm
đặc, tạo độ nhớt cao và giảm khả năng tách nước. Công nghệ này sẽ tạo ra những sản
phẩm bảo đảm tính an toàn thực phẩm cao do đó sẽ không cần sử dụng các chất phụ
gia tổng hợp từ bên ngoài vào.
1.3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa
Các gốc tự do như O.-, OH. và ROS được coi là các tác nhân oxy hóa mạnh,
chúng có thể phản ứng với tất cả các phân tử lớn trong tế bào dẫn đến gây ra các đột
biến và ung thư. Đặc tính chống oxy hóa của các PS từ thực vật, nấm đã được nghiên
cứu khá phổ biến và được sử dụng như các chất chống oxy hóa tự nhiên. Trong những
năm gần đây, EPS từ các vi khuẩn thuộc LAB đã nhận được nhiều sự quan tâm hơn
về tính chống oxy hóa. Các vi khuẩn có tiềm năng probiotic sinh tổng hợp EPS có thể
làm giảm ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau thông qua hoạt động quét các gốc tự
do và một phần của cơ chế đó có thể liên quan đến các EPS tổng hợp được.
Chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tổng hợp các PS ngoại bào (EPS) với
những tác động sinh lý khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp. Hoạt tính
sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏ các phản ứng
oxy hóa (ROS) - là dạng được hình thành trong ruột bởi các phản ứng trao đổi chất
khác nhau, chính vì vậy chúng đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính
chống oxy hóa của EPS từ chủng vi khuẩn này được so sánh với chất chống oxy hóa
20
là vitamin C. Kết quả cho thấy, EPS sinh từ chủng này có hoạt tính loại bỏ gốc tự do
và chống oxy hóa đáng kể [65]. Khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp
bởi hai chủng Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus
plantarum R315 (L-EPS) và cả sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá.
Kết quả cho thấy, cả B-EPS và L-EPS đều có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và
các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao. Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng
được ghi nhận. Với các khả năng này, cả hai EPS tổng hợp được đều có thể được sử
dụng trong công nghiệp thực phẩm như là các tác nhân chống oxy hóa tự nhiên [72].
Như vậy, bên cạnh khả năng chống ung thư, giảm cholesterol, chống viêm loét
dạ dày cùng các chức năng tạo cấu trúc, giúp hoàn thiện tính lưu biến đối với các sản
phẩm lên men từ sữa, các EPS từ LAB cũng được biết đến với khả năng chống oxy
hóa cao. Với các tính chất chức năng quan trọng này, EPS sinh tổng hợp từ LAB
xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn trong các ứng dụng công
nghiệp trọng yếu liên quan đến sức khỏe con người.
1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB
Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về EPS sinh tổng
hợp từ LAB được công bố [18], [22], [29]. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung
vào việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiện thu nhận EPS; một số đặc tính
lý hóa của EPS như khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu trúc cũng như một số
tính chất chức năng liên quan đến ứng dụng của chúng trong công nghiệp.
1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS
Mặc dù có vai trò quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi
khuẩn vẫn còn có nhược điểm là năng suất tạo thành thấp. Đây là lý do khiến khả năng
thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ LAB nói riêng còn khá hạn chế.
Một phương pháp hữu ích để quá trình sinh tổng hợp EPS đáp ứng về phương diện ứng
dụng trong thực phẩm nếu LAB có thể được lên men trong môi trường ăn được và an
toàn là cải thiện quá trình lên men sinh tổng hợp EPS [59]. Năng suất của EPS từ LAB
chịu tác động bởi các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH, thời gian lên men,…), các yếu tố hóa
21
học (nguồn C, N, tỉ lệ C/N,…) do đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng
quá trình hình thành các polyme sinh học này [19], [31], [66].
Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lượng và thành phần của các
EPS sinh tổng hợp bởi Lb. delbruckii. subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong các môi
trường chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau [55]. Trong khi đó, công bố của
Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S. thermophilis
không có sự thay đổi khi chủng này được nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác
nhau [32]. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của LAB cũng được tăng lên
khi bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) khác nhau. Việc
sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến những tác động tích cực trong việc tạo EPS có
thể liên quan đến tỷ lệ carbon /nitrogen (C / N) [83].
Bên cạnh những nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn C và N lên quá trình sinh tổng
hợp EPS của LAB, nhiều công bố liên quan đến sự tác động của nhiệt độ và pH lên
quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khác nhau cũng
được đề cập. Garcia-Garibay và Marshall (1991) đã kết luận rằng, sự tổng hợp EPS
bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tăng lên khi tăng nhiệt độ [48]. Ngược lại, quá
trình sinh tổng hợp EPS bởi chủng S. thermophilus BN1 đạt được ở 37oC là cao hơn
so với 42oC [99]. Đã có nhiều công bố về giá trị pH thích hợp cho quá trình sinh tổng
hợp EPS từ các chủng LAB khác nhau là không giống nhau, tuy nhiên đa phần quá
trình sinh tổng hợp EPS của các chủng này đều xảy ra tốt hơn ở khoảng pH gần 6,0
[44], [51], [140], [141].
Trong những năm gần đây, số lượng các nghiên cứu về điều kiện lên men sinh
tổng hợp EPS có xu hướng tăng. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung cải thiện sản lượng
EPS sinh tổng hợp từ LAB và tối ưu hóa các điều kiện lên men tương ứng với các
nguồn vi khuẩn từ LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS cao [44], [52], [124], [136],
[139],…. Đây cũng được coi là cơ sở quan trọng để làm nền tảng cho việc sử dụng
chúng một cách rộng rãi vào các mục đích công nghiệp khác nhau [115]. Các thông
tin về kết quả nghiên cứu cụ thể liên quan đến sự tác động của các yếu tố như thành
phần môi trường và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ loài thuộc
chi Lactobacillus thuộc LAB được tóm tắt ở Bảng 1.1.
22
Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ
các loài Lactobacillus đã được công bố
STT
Chủng
vi khuẩn
thuộc chi
Lactobacillus
(Lb.)
Thành
phần môi
trường
Nhiệt
độ và
pH của
môi
trường
Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Hàm
lượng
EPS
(µg/ml)
Tác giả (năm)
[TLTK]
1 helveticus
ATCC 15807
MRS có bổ
sung
đường
lactose
pH=4,5 30 280
Torino và cộng
sự (2005)
[118]
2 fermentum
TDS030603
MRS có
chứa
frucose 1%
30oC,
pH=6,5 72 97,1
Fukuda và
cộng sự (2010)
[44]
3 johnsonii 142 MRS 37oC
48
Gorska và
cộng sự (2010)
[52]
4 plantarum
KF5
MRS bổ
sung whey
30oC,
pH=6,3 30 95,58
Wang và cộng
sự (2010)
[130]
5 fermentum F6
MRS bổ
sung 10%
sữa gầy,
2% glucose
370C
pH=6,5 32 44,49
Zhang và cộng
sự (2011)
[141]
6 fermentum
CFR 2195 MRS
370C,
pH=6,7 24 28820
Yadav và cộng
sự (2011)
[136]
7 confusus
TISTR 1498
nước dừa,
20 g/L
sucrose, 5
g/L pepton,
2,5 g/L cao
thịt, 2,5
g/L cao
nấm
350C,
pH=5,5 24 38200
Seesuriyachan
và cộng sự
(2011)
[111]
8 rhamnosus
KL37B MRS
37oC
48
Gorska và
cộng sự (2011)
[54]
23
STT
Chủng
vi khuẩn
thuộc chi
Lactobacillus
(Lb.)
Thành
phần môi
trường
Nhiệt
độ và
pH của
môi
trường
Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Hàm
lượng
EPS
(µg/ml)
Tác giả (năm)
[TLTK]
9 johnsonii 151 MRS 37oC
48
Gorska và
cộng sự (2013)
[53]
10 plantarum
YW32 MRS
37oC,
pH=6,6 32
90
Wang và cộng
sự (2015)
[124]
11
delbrueckii
subsp.
bulgaricus
OLL1073R-1
MRS bổ
sung 10%
sữa gầy
37oC 18
Calsteren và
cộng sự (2015)
[17]
Từ kết quả tổng hợp ở Bảng 1.1 chúng tôi nhận thấy rằng, thành phần môi trường
và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các
chủng vi khuẩn thuộc LAB. Hàm lượng EPS tổng hợp từ LAB phụ thuộc vào thành
phần môi trường (nguồn C, N) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thời gian
nuôi cấy. Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB đều có khả năng phát triển và
sinh tổng hợp EPS trong những điều kiện khác nhau. Với sự đa dạng của các nguồn
cơ chất khác nhau được bổ sung thêm vào môi trường MRS thì tương ứng sẽ có sự
thay đổi tương ứng về các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian. Bên cạnh
đó, các chủng vi khuẩn có thể giống nhau về loài nhưng được phân lập từ các nguồn
khác nhau thì quá trình thu nhận EPS cũng được thực hiện với các nguồn dinh dưỡng
và các điều kiện nuôi cấy không giống nhau. Như vậy, không có quy trình với những
chỉ số duy nhất về điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất thu nhận EPS cao.
1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS
Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trường lỏng thường
được thực hiện qua nhiều công đoạn:
(1) Loại bỏ protein, tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc. Việc sử dụng acid
tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trường lên men đã
24
được đề xuất bởi Garcia- Garibay và Marshall (1991) [48]. Phương pháp này có ưu
điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn
của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai
lần để thu nhận EPS được tốt nhất [19];
(2) Các polyme kết tủa từ dịch nổi được thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân
kết tủa. Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polyme là không
hòa tan (chẳng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone). Tỉ lệ dung môi
sử dụng có thể là một, hai hoặc ba so với dịch nuôi cấy;
(3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô (quy mô phòng thí nghiệm)
hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp). Đầu tiên, các EPS kết tủa được thu nhận bằng
cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nước cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại
đường còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trường. Các EPS này sau
đó được đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4 °C [66]. Các phương pháp tinh
chế EPS này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế việc lựa chọn quy
trình thu nhận thích hợp đặc biệt là các hóa chất cần dựa vào mối tương quan giữa
mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất
của nó [42]. Các thông số liên quan cụ thể áp dụng trong từng phương pháp tách chiết
và tinh chế EPS từ LAB đã được nhiều nhóm tác giả sử dụng để thu nhận nhằm nghiên
cứu về quá trình sinh tổng hợp, về các đặc điểm lý hóa và cấu trúc của EPS như Doco
và cộng sự (1990) [36], Harding và cộng sự (2005) [58], Yuksekdag và cộng sự
(2008) [138], Rabha và cộng sự (2011) [99], Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111].
1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc
Để xác định một cách đầy đủ về các đặc tính lý hóa của một PS cụ thể, việc xác
định các thông tin về khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu hình các monomer
và các dạng liên kết của các monome đó trong phân tử đó là điều rất cần thiết. Đây
được xem là yếu tố quan trọng để hiểu rõ hơn về hoạt tính của các polyme sinh học
trong các môi trường khác nhau [42], [68].
Về khối lượng phân tử trung bình
Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của PS thường chỉ thể hiện là giá
trị trung bình của khối lượng phân tử. Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử
25
dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như
phương pháp sắc ký trao đổi ion [21], sắc ký rây phân tử [91], phương pháp sắc ký
thẩm thấu gel [10], [32],… Nguyên tắc chung của các phương pháp là dựa vào thời
gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc xạ của nó. Những phương
pháp này cũng tạo điều kiện cho việc ước tính được ngay khối lượng phân tử của PS.
Về thành phần hóa học
Việc đánh giá thành phần hóa học của EPS liên quan đến việc xác định các phân
tử đường, sự lặp lại của chúng và các nhóm phức đi kèm (nhóm acyl, nhóm
phosphate,…). Sắc ký khí là phương pháp truyền thống đã được sử dụng để xác định
thành phần monosaccharide, trong đó bao gồm các quá trình methyl hóa của tất cả
các nhóm hydroxyl, sau đó là sự thủy phân PS thành các monosaccharide, tiếp đến
quá trình alditol và acetyl hóa để tạo thành dẫn xuất alditol acetate và phân tích bằng
GC-MS [58], [126].
Về cấu trúc hóa học
Sự kết hợp nhiều đơn vị monome, cùng với các dạng stereo cụ thể của liên kết
glycoside (α hoặc β- anome), dẫn đến các cấu trúc hóa học rất phức tạp bao gồm từ
sự tuyến tính của các HoPS đến sự phân nhánh cao của các HePS. Phương pháp phân
tích và xác định cấu trúc của các PS hoàn chỉnh đã được tóm tắt bởi Kamerling và
Gerwig (2007) [62]. Các mô hình liên kết của các monome được phân tích bởi quá
trình methyl hóa tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó thực hiện thủy phân PS thành
monosaccharide bằng acid (như TCA hoặc acid trifloroacetic (TFA)), tiếp đến là quá
trình khử, acetyl hóa và phân tích GC-MS. Kết quả của GC-MS không chỉ đưa ra
được thông tin về vị trí hình thành liên kết mà còn chỉ ra cấu hình hoặc các
monosaccharide trong chuỗi oligosaccharide [9]. Sự suy thoái Smith (Smith
degradation) cũng có thể được sử dụng để phân mảnh một cách có chọn lọc các PS.
Quá trình này dựa trên ba bước liên tiếp là: oxy hóa, tiếp theo là giảm đến một
polyalcohol với borohydride, và cuối cùng là thủy phân bằng acid yếu. Hơn nữa, việc
làm giảm khối lượng phân tử và độ phân nhánh và làm tăng khả năng hòa tan trong
dung môi của các chất cần phân tích có thể đạt được bằng cách thủy phân một phần
với acid không đặc hiệu, hoặc sử dụng các enzyme đặc hiệu cho các mối liên kết
26
glycoside khác nhau. Những phân đoạn có khối lượng phân tử thấp này sau đó có thể
được phân tích bằng một số kỹ thuật như GC-MS, MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization-Time of Flight - Mass Spectometry) và NMR [42].
Trong tất cả các phương pháp phân tích cấu trúc của các oligosaccharide, NMR là
phương pháp rất nhạy và có khả năng đưa ra những thông tin chi tiết về cấu trúc của
chất cần phân tích. Do đó, đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác
định về cấu hình anome của monosaccharide, loại liên kết, nhóm thế và cả những
thành phần có bản chất phi-carbohydrate mà cho đến nay chưa có một phương pháp
nào có thể so sánh được [9].
Phổ 1D-1H và 13C NMR thường được ghi lại ở nhiệt độ khoảng từ 70oC trở lên
với các PS hòa tan trong D2O hoặc trong DMSO. Độ chuyển dịch hóa học được biểu
diễn theo ppm với việc sử dụng acetone làm chất nội chuẩn ( của 1H là 2,225 và của
13C là 31,55) hoặc TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm). Trong phổ proton, vùng từ
trường thấp bao gồm các cộng hưởng từ của các nguyên tử anomer và các proton
khác trong cấu trúc dạng vòng ở vùng có từ trường cao [68]. Sự kết hợp các kết quả
từ phổ 1H và 13C – NMR cho phép xác định số lượng các phân tử monosaccharide
trong cấu trúc phân tử. Các phổ 2D-NMR cho phép đánh giá mức độ tương tác của
mỗi C hoặc H với các nguyên tử lẫn cận hoặc xa nhau trong không gian và xác định
được các vị trí liên kết của chúng trong cấu trúc PS. Phổ COSY và TOCSY được sử
dụng để gán các hạt nhân proton trong cấu trúc vòng. Trong khi đó, với phổ 2D HSQC
và HMBC, 13C – 1H lại được sử dụng để gán các nguyên tử C và cung cấp các thông
tin về dạng liên kết trong cấu trúc của phân tử, cấu hình anomer (như phổ HMBC,
NOESY, ROESY).
Mô hình liên kết của các monome được xác định bằng sự kết hợp của quá trình
methyl hóa và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả về cấu trúc của các PS
này được xác định bằng cách đối chiếu với các dữ liệu phổ thư viện đã được công bố
[42], [68]. Thông tin về cấu trúc và các phổ tương ứng giúp xác định chi tiết về cấu
trúc PS được cụ thể hóa ở Bảng 1.2 [9].
27
Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng
Thông tin về
cấu trúc Các phương pháp NMR tương ứng
Số lượng phân tử
đường
Phổ một chiều 1H – NMR
Phổ 13C – NMR
Phổ tương tác hai chiều 1H – 1H giúp phân tích kết nối
Phổ tương quan hai chiều 1H – 13C
Các
monosaccharide
cấu thành
Độ chuyển dịch hóa học của 1H – NMR
Hằng số ghép JH,H trong 1H – NMR
Phổ tương quan của các hạt nhân trong cùng phân tử (COSY)
Độ chuyển dịch hóa học của 13C – NMR
Phổ tương quan giữa 1H – 13C
Cấu hình anomer Độ chuyển dịch hóa học 1H – NMR và hằng số ghép cặp
Độ chuyển dịch hóa học 13C – NMR và hằng số ghép cặp JH,H
Tương tác trong phổ NOESY
Vị trí liên kết và
chuỗi lặp lại
Độ chuyển dịch hóa học trong 1H và 13C – NMR
Tương tác trong phổ NOESY
Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử
Vị trí của các
nhóm thế
Độ chuyển hóa học trong 1H và 13C – NMR
Tương tác trong phổ NOESY
Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử
Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp quá trình methyl hóa và NMR
trong quá trình phân tích các đặc điểm cấu trúc của PS [11], [39], [74], [104],… Kết
quả công bố về các đơn vị monosaccharide chủ yếu thường gặp trong thành phần của
EPS là glc, gal và rha với tỷ lệ khác nhau [29], [87], [91]. Sự liên kết giữa các đơn vị
monome trong EPS đã tạo nên bộ khung của các polyme với sự thay đổi của các loại
liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α-glycoside. Đây cũng
là cơ sở chủ yếu được sử dụng để phân loại EPS [87].
Bằng phương pháp kết hợp phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D
(1H và 13C), cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc
loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000)
[137], Robijn và cộng sự (1995) [103]. EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb.
helveticus 776 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ
28
phân tử là 1:2. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa N-
acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb.
helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2
mạch nhánh. Nhóm tác giả này cũng cho thấy rằng chủng Lb. helveticus K16 sinh
tổng hợp EPS ngoại bào là một hexasaccharide lặp lại và là một hetero-EPS của các
đường gal và glc và có cấu tạo mạch nhánh.
EPS từ LAB có thể là sự tổng hợp của các hỗn hợp và có cấu trúc khác nhau.
Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp các phổ 1H, 13C, 1D và 2D NMR,
cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lactobacillus spp. G-77 được kết luận gồm hai PS có
cấu trúc đơn vị monosaccharide lặp lại khác nhau [38]. Grobben và cộng sự (1996)
đã sử dụng một môi trường xác định để nuôi cấy Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus
NCFB 2772. Khi nuôi cấy với glc hoặc fruc, có hai EPS đã được tách chiết: một PS
có khối lượng phân tử cao và một PS có khối lượng phân tử thấp nhờ phương pháp
sắc ký trao đổi ion. Thành phần monome và các liên kết trong PS có khối lượng phân
tử lớn thu nhận từ glc và fruc đều tương tự và xấp xỉ nhau (± 5%) đã được xác định
nhờ phương pháp GC-MS. Tuy nhiên, các PS có khối lượng phân tử thấp, được sinh
tổng hợp với số lượng nhỏ, và xuất hiện một thành phần monome khác nhau [55].
Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, quá trình sinh tổng hợp các EPS có cấu trúc
tương tự nhau nhưng có khối lượng phân tử khác nhau. Degeest và de Vuyst (1999)
công bố kết quả về việc sinh tổng hợp một phân tử EPS có khối lượng cao (1,8x 106)
và một phân tử EPS có khối lượng thấp (4,1x105) từ S. thermophilus LY03 [32]. Quá
trình sinh tổng hợp hai PS bởi Lb. rhamnosus cũng đã được công bố bởi Pham và
cộng sự (2000). Các EPS có khối lượng phân tử thấp tạo thành được lý giải là từ quá
trình thủy phân các sản phẩm có khối lượng phân tử cao do enzyme glycosyl-
hydrolase xúc tác [95].
Sự đa dạng về đặc điểm lý hóa của các EPS từ các chủng vi khuẩn khác nhau
thuộc LAB từ các công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt ở Bảng 1.3
29
Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương
ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb.
acidophilus
LMG9433
D-glc: D-gal:
D-glcA :2-
acetamido-2-
deoxy-D-glc =
2:1:1:1
β-D-GlcpNAc
4)-β-D-GlcpA-(16)-α-D-Glcp-(14)- β-D-Galp-(14)- β-
D-Glcp-(1
Robijn và
cộng sự
(1996)
[102]
Lb. helveticus
K16
D-glc:D-gal = 2:1
β-D-Galp
β-Glcp-(12- β-D-Glcp
4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1
Yang và
cộng sự
(2000)
[137] 1
4
1
6
1
3
30
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương
ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. delbrueckii
subsp.
bulgaricus 291
1,4 x 106
β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp
4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1
Faber và
cộng sự
(2001) [39]
Lb. rhamnosus
KL37C
D-glc:D-gal = 1:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-
Glcp-(13)-β-D-Galf(1
Lipin’ski
(2003) [74]
Lb. delbrueckii
ssp. bulgaricus
LBB.B332
D-glc:D-gal:L-rha
= 1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L-
Rhap 12)- α-D-Galp-(1
Sanchez-
Medina
(2007)
[108]
Lb. delbrueckii
ssp. bulgaricus
LBB.B26
D-glc:D-gal = 2:3
α-D-Glcp
3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf-
(1
Sanchez-
Medina
(2007)
[108]
1
6
1
6
31
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương
ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. pentosus
LPS26
2,0 x 106 D-glc:D-GlcA:L-
rha = 1:2:2 4)-α-D-Glcp-(13)-α -D-GlcpA4Ac-(13)-α-L-Rhap-
(14)-α-D-GlcpA-(13)-β-L-Rhap2Ac-(1
Rodríguez-
Carvajal và
Gil-Serran
(2008)
[104]
Lb. johnsonii
142
1,0 x 105 D-glc:D-gal = 1:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-
Glcp-(13)-β-D-Galf(1
Górska và
cộng sự
(2010) [52]
Lb. rhamnosus
KL37B
4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β-
D-Galp-(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf-
(16)- β -Galf-(1
α-D-Glcp-(12)- β -Glcp
Górska-Fra˛
czek và
cộng sự
(2011) [54]
Lb. johnsonii
FI9785
6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1
4)- β -Galp-(1 4)- β -Glcp-(1
Dertli và
cộng sự
(2013) [33]
3
1
32
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương
ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. fermentum
TDS030603
D-glc:D-gal =
2,6:1,0
[3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n
Gerwig và
cộng sự
(2013) [49]
Lb. plantarum
70810
r-EPS1: D-glc:D-
man:D-gal =
18,21:78,76:3,03
r-EPS2: D-glc:D-
man:D-gal =
12,92:30,
89:56,19
Wang và
cộng sự
(2014)
[126]
Lb. plantarum
YW32
D-man:D-fruc: D-
gal: D-glc =
8,2:1,0:4,1:4,2
Wang và
cộng sự
(2015)
[124]
2
1
α-D-Galp
6
1
α-Glcp
33
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương
ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. delbrueckii
subsp.
bulgaricus
OLL1073R-1
5,0 x 106 D-glc:D-gal =
1,0:1,5
β-D-Galp
[2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D-
Galp-(1]n
Calsteren và
cộng sự
(2015) [17]
Lb. fermentum
Lf2
D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng
sự (2016)
[12]
1
4
34
Từ kết quả tổng hợp trên Bảng 1.3 cho thấy các EPS được sinh tổng hợp từ các
chủng thuộc LAB có sự đa dạng về thành phần, mối liên kết, tỉ lệ các monosaccharide
trong cấu trúc của chúng. Cùng một loài vi khuẩn giống nhau nhưng khả năng sinh
tổng hợp EPS có thể khác nhau (có thể là HoPS hoặc là HePS). Sự khác nhau giữa
các EPS tổng hợp được có thể do nguồn thu nhận các vi khuẩn này khác nhau, điều
kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy không giống nhau. Trong luận án
này, để xác định cấu trúc của EPS thu được chúng tôi cũng tiến hành sử dụng phương
pháp phân tích GC-MS để xác định thành phần monosaccharide, dạng liên kết và các
phổ NMR nhằm khẳng định lại một số thông tin chi tiết trong cấu trúc như cấu hình
anomer, thành phần monosaccharide, loại liên kết,…
Ở Việt Nam, các công bố về EPS từ LAB nói chung và từ chủng Lb. fermentum
nói riêng còn rất hạn chế. Đa số các nguồn cung cấp PS trong các nghiên cứu tại Việt
Nam mà chúng tôi đã cập nhật được chủ yếu là từ các loài nấm [1], [8], [3], tảo [4],
các loại rong [7],.. Các công trình này nghiên cứu đa phần tập trung vào điều kiện
tách chiết, thu nhận, các tính chất hóa lý,…Chính vì vậy, để góp phần tạo nên sự đa
dạng và phong phú hơn về nguồn thu nhận các PS, đặc biệt là các PS từ LAB, trong
các nội dung của luận án, chúng tôi đã tiến hành thực hiện các nghiên cứu về điều
kiện thu nhận, quá trình tách chiết cùng các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong
công nghệ thực phẩm cũng như xác định một số đặc điểm lý hóa về cấu trúc của các
EPS mới thu nhận được này.
1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe
Xuất phát từ nhu cầu ngày càng tăng về các polyme tự nhiên sử dụng với nhiều
ứng dụng khác nhau đã dẫn đến sự quan tâm và nghiên cứu về EPS từ vi sinh vật nói
chung và từ LAB nói riêng được phát triển mạnh mẽ. Bên cạnh những tác dụng chức
năng trong thực phẩm như tạo gel, tạo độ đặc, ổn định cấu trúc sản phẩm, hạn chế sự
tách nước…đã được ứng dụng từ lâu, một khía cạnh khác của EPS từ LAB cũng đã
được nghiên cứu phổ biến trong những năm trở lại đây như khả năng chống oxy hóa,
chống ung thư, kích thích khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol.
1.4.4.1. Các tác động liên quan đến sức khỏe của EPS
35
Hoạt động chống oxy hóa của EPS (LPC-1) tách chiết từ Lb. plantarum C88 đã
được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013). Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ
Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu
quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế
bào Caco-2 đã được khảo sát. Kết quả cũng đã chỉ ra rằng tổng hoạt lực chống oxy
hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ; tác dụng chống oxy hóa liên quan
đến khả năng làm tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi
enzyme cũng như giảm sự hình thành peroxy của lipid [139]. Hoạt động chống oxy
hóa của EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB cũng được
công bố bởi Kodali và cộng sự (2008) [65], Li và cộng sự (2014) [73], Polak và cộng
sự (2013) [96] … Một số tác động khác liên quan đến sức khỏe cũng được tổng hợp
ở Bảng 1.4.
Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp
từ LAB đã được công bố
EPS từ các chủng vi
khuẩn thuộc LAB
Tác động liên quan đến sức khỏe Tác giả (năm)
[TLTK]
Lb. lactis subsp.
cremoris SBT 0495 Hỗ trợ quá trình chuyển hóa cholesterol Nakajima và cộng
sự (1992) [85]
Lb. acidophilus - Giúp làm giảm sự hình thành màng sinh
học từ E. coli O157:H7 Kim và cộng sự
(2009) [63]
Lb. reuteri Ức chế enterotoxigenic Escherichia coli
gây ra sự ngưng kết hồng cầu Wang và cộng sự
(2010) [129]
Lb. plantarum 70810 - Ức chế chống lại các tế bào ung thư
HepG-2, BGC-823 và HT-29 Wang và cộng sự
(2014) [125].
Bifidobacterium
bifidum WBIN03 (B-
EPS) và Lb.
plantarum R315 (L-
EPS)
- Chống oxy hóa
- Có hoạt tính kháng khuẩn chống lại tác
nhân gây bệnh như Escherichia coli,
Staphyloccocus aureus, Candida
albicans, Bacillus cereus, Salmonella
typhimurium, và Shigella sonnei,…
Li và cộng sự
(2014) [72]
36
1.4.4.2. Các tác dụng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm
Trong thời gian qua, đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác tác dụng có lợi của
EPS sinh tổng hợp từ LAB được tiến hành trong điều kiện in vitro. Các nghiên cứu
này chủ yếu tập trung quanh sữa và các sản phẩm từ sữa với vai trò của EPS tác động
lên những tính chất chức năng của sản phẩm: EPS từ S. thermophiles giúp làm tăng
độ ẩm, cải thiện được những đặc tính tan chảy của pho mát Mozzarella [93], làm tăng
khả năng giữ ẩm [76], [92]; EPS từ S. thermophilus, S. cremoris, và Lb. bulgaricus
giúp làm giảm khả năng tách nước, giảm độ cứng tương đối và độ nhớt biểu kiến
[110].
Những tính chất chức năng được tạo nên nhờ có sự có mặt của các EPS (có thể
được bổ sung vào hoặc được tổng hợp trực tiếp trong quá trình sản xuất sản phẩm)
đã góp phần hạn chế được việc sử dụng các phụ gia tổng hợp. Từ đó giúp duy trì tính
chất tự nhiên, nâng cao chất lượng sản phẩm đáp ứng được yêu cầu về mức độ an
toàn cần thiết và nâng cao lòng tin của người tiêu dùng khi sử dụng những sản phẩm
có sự có mặt của hợp chất này.
Tóm lại, các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB đã mang lại rất lớn những
tiềm năng quan trọng trong các ngành công nghiệp và đối với sức khỏe con người.
Tuy nhiên, với sự đa dạng về các chủng loài các vi khuẩn, cũng như sự phong phú về
nguồn phân lập các vi khuẩn này, sẽ không có sự giống nhau về điều kiện thu nhận,
các đặc tính lý hóa giữa các EPS tổng hợp được. Do đó, để quá trình tổng hợp EPS
từ mỗi vi khuẩn hiệu quả hơn, việc tìm ra các thông số lý hóa thích hợp như thành
phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy là hết sức cần thiết. Bên cạnh đó,
việc xác định các điều kiện tách chiết, các tính chất lý hóa tương ứng với mỗi loại
EPS thu nhận khác nhau cũng như các đặc điểm về cấu trúc của các EPS này sẽ là cơ
sở và nền tảng giúp chúng ta có thể sử dụng chúng trong thực tiễn tốt hơn. Đây cũng
là những nội dung chính sẽ được nghiên cứu và làm sáng tỏ trong luận án.
37
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn lactic được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao
gồm: Lb. fermentum TC12, Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC14, Lb.
fermentum TC15, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC18, Lb. fermentum TC19,
Lb. fermentum TC20, Lb. fermentum TC21, Lb. fermentum MC2, Lb. fermentum
MC3, Lb. fermentum N9 và Lb. fermentum N10. Các chủng này được cung cấp bởi
phòng thí nghiệm vi sinh, Đại học Ghent, Bỉ (BCCM/LMG: Belgian Co-ordinated
Collections of Microorganisms/ Laboratory for Microbiology).
- Các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum được chọn.
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Hóa chất
- MeOH, CHCl3,, NaBH4, TFA, TCA (hãng Merck - Đức).
- (CH3)2SO, (CH3CO)2O, C6H6, CH3COOC2H5 (hãng Daejung Chemicals &
Metals - Hàn Quốc).
- NaOH, HCl, NH3 đậm đặc, CH3COOH, D-glucose, H2SO4 đậm đặc, (CH3)2SO4
(Trung Quốc).
- EtOH tuyệt đối 99,9% của công ty cổ phần hóa chất Đức Giang (Việt Nam).
- MRS lỏng (hãng Scharlau – Tây Ban Nha) (Phụ lục 2.1) và môi trường MRS
agar: có thành phần là môi trường MRS có bổ sung 10 – 15 g agar/l.
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Máy quét phổ tử ngoại - khả kiến mẫu lỏng (UV-Vis DRS-Jacos V630, Nhật
Bản).
Thiết bị Bruker Avance 500MHz.
Thiết bị GC-MS (Shimadzu, Nhật Bản, 2010).
Hệ thống sắc ký lỏng của hãng Agilent (USA).
Máy ly tâm Universal R320, Máy li tâm để bàn K241R (Hettich-Đức).
Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật khác: tủ sấy, tủ cấy,
tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng,…
38
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ
quang (OD)
Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng sẽ
bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng
đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối
lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp
thụ một phần ánh sáng. Do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất
của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế
bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy,
đối chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh
khối vi khuẩn.
Để xác định mật độ tế bào vi khuẩn, canh trường được đo OD ở bước sóng
600nm. Tham chiếu giá trị OD 600nm = 1 tương ứng với mật độ tế bào là 8*108
CFU/ml (http://www.genomics.agilent.com/biocalc…/calcODBacterial.jsp).
Số ml môi trường cần hút =Số ml môi trường lên men x mật độ tế bào cần bổ sung
𝑂𝐷𝑐𝑎𝑛ℎ 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 x 8 x 108
Đo mật độ quang trên thiết bị Thermo Spectronic Genesys 10 UV/Vis.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6]
Chủng Lb. fermentum
từ ống giống gốc
MRS agar
- Cấy ria
Khuẩn lạc thuần
- Ủ ở 37oC, 24 giờ
MRS lỏng
- Ủ ở 37oC, 24 giờ
- Ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC, 5 phút
- Rửa hai lần bằng 1% pepton + 0,85% NaCl (tái huyền phù)
Sinh khối (điều chỉnh OD600nm = 1)
(1)
Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối
39
Các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 từ ống giống gốc được cấy
ria trên môi trường MRS agar, và ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24 giờ. Khuẩn lạc thuần sau
đó được cấy vào môi trường MRS lỏng, ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24 giờ. Sinh khối được
thu nhận sau khi ly tâm 5000 vòng/phút ở 4oC, trong 5 phút và rửa lại 2 lần bằng dung
dịch 1% pepton + 0,85% NaCl được tái huyền phù và xác định mật độ tế bào bằng
phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm.
2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS
Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim
có sửa đổi [138]. Sinh khối tế bào thu nhận theo sơ đồ Hình 2.1 của các chủng Lb.
fermentum được bổ sung vào các môi trường cần khảo sát. Tiến hành lên men ở 37oC
trong 24 giờ sau đó tủa protein bởi acid trichloroacetic 30% (TCA). Dịch nổi thu được
sau khi ly tâm, kết tủa EPS bởi ethanol lạnh lần 1 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Hòa
tan tủa trong nước cất 50oC (khoảng 2 ml). EPS trong dịch nổi thu được sau khi ly
Dịch lên men từ các chủng
Lb. fermentum
- Xử lý nhiệt (1000C, 15 - 20 phút)
- Làm nguội
- Bổ sung 30% TCA, giữ trong 24 giờ
- Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC)
Dịch nổi chứa EPS
EPS tủa
Phương pháp phenol-sulfuric
- Nước cất 50oC
- Bổ sung ethanol lạnh, giữ ở 4oC
- Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4oC)
Môi trường dinh dưỡng
- Bổ sung sinh khối tế bào
- Ủ ở 37oC trong 24 giờ
Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS
40
tâm được kết tủa bởi ethanol lạnh lần 2 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Kết tủa được
tiếp tục hòa tan trong nước cất 50oC. Dung dịch này được xác định hàm lượng EPS
bằng phương pháp phenol – sulfuric.
2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS
từ một số chủng Lb. fermentum
Các chủng Lb. fermentum khác
nhau từ ống giống gốc
Nuôi cấy thu nhận sinh khối
- Điều chỉnh OD600nm=1
- Lên men trong môi trường MRS, 37oC, 48 giờ
Thu nhận và tách chiết EPS
Phương pháp phenol-sulfuric
Chọn chủng có khả năng sinh
tổng hợp EPS cao
- Nuôi thu nhận sinh khối
- Lên men trong các điều kiện khác nhau
Làm lạnh
- Bổ sung TCA ở các nồng độ khác nhau
- Giữ 24 giờ
Ly tâm (13000 vòng/phút, 10
phút, 4oC)
- Bổ sung ethanol lạnh với các tỉ lệ khác nhau,
- Giữ ở 4oC
Protein
Ly tâm (6000 vòng/phút,
10 phút, 4oC) EPS tủa Phương pháp
phenol-sulfuric
Phương pháp kjeldahl
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS
41
Hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum sau khi cải thiện các điều
kiện của quá trình lên men so với môi trường ban đầu (MRS) là lượng EPS thu được
trong môi trường lên men với các điều kiện thích hợp nhất (về thành phần môi trường,
điều kiện lên men) so với lượng EPS thu được trong điều kiện lên men ban đầu với
môi trường MRS và được xác định bằng %, theo công thức số 2:
2.3.4.1. Phương pháp tuyển chọn các chủng Lb. fermentum có khả năng sinh tổng
hợp EPS cao
Các chủng Lb. fermentum (TC12, TC13, TC14, TC15, TC16, TC18, TC19,
TC20, TC21, MC2, MC3, N9, N10) được nuôi thu nhận sinh khối theo Hình 2.1 sau
đó tiến hành lên men trong 48 giờ ở 37oC trong môi trường MRS. Thực hiện tách, thu
nhận EPS theo Hình 2.2 và xác định hàm lượng EPS để chọn ra các chủng có khả
năng sinh tổng hợp EPS cao.
2.3.4.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng (nguồn carbon
và nitrogen)
Bổ sung thêm lần lượt vào môi trường MRS chứa (g/l): pepton 10, cao thịt 8,0,
cao nấm 4,0, glucose 20, K2HPO4 2,62, MgSO4 0,2, MnSO4 0,038, NH4 2,0,
CH3COONa 5,0, Tween 1,0 các nguồn C và nguồn N ở các nồng độ khác nhau. Các
nguồn C sử dụng để khảo sát bao gồm suc, lac, glc với nồng độ (2%, 3%, 4%, 5%,
6%) và các nguồn N bao gồm pepton, cao thịt, cao nấm với các nồng độ 0,2%; 0,4%;
0,6%; 0,8%; 1,0% cho cả pepton và cao thịt; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% cho cao
nấm. Mẫu đối chứng là môi trường MRS không bổ sung thêm nguồn C và nguồn N.
Tiến hành nuôi các chủng Lb. fermentum được tuyển chọn (kết quả mục 2.3.4.1) với
các điều kiện lên men khác như pH, nhiệt độ, thời gian và tách EPS được thực hiện
như mục 2.3.3. Hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric
[37].
Hiệu suất thu nhận EPS (%) =
Hàm lượng EPS thu được trong môi trường
lên men thích hợp nhất được chọn
Hàm lượng EPS thu được trong môi
trường ban đầu MRS
x 100 (2)
42
2.3.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu
Thực hiện nuôi cấy các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 trong
môi trường MRS có chứa nguồn C và N bổ sung ở nồng độ thích hợp (kết quả mục
2.3.4.2) với mật độ tế bào ban đầu khác nhau (104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL). EPS
được thu nhận và tách (theo mục 2.3.3) và xác định hàm lượng bằng phương pháp
phenol-sulfuric.
2.3.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường
Các chủng LAB được nuôi cấy trong môi trường MRS chứa nguồn C và N ở
nồng độ thích hợp với mật độ tế bào ban đầu đã khảo sát (kết quả của các mục 2.3.4.2
và 2.3.4.3) ở các giá trị pH ban đầu của môi trường khác nhau (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0;
6,5). EPS được thu nhận và tách như đã trình bày ở mục 2.3.3 và xác định hàm lượng
bằng phương pháp phenol-sulfuric.
Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6,0 – 6,2. Độ
pH được đo bằng thiết bị Thermo Scientific Orion 1112001 3-star benchtop.
2.3.4.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men
Với kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N và của mật độ tế bào nuôi cấy
ban đầu ở mục 2.3.4.2, 2.3.4.3, các chủng LAB được nuôi cấy ở các mức nhiệt độ
khác nhau (30oC, 35oC, 40oC, 45oC) với pH ban đầu thích hợp tương ứng (kết quả
mục 2.3.4.4). EPS được thu nhận và tách như đã trình bày ở mục 2.3.3 và xác định
hàm lượng bằng phương pháp phenol-sulfuric.
2.3.4.6. Phương pháp khảo sát đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian
lên men
Tiến hành nuôi cấy các tế bào của các chủng Lb. fermentum được tuyển chọn
trong môi trường MRS có bổ sung thêm các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi
cấy thích hợp đã được xác định theo kết quả từ mục 2.3.4.2 đến mục 2.3.4.5. Để khảo
sát đường cong sinh trưởng bao gồm các chỉ tiêu về sự biến đổi của mật độ tế bào, sự
biến đổi của pH môi trường theo thời gian lên men, chúng tôi đã thực hiện lấy mẫu ở
các mốc thời gian lên men khác nhau (0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và
72 giờ). Các mẫu thu được sử dụng để đo các chỉ số về mật độ tế bào, pH, tiến hành
tách EPS (theo mục 2.3.3) và xác định hàm lượng bằng phương pháp phenol-sulfuric.
43
2.3.4.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ
protein trong dịch lên men
Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men thu được sau quá trình
nuôi cấy các chủng Lb. fermentum nhằm loại bỏ protein đã được thực hiện với các
nồng độ bổ sung khác nhau so với dịch lên men bao gồm: 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, 40%. Trình tự khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình 2.3. Các protein
kết tủa được tách khỏi dịch nổi bằng cách ly tâm. Hàm lượng protein còn lại trong
dịch nổi sẽ được thông qua lượng nitơ tổng số bằng phương pháp kjeldahl [5].
2.3.4.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thể tích ethanol và thời gian tủa lên
quá trình thu nhận EPS tủa từ dịch nổi
Dịch nổi thu được sau khi ly tâm tách bỏ protein (kết quả mục 2.3.4.7) sẽ tiếp
tục được kết tủa bằng ethanol với thể tích bổ sung vào so với dịch nổi theo tỉ lệ khác
nhau (ethanol: dịch nổi bao gồm: 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1). Thời gian tủa bằng
ethanol được khảo sát sau khi xác định được thể tích ethanol bổ sung vào. Các mức
thời gian khảo sát là: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Lượng EPS kết tủa thu được
sau khi ly tâm tiếp tục được hòa tan vào nước cất khoảng 50oC và xác định hàm lượng
bằng phương pháp phenol-sulfuric. Quá trình khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình
2.3.
2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37]
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharide thành monosaccharide,
monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước
sóng λ = 490 nm. Xây dựng đường chuẩn glucose sau đó đo mẫu thực và tính ra lượng
EPS.
1 ml dung dịch có chứa EPS được trộn với 1 ml phenol 5% và 5 ml H2SO4 đậm
đặc, votex và hấp cách thủy 2 phút. Làm nguội về nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo
OD490nm. Tính hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose.
Cách xây dựng đường chuẩn:
+ Cân chính xác 0,2500 (g) D-glucose cho vào bình định mức 250 ml rồi định
mức bằng nước cất ta được dung dịch A. Như vậy, nồng độ dung dịch D-glucose là
1 mg/ml (1000 μg/ml).
44
- Lấy 50 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu được dung dịch D-glucose có
nồng độ 100 μg/ml (dung dịch B).
- Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch B pha thành 100 ml thu được
dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/ml.
- Lấy 125 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu được dung dịch D -glucose có
nồng độ 250 μg/ml (dung dịch C).
- Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 ml dung dịch C pha thành 100 ml thu được dung
dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 μg/ml.
- Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm
1ml dung dịch phenol 5%, 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống
nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu
được các giá trị độ hấp thụ quang.
- Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose (phụ lục 1).
2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5]
Nguyên tắc: Chuyển hóa các hợp chất nitơ trong mẫu về dạng muối amoni
(NH+4) bằng cách đun nóng trong dung dịch acid sulfuric đậm đặc (H2SO4) với sự có
mặt của chất xúc tác đồng sulfat (CuSO4), sau đó chưng cất amoniac (NH3) trong môi
trường kiềm (NaOH) và hấp thụ bằng dung dịch acid boric (H3BO3). Tiến hành chuẩn
độ amoni tetraborat [(NH4)2B4O7] bằng dung dịch acid tiêu chuẩn (H2SO4 0,1N) từ
đó tính hàm lượng nitơ trong mẫu.
Tính kết quả: Hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu được tính theo công thức:
Nmg% = w
V 10042,1
trong đó: V- số ml H2SO4 0,1N chuẩn độ
1,42 – số mg nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N
100 – hệ số chuyển thành %
w – khối lượng mẫu (mg)
(3)
45
2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm
2.3.7.1. Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan trong trong nước [10]
Khả năng hòa tan trong nước của các EPS tách chiết từ dịch nuôi cấy các chủng
Lb. fermentum được thực hiện theo Ahmed và cộng sự có sửa đổi [10]. Cụ thể là chế
phẩm EPS (50 mg) (thu nhận theo sơ đồ Hình 2.4) được hòa tan trong 1ml nước và
khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, dung dịch được ly tâm ở 13000
vòng/phút trong 15 phút để tách EPS không tan. Lượng EPS hòa tan trong nước được
xác định bằng phương pháp phenol – sulfuric acid.
Khả năng hòa tan được tính theo công thức sau:
Khả năng hòa tan (%) = Khối lượng của EPS trong dịch nổi
Khối lượng mẫu EPS
x 100 (4)
Dịch nuôi cấy các chủng Lb. fermentum
(TC13, TC16, TC21, MC3)
- Xử lý nhiệt (1000C, 15 - 20 phút)
- Làm lạnh
- Bổ sung TCA, giữ 24 giờ
- Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC)
- Bổ sung ethanol lạnh, giữ 4oC
- Ly tâm (6000 vòng/phút, 10 phút, 4oC)
EPS tủa
- Thẩm tích với nước, giữ qua đêm
Chế phẩm EPS
Xác định một số tính chất
của EPS
Đông khô
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng
ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
46
Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số.
2.3.7.2. Phương pháp khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu [10]
Huyền phù gồm 0,2 g mẫu (thu nhận theo sơ đồ Hình 2.4) và 10 ml nước cất
được ly tâm 5.000 vòng/phút trong 25 phút để tách lượng nước không được giữ bởi
EPS. Sau đó, giọt toàn bộ lên giấy lọc đã biết trước khối lượng để thấm hết lượng
nước bị tách ra. Cân lại khối lượng của EPS đã hấp thụ bởi nước và tính theo công
thức 5.
Dầu được sử dụng trong khảo sát là dầu Đậu nành Simply, sản xuất bởi Chi
nhánh Công ty tinh dầu thực vật Cái lân tại Hiệp Phước, thành phố Hồ Chí Minh.
Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số.
2.3.7.3. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc
tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) [65]
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng các chất kháng oxy hóa chuyển hóa gốc tự do
1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl thành sản phẩm phân tử làm cho dung dịch chuyển từ
màu tím sang vàng. Chất đối chứng là vitamin C (acid L-ascorbic)
Cách tiến hành
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH xác định khả năng cho hydro của mẫu thử có khả
năng kháng oxy hóa. Pha dung dịch DPPH nồng độ 100 µM trong ethanol tuyệt đối
99,9% ngay trước khi dùng. Hỗn hợp phản ứng có thể tích 3000 µL, gồm 2000 µL
mẫu chế phẩm EPS khảo sát ở các nồng độ khác nhau và 1000 µL dung dịch DPPH
nồng độ 100 µM. Các hỗn hợp phản ứng được lắc trong 1 phút và ủ ở nhiệt độ phòng
trong 30 phút, rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 517 nm.
Khả năng bắt gốc tự do của DPPH được xác định bằng công thức 6:
Trong đó:
SA DPPH (%): khả năng bắt gốc tự do (Scavenging Activity) của DPPH
AS : mật độ quang của mẫu khảo sát
AC: mật độ quang của mẫu trắng không chứa mẫu
SADPPH (%) = AC –AS
AC x 100 (6)
WHC (%) = Khối lượng của EPS sau khi hấp thụ nước /dầu
Khối lượng mẫu EPS
x 100 (5)
47
Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số. Khả năng bắt gốc tự do được
đánh giá qua giá trị IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH
càng cao.
2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS
2.3.8.1. Phương pháp xác định khối lượng phân tử bằng sắc ký thẩm thấu gel [44]
Khối lượng phân tử của các EPS được xác định bằng phương pháp sắc kí thẩm
thấu gel với hệ thống sắc kí lỏng 1100 của hãng Agilent (USA) tại Phòng thí nghiệm
phân tích trung tâm, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh. Chất chuẩn sử dụng là các phân tử pullulan có phân tử lượng khác nhau (5, 10,
20, 50 và 100, 200, 400 và 800 kDa) được cho chạy qua cột sắc ký ultrahydrogen 500
(7,8 mm x 300 mm, 10 µm) và rửa giải với NaNO3 0,1M pha trong nước khử ion,
chạy đẳng dòng với tốc độ 1mL/phút. Nhiệt độ đầu dò được ổn nhiệt ở 35oC, lò cột
được ổn nhiệt tại 40oC. Thể tích rửa giải được minh họa bằng đồ thị tương ứng với
khối lượng phân tử của chúng. Tương tự, EPS đã được hòa tan trong NaNO3 0,1M sẽ
được bơm vào cột và rửa giải với tốc độ như trên. Thể tích rửa giải được phác thảo
trên cùng đồ thị với chất chuẩn và xác định khối lượng phân tử.
2.3.8.2. Phương pháp methyl hóa – thủy phân cắt mạch – khử hóa – tạo dẫn xuất -
phân tích GC-MS để xác định vị trí liên kết glycoside của EPS [7]
* Nguyên tắc
- Methyl hóa sau đó thủy phân cắt mạch, khử hóa, acetyl hóa và xác định thành
phần dẫn xuất monosaccharide bằng GC-MS
- Methyl hóa các nhóm –OH tự do của PS thành –OCH3.
- Thủy phân cắt mạch dẫn xuất methyl-PS thành monosaccharide, do đó các vị
trí tạo liên kết O=glycoside sẽ tạo thành -OH tự do.
- Acetyl hóa: các vị trí –OH tự do của liên kết O-glycoside ban đầu sẽ bị O-
acetyl hóa, các vị trí đã bị O-methyl hóa thì không xảy ra phản ứng.
- GC-MS: xác định các dẫn xuất O-methyl O-acetyl của monosaccharide, vị trí
nào bị acetyl hóa thì vị trí đó tạo liên kết glycoside trong PS.
* Cách tiến hành
48
Quá trình methyl hóa EPS, thủy phân tạo dẫn xuất acetyl hóa sau đó phân tích
GC-MS được chỉ ra ở Hình 2.5.
2.3.8.3. Phương pháp tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích GC-MS để xác
định thành phần các monosaccharide [7]
* Nguyên tắc:
Thủy phân PS thành các monosaccharide, chuyển các monosaccharide sang dẫn
xuất alditol acetate và định tính và định lượng bằng GC-MS.
* Cách tiến hành:
Quá trình tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích GC-MS để xác định
thành phần các monosaccharide được thể hiện ở Hình 2.6
Hỗn hợp phản ứng
0,3 g mẫu EPS
Dung dịch EPS
EPS đã methyl hóa
1. 15 mL (CH3)2SO
2. Khấy từ 600C bằng dòng N2
1. 7,5g NaOH
2. 12 mL(CH3)2SO4
3. Khuấy từ bằng dòng N2 16 giờ
1. Chiết qua CHCl3:H2O =2:1
2. Cô đuổi dung môi
Methyl hóa
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết
glycoside
49
* Hệ thống GC-MS sử dụng: GCMS – Shimadzu (2010)
Điều kiện làm việc của thiết bị sắc ký:
Cột tách: cột mao quản DB-5 (chiều dài: 30 m, đường kính trong: 0,32 mm, độ
dày lớp pha tĩnh: 0,25 μm).
Khí mang: He (độ tinh khiết đạt 99,9999%).
Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 275oC.
Điều kiện làm việc của thiết bị khối phổ:
Nguồn ion hoá: nguồn EI (Ion hoá trên cơ sở bắn phá điện tử)
Thủy phân PS
Khử monosaccharide
Acetyl hóa
alditol
alditol
alditol acetate
Phân tích GC-MS
5 (mg) mẫu EPS methyl hóa
4 mL TFA 2 M/ 2 giờ, 120 0C
Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần
5 mL MeOH
monosaccharide
4 mL NaBH4 0,25 M/
NH4OH 1M
5 mL CH3COOH 10%/MeOH
Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần
2 mL anhydride acetic : pyridine =
1:1 (v/v)/1000C, 20 phút
5 mL MeOH
Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS
50
Nhiệt độ nguồn MS: 230oC
Thời gian cắt dung môi: 5 phút
Chế độ phân tích: Scan
Nhiệt độ lò: 65oC
Tốc độ dòng: 2 mL/phút
Chương trình nhiệt độ được cho ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS
Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ cuối (oC) Thời gian giữ
(phút)
-
8,00
2,00
65
250
280
1,00
10,00
5,00
Tổng thời gian : 54 phút
2.3.8.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Các mẫu EPS thu được sau khi ly tâm được thẩm tích trong 4 - 5 ngày bằng máy
khuấy từ nhằm loại bỏ các phân tử có khối lượng thấp. Tiến hành thu mẫu bằng
phương pháp đông khô. Để tăng khả năng hòa tan của mẫu, mẫu tiếp tục được xử lý
bằng cách thủy phân với TFA 2M ở 80oC trong 8giờ. TFA dư thừa được loại bỏ bằng
cách đông khô và thu mẫu nhằm phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR) của EPS-MC3 được đo trên thiết bị Bruker
Avance 500MHz trong dung môi DMSO với nồng độ mẫu là 10 mg/ml tại Viện Hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nhiệt độ đo là 79,85 oC, trừ
trường hợp peak HOD chuyển về trường cao hơn hay độ nhớt của mẫu thấp thì có thể
tăng nhiệt độ để nhận được phổ rõ nét hơn. Độ chuyển dịch hóa học được biểu diễn
theo ppm, sử dụng TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm).
Phổ một chiều 1H-NMR, 13C-NMR được ghi ở 79,85 oC với các chế độ ghi khác
nhau. Các phổ tương tác hai chiều HSQC, HMBC, COSY, NOESY cũng được ghi
nhận ở các chế độ ghi tương ứng.
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
2.3.9.1. Xác định khoảng tin cậy của số liệu thực nghiệm
Khoảng tin cậy của số liệu kết quả nghiên cứu thể hiện như sau:
51
𝑋 ± 𝜀 = �� ± 𝑡(𝑃, 𝑓). 𝑆
√𝑛
Trong đó:
��: là giá trị trung bình của kết quả nghiên cứu sau n thí nghiệm
t(P,f): là giá trị của chuẩn Student với độ tin cậy P=0,95 và bậc tự do f = n-1
S: là độ lệch chuẩn (S) và được tính theo công thức (7):
𝑆 = √∑ (𝑥𝑖 − ��)2𝑛
𝑖=1
𝑛 − 1
2.3.9.2. Sự sai khác của các số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 22.0, sai số giữa các thí nghiệm với
mức ý nghĩa (p<0,05).
- Sử dụng One way ANOVA để chỉ ra có hay không sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê giữa các giá trị trung bình.
- Sử dụng One way ANOVA (Options Homogeneity of variance test) chỉ ra có
hay không sự đồng nhất giữa các phương sai của các nhóm.
Kết quả thể hiện:
- Dựa vào giá trị Sig trong bảng ANOVA để biết có hay không sự khác biệt các
giá trị trung bình:
+ Sig ≤ α (0,05): có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình
+ Sig > α: không có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình
Các số liệu trong biểu đồ sẽ được kí hiệu bằng các chữa cái a, b, c để phân biệt
sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các cặp giá trị trung bình.
(6)
(7)
52
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb.
fermentum
3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao
LAB là một nhóm các vi khuẩn đã được công nhận là vi khuẩn an toàn cho thực
phẩm, các sản phẩm thứ cấp do chúng sinh ra đặc biệt là EPS được kết luận là có
nhiều chức năng khác nhau trong công nghệ thực phẩm cũng như trong y học. Tuy
nhiên, nhược điểm chủ yếu của EPS tổng hợp từ LAB là năng suất tạo thành thấp do
đó đã khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ LAB còn hạn chế. Quá trình tổng
hợp EPS liên quan đến rất nhiều yếu tố như chủng vi khuẩn sử dụng ban đầu, nguồn
phân lập, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nhất định. Do đó, để tuyển
chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt, đầu tiên chúng tôi
tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn này (đã được trình bày ở phần đối tượng
nghiên cứu) trong cùng một điều kiện không thay đổi về thành phần môi trường và
các yếu tố như nhiệt độ, pH, mật độ tế bào gieo cấy ban đầu ở một thời gian xác định.
Quá trình khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình 2.3
Sau 48 giờ lên men, khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng Lb.
fermentum thể hiện ở Hình 3.1.
Trong cùng một điều kiện nuôi cấy, mỗi chủng vi khuẩn thuộc LAB có khả năng
sinh tổng hợp EPS khác nhau (Hình 3.1). Trong số các chủng vi khuẩn được khảo sát,
Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC21 và Lb. fermentum
MC3 là những chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS vượt trội hơn so với các chủng
còn lại (Lb. fermentum TC12, TC14, TC15, TC18, TC19, TC20, MC2, N9, N10).
Lượng EPS đạt được trong điều kiện này lần lượt là 119,142 µg/ml cho chủng Lb.
fermentum TC13; 116,744 µg/ml cho chủng Lb. fermentum TC16; 100,768 µg/ml cho
chủng Lb. fermentum TC21 và 88,776 µg/ml cho chủng Lb. fermentum MC3.
53
Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic
Ở cùng một điều kiện lên men giống nhau, khả năng sinh tổng hợp EPS của các
chủng vi khuẩn Lb. fermentum có sự khác nhau. Điều này có thể liên quan đến giai
đoạn sinh trưởng và phát triển ban đầu của chính các vi khuẩn đó trước khi được gieo
cấy vào môi trường lên men. Chính vì vậy, trong môi trường mới, một số chủng có
khả năng thích nghi và sinh trưởng tốt hơn sẽ thực hiện quá trình sinh sản sớm hơn
do đó lượng sản phẩm tạo thành từ quá trình trao đổi chất có thể nhiều hơn so với các
chủng khác. Quá trình sinh tổng hợp EPS của một số vi khuẩn có thể xảy ra ở giai
đoạn phát triển, một số khác được tổng hợp trong giai đoạn logarid hoặc giai đoạn ổn
định và đạt các giá trị cực đại ở tại các giai đoạn đó [66].
Như vậy, lượng EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau là không
giống nhau, mặc dù các chủng vi khuẩn này cùng loài. Sự biến động về hàm lượng
35,484i
119,142a
62,516e68,980d
116,744a
68,370d
43,248h50,728g
100,768b
56,581f
88,776c
58,939ef
69,508d
0
20
40
60
80
100
120
140
TC12 TC13 TC14 TC15 TC16 TC18 TC19 TC20 TC21 MC2 MC3 N9 N10
EP
S (
µg/m
l)
Chủng vi khuẩn lactic
(Trong đó: - TC12: Lb. fermentum TC12 - TC20: Lb. fermentum TC20
- TC13: Lb. fermentum TC13 - TC21: Lb. fermentum TC21
- TC14: Lb. fermentum TC14 - MC2: Lb. fermentum MC2
- TC15: Lb. fermentum TC15 - MC3: Lb. fermentum MC3
- TC16: Lb. fermentum TC16 - N9: Lb. fermentum N9
- TC18: Lb. fermentum TC18 - N10: Lb. fermentum N10
- TC19: Lb. fermentum TC19
Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các
chủng
54
EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB cũng là kết quả công bố của nhiều tác
giả [44], [118], [136], [141].
Lượng EPS của các chủng còn lại (TC12, TC14, TC15, TC18, TC19, TC20,
MC2, N9, N10) đạt được tương đối thấp, chỉ đạt dưới 70 µg/ml. Từ kết quả này, các
chủng được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb.
fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3).
3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh
tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn
Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật luôn luôn đòi hỏi một số chất
dinh dưỡng cần thiết với nồng độ phù hợp. Các nguồn C và N là những chất dinh
dưỡng thường sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Việc sử dụng nguồn C
trong môi trường ngoài việc tạo ra năng lượng cho hoạt động sống của vi sinh vật, nó
còn tham gia vào quá trình biến đổi góp phần tạo thành các sản phẩm cuối cùng. Các
nguồn C thường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật bao gồm glc, suc, rỉ đường,
tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, … Trong khi đó, nguồn N thường tham
gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất chứa N trong tế bào. Một số nguồn N thường
được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm chuyển hóa của protein (peptone,
peptide, amino acid...), muối amoni, nitrate, ... Mỗi loại vi sinh vật khác nhau có nhu
cầu về một chất dinh dưỡng bất kỳ không giống nhau, hơn nữa, chúng cũng có khả
năng đáp ứng với sự biến hóa của nồng độ chất dinh dưỡng, nhất là các chất dinh
dưỡng hạn chế. Do đó, việc khảo sát để bổ sung nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các
vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thích hợp nhất là điều kiện tất yếu đầu tiên
của nhiều nghiên cứu nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp từ quá trình trao đổi chất của
chúng.
3.1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp
EPS
Một số công trình nghiên cứu đã kết luận rằng, hàm lượng và kích thước của
EPS có thể thay đổi theo các nguồn C [31], [55], [94]. Do đó, để thực hiện việc khảo
sát ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb.
fermentum, trước hết chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng này trong các môi trường
55
MRS có sự bổ sung thêm nguồn C khác nhau bao gồm glc, lac, suc với nồng độ bổ
sung lần lượt là 2%; 3%; 4%; 5%; 6% (chi tiết được mô tả ở mục 2.3.3.2). Thực hiện
lên men ở 37oC trong 48 giờ. Môi trường đối chứng là môi trường MRS không bổ
sung thêm các loại đường. Kết quả thể hiện ở Hình 3.2
Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, so với môi trường đối chứng, các loại đường
khác nhau khi bổ sung vào môi trường MRS phần lớn đều có những ảnh hưởng nhất
định đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Kết quả
Hình 3.2 cũng cho thấy rằng, so với lac và suc, glc là nguồn C có tác dụng kích thích
sớm hơn lên quá trình sinh tổng hợp bởi các chủng này. Hàm lượng EPS tạo thành có
sự thay đổi theo chủng và nguồn C bổ sung. Cụ thể là, lượng EPS tổng hợp bởi Lb.
fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 tăng nhanh và đạt được tốt hơn khi glc được
bổ sung vào; trong khi đó khả năng sinh tổng hợp EPS của Lb. fermentum TC16 và
Lb. fermentum TC21 đạt được cao hơn trong môi trường chứa nguồn C tương ứng là
suc và lac. Lý giải cho kết quả này có thể là do, khi môi trường chứa nhiều nguồn C
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường
MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1
56
khác nhau, ban đầu vi sinh vật sẽ ưu tiên đồng hóa các cơ chất mà chúng thích hợp
nhất để thực hiện quá trình trao đổi chất. Sự đồng hóa các cơ chất còn lại sẽ xảy ra
chậm hơn. Đây có thể là lý do khiến lượng EPS thu được trong các môi trường chứa
các loại đường còn lại thấp hơn. Kết quả tác động tích cực hơn của glc lên khả năng
tổng hợp EPS của hai chủng Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 trùng khớp
với công bố của Yuksekdag và cộng sự (2008) [138]; Zhang và cộng sự (2011) [141]
khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên quá trình hình thành EPS
bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12); S. thermophilus (W22) và Lb.
fermentum F6.
Sự tác động của các loại đường lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi LAB còn
liên quan đến các nồng độ bổ sung vào. Hàm lượng EPS đạt cực đại đối với các chủng
Lb. fermentum TC13, TC21 và MC3 đều ở nồng độ đường bổ sung là 4%. Cụ thể như
sau, lượng EPS sinh ra trong MRS có bổ sung thêm 4% glc là 238,817 µg/ml cho
chủng Lb. fermentum TC13; MRS có bổ sung thêm 4% lac là 179,752 µg/ml cho
chủng Lb. fermentum TC21 và MRS có bổ sung thêm 4% glc là 178,207 µg/ml cho
chủng Lb. fermentum MC3. Đối với chủng Lb. fermentum TC16, lượng EPS thu được
cao nhất khi nồng độ đường suc bổ sung là 3% (231,988 µg/ml). Ở nồng độ bổ sung
khác (2% hoặc 3%), khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng nghiên cứu có tăng
nhưng tăng không đáng kể. Tuy nhiên, ở các nồng độ đường bổ sung cao (5%, 6%)
lượng EPS tạo thành của tất cả các chủng này đều có xu hướng giảm. Điều này có thể
được giải thích là do khi nồng độ đường cao làm tăng áp suất thẩm thấu, do đó làm
ức chế sự phát triển của vi khuẩn vì vậy mà lượng EPS tạo thành bị giảm.
Ảnh hưởng của các loại đường ở các nồng độ khác nhau lên quá trình sinh tổng
hợp EPS của các chủng LAB thường không giống nhau đã được nhiều tác giả công
bố. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (B3,
G12) và S. thermophilus (W22) trong môi trường chứa các nguồn C khác nhau (gồm
glc, fruc, suc, lac) đã được nghiên cứu [138]. Kết quả cho thấy, glc là nguồn C có tác
động tốt nhất đến quá trình tổng hợp EPS đối với các chủng B3, G12 và W22. Lượng
EPS tổng hợp được đạt cực đại khi môi trường chứa 30 g/L glc (đạt 255 mg/L đối với
G12, 225 mg/L đối với B3 và 174 mg/L đối với W22). Bên cạnh đó, nhóm tác giả
57
cũng đã ghi nhận được rằng việc bổ sung fruc trong môi trường nuôi cấy đối với hai
chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus và suc cho chủng S. thermophilus đều không
có hiệu quả. Zhang và cộng sự (2011) [141] đã kết luận về khả năng sinh tổng hợp
EPS của chủng Lb. fermentum F6 đạt được cao nhất trong môi trường MRS có bổ
sung thêm 2% glc ở nhiệt độ 37oC, pH 6,5. Hàm lượng EPS sinh tổng hợp bởi chủng
này được ghi nhận tiếp tục tăng gấp đôi khi bổ sung thêm 0,5% whey protein (44,49
mg/L). Trong khi đó, với chủng S. thermophilus ST1, việc bổ sung 2% suc kết hợp
với whey protein vào môi trường chứa 10% sữa tách béo có tác dụng làm tăng tốt
nhất lượng EPS tạo thành so với các loại đường glc, lac, gal và fruc ở cùng nồng độ
[140]. Kết quả nghiên cứu của Cerning và cộng sự (1994) đã kết luận về lượng EPS
tổng hợp bởi chủng Lb. casei CG11 tăng dần theo chiều tăng của nồng độ các loại
đường bổ sung (bao gồm glc, gal, lac, suc, maltose, melibiose với các nồng độ là 2,
5, 10, 20 g/l) trong môi trường tối ưu cơ bản (BMM- basal minimum medium). Lượng
EPS đạt được cao nhất với 160 mg/L khi glc được bổ sung vào. Bên cạnh đó, nghiên
cứu cũng cho thấy rằng, lac và gal là hai loại đường có tác động kích thích kém hiệu
quả nhất đến quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng này [22]. Quá trình sinh tổng
hợp PS ngoại bào của chủng Lb. rhamnosus C83 trong BMM có chứa các nguồn C
khác nhau là glc, fruc, glc + fruc, mannose hoặc maltose với các nồng độ 20, 40 và
60g/l cũng được nghiên cứu bởi Gamar và cộng sự (1998) [45]. Kết quả nghiên cứu
cho thấy quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. rhamnosus C83 đạt tốt nhất trong
môi trường có chứa 4% mannose. So với môi trường đối chứng là MRS có chứa 2%
glc, lượng EPS tạo thành trong môi trường này đạt 132 mg/L (tăng gấp bốn lần) và
tiếp theo là trong môi trường có bổ sung 2% hỗn hợp glc + fruc (tỉ lệ 1:1) là 111 mg/L
(tăng gấp ba lần). Trong một nghiên cứu khác, Torino và cộng sự (2005) đã kết luận
về ảnh hưởng tích cực của việc sử dụng lac thay thế cho glc trong MRS lên quá trình
sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. helveticus ATCC 15807. Lượng EPS thu được
trong môi trường chứa lac tăng lên khoảng 450 % (208 mg/L) so với môi trường chứa
glc (46 mg/L) [118].
Sự tác động khác nhau của các nguồn C không giống nhau lên quá trình sinh
tổng hợp EPS bởi các chủng LAB có thể liên quan đến các phản ứng chuyển hóa xảy
58
ra trong tế bào vi khuẩn và hoạt độ của các enzyme nội bào do vi khuẩn tiết ra (Sơ đồ
Hình 1.7). Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng, với sự sinh
tổng hợp EPS trong quá trình sinh trưởng của L. lactis, một phần nguồn C sử dụng
phải được chuyển thành Glc-6-P sau đó chuyển thành Glc-1-P và tham gia vào sự
tổng hợp và hình thành EPS [69], [100]. Có nhiều con đường khác nhau để tạo thành
Glc-1-P. Quá trình này phụ thuộc vào nguồn C được sử dụng trong môi trường nuôi
cấy và hệ thống vận chuyển có sẵn trên màng tế bào (PEP-PTS) của vi khuẩn.
Grobben và cộng sự (1996) cho rằng khi chủng Lb. bulgaricus được nuôi cấy trong
môi trường chứa fruc, đường này phải trải qua nhiều phản ứng chuyển hóa khác nhau
để tạo thành Glc-1-P. Sự chuyển hóa qua nhiều giai đoạn khác nhau đã dẫn đến quá
trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn
xảy ra chậm hơn. Nghiên cứu này cũng chỉ ra một con đường khác ngắn hơn để hình
thành Glc-1-P là tiến hành nuôi cấy chủng này trong môi trường chứa glc. Lúc đó,
thông qua PEP-glc PTS, glc sẽ nhanh chóng tạo thành Glc-6-P và hợp chất này được
trực tiếp chuyển thành Glc-1-P [55]. Công bố của de Vos và Vaughan (1994) kết luận
rằng, khi L. lactis được nuôi cấy trong môi trường chứa lac, lac sẽ được chuyển qua
màng tế bào nhờ hệ thống vận chuyển phosphotransferase lac và tạo lac-6-phosphate
ở bên trong màng tế bào. Ở bên trong tế bào, lac-6-phosphate được tạo thành gal-6-
P, α- Glc-6-P và glc dưới sự xúc tác của các enzyme khác nhau (phospho –β-
galactosidase, glucokinase) [26]. Ngược lại, chủng S. thermophilus âm tính với gal,
nó sẽ sử dụng đường lac bằng cách kết hợp lac permease trong một hệ thống vận tải
trung gian antiport và tạo ra Glc-6-P trong tế bào nhờ sự xúc tác đồng thời của các
enzyme glycosidase và glycokinase [97]. Ảnh hưởng của fruc và glc lên quá trình
sinh tổng hợp EPS và hoạt tính của các enzyme liên quan đến sự tổng hợp các
nucleotide đường của chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB2772 cũng được
chứng minh bởi Grobben và cộng sự (1996). Khi được nuôi cấy trong môi trường có
bổ sung fruc, chủng này sinh tổng hợp EPS với lượng khá thấp, chỉ đạt khoảng 25
mg/L. Khi nguồn C được sử dụng là hỗn hợp của glc và fruc hoặc chỉ chứa glc, quá
trình sinh tổng hợp EPS đạt 80 mg/L. Kết quả phân tích các enzyme liên quan đến
quá trình tổng hợp các nucleotide đường khi nuôi cấy chủng Lb. delbrueckii subsp.
59
bulgaricus NCFB2772 trong các môi trường chứa 167 mM fruc, 83 mM fruc + 83
mM glc hoặc 167 glc chỉ ra rằng, hoạt độ của các enzyme tham gia vào con đường
đường phân và tổng hợp nên các nucleotide đường (UDP-glc pyrophosphorylase) có
sự khác biệt rõ rệt. Hoạt độ của các enzyme này trong môi trường chứa fruc thấp hơn
so với glc. Điều này cho thấy, nguyên nhân khiến lượng EPS tạo thành trong môi
trường chứa glc cao hơn so với fruc là do quá trình tổng hợp các nucleotide đường
như UDP-glc và UDP-gal xảy ra chậm hơn trong môi trường chứa fruc. Bên cạnh đó,
hoạt độ của fruc 1,6-bisphosphate cũng thấp hơn so với glc 1,6-bisphosphate. Chính
vì thế đã dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng EPS tổng hợp được trong một thời gian
nhất định [55].
Như vậy, sự chuyển hóa các cơ chất xảy ra trong tế bào để hình thành nên các
đơn vị lặp lại của EPS có liên quan đến một loạt các enzyme của vi khuẩn, đặc biệt
là tính đặc hiệu của từng loại enzyme. Khi nguồn cơ chất sử dụng cho quá trình sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn không phù hợp, hoạt độ của enzyme đó có thể bị
bất hoạt hoặc thể hiện hoạt độ rất kém do đó lượng EPS tạo thành sẽ ít hơn. Trong
thành phần môi trường nuôi cấy các chủng Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum
MC3 chứa nguồn C là glc – chính nguồn này là cơ chất chủ yếu cho quá trình sinh
tổng hợp EPS ngoại bào. Từ các lý giải này, kết hợp với kết quả đạt được trong nghiên
cứu cho phép chúng tôi kết luận rằng hoạt độ của hệ enzyme hexokinase (chuyển hóa
Glc thành Glc-6-P), PGM (chuyển hóa Glc-6-P thành Glc-1-P) trong tế bào vi khuẩn
Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 là rất mạnh.
Trong khi đó, với Lb. fermentum TC21, hoạt độ của PGM tham gia chuyển hóa
Gal-1-P thành Glc-1-P có thể lớn hơn so với hoạt độ của PGM (tham gia chuyển hóa
Glc-6-P thành Glc-1-P) do đó, với chủng vi khuẩn này, lac là nguồn cơ chất phù hợp
hơn cho chủng này sử dụng trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Tương tự, với
Lb. fermentum TC16, hoạt độ của hexokinase tham gia chuyển hóa fruc thành fruc-
6-P cao hơn so với hoạt độ của hexokinase chuyển hóa glc thành Glc-6-P nên cơ chất
được ưu tiên sử dụng hơn trong quá trình phát triển của chủng này là suc (Hình 1.7).
Sự liên quan của hoạt độ enzyme nội bào đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi LAB
cũng đã được làm sáng tỏ trong nghiên cứu của Torino và cộng sự (2005) khi nhóm
60
tác giả này đã kết luận rằng, quá trình sinh tổng hợp enzyme α-phosphoglucomutase
(α-PGM) có liên quan đến sự tổng hợp EPS. Khi glc được sử dụng như là nguồn C
cho sự phát triển của vi khuẩn, quá trình sinh tổng hợp EPS đạt thấp hơn đã được
quan sát cùng với sự giảm hoạt tính của các enzyme α-PGM và gal 1-phosphate-
uridyltransferase (GalT). Ngược lại, hoạt tính của hai enzym này đã tăng lên đáng kể
khi thay thế glc bằng lac, từ đó dẫn đến lượng EPS tạo thành cũng được cải thiện tốt
hơn. α- PGM và GalT là hai enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp nên các
nucleotide đường UDP-glc and UDP-gal EPS. Đây chính là tiền thân của các monome
tổng hợp nên EPS [118]. Một công bố tương tự của Levander và cộng sự (2002) đã
cho thấy, lượng EPS tạo thành từ S. thermophilus có thể được cải thiện nhờ sự thay
đổi vị trí của các enzyme trong quá trình trao đổi chất mà quá trình này có liên quan
đến các nucleotide đường [71].
Như vậy, ảnh hưởng của nguồn carbohydrate lên quá trình sinh tổng hợp EPS
của các chủng thuộc LAB còn phụ thuộc vào các chủng cụ thể, các thành phần khác
có trong môi trường, những đặc điểm về khả năng đồng hóa nguồn carbohydrate của
tế bào cũng như hoạt độ của các enzyme xúc tác [86].
Tóm lại, với sự đa dạng của các con đường tạo nên Glc-1-P trong quá trình sinh
tổng hợp EPS của vi khuẩn, việc sử dụng các loại đường có sẵn để tổng hợp nên hợp
chất này sẽ dễ dàng hơn cho quá trình hình thành sản phẩm khi hoạt độ của hệ enzyme
tham gia vào quá trình chuyển hóa đó thể hiện nổi trội hơn. Bên cạnh đó, các
monosaccharide sẽ được chuyển hóa nhanh hơn so với các dạng disaccharide hoặc
PS. Điều này cũng tương đối phù hợp với kết quả khảo sát ảnh hưởng của các loại
đường với các nồng độ khác nhau khi mà glc có tác động kích thích sớm và đều hơn
so với lac và suc. Chính lý do này khiến lượng lượng sản phẩm tạo thành trong môi
trường chứa glc đã được ổn định khi ở các nồng độ thấp. Trong khi đó, với lac và suc
khả năng đồng hóa của vi khuẩn xảy ra chậm do đó, lượng sản phẩm tổng hợp được
ban đầu sẽ ít hơn. Tuy nhiên trong quá trình lên men, sự thủy phân của hai loại đường
này có thể sẽ có lợi hơn cho sự phát triển và sinh tổng hợp EPS, do đó hiệu quả của
hai loại đường này thường thể hiện rõ rệt hơn khi ở nồng độ bổ sung lớn hơn. Với
61
môi trường MRS có bổ sung thêm các loại đường phù hợp nhất và có sự khác nhau
tùy vào từng chủng, chúng tôi quy ước gọi tên là môi trường thích hợp (MTTH).
3.1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng
hợp EPS
Ảnh hưởng của nguồn N lên quá trình sinh EPS của các chủng này đã được khảo
sát. Các chủng vi khuẩn Lb. fermentum được lên men ở 37oC, 48 giờ trong MTTH
tương ứng của chúng, đồng thời có bổ sung thêm các nguồn N như peptone, cao thịt,
cao nấm với các nồng độ khác nhau theo mô tả ở mục 2.3.3.2.
Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb. fermentum TC16,
TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt. Cụ thể, lượng EPS đạt được trong
môi trường này là 344,305 µg/ml cho Lb. fermentum TC16 và 301,988 µg/ml cho Lb.
fermentum TC21. Đối với chủng Lb. fermentum TC13 và MC3, khả năng sinh tổng
Các mức
bổ sung Các mức
bổ sung
Các mức
bổ sung
Các mức
bổ sung
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến
khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và
cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% bổ sung vào MTTH
* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.2
62
hợp EPS của cả hai chủng này đạt cực đại trong môi trường có bổ sung thêm cao nấm.
Trong đó, với nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4%, chủng Lb. fermetum TC13 sinh EPS
lớn nhất với 357,354 µg EPS/ml. EPS thu được từ chủng Lb. fermentum MC3 cao
nhất là 382,963 µg/ml khi chủng này phát triển trong điều kiện có bổ sung thêm 0,3%
cao nấm (Hình 3.3).
Từ kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy rằng, việc bổ sung thêm các nguồn N khác
nhau ở các nồng độ không giống nhau vào MTTH đã được khảo sát có ảnh hưởng rõ
rệt đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn Lb. fermentum TC13,
TC16, TC21, MC3.
Bên cạnh sự tác động theo chiều hướng tích cực khi bổ sung cao nấm và cao
thịt vào MTTH của chúng thì sự tác động của pepton được ghi nhận là chậm hơn,
thậm chí ở một số chủng, lượng EPS tạo thành còn thấp hơn so với môi trường đối
chứng. Cụ thể là, khả năng kích thích của thành phần này lên quá trình sinh tổng hợp
EPS của chủng Lb. fermentum TC13 đã không thể hiện rõ rệt ở các nồng độ bổ sung
là 0,2%, 0,4%. Lượng EPS quan sát được trong các điều kiện lên men này không có
sự sai khác so với môi trường đối chứng – là môi trường không bổ sung thêm nguồn
pepton khi xử lý thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05. Ở nồng độ bổ sung cao hơn là
0,6%, 0,8%, 1,0%, lượng EPS tạo ra nhiều hơn với sự sai khác có ý nghĩa thống kê
(Hình 3.3). Với chủng Lb. fermentum TC16, khả năng kích thích của pepton đã không
xảy ra khi nồng độ pepton bổ sung vào ở các mức 0,2%, 0,4% và 0,6%. Hàm lượng
EPS đạt được trong các môi trường được bổ sung các nồng độ này đều thấp hơn so
với đối chứng. Lượng EPS thu được ở các nồng độ này chỉ dao động từ 183,207 µg/ml
đến 196,134 µg/ml trong khi môi trường đối chứng là 239,305 µg/ml. Quá trình kích
thích của pepton lên khả năng sinh tổng hợp EPS chỉ xảy ra khi nồng độ pepton bổ
sung vào cao. Và lượng EPS cũng tăng lên tương tự như chủng Lb. fermentum TC13.
Lượng EPS sinh tổng hợp được từ Lb. fermentum TC16 đạt 314,305 µg/ml và 264,427
µg/ml khi nồng độ pepton bổ sung vào tăng tương ứng là 0,8% và 1%. Dữ liệu trên
bảng 3.2 cũng cho thấy, tác dụng kích thích của pepton đến lượng EPS sinh tổng hợp
bởi Lb. fermentum TC21 và MC3 không hiệu quả khi thành phần này được bổ sung
ở các nồng độ thấp (0,2% và 0,4%). Hàm lượng EPS thu được thực sự cao hơn nhiều
63
khi nồng độ pepton bổ sung là 0,6%, 0,8%, 1,0% đối với chủng Lb. fermentum TC21
và 0,8%, 1,0% đối với chủng Lb. fermentum MC3. Ở các nồng độ còn lại, lượng EPS
tạo thành tương đối ít, đặc biệt đối với chủng Lb. fermentum MC3, hàm lượng EPS
thu được thấp hơn hẳn so với môi trường đối chứng khi nồng độ pepton thêm vào là
0,2%.
Đối với nguồn cao thịt, ngoại trừ chủng Lb. fermentum MC3, quá trình sinh tổng
hợp EPS bởi Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 chịu ảnh hưởng nhiều hơn và có sự
tăng vượt trội về lượng EPS tạo thành so với các nguồn N bổ sung còn lại. Lượng
EPS tạo thành của hai chủng Lb. fermentum TC13 và TC21 có sự tăng lên theo chiều
tăng của nồng độ cao thịt bổ sung và đều đạt tốt nhất ở nồng độ bổ sung là 0,8% (đạt
347,476 µg/ml cho Lb. fermentum TC13 và 136,500 µg/ml cho Lb. fermentum TC21).
Sự kích thích quá trình sinh tổng hợp EPS cũng xảy ra tương tự đối với chủng Lb.
fermentum TC16, chỉ khác là lượng EPS tạo thành chỉ đạt cao hơn nhiều khi nồng độ
cao thịt bổ sung lớn (0,6%, 0,8%, 1,0%). EPS tạo thành đều rất thấp, thấp hơn môi
trường đối chứng của chủng này được ghi nhận ở hai nồng độ cao thịt bổ sung là
0,2% và 0,4% với EPS tương ứng là 195,159 µg/ml và 219,793 µg/ml. Với chủng
MC3, sự kích thích của cao thịt lên quá trình sinh tổng hợp EPS hầu như không xảy
ra. Lượng EPS thu được ở tất cả các nồng độ bổ sung được nghiên cứu đều thấp hơn
nhiều so với môi trường đối chứng. Với chủng MC3, sự kích thích của cao thịt lên
quá trình sinh tổng hợp EPS hầu như không xảy ra. Lượng EPS thu được ở tất cả các
nồng độ bổ sung được nghiên cứu đều thấp hơn nhiều so với môi trường đối chứng.
Đối với nguồn N là cao nấm, chủng chịu ảnh hưởng nhiều nhất là MC3, tiếp đến
là chủng TC13. Với Lb. fermentum MC3, lượng EPS đã tăng mạnh khi nồng độ cao
nấm bổ sung thêm vào chỉ mới 0,1% (tăng 171,21% so với môi trường đối chứng) và
sau đó tăng nhanh ở các nồng độ 0,2%, 0,3% và chỉ giảm nhẹ ở các nồng độ 0,4%,
0,5%. EPS tại các nồng độ cao nấm cao 0,4% và 0,5% lần lượt là 329,793 µg/ml và
280,199 µg/ml trong khi môi trường đối chứng là 174,915 µg/ml. Sự kích thích tốt
lên quá trình tổng hợp EPS của cao nấm cũng xảy ra đối với chủng TC13. Hàm lượng
EPS tạo thành tăng cao khi nồng độ cao nấm bổ sung là 0,3%, 0,4% và chỉ giảm nhẹ
ở 0,5% (Hình 3.3). Khả năng kích thích của cao nấm lên quá trình tổng hợp EPS của
64
Lb. fermentum TC21 là tương đối chậm. EPS tạo thành chỉ dao động từ 211,256 µg/ml
ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,5% đến 281,378 µg/ml ở nồng độ cao nấm bổ sung
là 0,4%, trong khi EPS sinh ra từ môi trường không bổ sung cao nấm của chủng này
đã đạt 180,525 µg/ml. Với chủng TC16, sự hình thành EPS trong môi trường được
bổ sung thêm cao nấm ở nồng độ 0,1% và 0,2% đều thấp hơn nhiều so với mẫu đối
chứng. Sau đó có xu hướng tăng nhẹ ở các nồng độ cao hơn. Sự tác động khác nhau
của các nguồn N lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum trong
nghiên cứu này cũng được làm sáng tỏ khi xử lý thống kê (p<0,05) (Phụ lục 4.2).
Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy rằng, việc bổ sung thêm nguồn N
vào MTTH đã có tác dụng kích thích rõ rệt và đa phần đều có tác dụng tích cực. Hiệu
quả kích thích mạnh mẽ của các nguồn N bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy có
lẽ do chúng chứa các hợp chất ở dạng đơn giản dễ đồng hóa như các peptide, các acid
amin, vitamin và các khoáng chất cần thiết cho tế bào trong quá trình sinh trưởng và
phát triển đặc biệt là cao nấm và cao thịt. Khi khả năng đồng hóa của tế bào tăng lên
trong quá trình trao đổi chất sẽ dẫn đến lượng sản phẩm tạo thành cao hơn. Mặt khác,
có lẽ các nguồn N này có thể có chứa các thành phần có tác dụng kích thích sự phát
triển dưới dạng vết nhờ đó mà làm tăng lượng EPS thu được cao hơn so với môi
trường không chứa nguồn N [66]. Bên cạnh sự tăng lên của các sản phẩm tạo thành
trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn thì một số nguồn N lại không có khả năng
kích thích tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đặc biệt là ở
những nồng độ bổ sung thêm vào thấp. Điều này có thể là do các cơ chất này không
phải là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn đặc biệt là khi các
chất này ở nồng độ thấp.
Những công bố khác nhau về ảnh hưởng của nguồn N lên quá trình tổng hợp
EPS từ các chủng thuộc LAB cũng đã được công bố. Seesuriyachan và cộng sự (2011)
đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các nguồn N (pepton, cao thịt, cao nấm) lên quá
trình sinh EPS của Lb. confusus TISTR 1498 trong môi trường có chứa nước dừa như
là một nguồn C thay thế. Kết quả chỉ ra rằng, trong môi trường MRS với việc thay
thế hoàn toàn nước cất bằng nước dừa có bổ sung thêm 2% suc, sự giảm hàm lượng
ba thành phần pepton, cao thịt, dịch chiết nấm men được coi là có hiệu quả tốt đối
65
với quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng này. Quá trình tổng hợp EPS đạt tốt nhất
khi hàm lượng pepton, cao thịt, dịch chiết nấm men giảm xuống 1/2 so với ban đầu
(5 g/l pepton, 2,5 g/l cao nấm, 2,5 g/l cao nấm). Lượng EPS tạo thành trong trường
hợp này là 12,3 g/L (tăng hơn 3 lần so với việc giữ nguyên hàm lượng của các thành
phần này trong MRS) [111]. Nghiên cứu của Rabha và cộng sự (2011) về ảnh hưởng
của thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh EPS của chủng S.
thermophilus BN1 đã được thực hiện. Các nguồn N được sử dụng để khảo sát trong
nghiên cứu này là sữa tách béo, sữa nguyên kem và dịch whey từ quá trình chế biến
pho mát. Kết quả cho thấy, chủng S. thermophilus BN1 có khả năng sinh tổng hợp
EPS trong tất cả các điều kiện được khảo sát, tuy nhiên đã có sự khác biệt đáng kể về
lượng EPS tạo thành trong các điều kiện nuôi cấy với nguồn dinh dưỡng khác nhau.
Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt giá trị cao nhất trong môi trường chứa sữa tách béo
với hàm lượng 548 PDM/mg (PDM- polymer dry mass), tiếp theo là môi trường chứa
whey từ quá trình sản xuất pho mát 375 PDM/mg và cuối cùng là 325 PDM/mg trong
môi trường chứa sữa nguyên kem [99]. Chủng S. thermophilus ST1 có khả năng sinh
tổng hợp EPS ở tất cả các môi trường được khảo sát là kết luận của Zhang và cộng
sự (2011). Lượng EPS đạt được giá trị cao nhất (135,80 mg/l) trong môi trường có
bổ sung 2% suc và 0,5% WPC [140]. Trong khi đó, ở điều kiện 37oC, pH ban đầu
6,5, khả năng phát triển và sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. fermentum F6 trong môi
trường sữa tách béo đều được kích thích khi bổ sung thêm 2% glc và 0,5% WPC.
Lượng EPS đạt được sau 32 giờ nuôi cấy trong trường hợp này tăng lên khoảng
134,61 % so với môi trường không chứa WPC (đạt 33,05 mg/l) [141]. Việc bổ sung
dịch whey protein có tác dụng kích thích khả năng sinh tổng hợp EPS của S.
thermophilus ST111 cũng là công bố của Vaningelgem và cộng sự [120]. Trong môi
trường chứa 4% fruc và 2,5% bột pepton cao nấm, Pleurotus citrinopileatus sinh tổng
hợp EPS đạt được là cao nhất (1,87 g/l) là công bố của Wu và cộng sự (2008) [134].
Như vậy, có thể nói sự sinh trưởng của vi sinh vật chịu tác động không phải chỉ
bởi một chất dinh dưỡng nhất định mà có thể bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất
dinh dưỡng đồng thời. Việc tăng khả năng sinh tổng hợp EPS trong các điều kiện
nuôi cấy có chứa các nguồn C và N khác nhau có thể còn liên quan đến tỉ lệ của chúng
trong môi trường. Một tỉ lệ C: N thích hợp có khả năng kích thích tốt hơn đến quá
trình sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào vi khuẩn. Do đó, ngoài sự tác động của
66
các nguồn dinh dưỡng khác nhau thì nồng độ của chúng cũng có ảnh hưởng không
nhỏ đến sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong môi trường nuôi cấy. Trong một
số trường hợp nuôi cấy, nguồn C được tìm thấy trong nguồn N có thể xem như là một
chất nền cho quá trình sinh tổng hợp EPS [25]. Điều này góp phần tăng tỷ lệ C: N, do
đó thúc đẩy quá trình tổng hợp EPS. Theo công bố của Vermani và cộng sự (1997)
thì việc bổ sung lượng nhỏ N có tác dụng kích thích năng suất EPS tạo thành [122]
và nồng độ sinh khối đạt được cao hơn khi tăng nồng độ N trong một giới hạn nhất
định [121]. Những kết quả thu được trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với
những lý giải từ các công bố của các tác giả trên. Vì thế, chúng tôi đã chọn ra được
thành phần môi trường chứa nguồn C và N thích hợp cho các chủng Lb. fermentum
TC13, TC16, TC21, MC3 sinh tổng hợp EPS lần lượt tương ứng là 4% glc + 0,4%
cao nấm; 3% suc + 0,8% cao thịt; 4% lac + 0,8% cao thịt; và 4% suc + 0,3% cao nấm.
3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các
chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3
3.1.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu
Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sinh tổng
hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 trong môi trường
chứa các nguồn dinh dưỡng bổ sung được khảo sát ở các mức 104, 105 106, 107 và 108
cfu/ml với điều kiện nuôi cấy ban đầu là 37oC, pH 6,0 – 6,2.
391,338348,898304,508
383,980
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
4 5 6 7 8
EP
S (
µg
/ml)
Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu (lg cfu/ml)
TC13
TC16
TC21
MC3
Các chủng Lb.
fermentum
104 105 106 107 108
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh
tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum
* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.3
67
Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum
TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 cfu/ml. EPS đạt được ở
nồng độ này lần lượt của TC16 là 348,898 µg/ml, của TC21 là 304,508 µg/ml, của
MC3 là 383,98 µg/ml . Khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng TC13 xảy ra mạnh
và đạt cực đại ở mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 107 cfu/ml với hàm lượng là
391,338 µg/ml. Hàm lượng EPS tại các môi trường có các mật độ tế bào cao hơn hoặc
thấp hơn đều thấp (Hình 3.4)
Kết quả xử lý thống kê cho thấy rằng, ở chủng Lb. fermentum T13, lượng EPS
thu được trong hai môi trường có mật độ gieo cấy ban đầu là 104 cfu/ml và 108 cfu/ml
là không có sự sai khác; ở chủng Lb. fermentum TC21, sự sai khác đã không xảy ra
ở mật độ nuôi cấy ban đầu là 105 cfu/ml và 106 cfu/ml; ở chủng Lb. fermentum TC21,
sự giống nhau về lượng sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở các nồng độ 105 cfu/ml,
106 cfu/ml và 107 cfu/ml (với p<0,05) (Phụ lục 4.3).
Sự tạo thành EPS trong quá trình phát triển của vi khuẩn có liên quan rất lớn
đến mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu. Ở mật độ tế bào nuôi cấy quá cao (107, 108 cfu/ml
đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 và 108 cfu/ml đối với TC13)
hoặc quá thấp (104, 105 cfu/ml đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3
và 104, 105, 106 cfu/ml đối với TC13), khả năng phát triển của vi khuẩn có thể bị giảm
dẫn đến khả năng tạo thành sản phẩm bị thấp hơn.
Điều này có thể được giải thích là khi lượng tế bào gieo cấy vào môi trường quá
ít (mật độ pha loãng cao) sự sinh trưởng xảy ra tốt nhưng do số lượng tế bào vi khuẩn
được gieo cấy vào môi trường ít hơn do đó khả năng tạo ra sản phẩm của quá trình
trao đổi chất trong một thời gian nhất định lại ít hơn. Điều này dẫn đến sản phẩm tạo
thành sẽ thấp. Ngược lại, khi lượng tế bào ban đầu gieo cấy vào môi trường quá nhiều
(mật độ pha loãng ít) và lượng chất dinh dưỡng được cố định lúc này sẽ xuất hiện sự
cạnh tranh cao về nguồn dinh dưỡng trong môi trường do đó khả năng sử dụng cơ
chất trong quá trình trao đổi chất của các tế bào bị giảm, tế bào phải dùng phần lớn
năng lượng để duy trì sự sống nên sự sinh trưởng và phát triển bị hạn chế do đó làm
giảm khả năng hình thành sản phẩm trao đổi chất của chúng. Hay nói cách khác, quá
trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn thực sự có hiệu quả khi tế bào có thể sử
68
dụng năng lượng vượt quá mức năng lượng để duy trì sự sống của chúng. Chính vì
vậy, để quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn trong cùng một điều kiện về dinh
dưỡng, cùng một thời gian cố định được tốt, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu cần phù
hợp, không quá thấp và cũng không nên quá cao. Bên cạnh đó, sự tác động không
giống nhau về mật độ tế bào gieo cấy ban đầu đến lượng EPS tạo thành của các chủng
vi khuẩn khác nhau còn liên quan đến giai đoạn sinh trưởng, phát triển của các tế bào
được gieo cấy vào môi trường. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn
có thể xảy ra nhanh hơn nếu giai đoạn thích nghi (pha tiền phát) với môi trường của
tế bào vi khuẩn ngắn và ngược lại, khi giai đoạn này kéo dài, quá trình sinh tổng hợp
EPS xảy ra chậm hơn.
Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi kết luận rằng, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu
thích hợp nhất là 107 cfu/ml cho chủng TC13 và 106 cfu/ml cho các chủng Lb.
fermentum TC16, TC21, MC3.
3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh
tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của các loại vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Nhiều vi khuẩn sản xuất EPS trong điều kiện môi trường pH trung tính, một số có thể
sinh tổng hợp tại các giá trị pH có tính acid [18]. Như vậy, các chủng vi khuẩn khác
nhau có thể có sự thích ứng với các giá trị pH không giống nhau. Tác động của pH
ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16,
TC21, MC3 được thực hiện sau khi xác định được thành phần môi trường và mật độ
tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp.
Ảnh hưởng của pH ban đầu (bao gồm 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5) lên quá trình
sinh EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đã được khảo sát
khi tiến hành lên men các chủng này ở 37oC trong môi trường chứa nguồn C, N và
mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp đã được xác định. Thí nghiệm được mô tả
chi tiết ở mục 2.3.3.4. Kết quả là trung bình của 3 lần lặp lại sau khi đã xử lý thống
kê.
Quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21,
MC3 đều chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi pH ban đầu của môi trường. Lượng EPS sinh ra
69
của các chủng TC16, TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với
chủng TC13. Hàm lượng EPS thu được tương ứng tại các giá trị pH này của các chủng
lần lượt là 380,484 µg/ml; 382,654 µg/ml; 420,809 µg/ml và 405,037 µg/ml (Hình
3.5).
Hàm lượng EPS đạt được của chủng TC13 trong môi trường có giá trị pH 5,5;
6,5 và môi trường tự nhiên (ĐC)– là môi trường không điều chỉnh pH đều không có
sự sai khác khi xử lý thống kê (p<0,05) (Phụ lục 4.4). Quá trình tổng hợp EPS của
chủng TC16 xảy ra tương tự nhau ở các mức pH 5,0; 5,5 và thấp hơn ở mức pH 6,5
và dưới 5,0. Trong khi đó, với chủng TC21, lượng EPS thu được ở các mức pH còn
lại (pH 5,5; 5,0; 4,5; và 4,0) đều đạt thấp hơn rất nhiều so với giá trị cực đại. Phần
trăm EPS dao động ở các mức pH này chỉ chiếm khoảng 54,25 – 74,27% so với giá
trị cực đại tại pH 6,0. Khi tăng pH ban đầu lên 6,5, quá trình sinh EPS giảm nhẹ, EPS
còn lại khoảng 91,22%. Đối với chủng MC3, ngoài hai mức pH 5,5 và 5,0 chủng này
sinh tổng hợp EPS cao. Ở các mức pH còn lại (4,0; 4,5; 6,0; 6,5), khả năng sinh EPS
giảm dần và đặc biệt là đạt thấp nhất khi pH ban đầu là 6,5. Như vậy, khoảng pH ban
đầu thích hợp cho các chủng khác nhau có thể giống nhau hoặc khác nhau. Tuy nhiên,
nó chủ yếu dao động trong khoảng pH 5,5 - 6,0. Việc nuôi cấy trong môi trường có
giá trị pH nằm ngoài khoảng này thì khả năng phát triển đều bị giảm và số lượng sản
phẩm tạo thành sẽ ít hơn.
405,037380,484
328,654
420,809
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
4 4.5 5 5.5 6 6.5 ĐC
EP
S (
µg
/ml)
pH ban đầu
TC13
TC16
TC21
MC3
Các chủng Lb.
fermentum
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ĐC
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi
các chủng Lb. fermentum
Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.4
70
pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Sự tác động trực
tiếp của pH lên vi sinh vật có thể thông qua việc các ion H+ trong môi trường làm
thay đổi trạng thái điện li của thành tế bào. Mặt khác, sự thay đổi về giá trị pH cũng
có thể làm ức chế một phần nào đó các enzyme có mặt trên thành tế bào trong đó đặc
biệt phải kể đến là các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn.
Khả năng sinh tổng hợp tốt trong khoảng pH trung tính của các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về ảnh
hưởng của điều kiện nuôi cấy lên một số chủng thuộc LAB đã được công bố.
Khả năng sinh tổng hợp EPS của Lb. plantarum KF5 trong môi trường MRS có
bổ sung thêm dịch whey đạt cao nhất tại pH 6,3 [130]. Trong khi Lb. confusus TISTR
1498 sinh EPS trong môi trường có sự thay thế 100% nước cất bằng nước dừa đạt
cao nhất tại pH 5,5 [111]. Sự phát triển và sinh tổng hợp EPS bởi Lb. fermentum F6
phân lập từ các sản phẩm sữa truyền thống của Trung Quốc đã được nghiên cứu khi
chủng này được nuôi cấy trong môi trường chứa 10% (w/v) sữa tách béo với điều
kiện lên men khác nhau. Kết quả cho thấy rằng khi nuôi cấy Lb. fermentum F6 ở nhiệt
độ 37°C và pH 6,5 thì sự phát triển đạt được là tối ưu và đây cũng là điều kiện thuận
lợi cho sự sinh tổng hợp EPS. Với điều kiện về nhiệt độ và pH này, quá trình sinh
tổng hợp EPS của chủng Lb. fermentum F6 tiếp tục được cải thiện tăng lên gấp hai
lần khi thực hiện bổ sung vào môi trường ban đầu 2% (w /v) glc và 0,5% (w/v) WPC.
Hàm lượng EPS thu được trong điều kiện này đạt 44,49 mg/l so với môi trường đối
chứng (15,11 mg/l) [141]. Giá trị pH ban đầu 6,5 phù hợp nhất cho chủng Lb.
fermentum F6 sinh tổng hợp EPS và cũng là kết quả công bố của Fukuda và cộng sự
(2010) [44], Zhang và cộng sự (2011) [140] khi thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của
pH đến khả năng sinh EPS của một số chủng thuộc LAB tương ứng là Lb. fermentum
TDS030603, S. thermophilus ST1. Mặc dù pH thích hợp cho quá trình sinh EPS có
sự khác nhau trong các chủng LAB khác nhau, tuy nhiên, nó thường nằm trong
khoảng gần pH 6,0 [30], [35].
Ở các mức pH thấp (pH 4,0; 4,5), quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS
của các chủng đều bị hạn chế. Nguyên nhân có thể là do trong môi trường có tính acid
sẽ làm thay đổi trạng thái điện li của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng
71
sử dụng chúng của vi sinh vật. Hơn nữa, khi môi trường càng acid (pH thấp), khả năng
gây ra sự biến tính đối với các enzyme tham gia vào quá trình xúc tác tổng hợp EPS
trong tế bào vi khuẩn như hệ enzyme pyrophosphorylase, guanylytransferase,
dehydrogenase, epimerase,… xảy ra càng dễ dàng. Kết quả là các enzyme này bị bất
hoạt một phần do đó, sản phẩm tạo thành sẽ bị giảm.
Bên cạnh đó, trong quá trình sinh trưởng và phát triển, các vi sinh vật thường
sinh ra các chất thải có tính acid hoặc kiềm nên sẽ làm thay đổi pH của môi trường
như sự lên men carbohydrate tạo ra các acid hữu cơ hoặc sự phân giải các acid amin
sinh ra NH3…. Những chất này có thể làm ức chế quá trình sinh trưởng của vi sinh vật;
do đó làm giảm khả năng tổng hợp của tế bào để tạo thành các sản phẩm thứ cấp của
chúng. Khi nồng độ ion H+ trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi
sinh vật thì sự sống của chúng sẽ bị ức chế, quá trình trao đổi chất có thể xảy ra theo
một hướng khác. Lí do này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu khi khoảng pH
thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn Lb. fermentum
TC13, TC16, TC21, MC3 này đều nằm trong khoảng pH 5,5 – 6,0. Đây cũng là mức
pH thường gặp chủ yếu trong môi trường tự nhiên, do đó đây có thể là một lợi thế
nếu sử dụng trực tiếp các chủng vi khuẩn này khi ứng dụng trong các sản phẩm thực
phẩm.
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng
rất lớn đối với vi sinh vật. Để phát triển, mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ
tối ưu nhất định và ở nhiệt độ này sự phát triển của vi sinh vật xảy ra thuận lợi nhất.
Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn
cảm với sự biến hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự thay đổi về nhiệt
độ của môi trường xung quanh. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ban đầu lên khả
năng sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3
đã được khảo sát khi tiến hành nuôi cấy các chủng này phát triển ở các mức nhiệt độ
lần lượt là 30, 35, 40 và 45oC trong 48 giờ với mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu và các
giá trị pH thích hợp đã được nghiên cứu ở trên.
72
Kết quả từ Hình 3.6 cho thấy, khả năng sinh trưởng và tổng hợp EPS của các
chủng vi khuẩn khảo sát đạt tích cực đều nằm trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 40 oC và
giá trị EPS đạt cực đại tại các mức nhiệt khác nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn.
Hàm lượng EPS tăng mạnh và đạt giá trị cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum
TC16, TC21, MC3 đều ở 35 oC, trong khi chủng TC13 là ở 40 oC. Lượng EPS thu
được tại các mức nhiệt độ này tương ứng là 405,402 µg/ml; 376,134 µg/ml; 421,947
µg/ml và 419,183 µg/ml.
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng thuộc
LAB cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Nhiều tác giả đã kết luận rằng, nhiệt độ
phát triển là một thông số có tác động rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS. Rabha
và cộng sự (2011) đã thực hiện khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men bao gồm
môi trường nuôi cấy, nhiệt độ ủ lên quá trình sinh EPS của chủng S. thermophilus
BN1 [99]. Theo đó, các tác giả đã tiến hành nuôi cấy chủng này trong môi trường
chứa sữa tách béo, sữa hoàn nguyên và dịch whey pho mát ở hai mức nhiệt độ là 37oC
và 42oC. Kết quả cho thấy, quá trình sinh EPS xảy ra ở cả hai mức nhiệt độ khảo sát,
tuy nhiên lượng EPS thu được đạt cao hơn ở 37oC trong cả ba môi trường. Zhang và
cộng sự (2011) đã khảo sát quá trình sinh trưởng và tổng hợp EPS bởi Lb. fermentum
F6 ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Kết quả chỉ ra rằng, quá trình tổng hợp EPS
của chủng Lb. fermentum F6 đạt tốt nhất ở 37oC trong môi trường chứa 10% sữa tách
Các chủng Lb.
fermentum
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi
các chủng Lb. fermentum
Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.5
73
béo, 2% glc và 0,5% whey protein với pH ban đầu là 6,5. Lượng EPS thu được cao
nhất trong điều kiện này là 44,49 mg/l [141]. Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cực
đại tại 37oC cũng được chỉ ra bởi các tác giả Yadav và cộng sự (2011) [136], Gorska-
Fra˛czek và cộng sự (2011, 2013) [53], [54], Wang và cộng sự (2015) [124], Calsteren
và cộng sự 2015) [17]. Thông số nhiệt độ có sự khác nhau tùy thuộc vào từng chủng
vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy. Gorret và cộng sự (2001) đã công bố rằng, quá trình
tổng hợp EPS bởi chủng Propionibacterium acidipropionici đạt được tốt hơn khi nuôi
cấy ở nhiệt độ dưới 37oC. Ở cùng điều kiện nuôi cấy, lượng EPS sinh tổng hợp bởi
chủng này đạt tốt hơn ở 23oC (0,25g/L), trong khi đó, ở 37oC, quá trình tổng hợp EPS
gần như bị ức chế hoàn toàn (0g/L) [51]. Kết quả này có thể được giải thích bằng các
cơ chế do Sutherland (1972) đề xuất, tức là khi giảm nhiệt độ dẫn đến sự sụt giảm tốc
độ sinh trưởng và sinh tổng hợp polyme ở thành tế bào, tạo ra nhiều tiền chất có sẵn
để tổng hợp EPS [115].
Ở 42oC, chủng S. thermophilus ST1 có khả năng phát triển tối ưu và tạo được
lượng EPS cao nhất sau 32 giờ nuôi cấy là công bố của Zhang và cộng sự (2011) khi
nghiên cứu về sự phát triển và quá trình tổng hợp EPS bởi chủng này trong môi trường
chứa sữa tách béo. Lượng EPS thu được trong điều kiện này là 59,06 mg/l; ở các mức
nhiệt độ là 30 và 37oC, lượng EPS tổng hợp được là ít hơn (khoảng 18 – 20 mg/l).
Khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng vào môi trường chứa 10% sữa tách béo gồm 2%
suc, 0,5% dịch whey protein thì lượng EPS tạo thành tăng mạnh, đạt 135,80 mg/l
[140].
Với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3, ở nhiệt độ 40oC lượng EPS
tạo thành đã giảm nhiều so với mức nhiệt cực đại (35oC), sau đó tiếp tục giảm khi
tăng nhiệt độ lên 45oC. Lượng EPS chỉ còn lại tương ứng đối với các chủng Lb.
fermentum TC16, TC21 và MC3 là 90,19%, 78,22% và 71,45% so với giá trị cực đại.
Sự sai khác về lượng EPS thu được phần lớn đã không xảy ra ở hai mức nhiệt 30 và
45oC khi phân tích phương sai (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Đối với chủng MC3, tại mức
nhiệt 30oC, lượng EPS đạt được là thấp nhất, giảm trên 50% so với mức nhiệt cực đại
(khoảng 236,134 µg/ml). Đối với chủng TC13, lượng EPS tạo thành tăng dần khi
nhiệt độ tăng sau đó giảm mạnh ở mức nhiệt 45oC. Hàm lượng EPS tại mức nhiệt độ
74
này chỉ đạt 360,362 µg/ml (đã giảm 14,03% so với mức cao nhất ở 40 OC). Từ kết
quả phân tích thống kê cho thấy, giá trị EPS thu được ở hai mức nhiệt độ 30 và 45 oC
đối với chủng này là không có sự sai khác (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Ở các mức nhiệt
độ thấp (30oC) và nhiệt độ cao 45oC, khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng đều
ở mức thấp. Điều đó cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn này là những chủng vi khuẩn
ưa ấm; do đó, với khoảng nhiệt độ trung bình sẽ kích thích cho quá trình tổng hợp các
hợp chất thứ cấp như EPS tốt hơn.
Quá trình sinh tổng hợp HoPS và HePS đều có liên quan đến các enzyme đặc
hiệu có ở bên trong hoặc ngoài tế bào vi khuẩn. Vi sinh vật thường rất mẫn cảm với
sự thay đổi của nhiệt độ. Tính mẫn cảm này được thể hiện qua sự tác động lên các phản
ứng xúc tác của enzyme. Khi các cơ chất được vận chuyển vào tế bào, dưới tác dụng
của các enzyme đặc hiệu, các sản phẩm lần lượt của quá trình xúc tác này được tạo
thành – đây cũng chính là tiền thân của các đơn vị lặp lại trong phân tử EPS. Chính vì
thế, lí do liên quan đến lượng sản phẩm tạo thành thấp trong các điều kiện này có lẽ
liên quan đến tác động của nhiệt độ lên các phản ứng do enzyme xúc tác. Với phản ứng
có sự xúc tác của enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng tốc độ phát triển của vi sinh
vật do đó hoạt động trao đổi chất của chúng cũng tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng
lên đến một mức độ nhất định thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lại có xu hướng
ngược lại với sự tăng nhiệt độ và khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Nhiệt độ
tăng quá cao có thể gây ra sự biến tính của enzyme và các protein khác trong môi
trường do đó làm giảm khả năng xúc tác sự chuyển hóa các chất dinh dưỡng hoặc các
hệ enzyme tham gia tổng hợp PS có thể không hoạt động được. Ngoài ra, nhiệt độ tăng
cao có thể làm tổn thương màng tế bào vi sinh vật đến mức khó phục hồi và dẫn đến
ức chế sự sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn [6].
Khả năng tạo thành EPS thấp hơn ở mức nhiệt thấp có thể giải thích rằng, ở mức
nhiệt này, vi khuẩn vẫn tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, khả năng phát triển thường
rất yếu do đó khả năng chuyển hóa các chất dinh dưỡng trong quá trình trao đổi chất
cũng chậm lại. Kết quả của quá trình này là gây nên sự ức chế hoạt động của các hệ
enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng dần dần khiến khả năng sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn mất dần.
75
Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc
vào từng loài vi sinh vật. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của cùng một loài vi
sinh vật không phải là cố định mà có thể phụ thuộc vào pH, nguồn dinh dưỡng và các
nhân tố khác.
3.1.3.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men lên khả năng
sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum
Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của vi sinh vật sống. Quá trình
sinh trưởng và phát triển này thường xảy ra qua bốn giai đoạn khác nhau. Giai đoạn
đầu tiên là giai đoạn vi sinh vật chưa sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với
môi trường mới (pha lag – pha tiền phát); giai đoạn thứ hai (pha log), giai đoạn này
tế bào bắt đầu phát triển mạnh, chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của vi
sinh vật để tạo thành các sản phẩm thứ cấp. Vì thế, để tận thu được tốt lượng sản
phẩm tạo thành từ quá trình trao đổi chất của chúng thì việc kết thúc quá trình nuôi
cấy ở cuối giai đoạn này là phù hợp nhất. Giai đoạn thứ ba (pha ổn định) là giai đoạn
mà quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động. Tổng số tế bào mới sinh ra bao
giờ cũng gần bằng tổng số tế bào chết đi. Và giai đoạn cuối cùng được coi là giai
đoạn suy vong, số lượng tế bào chết sẽ tăng lên. Chính vì vậy, trong quá trình nuôi
cấy thu các sản phẩm thứ cấp, chúng ta cần xác định thời gian tương ứng với các pha
sinh trưởng của vi khuẩn để thu được lượng sản phẩm một cách tối đa. Quá trình phát
triển và sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có thể xảy ra sớm hoặc muộn hơn tùy loại
vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy của chúng (như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH,
…). Chính vì thế, để khảo sát quá trình thu nhận EPS hiệu quả từ các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3, bốn chủng này được nuôi cấy ở các khoảng
thời gian khác nhau trong môi trường đã được xác định về nguồn C, N, mật độ tế bào,
pH và nhiệt độ thích hợp đối với mỗi chủng để xác định ảnh hưởng của yếu tố thời
gian lên quá trình sinh tổng hợp EPS của chúng. Thực hiện lấy mẫu tại các thời điểm
0, 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ để xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men nhằm
tận thu lượng sản phẩm cao nhất trong môi trường.
Kết quả Hình 3.7a, Hình 3.7b, Hình 3.7d cho thấy rằng, sau 48 giờ lên men, quá
trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16 và MC3 đều đạt
76
được là cao nhất với hàm lượng thu được lần lượt là 421,378 µg/ml; 406,703 µg/ml;
422,638 µg/ml. Lượng EPS thu được cực đại sau 48 giờ lên men các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16 và MC3 cũng là điều kiện mà rất nhiều nghiên cứu đã sử
dụng như một điều kiện tối ưu để nghiên cứu các khía cạnh liên quan đến EPS tiết ra
từ các chủng thuộc LAB [52], [54], [118]. Từ 12 đến 36 giờ lên men, lượng EPS tạo
ra có tăng nhưng tăng chậm. Sau khi đạt cực đại tại 48 giờ, lượng EPS đo được trong
các môi trường giảm mạnh ở 60 và 72 giờ. Lượng EPS của cả ba chủng tại thời điểm
60 giờ nuôi cấy chỉ còn khoảng 85 – 88% và tại 72 giờ khoảng 64 – 88% so với thời
điểm cực đại. Kết quả phân tích thống kê cho thấy lượng EPS thu được từ quá trình
sinh tổng hợp bởi chủng TC13 không có sự sai khác ở thời điểm 12 và 24 giờ; giữa
36 và 60 giờ (p<0,05) (Phụ lục 4.6). Trong khi sự sai khác lại không xảy ra với lượng
EPS tạo thành bởi chủng TC16 giữa các thời điểm 12, 24, 36 giờ và giữa 60 và 72
giờ.
a) pH
0 12 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
pH b)
0 12 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
77
So với các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, MC3, quá trình tổng hợp của Lb.
fermentum TC21 xảy ra sớm hơn. Lượng EPS đạt cực đại chỉ sau 36 giờ lên men
(405,728 µg/ml), sau đó giảm dần theo thời gian với các giá trị lần lượt là 382,395
µg/ml ở 48 giờ, 382,760 µg/ml ở 60 giờ và 341,175 µg/ml ở 72 giờ (Hình 3.7c).
Nguyên nhân của sự tăng giảm trong quá trình lên men các chủng vi khuẩn này
có lẽ liên quan đến các giai đoạn trong quy luật phát triển của các vi sinh vật. Sau khi
được nuôi cấy vào môi trường, các chủng vi khuẩn thích nghi dần và bắt đầu phát
triển (từ 12 giờ đến 36 giờ). Tốc độ sinh sản của vi sinh vật được tăng lên cực đại,
chỉ số OD trong các môi trường tương ứng tăng mạnh cùng với lượng chất dinh dưỡng
giảm (từ 36 giờ đến 48 giờ). Từ sau 48 giờ, lượng sản phẩm tạo thành sẽ không tăng
pH d)
0 12 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
c) pH
0 12 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp
EPS bởi các chủng Lb. fermentum
Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.6
78
nữa mà bắt đầu có xu hướng giảm. Sự giảm sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật
trong môi trường có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong môi trường giảm, một số
enzyme có thể phân giải chính sản phẩm tạo thành của chúng để làm nguồn thức ăn.
Mặt khác, trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, bên cạnh việc sử dụng các chất
dinh dưỡng trong môi trường thì đồng thời chúng cũng thải ra một số chất gây ức chế
quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng của chính bản thân nó, hoặc có thể ức chế hoạt
động của enzyme tổng hợp do đó vi sinh vật phát triển chậm lại và sẽ chuyển sang
trạng thái cân bằng và dần dần sẽ suy vong. Những nguyên nhân này sẽ làm cho lượng
EPS thu được cũng giảm xuống khi thời gian nuôi cấy kéo dài.
Bên cạnh đó, quá trình sử dụng các hợp chất thuộc nhóm carbohydrate của vi
khuẩn sẽ tạo thành các sản phẩm khác nhau trong đó có các acid hữu cơ. Theo thời
gian nuôi cấy, lượng acid tạo thành càng nhiều do đó giá trị pH có xu hướng giảm
dần. Sự biến đổi của pH môi trường có thể đã làm thay đổi trạng thái điện li của các
chất dinh dưỡng chính vì thế làm giảm khả năng sử dụng của chúng. Đây cũng có thể
là nguyên nhân làm giảm quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng LAB. Một lý
do nữa khiến lượng EPS tổng hợp được bị giảm khi kéo dài quá trình nuôi cấy có thể
do enzyme glycohydrolase có sẵn trong môi trường xúc tác quá trình phân hủy các
PS vừa tạo thành [126], [139].
Từ những kết quả thể hiện trên các Hình 3.7 (a, b, c, d) cũng cho thấy có những
mối liên quan nhất định giữa lượng EPS tạo thành với giá trị OD và sự thay đổi của
pH trong suốt thời gian nuôi cấy. Cụ thể chúng tôi nhận thấy rằng, lượng EPS tạo
thành của cả bốn chủng này đều có xu hướng tăng nhanh ở các thời điểm có giá trị
pH môi trường nằm trong khoảng 4,2-4,7. Đây có lẽ cũng là khoảng pH thích hợp
cho các vi khuẩn lactic hoạt động. Ở các giá trị pH khác tương ứng với các thời gian
nuôi cấy khác nhau, lượng EPS tạo thành không cao. Như vậy, sự thay đổi giá trị pH
trong môi trường theo thời gian có thể là yếu tố ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn. Và ở các giá trị pH môi trường thấp hoặc cao có
thể là nguyên nhân gây nên sự tổn thương đến tế bào của vi khuẩn; do đó, quá trình
sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của nó bị giảm.
79
Đối với giá trị OD, nó có sự liên quan tương đối cao đối với sự sinh tổng hợp
EPS. Đa số các kết quả nghiên cứu đều thể hiện rằng, thời điểm mà EPS tổng hợp
được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD đo được từ môi trường cao
nhất. Cụ thể, đối với chủng Lb. fermentum MC3, lượng EPS đạt được cao nhất vào
thời điểm 48 giờ, đây cũng chính là thời điểm mà OD thu được đạt cao nhất (1,193).
Tương tự, quá trình sinh tổng hợp EPS và giá trị OD đo được từ môi trường đều đạt
cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC16. Như vậy, đối với hai chủng
Lb. fermentum TC16, MC3 thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất cũng chính là
thời điểm mà lượng sản phẩm trao đổi chất tạo ra nhiều nhất. Đối với chủng Lb.
fermentum TC13 và TC21, quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cực đại không trùng khớp
với thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất (OD cao nhất). OD đo được từ môi
trường nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC21 theo thời gian đạt cao nhất sau 48 giờ
nuôi cấy, trong lúc đó lượng EPS đạt được tốt nhất ở 36 giờ. Với chủng Lb. fermentum
TC13, giá trị OD đo được đạt cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy, trong khi đó lượng EPS
lại thu được cao nhất ở 48 giờ. Như vậy, đối với chủng TC21, có thể nói rằng quá
trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp đạt cực đại xảy ra sớm hơn so với sự phát
triển của vi khuẩn. Ngược lại, quá trình tổng hợp EPS cực đại của chủng Lb.
fermentum TC13 lại xảy ra chậm hơn so với sự phát triển của vi khuẩn. Từ kết quả
nghiên cứu thu được, chúng tôi nhận thấy rằng, quá trình phát triển và sinh tổng hợp
các sản phẩm thứ cấp của mỗi loại vi khuẩn khác nhau còn phụ thuộc vào thành phần
môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy. Giá trị OD trong các môi trường chúng tôi
đo được có thể thể hiện sự phát triển của vi khuẩn cũng như những sản phẩm thứ cấp
được tạo thành trong quá trình sinh trưởng của chúng. Những sản phẩm tạo thành này
có thể bao gồm những chất độc và có thể cản trở sự phát triển của vi sinh vật gây
giảm khả năng tổng hợp EPS. Chính vì vậy, dựa vào sự biến đổi của đường cong sinh
trưởng và sản phẩm cần thu để chọn thời điểm kết thúc quá trình nuôi cấy phù hợp
nhất.
Thời gian sinh trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các loài vi sinh vật
khác nhau thường khác nhau, đặc biệt là khi được nuôi cấy với điều kiện và thành
phần môi trường không giống nhau. Quá trình sinh trưởng và tổng hợp EPS từ Lb.
80
confusus TISTR 1498 đạt được cao nhất (đạt 38,2g/l) xảy ra sau 24 giờ nuôi cấy trong
môi trường MRS chứa 100 g/l suc ở điều kiện pH 5,5, nhiệt độ 35oC [111]. Kết quả
nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2011) cho thấy, chủng Lb. fermentum F6 sinh tổng
hợp EPS tăng dần từ khi bắt đầu nuôi cấy và đạt cực đại sau 32 giờ trong môi trường
chứa sữa tách béo, glc và dịch whey protein (WPC) [141]. Khả năng sinh tổng hợp
EPS của Lb. fermentum TDS030603 xảy ra ở các thời điểm khác nhau tùy vào thành
phần môi trường là kết luận của Fukuda và cộng sự (2010) khi nghiên cứu ảnh hưởng
của nguồn carbohydrate lên tính chất lý hóa của EPS sinh ra từ chủng này. Trong môi
trường MRS, lượng EPS thu được cao nhất chỉ sau khoảng 24 giờ nuôi cấy, trong khi
đó, với môi trường MRS có bổ sung thêm glc, lac, gal, quá trình tổng hợp EPS đạt
cực đại sau khoảng 48 giờ nuôi cấy, còn với môi trường MRS có bổ sung thêm suc
thì lượng EPS tạo thành tăng theo thời gian ủ đến khoảng 72 giờ [44]. Nghiên cứu
của Torino và cộng sự (2005) về quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. helveticus
ATCC 15807 cho thấy, quá trình sinh EPS của chủng này xảy ra trong suốt pha phát
triển ở cả hai giá trị pH và đạt cực đại ở pha cân bằng. Lượng EPS tổng hợp được
trong điều kiện môi trường có pH 4,5 đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và có giá trị cao
hơn gấp 2,9 lần so với môi trường có pH 6,2. Sau 24 giờ nuôi cấy, quá trình tổng hợp
EPS giảm nhẹ ở pH 6,2 nhưng lại tiếp tục tăng ở pH 4,5 đến 30 giờ mới có chiều
hướng giảm [118]. Quá trình tổng hợp EPS bởi chủng S. salivarius ssp. thermophilus
đã không xảy ra pha phát triển (0-6 giờ) hoặc trước pha cân bằng (6-10 giờ) khi thực
hiện nuôi cấy ở 42 oC. Lượng EPS chỉ thu được với giá trị cực đại giữa thời điểm 14
và 18 giờ ủ [46]. Chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus HP1 phân lập từ các hạt
kefir khi được ủ riêng biệt có khả năng sinh tổng hợp EPS đạt cực đại (472,6 mg/L)
sau 28 giờ nuôi cấy. Trong khi đó, hỗn hợp các chủng (gồm Lb. bulgaricus HP1 + S.
thermophilus T15 + Lb. lactis C15 + Lb. helveticus MP12 + S. cerevisiae A13) được
ủ cùng nhau lại sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất sau 22 giờ nuôi cấy với lượng EPS
thu được khoảng 824,3 mg/L [43]. Công bố của Zhang và cộng sự (2011) về sự khác
nhau của quá trình sinh tổng hợp EPS bởi S. thermophilus ST1 khi được nuôi cấy ở
các mức nhiệt độ khác nhau (gồm 30, 37 và 42 oC). Theo đó, ở 42oC, lượng EPS thu
được tốt nhất với 59,06 mg/l sau 32 giờ nuôi cấy. Chủng này sinh EPS ít hơn ở 30 và
81
37oC với các giá trị tương ứng ở mức nhiệt độ này là 21,47 mg/l sau 24 giờ và 34,35
mg/l sau 16 giờ nuôi cấy. Trong môi trường sữa tách béo và môi trường sữa tách béo
có bổ sung thêm 0,5% WPC, chủng S. thermophilus ST1 có khả năng tổng hợp EPS
đạt cực đại tương ứng sau 16 giờ (41,10 mg/l) và 24 giờ (82,70 mg/l) ở 42 oC [140].
Tóm lại, quá trình sinh trưởng và phát triển chỉ xảy ra trong một khoảng thời
gian nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy
và chất lượng của tế bào nuôi cấy. Khả năng phát triển của vi sinh vật trong môi
trường sẽ xảy ra chậm khi các chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và đến hết
khiến vi sinh vật không đủ chất dinh dưỡng để duy trì quá trình trao đổi chất. Mặt
khác, khi tế bào đã đến giai đoạn già hóa hoặc các sản phẩm trao đổi chất trong môi
trường quá nhiều đã gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào. Chính vì vậy, với
mục đích thu các sản phẩm trao đổi chất thì quá trình nuôi cấy nên kết thúc vào thời
điểm cuối pha log là phù hợp nhất.
Kết luận 1:
Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu
trong luận án
Các
chủng vi
khuẩn Lb.
fermentu
m
Điều kiện thu nhận Hiệu suất thu
nhận EPS ở
các điều kiện
đã khảo sát so
với môi
trường đối
chứng MRS
(%)
Thành phần môi
trường
Mật độ
tế bào
nuôi
cấy
ban
đầu
(cfu/ml
)
pH
ban
đầu
Nhiệt
độ
nuôi
cấy
(oC)
Thời
gian
lên
men
(giờ) Nguồn
C
Nguồn
N
TC13 4% glc 0,4%
cao nấm 107 5,5 40 48 353,56
TC16 3% suc 0,8%
cao thịt 106 6,0 35 48 356,95
TC21 4% lac 0,8%
cao thịt 106 6,0 35 36 414,51
MC3 4% glc 0,3%
cao nấm 106 6,0 35 48 479,14
* Số liệu tính hiệu suất thu nhận EPS được trình bày chi tiết ở phụ lục 4.7
82
Như vậy, mỗi chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có những điều kiện sinh trưởng của
riêng chúng. Tổng lượng EPS tổng hợp bởi LAB phụ thuộc vào thành phần của môi
trường (nguồn C và N) và điều kiện mà các chủng đó phát triển, như nhiệt độ, pH ban
đầu và thời gian nuôi cấy. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum
nghiên cứu được tổng hợp ở Bảng 3.1.
Từ kết luận này và kết hợp đối chiếu kết quả thu nhận EPS từ các chủng Lb.
fermentum đã được công bố trước đây (Lb. fermentum TDS030603 [44]; Lb.
fermentum F6 [141]; Lb. fermentum CFR 2195 [136]) khi nuôi cấy chúng trong môi
trường chứa nguồn C, N khác nhau ở các điều kiện không giống nhau, chúng tôi nhận
thấy rằng cùng một loài vi khuẩn là fermentum khi được nuôi cấy trong những điều
kiện lên men khác nhau cũng thể hiện khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh tổng
hợp EPS khác nhau nhất định. Sự khác biệt về hàm lượng EPS tạo thành này liên
quan đến sự tác động không nhỏ của nhiều yếu tố như nguồn phân lập của các vi
khuẩn, thành phần dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy.
3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men
3.1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ
protein
Để thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein
có trong dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lb. fermentum, chúng tôi đã tiến hành bổ
sung TCA vào các môi trường lên men ở các nồng độ khác nhau (10, 15, 20, 25, 30,
35, 40%). Thực hiện khuấy trong 24 giờ sau đó thu mẫu và tiến hành xác định hàm
lượng protein còn lại theo phương pháp Kjeldahl và hàm lượng EPS trong dịch nổi
được xác định theo phương pháp phenol – sulfuric.
Kết quả khảo sát thể hiện ở Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11. Kết quả các số liệu nghiên
cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 5.1.
Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung
vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần.
Khả năng loại bỏ protein bởi nồng độ TCA bổ sung vào trong dịch lên men của các
chủng khác nhau là không giống nhau.
83
491,053
289,680
0
100
200
300
400
0
100
200
300
400
500
600
10 15 20 25 30 35 40
Hàm
lư
ợng p
rote
in
còn l
ại (
µg
/ml)
EP
S (
µg/m
l)
Nồng độ TCA (%)
Lb. fermentum TC21
EPS Protein
432,110
289,207287,550
275
280
285
290
295
300
0
100
200
300
400
500
10 15 20 25 30 35 40 Hàm
lư
ợn
g p
rote
in
còn
lại
(µ
g/m
l)
EP
S (
µg
/ml)
Nồng độ TCA (%)
Lb. fermentum TC16
EPS Protein
473,004
261,280
0
100
200
300
400
360380400420440460480
10 15 20 25 30 35 40 Hàm
lư
ợng p
rote
in
còn l
ại (
µg/m
l)
EP
S (
µg/m
l)
Nồng độ TCA (%)
Lb. fermentum TC13
EPS Protein
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein
và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein
và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein
và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13
84
Đối với chủng Lb. fermentum TC13, khả năng loại bỏ protein hiệu quả nhất khi
nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein còn lại trong dịch nổi trong trường
hợp này chỉ còn 231,933 µg/ml. Ở nồng độ TCA 40%, lượng EPS thu được tương
ứng rất thấp, chỉ đạt 407,72 µg/ml. Hàm lượng EPS quan sát được là cao nhất với
473,004 µg EPS /ml khi nồng độ TCA bổ sung vào là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung
này, lượng protein còn lại trong dịch nổi cũng tương đối thấp, còn khoảng 261,28
µg/ml. Hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi là 261,28 µg/ml cũng là hàm lượng
protein đo được khi nồng độ TCA bổ sung vào là 20%. Tuy nhiên, lượng EPS ở nồng
độ TCA 20% thu được cũng thấp hơn so với EPS tại nồng độ 15% (Hình 3.8). Ở các
nồng độ TCA bổ sung vào cao hơn (25, 30, 35%), lượng EPS có sự khác nhau với
mức ý nghĩa p<0,05 nhưng lượng protein bị loại bỏ lại hầu như không có sự sai khác
khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Như vậy, mặc dù ở nồng độ TCA là 40%, lượng
protein được loại bỏ tốt hơn so với ở nồng độ 15% nhưng hàm lượng EPS thu được
ở hai nồng độ này thì ngược lại. Do đó, với mục đích là thu nhận EPS hiệu quả chúng
tôi chọn nồng độ TCA bổ sung vào là 15%.
Với chủng Lb. fermentum TC16, lượng protein còn lại trong dịch lên men thấp
và lượng EPS thu được đạt cực đại khi quá trình tủa bằng TCA được thực hiện với
nồng độ bổ sung là 35%. Ở điều kiện này, lượng EPS đạt được khoảng 432,11 µg/ml
và lượng protein còn lại là 287,55 µg/ml. Ở các nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi
498,817
244,240
0
50
100
150
200
250
300
350
380
400
420
440
460
480
500
520
10 15 20 25 30 35 40
Hàm
lư
ợng p
rote
in
còn l
ại (
µg/m
l)
EP
S (
µg/m
l)
Nồng độ TCA (%)
Lb. fermentum MC3
EPS Protein
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein
và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3
85
cấy là 10, 15, 20, 25, 30 và 40%, EPS thu được thấp và lượng protein còn lại có giảm
theo chiều tăng của nồng độ TCA. Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy,
hàm lượng EPS thay đổi và có sự khác nhau giữa các nồng độ nhưng khả năng loại
bỏ protein ở các nồng độ TCA bổ sung vào lại không có sự sai khác (p<0,05) (phụ
lục 5.1).
Khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum TC21 đạt
hiệu quả cao hơn khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng dần từ 10% đến 40% (Hình
3.10). Trong khi đó, khả năng thu EPS lại đạt được cao hơn với nồng độ TCA bổ
sung ở mức thấp là 10, 15, 20%. Đặc biệt, EPS đạt cao nhất với hàm lượng là 491,703
µg/ml khi nồng độ TCA bổ sung vào môi trường là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung
vào là 20%, lượng EPS thu được cũng tương đối cao, đạt 491,053 µg/ml (chiếm
99,87% so với EPS cực đại).
Kết quả phân tích thống kê cho thấy, hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi
sau khi ly tâm chỉ có sự sai khác ở hai khoảng nồng độ TCA bổ sung là 10%, 15% và
từ 20 - 40%. Như vậy, mặc dù lượng EPS thu được ở dịch nổi có bổ sung 15% TCA
cao hơn so với EPS trong dịch nổi bổ sung 20% TCA. Tuy nhiên, xét về mối tương
quan để thu nhận EPS hiệu quả, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ TCA bổ sung vào
dịch nuôi cấy vừa có hiệu quả cho cả việc loại bỏ protein và việc thu nhận EPS là
20%.
Ở dịch lên men của Lb. fermentum MC3, lượng protein bị loại bỏ xảy ra theo
chiều hướng tăng dần khi tăng nồng độ TCA bổ sung vào. Khả năng loại bỏ protein
trong dịch lên men đạt cao nhất ở nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein
còn lại trong dịch nổi chỉ còn 185,547 µg/ml. Tương ứng với khả năng loại bỏ protein
tốt nhất thì lượng EPS còn lại trong dịch nổi lại được xác định là giảm khá nhiều so
với lượng EPS ở các nồng độ khác. Lượng EPS thu được tốt nhất sau khi ly tâm dịch
nuôi cấy có bổ sung thêm 20% TCA, đạt khoảng 498,817 µg/ml. Kết quả phân tích
thống kê cho thấy, khả năng tách bỏ protein hầu như không có sự sai khác ở các nồng
độ 10% và 15%; 20%, 25% và 30%; 30% và 35%; 35% và 40%. Trong khi đó, sự sai
khác đã xảy ra đối với lượng EPS thu được khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Cụ thể
là, lượng EPS thu được có sự sai khác rõ rệt với mức ý nghĩa p < 0,05 ở ba nồng độ
86
TCA là 15%, 20% và 25%. Ở các nồng độ 30%, 35%, 40% lượng EPS thu được
không có sự sai khác. Kết hợp các kết quả ở trên, chúng tôi chọn nồng độ TCA bổ
sung phù hợp nhất để loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum
MC3 là 20%.
Nồng độ TCA sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dịch lên men trong nhiều
nghiên cứu thu nhận EPS từ LAB không cố định và thay đổi khác nhau tùy nhóm tác
giả. Chẳng hạn, nồng độ TCA sử dụng trong quá trình tách chiết EPS từ dịch lên men
của các chủng thuộc LAB trong các nghiên cứu tương ứng của Harding và cộng sự
(2005) [58] là 14%, Yuksekdag và cộng sự (2008) là 17% [138], Rabha và cộng sự
(2011) [99] là 12% và Seesuriyachan và cộng sự (2011) là 30% [111], ...
Với tất cả các chủng Lb. fermentum sử dụng trong nghiên cứu này, lượng EPS
có thể sẽ bị giảm xuống khi tăng nồng độ TCA bổ sung vào để loại bỏ protein. Điều
này có thể được lý giải là do bên cạnh việc tách bỏ protein tốt hơn ở nồng độ TCA
bổ sung vào cao thì acid này có thể gây nên sự phân hủy EPS có trong môi trường.
Chính vì vậy, từ mục đích là thu nhận EPS có hiệu quả, chúng tôi tiến hành chọn các
nồng độ TCA bổ sung vào nhằm tách chiết EPS đạt được tốt nhất tương ứng với các
chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 lần lượt là 15%, 35%, 20% và 20%.
Các nồng độ này sẽ được sử dụng để tiếp tục hoàn thiện quy trình tách chiết EPS tổng
hợp từ các chủng Lb. fermentum này hiệu quả hơn.
3.1.4.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS
Dịch nổi chứa EPS của các chủng vi khuẩn được bổ sung EtOH ở các tỉ lệ khác
nhau nhằm thu EPS dưới dạng tủa. Các tỉ lệ dịch nổi và EtOH được sử dụng trong
nghiên cứu này bao gồm: 1:0,5; 1:1,0; 1:1,5; 1:2,0; 1:2,5; 1:3,0. Kết quả khảo sát ảnh
hưởng của thể tích EtOH so với dịch nổi chứa EPS đến khả năng tách chiết EPS sau
24 giờ thể hiện ở Hình 3.12.
87
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS
Lượng EPS thu được từ các dịch nổi chứa EPS sinh ra bởi các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1.
Lượng EPS thu được ở tỉ lệ này tương ứng với các chủng Lb. fermentum TC13, TC16,
TC21, MC3 lần lượt là 502,191 µg/ml; 450,24 µg/ml; 434,996 µg/ml; 450,646 µg/ml.
Ở tỉ lệ EtOH và dịch nổi là 0,5:1, lượng EPS tủa được ở tất cả các chủng thu được thấp
hơn rất nhiều so với thời điểm đạt cực đại (đạt dưới 200 µg EPS/ml). Khi thể tích EtOH
tăng lên (1,5; 2; 2,5; 3,0), lượng EPS tách ra không tăng nữa và có chiều hướng giảm
nhẹ (Hình 3.12). Khả năng kết tủa EPS có chiều hướng tách ra không hiệu quả ở các
thể tích EtOH bổ sung vào so với dịch nổi là 0,5; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 có lẽ là do, lượng
EPS trong dịch nổi đã được kết tủa hết khi thể tích EtOH bổ sung vào dịch nổi là 1:1.
Do đó, khi tăng thể tích EtOH lên thì khả năng tách thêm EPS là không hiệu quả. Khả
năng tủa EPS bởi EtOH trong dịch nổi thu được từ quá trình tách chiết EPS trong dịch
nuôi cấy của Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 sẽ được chọn để khảo sát thời
gian tủa phù hợp là 1:1. Đây cũng là tỉ lệ được sử dụng khá phổ biến trong một vài
công trình nghiên cứu tách chiết EPS từ LAB [58], [130], [138].
3.1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS
Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng EtOH lên khả năng tách chiết EPS từ dịch
nổi được thực hiện trong các khoảng thời gian khác nhau 12, 24, 36 và 48 giờ. Quá
trình kết tủa được thực hiện trong điều kiện lạnh (4oC).
0
100
200
300
400
500
600
1:0,5 1:1,0 1:1,5 1:2,0 1:2,5 1:3,0
EP
S (
µg/m
l)
Tỉ lệ dịch nổi : ethanol (v/v)
TC13
TC16
TC21
MC3
Các chủng Lb.
fermentum
88
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 5.3
Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy, sự chênh lệch về lượng EPS tủa của các chủng
Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 khi được duy trì trong các khoảng thời gian
tủa khác nhau từ 24 giờ đến 48 giờ hầu như rất thấp và đều không có sự sai khác khi
xử lý thống kê (p<0,05). Đối với mẫu chỉ thực hiện tủa trong 12 giờ, lượng EPS thu
được khá thấp, chỉ xấp xỉ đạt 50% so với các thời điểm còn lại (24, 36, 48 giờ). Như
vậy, việc kéo dài yếu tố thời gian tủa hầu như không tác động nhiều đến lượng EPS
tách ra. Do đó, với kết quả này, thời gian áp dụng thích hợp và hiệu quả để thu EPS
tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết EPS từ dịch nổi là 24 giờ. Đây cũng là thời
gian mà nhiều tác giả đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu thu nhận cũng như dùng
để xác định một số đặc tính lý hóa và cấu trúc của các EPS từ một số chủng LAB
[46], [52], [140], [141].
Kết luận 2:
510,687 506,175450,362 452,923
450,077
440,240451,419452,801
0
100
200
300
400
500
600
12 24 36 48
EP
S (
μg
/mL
)
Thời gian tủa (giờ)
Lb. fermentum TC13 Lb. fermentum TC16
Lb. fermentum TC21 Lb. fermentum MC3
89
Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb.
fermentum trong luận án
Các chủng Lb.
fermentum
Nồng độ
TCA bổ
sung (%)
Tỉ lệ dịch nổi:
ethanol (v/v)
Thời gian
tủa bằng
ethanol
(giờ)
Hiệu suất thu
nhận tăng sau
khi tách EPS ở
các điều kiện
lựa chọn (%)
TC13 15 1:1 24 121,19
TC16 35 1:1 24 101,73
TC21 20 1:1 24 110,93
MC3 20 1:1 24 106,81
Quá trình khảo sát các điều kiện tách cho thấy, việc thay đổi nồng độ TCA có
ảnh hưởng đến khả năng loại bỏ protein. Hàm lượng protein đã được loại bỏ dần khỏi
dịch lên men nhiều hơn khi nồng độ TCA tăng lên. Trong khi đó, với tỉ lệ EtOH và
thời gian thực hiện tủa bằng EtOH, chúng tôi đã nhận thấy rằng, việc tăng tỉ lệ EtOH
so với dịch nổi cũng như việc kéo dài thời gian tủa bằng EtOH hầu như không ảnh
hưởng lớn đến quá trình tách chiết EPS. Do đó, xét mối tương quan với lượng EPS
trong mỗi dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn và hiệu quả kinh tế tốt nhất khi thu
nhận EPS từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3, chúng tôi đã chọn
được các điều kiện tách EPS tương ứng tóm tắt ở Bảng 3.2. Với kết quả khảo sát
được, chúng tôi đã tìm ra được điều kiện thích hợp mới cho quá trình thu nhận EPS
từ các chủng được sử dụng trong nghiên cứu này.
3.1. Kết quả khảo sát các tính chất của EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum
(TC13, TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước
Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng ngàn phân tử
monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside. Do đó, các PS mang nhiều
tính chất khác với các mono và disaccharide như: khả năng hòa tan, không có vị ngọt,
không có phản ứng khử. Một trong những tính chất lý hóa được quan tâm chủ yếu
đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm của PS đó là khả năng hòa tan trong nước.
90
Tính chất này đóng vai trò quan trọng trong chế biến như là khả năng làm đặc hoặc
là tác nhân ổn định trong một số sản phẩm như các loại bánh hoặc kẹo [90].
Với các EPS chế phẩm thu được sau khi đông khô, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu khảo sát và đánh giá khả năng hòa tan trong nước theo mục 2.3.6.1
Kết quả khảo sát khả năng hòa tan trong nước của các EPS từ chủng Lb.
fermentum thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum
EPS tách chiết từ các chủng Lb.
fermentum Độ hòa tan (%)
EPS- TC13 73,33±3,81
EPS-TC16 75,33±5,17
EPS-TC21 64,00±4,97
EPS-MC3 87,00±2,49
Các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) đều
có khả năng hòa tan trong nước khá cao (Bảng 3.3). Trong các EPS sử dụng ở nghiên
cứu này, EPS có khả năng hòa tan trong nước tốt nhất là EPS-MC3 đạt khoảng 87%,
tiếp đến là EPS-TC16 với 75,33%, sau đó là EPS-TC13 với 73,33% và cuối cùng là
64% đối với EPS-TC21.
Khả năng hòa tan trong nước của các EPS sinh ra từ các chủng Lb. fermentum
(TC13, TC16, TC21, MC3) có sự khác nhau tuy nhiên sự chênh lệch là không đáng
kể. Công bố của Ahmed và cộng sự (2013) về các tính chất công nghệ của EPS khi
các tác giả này tiến hành nghiên cứu về tính chất của EPS được tách chiết từ Lb.
kefiranofaciens ZW3. Với kết quả khảo sát được, nhóm tác giả đã kết luận rằng khả
năng hòa tan trong nước của EPS được sinh ra từ ZW3 là tương đối thấp, đạt khoảng
14,2% [10].
Như vậy, các EPS được sinh ra từ các chủng vi khuẩn khác nhau hoặc các chủng
vi khuẩn cùng loài nhưng nguồn phân lập khác nhau thì khả năng hòa tan trong nước
không giống nhau. Khả năng hòa tan trong nước của một PS phụ thuộc vào nhiều yếu
tố như sự có mặt của các nhóm phân cực như –OH, bản chất của các monosaccharide
91
cấu tạo nên PS đó, hoặc phụ thuộc vào các mối liên kết có trong các phân tử đường
(có thể là α hoặc β), hoặc khả năng liên kết bởi các tác động từ chính bên trong phân
tử đó [82]. Các monosaccharide thường được hòa tan dễ dàng trong nước, tuy nhiên,
với các PS thì lại khác, mặc dù chúng được tạo thành từ các monosaccharide liên kết
với nhau nhưng khả năng hòa tan của các PS này lại thấp. Sở dĩ, sự hòa tan của các
PS vào trong nước thấp có lẽ là do sự hình thành các mối liên kết giữa các phân tử
monosaccharide để tạo thành các polyme đã làm giảm hoạt tính phân cực của các
nhóm OH của đường do đó nó ngăn chặn sự tương tác với nước của các phân tử này;
chính vì thế khả năng hydrate hóa ít hơn. Bên cạnh đó, sự tập trung của các phân tử
monosaccharide trong quá trình trùng hợp để tạo thành polyme cũng có thể làm giảm
khả năng hoạt động của các nhóm hydroxy liền kề tương tác với nước. Thông thường sự
hình thành các polyme với mối liên kết α 16 giúp duy trì được một số tính chất hòa
tan trong nước của đường được tốt hơn [133].
Khả năng hòa tan trong nước của EPS từ LAB làm tăng độ nhớt và đặc tính
nhầy của môi trường nuôi cấy đã được công bố bởi Martensson và cộng sự [77]. Với
những kết quả này, nhóm tác giả đã chỉ ra được tiềm năng của cả hai chủng LAB là
có thể được sử dụng như các chủng khởi đầu trong quá trình lên men các sản phẩm
mới không phải từ sữa. Nhờ khả năng tạo độ nhớt của EPS từ Lb. fermentum CFR
2195 mà nó đã góp phần vào tính lưu biến và tạo kết cấu đặc trưng cho các sản phẩm
thực phẩm là kết luận của Yadav và cộng sự (2011) [136].
Tóm lại, khả năng hòa tan của các PS trong nước tuy không cao nhưng nó lại
có liên quan đến nhiều ứng dụng có lợi trong công nghiệp. Việc các EPS thu được từ
các chủng Lb. fermentum có thể hòa tan trong nước, dễ dàng phân tán đồng đều trong
dung dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình biến đổi như khả năng tạo gel, ổn
định khối nhũ tương …của thực phẩm, đặc biệt là đối với các thực phẩm dạng lỏng
(phần lớn là nước). EPS được ví như một tác nhân kết dính và chất nhũ hoá, làm tăng
độ nhớt cho sản phẩm. Khi phân tán đều trong khối thực phẩm, EPS có khả năng ổn
định cấu trúc, trạng thái của một số thực phẩm, hạn chế hiện tượng tách pha – là hiện
tượng có ý nghĩa quan trọng đối với một số sản phẩm như sữa, nước trái cây... [112].
3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu
92
Nghiên cứu về tính chất lưu biến của các sản phẩm từ sữa cho thấy, gần đây
hiện tượng tách nước lên trên bề mặt gel là một vấn đề cần được giải quyết. Để giải
quyết vấn đề này, người ta thường phải bổ sung các chất phụ gia vào các sản phẩm
sữa lên men như các chất tạo độ đặc, chất ổn định, hợp chất hóa học tổng hợp,...Các
hợp chất này thường bị một số nước trên thế giới không cho phép sử dụng. Vì vậy,
EPS được xem như là một polyme thiên nhiên có thể thay thế được các hợp chất hóa
học này [128].
Các tính chất vật lý liên quan đến khả năng giữ nước và giữ dầu của EPS được
coi là đặc tính có lợi trong sản xuất thực phẩm đặc biệt là sản xuất các sản phẩm như
sữa lên men, xúc xích, thịt xông khói,…Các tính chất chức năng này đóng vai trò
quan trọng đối với các đặc tính của sản phẩm thực phẩm trong suốt quá trình chế biến
cũng như đặc tính cuối cùng của sản phẩm tạo thành. Trong đó, khả năng giữ nước
đóng một vai trò quan trọng đối với chất lượng cuối cùng của một số sản phẩm chứa
nhiều nước như rau, quả, thịt, cá…
Khả năng giữ nước và giữ dầu của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb.
fermentum thể hiện ở Bảng 3.4 và Bảng 3.5
Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum
EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ nước (%)
EPS- TC13 140,55 ± 0,45
EPS-TC16 136,22 ± 0,60
EPS-TC21 120,63 ± 1,99
EPS-MC3 135,70 ± 3,11
Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum
TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước tốt. Trong đó, khả năng giữ nước
cao nhất là của EPS từ EPS- TC13, đạt 140,55% và thấp nhất so với các EPS còn lại
là EPS- TC21 chỉ đạt 120,63%. Đối với EPS từ hai chủng Lb. fermentum TC16 và
Lb. fermentum MC3 có giá trị tương đương nhau, đạt tỉ lệ lần lượt là 136,22 % và
135,7%.
93
Khả năng giữ nước của EPS có được có thể được coi là một trong những đặc
tính quan trọng của các thực phẩm tươi, nó góp phần duy trì độ tươi của sản phẩm
cũng như duy trì những tính chất vốn có của sản phẩm như độ đàn hồi, tăng giá trị
cảm quan giúp duy trì được sản phẩm trong một thời gian có thể từ đó đáp ứng được
yêu cầu thiết yếu của người tiêu dùng.
Nghiên cứu của Ahmed và cộng sự (2013) về tính chất của EPS tách chiết từ
Lb. kefiranofaciens ZW3 đã kết luận rằng, EPS sinh tổng hợp từ chủng này có khả
năng giữ nước rất tốt. Cụ thể, khả năng giữ nước của EPS sinh tổng hợp bởi Lb.
kefiranofaciens ZW3 đạt lên đến 496,00 % [10]. Điều này có thể cho thấy rằng EPS
được sinh tổng hợp từ các chủng LAB khác nhau hoặc các LAB thu nhận từ các
nguồn khác nhau thì khả năng giữ nước không giống nhau.
Khi khả năng giữ nước của EPS thấp thì tương ứng khả năng giữ dầu của chúng
lại tăng lên khá cao. Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb.
Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 lần lượt là 590,78%; 594,57%; 608,3% và
599,97% (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum
EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ dầu (%)
EPS- TC13 590,78 ± 1,94
EPS-TC16 594,57 ± 1,42
EPS-TC21 608,30 ± 0,45
EPS-MC3 599,97 ± 1,14
EPS có khả năng giữ được nước hay giữ dầu có lẽ là do các mạch phân tử EPS
ở dạng sợi cuộn phân tán trong dung dịch, khi có sự thay đổi về một số yếu tố nào đó
của dung dịch (nhiệt độ, pH…) thì các mạch polyme sẽ liên kết, xoắn kép với nhau
tạo ra sợi kép. Các sợi xoắn này lại liên kết với nhau bằng các mối nối để hình thành
nên mạng lưới không gian ba chiều vững chắc, nhốt các phân tử chất lỏng (nước,
dầu…) bên trong. Phần xoắn vòng lò xo của các mạch PS chính là những mầm tạo
gel, chúng lôi kéo các phân tử dung môi vào vùng liên kết. Từ dạng dung dịch chuyển
94
sang dạng gel là do tương tác giữa các phân tử polyme hòa tan với các phân tử dung
môi ở bên trong, nhờ tương tác này mà gel tạo thành có độ bền cơ học cao hơn.
Mức độ giữ nước và giữ dầu của các EPS khác nhau với tỷ lệ chênh lệch lớn có
thể liên quan đến đặc điểm về cấu trúc của EPS. Ngoài ra còn có thể do có sự khác
nhau về độ nhớt giữa các dung môi này. Khả năng giữ dầu của các EPS thu được từ
các chủng Lb. fermentum cao hơn rất nhiều so với khả năng giữ nước. Điều này có
thể lý giải là do trạng thái của các dung môi này. Dầu là chất lỏng sánh, có độ nhớt
cao, các phân tử dầu có mức độ liên kết với nhau bền chặt hơn, trong khi đó, nước là
chất lỏng có độ nhớt thấp nên dễ dàng phân tán ra riêng rẽ. Chính vì vậy mà khi được
bổ sung EPS vào trong nước, sự phân tán của nước sẽ xảy ra tốt hơn nên các phân tử
nước bị lôi kéo vào bên trong mạng lưới của mạch PS ít hơn so với dầu.
Khả năng hòa tan cũng như khả năng giữ nước của EPS có ảnh hưởng rất lớn
trong việc tạo gel của dung dịch. Khả năng giữ và hòa tan tốt làm cho khối nhũ tương
có độ nhớt, độ sánh cao hơn, kết cấu của khối nhũ tương đồng nhất hơn, khó bị phá
vỡ, từ đó hạn chế được hiện tượng tách pha. Đồng thời khả năng tạo gel cũng tốt hơn,
cấu trúc khối gel bền chặt hơn. Pradip và cộng sự (2013) đã nghiên cứu các thuộc
tính lưu biến của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum V10 trong môi trường sữa lên
men có hàm lượng chất béo thấp. Kết quả cho thấy khả năng tách whey thấp, sản
phẩm có độ nhớt cao, độ kết dính, và các thuộc tính cảm quan tốt [14].
Với khả năng giữ nước của EPS, các chủng lên men khởi đầu có khả năng sản
xuất EPS đã được sử dụng để cung cấp các tác nhân ổn định tự nhiên có sẵn. Ngoài
ra, các EPS có thể hoạt động như là các chất làm đặc tự nhiên, tạo cho sản phẩm có
độ nhớt cao hơn và giảm khả năng tách nước do đó mang lại cho sản phẩm sự cải tiến
về chất lượng mà không sử dụng các chất phụ gia [29]. Husein và cộng sự (2010) khi
nghiên cứu về sự tác động của EPS sinh tổng hợp từ Lb. helveticus lên chất lượng của
bánh quy đã kết luận rằng, việc sử dụng EPS sinh ra từ chủng này có tác dụng làm
tăng nhẹ mức độ hấp thụ nước và sự ổn định của bột nhào trong giai đoạn ủ [61].
Khả năng giữ nước và giữ dầu tốt của các chủng vi khuẩn lactic giúp chúng có thể
được ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm; đặc biệt là các sản phẩm lên men từ sữa,
kem, qua đó góp phần hoàn thiện cấu trúc của sản phẩm. Chẳng hạn như, đối với các sản
95
phẩm như các loại sốt có chứa chất béo, khả năng giữ dầu của các PS có mặt trong sản
phẩm sẽ hạn chế được sự tách pha, giúp hệ nhũ tương trong sản phẩm này bền hơn.
Wang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và kết luận rằng, khả năng giữ nước của các sản
phẩm sữa chua tăng lên khi bổ sung các vi khuẩn lactic có khả năng sinh EPS cao trong
quá trình lên men [130]. Hoặc đối với sản phẩm pho mát, khả năng giữ nước của EPS
được hình thành trong quá trình sản xuất pho mát đã đáp ứng yêu cầu quan trọng trong
việc cải thiện kết cấu của các loại pho mát và cho phép giảm lượng năng lượng trong sản
phẩm cuối cùng [15].
Với những tính chất có lợi như vậy, trong tương lai EPS sản xuất từ các chủng
Lb. fermentum hoàn toàn có thể thay thế một số loại phụ gia tổng hợp trong sản xuất
thực phẩm mà vẫn giữ được tính chất, đặc điểm của sản phẩm đồng thời đảm bảo an
toàn cho sức khỏe.
Kết luận 3
Từ kết quả khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ
thực phẩm của EPS tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)
bao gồm khả năng hòa tan trong nước, khả năng giữ nước, giữ dầu chúng tôi đã nhận
thấy rằng, các EPS thu được từ quá trình nuôi cấy các chủng Lb. fermentum (TC13,
TC16, TC21, MC3) đều thể hiện được các tính chất này khá tốt. Đây là những tính
chất rất quan trọng trong việc thể hiện tính chất lưu biến và khả năng ổn định trạng
thái của sản phẩm. Do đó, EPS sinh ra từ các chủng này đều có thể ứng dụng trong
công nghệ chế biến các sản phẩm như sữa chua, các sản phẩm chế biến từ thịt (xúc
xích, thịt nguội, …), và các loại bánh hoặc kẹo cũng như giúp duy trì tốt chất lượng
của các sản phẩm có hàm lượng nước cao như rau quả, thịt, cá, …
3.2.3. Khả năng chống oxy hóa
Chất béo nói chung và các thực phẩm chứa chất béo thường bị biến đổi theo
chiều hướng không có lợi khi chế biến nhiệt hoặc bảo quản trong thời gian dài. Các
quá trình biến đổi này xảy ra chủ yếu là do phản ứng oxy hóa và sự phân hủy các sản
phẩm oxy hóa từ đó dẫn đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm bị giảm.
Các chất chống oxy hóa được coi là những phụ gia quan trọng trong quá trình
chế biến thực phẩm. Chúng có tác dụng hạn chế sự phát triển của quá trình oxy hóa
trong các sản phẩm chứa nhiều chất béo như thịt, các sản phẩm từ sữa, sản phẩm
96
chiên. Hoạt động chống oxy hóa của một loại phụ gia bất kỳ phụ thuộc vào khá nhiều
yếu tố như hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, sự có mặt
của các chất chống oxy hóa và các thành phần khác trong thực phẩm như nước và
protein. Sử dụng DPPH là một gốc tự do ổn định và có khả năng nhận điện tử hoặc
hydrogen để trở thành phân tử không ổn định nhằm khảo sát khả năng chống oxy hóa
của các EPS thu nhận. Acid ascorbic được sử dụng như là chất chuẩn đối chứng.
Kết quả chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum
và acid ascorbic thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.
fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)
Nồng độ
(mg/mL)
Hoạt lực chống oxy hóa (%) Acid ascorbic
EPS-
TC13
EPS-
TC16
EPS-
TC21
EPS-
MC3
Nồng độ
(mg/mL)
Hoạt lực
chống
oxy hóa
(%)
1,0 - - 36,94 ±
0,35 -
1,5 - - 57,14 ±
0,32
27,14 ±
0,30
2,0 29,14 ±
0,52
27,34 ±
0,32
67,41 ±
0,30
47,66 ±
0,55 0,00125
27,05 ±
0,12
2,5 38,56 ±
0,37
35,95 ±
0,52
78,99 ±
0,30
68,05 ±
0,47 0,0025
58,30 ±
0,17
3,0 55,01 ±
0,25
51,08 ±
0,22 -
80,93 ±
0,45 0,0050
89,57 ±
0,1
3,5 76,01 ±
0,35
72,11 ±
0,45 - - 0,1250
93,12 ±
0,12
IC50 2,85 2,96 1,32 2,06 0,00217
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4 chủng Lb. fermentum
TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa
tăng dần theo chiều tăng của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau
khi so sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau. Khả năng bắt gốc tự do của EPS
sinh tổng hợp từ chủng Lb. fermentum TC21 đạt được tương đối cao, ở nồng độ 1,0
mg/ml, EPS từ chủng này đã có tỉ lệ bắt gốc tự do đạt 36,94% và tăng nhanh khi nồng
độ EPS tăng lên 1,5 mg/ml (đạt 57,14%). Khả năng này bắt đầu tăng chậm hơn khi
nồng độ EPS thử nghiệm là 2,0 mg/ml và 2,5 mg/ml. Ở hai nồng độ này, tỉ lệ bắt gốc
97
tự do của EPS lên DPPH đạt được lần lượt là 67,14% 78,99%. Với chủng Lb.
fermentum MC3, khả năng chống oxy hóa của EPS từ chủng này chỉ đạt 27,14% khi
nồng độ EPS là 1,5 mg/ml. Tỉ lệ bắt gốc tự do tăng dần và đạt 80,93% khi nồng độ
EPS sử dụng tăng gấp đôi (3,0 mg/ml). Khả năng chống oxy hóa của các EPS tổng
hợp từ hai chủng Lb. fermentum TC13 và TC16 đạt được đều tương đối thấp giống
nhau khi ở cùng các mức nồng độ như nhau. Ở nồng độ EPS sử dụng là 3,0 mg/ml, tỉ
lệ bắt gốc tự do của EPS từ hai chủng này chỉ đạt 51,08 - 55,01%. Khi nồng độ EPS
tăng lên 3,5 mg/ml, khả năng chống oxy hóa của EPS từ hai chủng này cũng chỉ tăng
lên 72,11 – 76,01%.
Các dữ liệu từ Bảng 3.6 cũng chỉ ra rằng, khả năng chống oxy hóa của EPS sinh
tổng hợp từ Lb. fermentum TC21 thể hiện tốt nhất. Tỉ lệ bắt gốc tự do của các EPS
sinh tổng hợp từ 4 chủng LAB này được so sánh cụ thể hơn thể hiện thông qua giá trị
IC50. Khả năng bắt 50% gốc tự do của các EPS từ các chủng Lb. fermentum TC13,
TC16, TC21 và MC3 xảy ra ở các nồng độ tương ứng là 2,85 mg/ml, 2,96 mg/ml,
1,32 mg/ml, 2,06 mg/ml. Khả năng chống oxy hóa của các EPS có thể liên quan trực
tiếp đến mối liên kết trong phân tử EPS với các ion có gốc oxy hóa tạo nên các gốc
ổn định, chính vì thế mà nó ngăn chặn được chuỗi tác nhân phản ứng. Thêm vào đó,
sự có mặt của một lượng lớn các nhóm hydroxyl trong phân tử EPS cũng có thể tạo
ra những phản ứng mà chính sự kết hợp của chúng với nhau để tạo thành những sản
phẩm vô hại thông qua việc cung cấp các nguyên tử hydro kết hợp với các gốc
hydroxyl để tạo thành nước và những gốc tự do C bị oxy hóa tiếp nhằm tạo nên các
gốc peroxy [124].
Như vậy, khả năng chống oxy hóa của các chủng khác nhau là không giống
nhau. Các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB trong nghiên cứu
này đều có khả năng chống oxy hóa. Tuy nhiên, so với acid ascorbic thì khả năng bắt
gốc tự do của EPS từ các chủng này đều tương đối thấp. Khả năng chống oxy hóa của
acid ascorbic là rất tốt, ở nồng độ rất thấp (chỉ 0,00217 mg/ml) tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH của acid ascorbic đã đạt được 50%. Khả năng chống oxy hóa của hợp chất này
tăng lên rất nhanh khi tăng nồng độ. Khả năng bắt gốc tự do của acid ascorbic chỉ
tăng chậm khi nồng độ tăng lên từ 0,005 mg/ml đến 0,125 mg/ml (chỉ tăng lên gần
98
4%). Dù khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 là tương đối thấp, tuy nhiên, ưu điểm lớn và
trọng yếu của các EPS này là tổng hợp sẵn ngay trong sản phẩm. Điều này giúp cho
thực phẩm có được khả năng chống oxy hóa vốn có từ ban đầu. Bên cạnh đó, việc sử
dụng các thành phần được sinh ra trực tiếp trong sản phẩm có thể tạo nên cho thực
phẩm bản chất tự nhiên, hướng đến các loại thực phẩm an toàn, không sử dụng phụ
gia tổng hợp.
Khả năng chống oxy hóa của EPS sinh tổng hợp từ các vi khuẩn thuộc LAB
cũng được nhiều nhà nghiên cứu công bố. Liu và cộng sự (2011) đã kết luận rằng,
EPS sinh tổng hợp từ Lactobacillus có tác dụng lên quá trình sản xuất cytokine (gồm
IL-6, TNF-α, IL-1β) và có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự oxy hóa các acid linoleic
trong điều kiện in vitro [75]. Hoạt tính chống oxy hóa của EPS (LPC-1) thu nhận
được từ L. plantarum C88 đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013) [139].
Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối
với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác
nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế bào Caco-2 đã được kháo sát. Kết quả cũng
đã chỉ ra rằng khả năng ức chế sự hình thành của malondialdehyde (MDA- là chất
oxy hóa) và sự tăng hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và tổng hoạt lực
chống oxy hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ. EPS từ Lb. plantarum
C88 có tác dụng chống oxy hóa và liên quan đến khả năng loại bỏ phản ứng oxy hóa
(ROS), tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi enzyme cũng
như giảm sự hình thành peroxy của lipid. Tương tự, khả năng chống oxy hóa của hai
EPS (r-EPS1 và r-EPS2) được tách chiết từ chủng Lb. plantarum 70810 cũng được
công bố bởi Wang và cộng sự (2014) [126] trong điều kiện in vitro. Cả r-EPS1 và r-
EPS2 đều có khả năng chống oxy hóa mạnh đối với nhóm hydroxyl và gốc tự do
DPPH. Từ kết quả đó, nhóm tác giả dự đoán rằng, hai EPS này có thể được sử dụng
để sản xuất thuốc chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy của EPS sinh tổng hợp từ
chủng Lb. plantarum YW32 cũng được Wang và cộng sự (2015) [124] nghiên cứu
và kết luận trong điều kiện in vitro. Ở điều kiện nghiên cứu của mình, nhóm tác giả
đã xác định được khả năng chống oxy hóa của EPS lên chất oxy hóa DPPH, các gốc
99
hydroxyl và gốc oxy hóa khác. Khả năng bắt gốc tự do của EPS sinh tổng hợp từ
chủng này đạt 66,5% ở nồng độ 5,0 mg/ml và có xu hướng tăng lên theo chiều tăng
của nồng độ. Với kết quả này, nhóm nghiên cứu cũng kết luận EPS từ Lb. plantarum
YW32 có thể là một tác nhân chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng ngăn ngừa những
tổn thương do quá trình oxy hóa trong các điều kiện sinh lý và khả năng chống oxy
hóa của EPS chịu tác động bởi nhiều nhân tố như thành phần đường, khối lượng phân
tử, các liên kết trong cấu trúc cũng như những phương pháp tách chiết và thu nhận đã
sử dụng. Xu và cộng sự (2011) [135] đã nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của
EPS sinh tổng hợp từ Bifidobacterium animalis RH trong điều kiện in vitro và in vivo.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các EPS (EPSa- EPS trung tính, EPSb- EPS acid) tinh
chế từ chủng này đều có tác dụng ức chế đáng kể quá trình oxy hóa lipid và khả năng
loại bỏ gốc từ do DPPH, loại bỏ gốc hydroxyl và hoạt động chống oxy hóa triệt để.
Kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng, các phân đoạn EPS từ Bifidobacterium animalis
RH có khả năng chống oxy hóa trực tiếp. Trong điều kiện in vitro và in vivo, EPSb
thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn rất nhiều so với EPSa. Các EPS tương ứng
sinh tổng hợp từ Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lb. plantarum R315
(L-EPS) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và có khả năng kháng khuẩn là công bố
của Li và cộng sự (2014) [72]. Thông qua các thử nghiệm thể hiện hoạt tính sinh học
của hai EPS thu được, nhóm tác giả đã kết luận rằng, cả hai EPS này đều có thể ứng
dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
3.2. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của
các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3
Các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 trong môi trường chứa nguồn C
và N thích hợp được tiến hành tách chiết TCA để loại bỏ protein. Sau đó, các EPS
trong dịch nổi được thu nhận bằng cách bổ sung EtOH. EPS tủa thu được sau khi ly
tâm sẽ được tiến hành hòa tan vào nước (vừa đủ) và thực hiện thẩm tích nhằm loại bỏ
các phân tử đường đơn, các thành phần hòa tan khác. Tiến hành đông khô mẫu sau
quá trình thẩm tích và thu mẫu và thực hiện phân tích khối lượng phân tử, các đặc
điểm về cấu trúc.
3.3.1. Khối lượng phân tử
100
Các EPS (10 mg) sau khi đông khô được hòa tan lại trong NaNO3 0,1M. Tiến
hành tiêm 20 µl dung dịch chứa EPS vào cột sắc kí lỏng cao áp hiệu Agilent 1100
(USA). Thực hiện rửa giải bằng NaNO3 0,1M với tốc độ 1 ml/phút. Thời gian xuất
hiện tương ứng của EPS được thể hiện trên sắc kí đồ. Kết hợp với chất chuẩn, khối
lượng của các EPS phân tích được xác định (Hình 3.14).
Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký
thẩm thấu gel
Kết quả phân tích khối lượng phân tử các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum
MC3 (EPS-MC3) trên sắc kí đồ cho thấy sự đồng nhất với một peak ở 8,366 phút
(phụ lục 8). Dựa vào đường cong rửa giải kết hợp đối chứng với chất chuẩn pullulan
có khối lượng phân tử khác nhau (bao gồm 20, 50, 100, 200 kDa) chúng tôi nhận thấy
rằng EPS sinh tổng hợp Lb. fermentum MC3 chỉ chứa một phân tử với khối lượng
trung bình khoảng 98,5 kD (Hình 3.14).
Sự biến thiên về khối lượng phân tử của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB
khác nhau cũng đã được nhiều tác giả công bố. Nghiên cứu của Cerning và cộng sự
(1986) đã chỉ ra rằng, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 416a sinh tổng hợp một EPS
với khối lượng phân tử tương ứng 5 x 105 Da [21]. Công bố của Marshall và cộng sự
(1995) cho thấy rằng, chủng La. lactis subsp. cremoris LC 330 có khả năng sinh tổng
a) b)
Khối lượng phân tử (D) Khối lượng phân tử (D)
Khối lượng trung bình (Da)
101
hợp đồng thời hai EPS với một EPS có khối lượng phân tử lớn hơn 1,0x106 Da và một
EPS có khối lượng phân tử thấp với 1,0x104 Da. Trái ngược với EPS có khối lượng
phân tử cao, quá trình sinh tổng hợp EPS có khối lượng phân tử thấp không chịu ảnh
hưởng bởi điều kiện lên men (trong môi trường bị giới hạn về nguồn N) [80].
Bằng phương pháp HPLC, khối lượng phân tử các phân đoạn của các EPS sinh
tổng hợp từ chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong môi trường
chứa nguồn C khác nhau đã được xác định. Trong môi trường chứa glc, EPS sinh
tổng hợp từ chủng này đã được xác định với sự xuất hiện của hai peak với một phân
tử có khối lượng phân tử cao là 1,7 x 106 Da và một phân tử có khối lượng phân tử
thấp hơn là 4,2 x 104 Da. EPS sinh tổng hợp trong môi trường chứa fruc cũng chứa
hai peak với khối lượng phân tử lần lượt là 1,3 x 106 Da và 3,8 x 104 Da. Các EPS có
khối lượng phân tử thấp hình thành trong môi trường nuôi cấy được tổng hợp với số
lượng thấp hơn. Qua việc xác định được các phân đoạn EPS sinh tổng hợp từ chủng
Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772, nhóm tác giả cũng giải thích rằng, quá
trình sinh tổng hợp nên các EPS có phân tử lượng cao có thể phụ thuộc vào nguồn C,
trong khi đó, việc tổng hợp các EPS có khối lượng phân tử thấp lại không liên quan
đến cơ chất của sự sinh trưởng và phát triển có trong môi trường [55]. Degeest và de
Vuyst (1999) công bố kết quả về khả năng sinh tổng hợp một phân tử EPS giống nhau
trong cả môi trường chứa sữa và MRS lỏng từ S. thermophilus LY03. Nhóm tác giả
kết luận, thực tế cả hai loại EPS này đều được tổng hợp đồng thời và mặc dù chúng
có cùng thành phần các monome cấu tạo nên, tuy nhiên phân tử lượng của chúng lại
khác nhau. Kết quả phân tích theo phương pháp sắc kí thẩm thấu gel cho thấy một EPS
có khối lượng phân tử cao (1,8x 106 Da) và một phân tử EPS có khối lượng thấp
(4,1x105 Da). Tỉ lệ của các EPS này phụ thuộc rất nhiều vào tỉ lệ C/N trong môi trường
lên men. Quan sát từ thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy sự chuyển từ một
EPS có khối lượng phân tử cao thành một EPS có khối lượng phân tử thấp hơn cùng
với việc tăng nồng độ N phức tạp ban đầu [32]. Trong môi trường sữa tách béo, chủng
Lb. acidophilus 5e2 sinh tổng hợp EPS với ba phân đoạn có khối lượng phân tử khác
nhau: peak xuất hiện sớm nhất có khối lượng phân tử cao khoảng 400 kDa (chiếm 10%
so với tổng); tiếp đó là một peak khác có khối lượng phân tử trung bình khoảng 150
102
kDa (chiếm 50% so với tổng); và peak được rửa giải cuối cùng có khối lượng thấp hơn
khoảng 130 kDa (chiếm 40% so với tổng) là công bố của Laws và cộng sự (2008) [68].
Dịch thô chứa EPS trong môi trường nuôi cấy chủng Lb. helveticus thu được qua quá
trình kết tủa bởi EtOH. Tiến hành phân đoạn trên cột Sephacryl S-200 cho thấy có hai
EPS với kí hiệu là LB1 và LB2. Bằng phương pháp sắc kí thẩm thấu gel với chất chuẩn
là các Dextran có khối lượng khác nhau (2x106, 5x105, 4x104 Da), khối lượng phân tử
của hai EPS này cũng được công bố là khác nhau với khối lượng tương ứng là 5,4 x
105 Da của LB1 và 20,3 x 105 Da của LB2 [61].
Khối lượng phân tử của EPS sinh tổng hợp từ Lb. kefiranofaciens ZW3 phân lập
từ một loại rượu của Tây Tạng đã được Ahmed và cộng sự (2013) kết luận khi nhóm
tác giả này nghiên cứu một số đặc điểm của EPS này [10]. Bằng phương pháp thẩm
thấu gel HPLC, sắc kí đồ thu được của EPS này cho thấy chỉ có một đỉnh duy nhất với
khối lượng phân tử ước tính là 5,5 x 104 Da. Một EPS (LPC-1) khác sinh tổng hợp từ
Lb. plantarum C88 được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion và sắc ký thẩm thấu gel có
khối lượng phân tử trung bình là 1,15 x 106 Da [139]. Đặc tính lý hóa của các EPS sinh
tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N trong môi trường có chứa các nguồn C khác
nhau đã được nghiên cứu bởi Polak-Berecka và cộng sự (2013). Sự khác nhau về khối
lượng phân tử các EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. rhamnosus E/N khi nuôi cấy trong
môi trường MRS có bổ sung vào năm nguồn C khác nhau gồm suc (EPS-Suc), gal
(EPS-Gal), maltose (EPS-Mal), glc (EPS-Glc), lac (EPS-Lac) được xác định bằng
phương pháp sắc kí thẩm thấu gel. Khối lượng của các EPS lần lượt như sau: EPS-Mal
là 195 kDa, EPS-glc là 548,7 kDa, EPS-Gal là 3901 kDa, EPS-Lac là 7027 kDa và
EPS-Suc là 11130 kDa. Từ kết quả này, nhóm tác giả đã kết luận rằng, một chủng vi
khuẩn bất kỳ có thể sinh tổng hợp những EPS khác nhau với những đặc tính lý hóa
không giống nhau tùy thuộc vào nguồn C trong môi trường nuôi cấy [96].
Như vậy, khối lượng phân tử của các EPS sinh tổng hợp bởi các loài thuộc LAB
là không giống nhau. Chúng thường dao động từ 1,0x104 đến 6,0x106 Da. Trong quá
trình phát triển, một số chủng LAB có thể tổng hợp một EPS với một khối lượng phân
tử nhất định hoặc cũng có thể tổng hợp nên các EPS với khối lượng phân tử khác
nhau. Sự khác biệt về khối lượng phân tử của các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể
liên quan đến loài, nguồn tách chiết hoặc tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong
103
môi trường mà vi khuẩn đó sinh trưởng và phát triển. Kết quả khối lượng phân tử của
EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 hoàn toàn phù hợp với các công bố trước
đây về thông tin khối lượng phân tử của EPS tách chiết từ LAB.
3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3
3.3.2.1. Thành phần monosaccharide của các EPS
Mẫu EPS được tiến hành methyl hóa bằng (CH3)2SO4, sau đó tiếp tục thủy phân,
khử hóa, tạo dẫn xuất acetyl theo mục 2.3.8.2 và 2.3.8.3 và phân tích trên thiết bị GC-
MS -Shimadzu (2010). Từ kết quả GC-MS phân tích được, chúng tôi đã xác định được
các dẫn xuất của monnosaccharide trong EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3.
Thông tin về các dẫn xuất của monosaccharide trong EPS-MC3 được thể hiện
ở Bảng 3.7.
Từ kết quả Bảng 3.7 chúng tôi nhận thấy rằng các thành phần monosaccharide
tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glc, D-man.
Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb.
fermentum MC3
STT Hợp chất Thời gian
lưu (phút)
Diện tích
peak
1 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl- D- glucitol 5,134 6665390
2 1,3,5 tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methyl-D-mannitol 6,025 6034772
Từ diện tích peak của các dẫn xuất có mặt trong kết quả phân tích GC-MS chúng
tôi suy ra được tỷ lệ và thành phần phần trăm của các monosacharide. Kết quả được
xác định ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng
hợp bởi Lb. fermentum MC3
STT Thành phần Tỷ lệ Thành phần (%)
1 D-glucose 1,00 52,48
2 D-mannose 0,91 47,52
Với EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 (EPS-MC3), kết quả dữ liệu
Bảng 3.8 cho thấy, thành phần D-glc chiếm tỉ lệ cao nhất với 52,48% trong tổng số
104
các thành phần monosaccharide còn lại là D-man với tỉ lệ phần trăm tương ứng là
47,52%. Tỉ lệ phân tử tương ứng của glc và man trong EPS-MC 3 lần lượt là 1,00 :
0,91. Điều đó cho thấy, EPS-MC3 chứa chủ yếu là glucomanan (cấu thành từ D-glc
và D-Man). Từ các kết quả phân tích thành phần monosaccharide, chúng tôi kết luận
rằng EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. fermentum MC3 là một HePS với bộ khung chủ
yếu của EPS-MC3 là glucan.
Kết luận của một số công trình nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc của EPS tổng
hợp từ các chủng Lb. fermentum tách chiết từ các nguồn khác nhau bao gồm các
chủng: Lb. fermentum F6, Lb. fermentum Lf2 và Lb. fermentum TDS030603 với
thành phần đường đều chứa glc và gal, tuy nhiên tỉ lệ của hai đường này trong phân
tử EPS lại có sự khác nhau. Tỉ lệ glc và gal của EPS tách chiết từ Lb. fermentum F6
được công bố là 4:3 [141], EPS từ Lb. fermentum Lf2 là 2:1 [12], trong khi đó tỉ lệ
của glc và gal trong EPS của Lb. fermentum TDS030603 là 2,6:1,0 [49]. Với các kết
quả công bố về thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum
chúng tôi tham khảo được đến thời điểm hiện tại, sự có mặt của man trong thành phần
của EPS-MC3 được coi là một điểm mới và có sự khác biệt so với thành phần
monosaccharide của các EPS đã được công bố trước đây.
Với mỗi chủng LAB khác nhau sẽ sinh tổng hợp nên một loại EPS có cấu trúc
khác nhau. Cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc
loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000)
[137]. Exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. helveticus 776 và
TN-4 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ mol tương
ứng là 1:2 và 1:1 [103]. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa
thêm N-acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb.
helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2
mạch nhánh [137].
Sự đa dạng về thành phần các monosaccharide và các tỉ lệ tương ứng trong cấu
trúc của các EPS tổng hợp từ các LAB khác nhau (thậm chí là trong cùng một loài)
cũng được nhiều tác giả nghiên cứu công bố. Kết luận của Harding và cộng sự (2005)
về đặc điểm cấu trúc của một PS phân nhánh tổng hợp từ Lb. delbrueckii subsp.
105
bulgaricus NCFB2074 gồm D-glc và D-gal với tỷ lệ mol tương ứng là 3: 4 [58]. Với
chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus rr phát triển trong môi trường chứa sữa tách
béo sinh tổng hợp EPS đã được thu nhận. Thực hiện kết tủa phân đoạn EPS thu được
bằng aceton và tinh chế bằng phương pháp lọc gel trên Sephacryl S-500 cho thấy
thành phần của hỗn hợp thu được không chứa protein. Polysaccharide thu được gồm
100% carbohydrate với thành phần monosaccharide gồm D-gal, L-rha, và D-glc ở tỉ
lệ tương ứng là 5:1:1 là kết luận của Gruter và cộng sự (1993) [56]. Một số EPS sinh
tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc loài Lb. delbriickii subsp. bulgaticus trong môi
trường sữa tách béo cũng đã được nghiên cứu và công bố về các thành phần
monosaccharide không giống nhau bởi nhiều nhóm tác giả khác nhau. Một dạng chất
nhờn sinh tổng hợp bởi chủng Lb. delbriickii subsp. bulgaticus rr với thành phần gồm
các loại đường như gal và glc ở tỉ lệ mol tương ứng là 2:1 [110]. Các PS khác từ một
số chủng như Lb. delbriickii subsp. bulgaticus CNRZ 416, CNRZ737 có thành phần
gồm gal, glc và rha với cùng một tỉ lệ tương ứng giống nhau là 4:1:1 [21]. Trong khi
đó, Wang và cộng sự (2014) đã kết luận về sự có mặt của các monosaccharide gồm
glc, gal và man trong EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. plantarum 70810. Thực hiện
tách chiết và tinh chế bằng EtOH cùng các phương pháp sắc ký lọc gel, sắc kí trao
đổi ion đã chọn ra được hai phân đoạn EPS khác nhau (r-EPS1 và r-EPS2). Từ kết
quả GC-MS của hai EPS này cho thấy, thành phần các monosaccharide trong r-EPS1
và r-EPS2 thu được đều chứa các monosaccharide giống nhau là glc, man và gal với
các tỉ lệ tương ứng khác nhau lần lượt là 18,21:78,76:3,03 và 12,92:30,89:56,19
[109].
Với EPS từ Lb. plantarum YW32, thành phần của EPS tổng hợp được gồm man,
fruc, gal và glc ở tỉ lệ mol tương ứng là 8,2:1:4,1:4,2 là kết luận của Wang và cộng
sự (2015) [124]. Công bố của Robjin và cộng sự (1996) về đặc điểm cấu trúc của EPS
sinh tổng hợp từ Lb. acidophilus LMG9433 là một heteropolyme bao gồm các thành
phần D-glc, D-gal, acid D-glucuronic, và 2-acetamido-2-deoxy-D-glc với tỉ lệ mol
2:1:1:1 [102].
Một PS sinh tổng hợp bởi Lb. rhamnosus KL37B đã được tiến hành tách chiết
và tinh chế bằng các phương pháp khác nhau với hai phân đoạn được gọi là EPS-1 và
106
EPS-2. Thành phần monosaccharide của hai EPS này đã được kết luận bởi Górska-
Fraczek và cộng sự (2011) với hai loại đường trong phân tử là glc và gal ở cùng một
tỉ lệ giống nhau là 1:2. Sự khác nhau chỉ thể hiện ở các vị trí liên kết giữa các
monosaccharide chi tiết của hai EPS này. Cụ thể như sau: với EPS-1 gồm các dẫn
xuất 3-galactofuranose (1,3,4-tri-O-acetyl-2,5,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 2-
galactofuranose (1,2,4-tri-Oacetyl-3,5,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-
galactofuranose (1,4,6,-tri-O-acetyl-2,3,5-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-
glucopyranose (1,5,6-tri-Oacetyl-2,3,4-tri-O-methyl-D-glucitol) và 3-glucopyranose
(1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methyl-D-glucitol) với tỉ lệ mol tương ứng là
0,6:0,5:0,6:1:1; với EPS-2 lại gồm các dẫn xuất 6-galactofuranose (1,4,6,-tri-O-
acetyl-2,3,5-tri-O-methyl-D-galactitol), 3,6- galactofuranose (1,3,4,6-tetra-O-acetyl-
2,5-di-O-methyl-D-galactitol), 4-galactopyranose hoặc 5-galactofuranose (1,4,5-tri-
O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-galactopyranose (1,5,6-tri-O-acetyl-
2,3,4-tri-O-methyl-D-galactitol), 2- glucopyranose (1,2,5-tri-O-acetyl-3,4,6-tri-O-
methyl-D-glucitol), 3-glucopyranose (1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-Omethyl-D-
glucitol), và glucopyranose (1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol) với
tỉ lệ tương ứng là 1,2:1,0:0,9:2,0:1,0:1,0:0,8 [54].
Bên cạnh yếu tố liên quan đến loài vi khuẩn, nguồn thu nhận, điều kiện thu nhận
ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide trong cấu trúc lặp lại của PS, sự đa dạng
này còn liên quan đến hệ enzyme nội bào và hoạt độ của chúng có mặt trong chính
các chủng vi khuẩn đó. Quá trình sinh tổng hợp các HePS liên quan đến quá trình vận
chuyển các nguồn carbon từ môi trường ngoài vào tế bào chất theo cơ chế khuếch tán
và vận chuyển tích cực và có sự tham gia xúc tác của các enzyme khác nhau. Trong
tế bào, dưới tác dụng đặc hiệu của hệ các enzyme nội bào, các cơ chất đường được
chuyển hóa thành các dạng khác nhau. Cụ thể là, glc có trong môi trường nuôi cấy
Lb. fermentum MC3 được vận chuyển vào tế bào theo cơ chế vận tải tích cực. Ở bên
trong tế bào, dưới tác dụng của enzym hexokinase, glc chuyển hóa thành Glc-6-P,
sau đó nhờ xúc tác của enzyme PGM, Glc-6-P chuyển thành Glc-1-P. Theo cơ chế
quá trình sinh tổng hợp, Glc-1-P dưới tác dụng của hệ enzym pyrophosphorylase,
dehydrogenase khác nhau để tạo thành các nucleotide đường bao gồm Rha, Gal, Glc
107
trong phân tử EPS. Sự có mặt của monosaccharide là glc trong đơn vị lặp lại của PS
từ LAB có thể được giải thích là do sự có mặt của hệ enzyme tham gia vào quá trình
phosphoryl hóa là UDP-Glc pyrophosphorylase. Chính enzyme này sẽ xúc tác quá
trình chuyển hóa tạo thành nucleotide đường của glc trước khi hình thành đơn vị lặp
lại là glc trong cấu trúc của PS. Một nhánh khác, Glc-1-P dưới tác dụng của enzyme
PMM để hình thành nên Man-6-P sau đó tạo thành Man-1-P dưới tác dụng của man-
1-P guanylyltransferase có trong tế bào. Thành phần monosaccharide lặp lại fruc
trong phân tử EPS có được là do sự xúc tác đặc hiệu của GDP-man dehydratase lên
GDP-Man. Như vậy, kết quả của quá trình xúc tác này tạo thành các đơn vị tiền thân
lặp đi lặp lại trong phân tử của EPS gồm Glc, Gal, Rha, Fruc (Hình 1.5). Tuy nhiên,
với kết quả phân tích được về thành phần đường của EPS-MC3, PS tổng hợp được
chỉ gồm đường glc và man trong thành phần của chúng. Điều này có thể lý giải rằng,
sự hình thành các đơn vị lặp lại monnosaccharide khác nhau trong EPS tổng hợp từ
LAB ngoài liên quan đến nguồn cơ chất khác nhau, nó còn liên quan đến hoạt độ của
các enzym đặc hiệu bên trong tế bào của chúng. Với quá trình tổng hợp EPS-MC3,
hoạt độ của enzyme xúc tác sự hình thành GDP-fruc từ GDP-man có thể rất thấp hoặc
đã bị bất hoạt trong quá trình nuôi cấy do một số điều kiện nuôi cấy chủng Lb.
fermentum MC3 gây nên. Chính vì thế, thay vì sự hình thành fruc trong PS thì đơn vị
lặp lại man được hình thành và tham gia vào cấu tạo nên thành phần của EPS-MC3.
Trong nghiên cứu này, bên cạnh sự có mặt của các monnosaccharide như glc,
man, sự vắng mặt của một số monnosaccharide như fruc hoặc rha, gal có thể được
giải thích là do hoạt độ của các enzym xúc tác sự hình thành các loại đường này ở
giai đoạn chuyển hóa từ glc-1-P thấp hơn nhiều so với hoạt độ của các enzym khác.
Với mỗi enzyme tương ứng có trong tế bào của vi khuẩn, chúng có khả năng
xúc tác lên một cơ chất nhất định để tạo thành các sản phẩm khác nhau. Hoạt độ xúc
tác của chính các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp HePS sẽ quyết định
trực tiếp lên sự tạo thành các phân tử đường lặp lại trong chính cấu trúc của PS tổng
hợp được. Kết quả của nhiều nghiên cứu trước đây về thành phần monosaccharide
tham gia cấu tạo nên PS tổng hợp từ các chủng thuộc LAB đa phần đều chứa glc và
gal. Chỉ một số rất ít các công bố về sự có mặt của man hay fruc hoặc rha. Qua đó,
108
có thể thấy, cấu trúc EPS-MC3 với sự có mặt của man và glc có thể là một điểm khác
biệt chủ yếu trong thành phần EPS so với đại đa số các EPS sinh tổng hợp từ LAB đã
được công bố trước đây.
Tương ứng với sự có mặt của các thành phần monosaccharide trong mỗi EPS
tổng hợp được từ LAB được tạo thành là hoạt độ xúc tác của chính các enzyme đó
chiếm ưu thế. Hoạt độ của một enzyme trong tế bào vi khuẩn mạnh hay yếu chịu tác
động bởi nhiều yếu tố lý hóa khác nhau như nhiệt độ, pH, hoạt độ của nước cũng như
sự có mặt của các cơ chất trong môi trường. Đa phần các chủng LAB đã nghiên cứu
đều được tiến hành trong những điều kiện lý hóa khác nhau điều này đã tạo nên những
ảnh hưởng nhất định đến hoạt độ xúc tác của enzyme trong quá trình tạo thành các
phân tử đường lặp lại.
Thành phần monosaccharide và tỷ lệ giữa các monome trong EPS cũng như sự
phân bố khối lượng phân tử của EPS có thể thay đổi phụ thuộc vào các nguồn
carbohydrate được bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy là kết luận của nhiều công
trình nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu được công bố bởi Cerning và cộng sự (1994)
cho thấy rằng thành phần đường của EPS thu được chủ yếu là glc khi EPS được hình
thành bởi chủng Lb. casei CG11 và hai chủng Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-
ST trong môi trường BMM (buffer minimal medium - Môi trường tối ưu) có chứa
nguồn carbohydrate duy nhất là glc. Tỉ lệ glc (86,6-88%) trong EPS sinh tổng hợp từ
Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-ST cao hơn so với tỉ lệ glc trong EPS được hình
thành bởi Lb. casei CG11 (75,6%). Một kết luận khác trong nghiên cứu này đã chỉ ra
rằng, có một lượng nhỏ gal cũng có mặt trong các EPS sinh tổng hợp từ cả ba chủng
Lb. casei. Ngược lại, khi nuôi cấy các chủng này trong môi trường chứa lac như là
nguồn carbohydrate duy nhất, thành phần monosaccharide của những EPS này khác
với EPS sinh tổng hợp trong môi trường BMM chỉ chứa glc. Có 63% glc trong thành
phần của EPS sinh tổng hợp bởi chủng CG11, trong khi đó, lượng glc trong EPS được
tổng hợp bởi hai chủng Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-ST lại chiếm ít hơn rất
nhiều. Tỉ lệ glc trong các EPS từ hai chủng này lần lượt là: 37% cho chủng CG11-
NB và 39,2% cho chủng CG1-ST. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn cho thấy, khi môi
trường nuôi cấy chứa nguồn carbohydrate là lac, lượng gal ở các EPS thu nhận được
109
lớn hơn so với lượng gal trong các EPS tách chiết từ môi trường BMM có chứa glc.
Lượng gal chiếm tỉ lệ cao hơn ở EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. casei
CG11-NB, (47,1%) và Lb. casei CG1-ST (49,7%) so với gal trong EPS tổng hợp từ
chủng Lb. casei CG11 (13,2%). Trong điều kiện nuôi cấy này, một lượng nhỏ man
cũng đã được tìm thấy trong EPS được sinh tổng hợp bởi cả ba chủng Lb. casei. Như
vậy, sự phân bố của các loại đường trong EPS được sản xuất bởi các chủng thuộc Lb.
casei CG11 khác nhau tùy thuộc vào các nguồn carbohydrate [22]. Trong một nghiên
cứu trước đây, Cerning và cộng sự (1992) cũng công bố rằng có một sự khác biệt về
thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. casei CG11 trong môi
trường chứa sữa hoặc sữa có bổ sung glc hoặc suc và trong môi trường BMM có chứa
glc hoặc suc [20]. Grobben và cộng sự (1996) cũng đã công bố rằng thành phần
monosaccharide của EPS được sinh tổng hợp bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus
NCFB 2772 khi nuôi trong môi trường bổ sung fruc bao gồm glc và gal với tỷ lệ mol
1,0:2,4. Trong môi trường có bổ sung hỗn hợp fruc và glc, thành phần monosaccharide
của EPS tổng hợp được là glc, gal, rha với tỷ lệ mol 1,0 : 7,0 : 0,8 [55].
Bên cạnh những công bố về ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự hình thành các
monosaccharide trong phân tử EPS, một số công trình nghiên cứu khác lại kết luận
rằng, các nguồn carbohydrate bổ sung vào môi trường nuôi cấy ban đầu hầu như
không ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide và tỷ lệ giữa các monome trong
EPS mà chỉ ảnh hưởng đến sự phân bố khối lượng phân tử và độ nhớt của EPS. Van
Den Berg (1995) đã công bố rằng thành phần monosaccharide của EPS sinh bởi chủng
Lb. sake 0-1 là không có sự khác nhau khi bổ sung các nguồn carbohydrate khác nhau
[119]. Đây cũng là kết quả nghiên cứu của Laws và cộng sự (2008) khi nghiên cứu
đặc điểm về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. acidophilus 5e2 [68]. Polak-
Berecka và cộng sự (2013) cũng đã công bố rằng các EPS sinh tổng hợp bởi chủng
Lb. rhamnosus E/N có cấu trúc cơ bản độc lập với việc bổ sung các nguồn
carbohydrate khác nhau trong môi trường MRS. Các thành phần monosaccharide của
EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N gồm 4 rha, 2 glc, 1 gal và một lượng
dư với một nhóm thế pyruvate. Nghiên cứu cho thấy những khác biệt trong phân bố
khối lượng phân tử của EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N với những
110
phân đoạn chứa EPS có khối lượng phân tử cao và thấp gồm EPS-Gal, EPS-Suc và
EPS-Lac. Trong khi đó Polak-Berecka (2013) cũng chỉ phát hiện được một phân đoạn
duy nhất chứa EPS có khối lượng phân tử cao đó là EPS-Mal và EPS-Glc khi nuôi
cấy trong hai nguồn C khác nhau [96].
Như vậy, các HePS quan trọng chủ yếu sinh tổng hợp bởi các chủng LAB công
nghiệp thường chứa các loại đường như D-gal, D-glc và L-rha, D-man ở tỉ lệ khác
nhau. Trong đó, glc như là một thành phần mặc định có mặt trong các đơn vị lặp lại
của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB. Từ những kết quả này chúng tôi
nhận thấy rằng, sự không giống nhau về thành phần monosaccharide và tỉ lệ phân tử
trong EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc LAB khác nhau một phần có
thể là do thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn C và nguồn N), một phần nữa có
thể do sự khác nhau về nguồn thu nhận và hoạt độ của chính các enzym nội bào tham
gia vào quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng LAB.
3.3.2.2. Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS
Sử dụng GC-MS để xác định vị trí liên kết
Mẫu EPS-MC3 sau khi methyl hoá được tiếp tục tiến hành thuỷ phân, khử hoá,
tạo dẫn xuất alditol acetate và phân tích trên thiết bị GC-MS (sơ đồ hình 2.5). Từ vị
trí C được methyl hóa trong dẫn xuất alditol acetate thu được, cho phép xác định các
liên kết glycoside tương ứng trong các mẫu PS. Các liên kết glycoside tương ứng
trong EPS-MC3 được trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết
glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3
STT Hợp chất Liên kết glycoside Tỷ lệ
1 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-
methyl-D-glucitol
→6)-D- glucopyranoside-(1→ 1,00
2 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-Tri-O-
methyl-D-mannitol
→3)-D- mannopyranoside-(1→ 0,91
Kết quả phân tích liên kết glycoside với mẫu EPS-MC3 đã methyl hóa bằng GC-
MS cho thấy có hai thành phần chính là 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl- D- glucitol
111
và 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-Tri-O-Methyl-β-D-Mannitol, với tỉ lệ phân tử tương ứng là
1,00 : 0,91 (Bảng 3.9). Từ kết quả thu được ở Bảng 3.9, chúng tôi nhận thấy rằng, bộ
khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng manno-glucan với hai liên kết chủ yếu
là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside. Kết quả này một lần nữa khẳng định EPS sinh
tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 thuộc bộ khung hetero-mannan-glucan.
Sự có mặt của các thành phần monosaccharide và các dạng liên kết khác nhau trong
bộ khung của các EPS-MC3 sẽ tiếp tục được xác định bằng phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiểu (1H-NMR và 13C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC,
NOESY, COSY).
Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về cấu trúc của EPS-
MC3
Chế phẩm EPS trước khi phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân được tiến hành xử lý theo sơ đồ Hình 3.15.
Mẫu EPS được tách chiết và tinh sạch một phần nhờ phương pháp thẩm tích với
nước trong 4 -5 ngày bằng máy khuấy. Tiến hành thu mẫu bằng phương pháp đông
khô ở nhiệt độ thấp. Mẫu này tiếp tục được thủy phân, cắt mạch PS với TFA 2M
trong 8 giờ ở 80oC để tạo thành các PS mạch ngắn hơn nhằm tăng khả năng hòa tan
Chế phẩm EPS
Thẩm tích
(4-5 ngày)
Đông khô
Thủy phân bằng TFA
2M, ở 80oC trong 8 giờ
Đông khô
Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR
112
của mẫu. Thực hiện loại bỏ TFA dư và tiến hành đông khô thu mẫu. Mẫu thu được
dưới dạng xốp, có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn.
Kết quả phân tích phổ NMR một chiều và hai chiều thể hiện ở trên các hình
3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21.
Các tín hiệu của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần hiện diện trong phổ 1H
-NMR, 13C – NMR và các dạng tương tác trong phổ 2D –NMR (HMBC, HSQC,
NOESY và COSY) cho phép xác định thành phần cũng như liên kết trong phân tử PS
của EPS-MC3.
Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy, trong vùng từ 4,5 đến
4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của
hai proton anomer ở độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm O-
methyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16). Dạng liên kết glycoside trong cấu trúc
của PS qua phương pháp phân tích NMR cho thấy, với liên kết α-pyranoside thì độ
chuyển dịch hóa học của các proton anomer có giá trị lớn hơn 5,0 ppm và liên kết β-
pyranoside thì proton anomer có độ chuyển dịch hóa học nhỏ hơn 5,0 ppm [9]. Với độ
chuyển dịch hóa học của proton anomer từ 4,5 – 5,5 ppm trong phổ 1H NMR, Zhou và
cộng sự (2016) đã kết luận rằng, EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. plantarum BC-25
các proton của nhóm O-methyl Proton anomer
A B
Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3
113
chứa cả hai dạng liên kết α và β [142]. Tương tự, sự có mặt của cả hai cấu hình dạng α
và dạng β của các phân tử cấu thành EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum TDS030603
cũng được kết luận với các độ chuyển dịch hóa học của proton anomer tương ứng tại δ
5,674, δ 5,325 δ 4,985 ppm và δ 4,731 ppm [49]. Cấu hình của các đơn vị lặp đi lặp lại
trong EPS sinh tổng hợp từ Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus EU23 được xác định dựa
trên sự kết hợp của độ chuyển dịch hóa học của proton anomer và hệ số ghép cặp của
các proton cũng đã được công bố bởi Harding và cộng sự (2003). Kết quả cho thấy, cấu
hình của Glc với H1 5,14 ppm và JH1,2 3,0 Hz và một phân tử Glc khác với H1 5,02 ppm
và JH1,2 3,0 Hz được xác định đều là dạng α-D-Glc; trong khi đó phân tử Glc với H1 4,32
ppm và JH1,2 7,5 Hz lại được xác định là β-D-Glc [57]. Do đó, kết hợp các kết quả đã
được công bố trước đây cùng với độ chuyển dịch hóa học của hai proton anomer trong
phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ở Hình 3.16 cho thấy, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên
kết glycoside dạng β. Bên cạnh đó, kết quả từ phổ 1H-NMR cũng chỉ ra rằng, EPS-MC3
chứa hai đơn vị monosaccharide chính trong cấu trúc lặp lại của nó. Hai monosaccharide
này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ chuyển dịch hóa học.
Carbon anomer
Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3
114
Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3 có sự xuất hiện
của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là 94,1 và 94,0 ppm và các vùng
carbon trong mạch vòng của nó từ 61,5 đến 77,2 ppm. Từ các công trình nghiên cứu
trước cho thấy, các tín hiệu của carbon anomer nằm trong khoảng 93,0 - 96,8 ppm
có thể được xác định là glc [9], [41], [49], [108] và có thể là man khi tín hiệu đó
nằm trong khoảng 94,5 - 95,0 [9], [98]. Ở độ chuyển dịch hóa học của carbon
anomer δ 93,0 ppm, EPS từ Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus EU23 được kết luận là
D-glc [57]. Gerwig và cộng sự (2013) đã xác định được phân tử glc trong cấu trúc của
EPS từ Lb. fermentum TDS030603 khi kết quả phân tích phổ 13C-NMR cho thấy sự xuất
hiện của tín hiệu carbon anomer ở δ 96,4 ppm [49]. Kết luận của Rani và cộng sự
(2018) cho thấy sự xuất hiện của phân tử man trong cấu trúc của EPS tách chiết từ
Lb. gasseri FR4 khi độ chuyển dịch hóa học của carbon anomer là 94,81 ppm [101].
Công bố của Agrawal (1998) về sự có mặt của các monosaccharide dựa vào kết quả
trên phổ 1H, 13C NMR cho thấy rằng, ở δH1 4,64 và δC1 93,0 hoặc δC1 96,8 được xác
định là phân tử glc; trong khi đó, ở δH1 4,89 và δC1 94,5 hoặc δC1 94,9 được xác định
là phân tử man [9]. Bên cạnh đó, với độ chuyển dịch hóa học của carbon anomer
(C1) của các oligosaccharide nằm trong khoảng từ 103 – 112 ppm, cấu trúc của
chúng thường ở dạng furanose. Cấu trúc dạng pyranose của các monosaccharide cấu
thành các PS thường gặp hơn ở những độ chuyển dịch hóa học của C1 dưới 103 ppm [9].
Cấu trúc của EPS từ Lb. rhamnosus KL37C là một pentasaccharide với sự cấu thành của
các monnosaccharide ở dạng furanose và pyranose là công bố của Lipi’nski và cộng sự
(2003). Theo đó, các tín hiệu C1 của các phân tử gal với độ chuyển dịch hóa học lần lượt
là 108,53; 106,01 ppm đều là cấu trúc dạng vòng furanose; trong khi đó, ba
monnosaccharide còn lại là hai glc và gal với độ chuyển dịch hóa học của C1 tương ứng
là 98,07; 99,16; 98,30 ppm đều là cấu trúc dạng pyranose [74]. Kết quả công bố tương
tự về sự có mặt của cấu trúc dạng pyranose và furanose trong cấu trúc lặp lại của các
monnosaccharide cấu tạo nên PS sinh tổng hợp từ Lb. johnsonii 142. Cấu trúc dạng
pyranose của các phân tử glc, gal đã được kết luận khi δC1 của chúng tương ứng nằm
trong khoảng 95 – 102 ppm. Trong khi đó sự xuất hiện của tín hiệu carbon anomer ở độ
chuyển dịch hóa học là 109,4 ppm được xác định là dạng furanose [52]. Các
115
monosaccharide trong cấu trúc của EPS từ Lb. plantarum C88 đã được kết luậnu đều có
dạng pyranose với các giá trị δC1 nằm trong khoảng từ 96 – 97 ppm [41]. Kết hợp các
kết luận này và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon anomer ở
94,1 nên có thể được quy cho là của β-D-mannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ
là β-D-glucopyranose.
Như vậy, kết quả NMR đã chỉ ra sự có mặt của glc và man trong cấu trúc của
oligosaccharide là hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích thành phần
monosaccharide theo phương pháp GC-MS ở mục 3.3.2.1.
Hơn nữa, các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác định được vị
trí của các phân tử carbon và proton trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng.
Cụ thể, thông tin trên phổ HSQC đã chỉ ra các peak carbon lần lượt là 94,1; 94,0;
77,2; 73,8; 73,2; 71,6; 71,4; 70,6; 67,4; 67,1; 61,5; 61,5 ppm có sự tương tác tương
ứng với các proton 4,55; 4,87; 3,01; 3,28; 3,47; 3,53; 3,51; 3,49; 3,50; 3,27; 3,43;
3,62 ppm (Hình 3.18). Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối trực tiếp với
nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3.
a)
116
b)
c)
Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3
117
Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các tương tác giữa các proton
của carbon cận kề nhau trong cấu trúc EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum
MC3. Các tương tác đó bao gồm tương tác giữa A H-2 (δ 3,53)/A H-3 (δ 3,62)/A H-
4 (δ 3,49), giữa A H-4 (δ 3,49)/A H-3 (δ 3,62)/ A H-5 (δ 3,28), giữa B H-3 (δ 3,47)/B
H-4 (δ 3,27)/B H-5 (δ 3,50), và giữa B H-5 (δ 3,50)/B H-4 (δ 3,27)/B H-6 (δ 3,43).
Kết quả này cho phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường
tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 (Hình 3.19).
Đối chiếu với các tài liệu tham khảo [41], [54], [101], [137], [142] cùng những
phân tích trên các phổ 1H -NMR, 13C – NMR, COSY và HSQC, chúng tôi đã xác định
được độ chuyển dịch hóa học của các thành phần đường trong EPS-MC3 (Bảng 3.10).
A1
B1
Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3
118
Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo
trong DMSO
Đơn vị: ppm
Phần đường H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 Ký
hiệu
→6)-β- D-
glucopyranoside-(1→
4,87 3,53 3,62 3,49 3,28 3,51 A
→3)-β-D-
mannopyranoside-(1→
4,55 3,01 3,47 3,27 3,50 3,43 B
Phần đường C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6
→6)-β- D-
glucopyranoside-(1→
94,0 71,6 61,5 70,6 73,8 71,4 A
→3)-β-D-
mannopyranoside-(1→
94,1 77,2 73,2 67,1 67,4 61,5 B
Từ Hình 3.20 cho thấy, phổ HMBC của EPS-MC3 xuất hiện các tương tác giữa
proton anomer A H-1 ( 4,87) với carbon B C-3 ( 73,2); giữa proton anomer B H-1
( 4,55) với carbon A C-6 ( 71,4). Kết quả này chỉ ra các mối liên kết glycoside
trong cấu trúc của EPS-MC3 tương ứng là A(1→3)B và B(1→6)A.
( 4,87)
( 73,2)
( 4,55)
( 71,4)
A
AH-1 BC-3
B
BH-1 AC-6
A(13)B glycoside
B(16)A glycoside
Hình 3.20. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3
119
Thêm vào đó, với những tương tác mạnh giữa các proton anomer với các proton
khác trong không gian thể hiện trên phổ NOESY (Hình 3.21) bao gồm giữa A H-1 (
4,87) với B H-3 ( 3,47); giữa B H-1 ( 4,55) với A H-6 ( 3,51). Thông tin này cho
phép chúng tôi định vị được các gốc đường (Bảng 3.11).
Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC
Đơn vị: ppm
Phần đường Ký
hiệu H1 NOESY HMBC Mối liên kết
(1→6)-β-D-glucopyranoside A 4,87
3,47
73,2
A: H1 với B: H3
A: H1 với B: C3
(1→3)-β-D-
mannopyranoside
B 4,55
3,51
71,4
B: H1 với A: H6
B: H1 với A: C6
Từ kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân tích thành phần
monosacharide của EPS-MC3 cho phép sắp xếp đơn vị mắt xích lặp lại với dạng liên
Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3
120
kết cụ thể như sau: [6)-β-D-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n (Hình
3.22)
Như vậy, từ kết quả phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D trên
oligosaccharide từ PS đã thủy phân một phần bằng acid chúng tôi dự đoán rằng, cấu
trúc của EPS được tách chiết từ dịch nuôi cấy của chủng Lb. fermentum MC3 là một
HePS chứa các đơn vị lặp đi lặp lại là D-glc và D-man trong mạch chính của nó. Sự
liên kết giữa hai thành phần này trong cấu trúc của EPS-MC3 thông qua các mối liên
kết 1,3- và 1,6- glycoside cũng phù hợp với rất nhiều các công bố trước đây.
Sự đa dạng về các mối liên kết với các thành phần monosaccharide khác nhau
trong cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB nói chung và từ chi Lactobacillus nói
riêng đặc biệt là loài Lb. fermentum đã được nhiều công trình nghiên cứu kết luận.
Về thành phần monosaccharide của PS tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus nói chung chủ yếu thường gặp là glc và gal ở tỉ lệ rất khác nhau với các
mối liên kết trong mạch chính cũng khác nhau như Lb. helveticus K16 [137], Lb.
johnsonii FI9785 [33]. Bên cạnh sự có mặt gần như thường xuyên của thành phần glc
và gal, có rất ít các công bố về thành phần monosaccharide của EPS từ loài
Lactobacillus có sự tham gia của man [101], [125], [127]; rha [47] [101], [104], [109];
1
2 3 4
5
1 6
1
6
6
2 3
4
5
5 4
3
2
Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy
phân một phần
121
fruc [125]. Các mối liên kết chủ yếu được công bố trong các nghiên cứu về cấu trúc
EPS từ chi Lactobacillus cũng thay đổi khác nhau, có thể chứa liên kết β-1,4- hoặc
liên kết β-1,3- hoặc liên kết β-1,6- và α-1,2-, α-1,3- hay α-1,4- hay các liên kết α-
1,6- glycoside [17], [33], [34], [49]. Sự khác nhau về đặc điểm cấu trúc như thành
phần monosaccharide, loại liên kết không chỉ xảy ra trong cùng một chi mà thậm chí
sự khác nhau này còn xảy ra trong cùng một loài (Bảng 3.12).
Đối với loài fermentum, các công bố trước đây về thành phần monosaccharide
của các EPS được kết luận chủ yếu chỉ chứa glc, gal và rha. Với kết quả nghiên cứu
của luận án, thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb.
fermentum MC3 không chứa thành phần gal và rha mà chỉ chứa glc và man trong cấu
trúc lặp lại của nó. Điều này cho phép chúng tôi có thể khẳng định rằng các đơn vị
lặp lại trong cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3, đặc biệt là sự có
mặt của man được coi là một điểm mới so với các cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ
các chủng vi khuẩn thuộc loài fermentum đã công bố trước đây.
Hoạt tính sinh hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB liên quan
trực tiếp đến các liên kết cấu tạo nên một phần cấu trúc của chúng. Di và cộng sự
(2017) đã công bố về đặc điểm cấu trúc của hai phân đoạn EPS từ Lb. casei SB27
(LW1 và LW2) có chứa các liên kết chủ yếu là (14)- galactoside; (14)- glucoside
[34]; dạng liên kết chủ yếu trong cấu trúc của LCP1-EPS tách chiết từ Lb. casei bao
gồm liên kết (14)- glucoside và (1)- glucoside là kết luận của Ai và cộng sự
(2015) [11]; c-EPS từ Lb. plantarum 70810 chứa (14)- galactoside và (1)-
galactoside [127]; liên kết (12)- glucoside và (12)- mannoside trong Lb.
plantarum BC-25 [142], EPS từ Lb. gasseri FR4 chứa liên kết (16)- glucoside,
(14)- galactoside, (13,4)- mannoside, (13)- rhamnoside, (14)- fucoside,
(14)- glucoside và (1)- galactoside [101] và EPS từ Lb. fermentum TDS 030603
chứa liên kết (13)- glucoside ở dạng α, trong mạch chính cùng với liên kết (16)-
galactoside ở mạch nhánh… Sự khác biệt về thành phần monosaccharide của EPS và
các dạng liên kết trong cấu trúc của nó một lần nữa được cụ thể hóa ở Bảng 3.12.
Từ các kết quả công bố trước đây về thành phần monosaccharide, các dạng liên
122
kết trong cấu trúc EPS của các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus đặc biệt là loài
fermentum (Bảng 3.12) một lần nữa khẳng định rằng, EPS tách từ chủng Lb.
fermentum MC3 trong nghiên cứu của luận án là một PS mới với các đặc điểm về
thành phần monosaccharide và dạng liên kết trong cấu trúc của PS có sự khác biệt
nhất định.
Như vậy, sự đa dạng về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn liên quan
rất nhiều đến các yếu tố như chủng vi khuẩn, thành phần môi trường, điều kiện nuôi
cấy, điều kiện tách chiết và đặc biệt là liên quan đến tính xúc tác đặc hiệu của hệ
enzyme nội bào của chính các vi khuẩn tổng hợp nên các EPS đó. Tính đặc hiệu của
các enzyme tham gia vào sự chuyển hóa qua lại giữa các thành phần để tạo thành các
monosaccharide đặc trưng trong cấu trúc của EPS tổng hợp được sẽ phụ thuộc vào
cơ chất trong môi trường và hoạt độ của các enzyme tham gia xúc tác đó. Sự khác
nhau về thành phần monosacharide có thể cải thiện được một số tính chất lý hóa của
EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn.
123
Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. delbrueckii
subsp.
bulgaricus 291
1,4 x 106 D-glc : D-gal = 3:2
β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp (16)
|
4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Faber và
cộng sự
(2001) [39]
Lb. delbrueckii
ssp. bulgaricus
LBB.B332
D-glc:D-gal:L-rha =
1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L-Rhap 12)- α-D-
Galp-(1
Sanchez-
Medina
(2007)
[108]
Lb. delbrueckii
ssp. bulgaricus
LBB.B26
D-glc:D-gal = 2:3
α-D-Glcp (16)
|
3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf-(1
Sanchez-
Medina
(2007)
[108]
124
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. delbrueckii
subsp.
bulgaricus
OLL1073R-1
5,0 x 106 D-glc:D-gal =
1,0:1,5 β-D-Galp (14)
|
[2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D-Galp-(1]n
Calsteren
và cộng sự
(2015) [17]
Lactobacillus
delbrueckii
ssp. bulgaricus
SRFM-1
3,97 x
105
3,86 x
105
gal:glc = 1,00:1,34 α -D-Glcp (16)
|
→6-( β-D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→4)- α -D-Galp-(1→4)- β -D-Galp-(1→6)- β -
D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→4)- α -D-Galp-(1→4)- β -D-Galp-(1→4)- α -D-Glcp-
(1→
| |
β -D-Glcp (16) α -D-Glcp (16)
→6-( β -D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→6)- α -D-Galp-(1→
|
α -D-Glcp (16)
Tang và
cộng (sự
2017) [116]
Lb. johnsonii
FI9785
D-glc:D-gal = 4:2 6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1 4)- β -Galp-(1 4)-
β -Glcp-(1
Dertli và
cộng sự
(2013) [33]
125
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. johnsonii
142
1,0 x 105 D-glc:D-gal = 2:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-Glcp-(13)-β-D-
Galf(1
Górska và
cộng sự
(2010) [52]
Lb. rhamnosus
KL37C
D-glc:D-gal = 2:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-Glcp-(13)-β-D-
Galf(1
Lipin’ski
(2003) [74]
Lb. rhamnosus
KL37B
D-glc:D-gal = 3:6
4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β-D-Galp-
(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf-(16)- β -Galf-(1
|
α-D-Glcp-(12)- β -Glcp (13)
Górska-
Fra˛ czek và
cộng sự
(2011) [54]
Lb. plantarum
70810
r-EPS1: D-glc:D-
man:D-gal =
18,21:78,76:3,03
r-EPS2: D-glc:D-
man:D-gal = 12,92 :
30, 89 : 56,19
Wang và
cộng sự
(2014)
[126]
Lb. plantarum
YW11
D-glc:D-gal =
2,71:1,00
Wang và
cộng sự
(2015)
[123]
Lb. plantarum
YW32
D-man:D-fruc: D-
gal: D-glc =
8,2:1,0:4,1:4,2
Wang và
cộng sự
(2015)
[124]
126
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương ứng
Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. plantarum
C88
D-glc:D-gal = 3:2
β- D-Galp-(16)
|
4)-α-D-Galp2Ac-(12)-α -D-Glcp-(13)-β- D-Glcp-(1
|
β- D-Glcp-(13)
Fontana và
cộng sự
(2015) [41]
Lb. plantarum
BC-25
1,83x104
1,33x104
D-man: D-gal: D-glc
= 92,21:1,79:6,00
D-man: D-gal: D-glc
= 91,36:2,44:6,20
R’6)-β-D-Manp-(26)- β -D- Manp-(26)
|
[2)-α-D-Glcp-(12)- β -D-Manp-(12)-α- D-Glcp-(12)-α-D-Glcp-(1]n
| |
R”6)-β-D-Manp-(26)- α-D-Galp(26) 6)-β-D-Manp-(26)- β -D- Manp-
(26)
Zhou và
cộng sự
(2016)
[142]
Lb. plantarum
KX041
38,67
x103
D-man:D-glc: D-
gal: D-arabinose =
12,94:7,26:3,31:0,95
Wang và
cộng sự
(2017)
[127]
127
Chủng vi
khuẩn thuộc
chi
Lactobacillus
(Lb.)
Khối
lượng
phân tử
(Da)
Thành phần, tỉ lệ
phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)
Tác giả
(năm)
[TLTK]
Lb. fermentum
TDS030603
D-glc:D-gal = 3:1 [3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n
|
α-D-Glcp-(16)- α-D-Galp(12)
Gerwig và
cộng sự
(2013) [49]
Lb. fermentum
V10
5,7 x 105 Glc: Rha: Gal =
1:13:1,5
Behare và
cộng sự
(2013) [14]
Lb. fermentum
Lf2
D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng
sự (2016)
[12]
Lb. fermentum
MC3
9,85 x
104
D-glc:D-man =
1,00:0,91 [6)-β-D-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n Công bố
của luận án
128
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu thu được trong luận án cho phép chúng tôi có những
kết luận như sau:
1. Về hiệu suất thu nhận EPS:
- Từ các chủng LAB sử dụng trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn ra được
04 chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt. Đó là các chủng Lb. fermentum TC13,
Lb. fermentum TC1, Lb. fermentum TC21 và Lb. fermentum MC3.
- Đối với các chủng vi khuẩn khác nhau, không có một quy trình nào chung để
tiến hành thu nhận các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Từ kết quả nghiên cứu,
chúng tôi đã xác định được nguồn dinh dưỡng (nguồn C, N) và điều kiện nuôi cấy
(mật độ gieo cấy ban đầu, pH ban đầu, nhiệt độ, thời gian) thích hợp và hiệu quả cao
cho quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn sử dụng. Cụ thể như sau:
+ Chủng Lb. fermentum TC13 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao khi phát triển
trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose, 0,4% cao nấm với điều kiện lên
men ở 40 oC, pH ban đầu 5,5, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 107 CFU/mL trong thời
gian 48 giờ.
+ Chủng Lb. fermentum TC16 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao trong môi
trường MRS có bổ sung thêm 3% sucrose, 0,8% cao thịt sau 48 giờ ở điều kiện lên
men bao gồm mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 CFU/mL, pH ban đầu 6,0 và
nhiệt độ nuôi cấy là 35 oC.
+ Chủng Lb. fermentum TC21 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao sau 36 giờ
lên men ở nhiệt độ 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL
trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% lactose, 0,8% cao thịt.
+ Ở điều kiện lên men là 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu
106 CFU/mL trong thời gian 48 giờ với môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose,
0,3% cao nấm, chủng Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất.
- Từ dịch lên men thu nhận được bởi các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16,
TC21, MC3) chúng tôi đã xác định được điều kiện tách EPS hiệu quả tương ứng.
129
+ Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men của các chủng Lb. fermentum TC13,
TC16 phù hợp nhất nhằm loại bỏ protein và thu EPS tốt được làm sáng tỏ trong nghiên
cứu này lần lượt là 15%, 35% và 20% cho cả hai chủng Lb. fermentum TC21, MC3
+ Quá trình tách EPS đạt hiệu quả tốt khi thời gian tủa bằng EtOH được thực
hiện trong 24 giờ với tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1 cho tất cả các chủng sử dụng nghiên
cứu.
2. Về một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
Các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)
đều thể hiện tốt các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Cụ
thể là:
- Khả năng hòa tan trong nước của các EPS thu nhận được từ các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 theo thứ tự giảm dần như sau: EPS-MC3 > EPS-
TC16 > EPS-TC13 > EPS-TC21.
- Khả năng giữ nước của các EPS này tăng theo trình tự như sau: EPS-TC21 <
EPS-MC3 < EPS-TC16 < EPS-TC13.
- Khả năng giữ dầu của các EPS đạt được trong nghiên cứu này là tương đối
cao. EPS có khả năng giữ dầu cao nhất là EPS-TC21, tiếp đến là EPS-MC3, tiếp theo
là EPS-TC16 và thấp hơn cả là EPS-TC13.
- Dịch chiết của các EPS thu nhận được trong các điều kiện lên men đã được
khảo sát đều thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt và có xu hướng tăng dần theo nồng
độ. Khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb.
fermentum khác nhau theo trình tự giảm dần như sau: TC21 > MC3 > TC13 > TC16.
Cụ thể là, tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH của các EPS đạt 50% tại các nồng độ 1,32 mg/mL
đối với Lb. fermentum TC21, 2,06 mg/mL đối với Lb. fermentum MC3, 2,85 mg/mL
đối với Lb. fermentum TC13 và 2,96 mg/mL đối với Lb. fermentum TC16.
3. Về khối lượng phân tử và một số đặc điểm cấu trúc của EPS-MC3
- Đã xác định được khối lượng phân tử của EPS-MC3 là 98,5 kD nhờ phương
pháp sắc ký thẩm thấu gel.
130
- Một số thông tin mới về cấu trúc của EPS-MC3 bao gồm thành phần, tỉ lệ các
monosaccharide và các loại liên kết chủ yếu trong bộ khung đã lần lượt được làm
sáng tỏ.
+ Thành phần monosaccharide có trong EPS-MC3 bao gồm các đơn vị lặp đi
lặp lại là D-glucose, D-mannose với tỉ lệ phân tử tương ứng là 1,00:0,91.
+ Các loại liên kết chủ yếu tạo nên bộ khung chính của EPS-MC3 là (1→6)
glucoside và (1→3) mannoside.
+ EPS-MC3 là một PS mới so với các PS từ các chủng thuộc loài Lb. fermentum
đã được công bố trước đó.
2. Kiến nghị
Do thời gian tiến hành đề tài nghiên cứu có hạn, đồng thời, trong quá trình thực
hiện luận án, chúng tôi đã gặp một số khó khăn về vấn đề trang thiết bị do đó chúng
tôi vẫn chưa thể thực hiện sâu hơn các thông tin liên quan đến kết quả cũng như phạm
vi ứng dụng thực tiễn. Vì vậy, để các kết quả từ luận án này có thể được ứng dụng tốt
hơn trong thực tiễn, chúng tôi xin được phép kiến nghị tiếp tục:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng khác nhau lên đặc điểm về
cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb. fermentum này.
2. Tiến hành nghiên cứu ứng dụng của EPS thu được lên một số sản phẩm lên
men cụ thể về việc cải thiện tính chất lưu biến của sản phẩm như khả năng giữ nước,
khả năng tạo gel, khả năng làm đặc,...
3. Tiến hành nghiên cứu một số tính chất sinh lý tác động đến sức khỏe con
người của các EPS này như: khả năng kháng khuẩn, tác động làm giảm cholesterol,
hoạt tính chống khối u,...
131
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
1. Trần Thị Ái Luyến, Trần Bảo Khánh, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Văn Thi
(2017), Nghiên cứu điều kiện tách chiết và đặc điểm về cấu trúc của các
exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus
plantarum W12, Tạp chí Hóa học, Số 55 (4E23), 243-249.
2. Trần Bảo Khánh, Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2017), Xác định
khối lượng phân tử và một số tính chất lý hóa của các exopolysaccharide được sinh
tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus plantarum W12, Tạp
chí Hóa học, Số 55 (4E34), 17-21.
3. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2016), Optimal conditions for the
production of exopolysaccharide by Lactobacillus fermentum TC16, Tạp chí Khoa
học kỹ thuật nông lâm nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, số 06, 50-
62.
4. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2016), Ảnh hưởng của các nguồn
dinh dưỡng khác nhau và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp
exopolysaccharide từ Lactobacillus fermentum TC13, Kỷ yếu hội thảo khoa học toàn
quốc về tiến bộ khoa học thực phẩm và kỹ thuật sinh học: từ nghiên cứu đến sản xuất,
Đại học Bách khoa Hà nội, 58-66.
5. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Bảo Khánh, Nguyễn Quốc
Khánh (2016), Effect of some factors on exopolysaccharide production of
Lactobacillus fermentum TC21 isolated from ‘tom chua’ in Hue, Vietnam, Tạp chí
khoa học Đại học Huế: Khoa học tự nhiên, Tập 116, số 02, 55-66
6. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Hoàng Thị Hồng Ánh (2016), Ảnh
hưởng của nguồn nitơ và điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp
exopolysaccharide của Lactobacillus fermentum MC3, Tạp chí Khoa học Đại học
Huế: Kỹ thuật và công nghệ, Tập 121, số 07, 89-100.
7. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2018), Nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố lên quá trình tách chiết và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng
hợp bởi Lactobacillus fermentum phân lập từ tôm chua, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế: Khoa học tự nhiên, Kỹ thuật và công
nghệ, Tập 11, số 11, 71-82.
132
8. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Văn Thi, Phan Thị Thu
Huyền (2018), Study on the biosynthesis and structure characterization of
exopolysaccharide from Lactobacillus fermentum MC3, Tạp chí khoa học Đại học
Huế: Khoa học tự nhiên, Tập 127, số 01, 13-22.
133
TÀI LIÊU THAM KHẢO
TIẾNG VIÊT
1 Trần Thị Hồng Hà, Lưu Văn Chính, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Đỗ
Hữu Nghị, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương (2013), Đánh
giá hoạt tính sinh học của polysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nấm
hương (Lentinus edodes),Tạp chí sinh học, 35(4), 445-453.
2 Lê Thị Thúy Hằng, Trần Đặng Mỹ Ngân, Nguyễn Thị Kim Hậu, Nguyễn Thành
Sơn, Đinh Minh Hiệp, Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Thị Kim Oanh (2017), Khảo
sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps
sinensis thu nhận polysacharide ngoại bào (eps) có hoạt tính kháng oxy
hoá, Tạp chí khoa học và công nghệ, đại học Đà Nẵng, 5 (114), 95-103.
3 Lê Thị Thúy Hằng, Bạch Thị Bích Phượng , Nguyễn Thị Thu Tuyết, Trần Minh
Trang, Huỳnh Thư, Nguyễn Tiến Thắng, Đinh Minh Hiệp (2017), Tối ưu hóa
thành phần dầu ô liu trong môi trường nuôi cấy nấm Ophiocordyceps sinensis
để thu nhận exopolysaccharide, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ, 33 (1S), 174-181.
4 Trần Thị Hằng, Vũ Đình Ngọ, Maiko Okajima, Tatsuo Kaneko (2015), Nghiên
cứu cấu trúc và tính chất của polysacarit tách chiết từ tảo sinh trưởng và phát
triển tại ruộng lúa tỉnh Phú Thọ, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 20 (4),
171-176.
5 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội,
NXB Đại học Quốc gia Hà Nội
6 Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB xây dựng Hà Nội.
7 Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu (2012), Các thông số chất lượng của fucoidan
và một số sản phẩm khác được phân lập từ rong mơ (Sargassum) Thừa Thiên
Huế, Tạp chí Hóa học, 50 (5A), 29-33.
8 Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu, Nguyễn Thị Hoài (2012), Chiết xuất, xác định
hàm lượng và khảo sát tác dụng dược lý của phân đoạn polysaccharid từ nấm
Linh chi (Ganoderma lucidum), Tạp chí Dược học (Bộ Y tế), 5 (433), 18-23.
TIẾNG ANH
9 Agrawal P. K. (1992). NMR spectroscopy in the structural elucidation of
oligosaccharides and glycosides, Phytochemistry, 31(10), 3307–3330.
134
10 Ahmed Z., Wang Y., Anjum N., Ahmad A., Khan S.T. (2013), Characterization
of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated
from Tibet kefir e Part II, Food Hydrocolloids 30, 343-350.
11 Ai L., Guo Q., Ding H., Guo B., Chen W., Cui S. W. (2015), Structure
Characterization of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W from
skim milk, Food Hydrocolloids 56, 134-143
12 Ale E.C., Perezlindo M.J., Pavón Y., Peralta G.H., Costa S., Sabbag N.,
Bergamini C., Reinheimer J.A., Binetti A.G. (2016), Technological, rheological
and sensory characterizations of a yogurt containing anexopolysaccharide
extract from Lactobacillus fermentum Lf2, a new food additive, Food Research
International 90, 259-267
13 Badel S., Bernardib T., Michaud P. (2011), New perspectives for Lactobacilli
exopolysaccharides, Biotechnology Advances 29, 54–66
14 Behare P. V., Singh R., Nagpal R., Rao K.H. (2013), Exopolysaccharides
producing Lactobacillus fermentum strain for enhancing rheological and sensory
attributes of low-fat dahi, J. Food Sci. Technol. 50 (6), 1228–1232.
15 Bouzar F., Cerning J., Desmazeaud M. (1997), Exopolysaccharide production
and texturepromoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt
production, J. Dairy Sci. 80, 2310–2317.
16 Brandt M., Roth J.K., Hammes W.P. (2003), Effect of an exopolysaccharide
produced by LactoBacillus sanfranciscensis LTH1729 on dough and bread
quality. Sourdough from fundamentals to applications (p 80) Brussels: Vrije
Universiteit Brussel (VUB) IMDO
17 Calsteren M.V., Gagnon F., Nishimura J., Makino S. (2015), Structure
determination of the neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1, Carbohydrate Research 413, 115-
122
18 Cerning J. (1990), Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria,
FEMS Microbiology Reviews 87, 113-130
19 Cerning J. (1995), Production of exopolysaccharides by lactic acid bacteria and
dairy propionibacteria, Lait 75, 463-472.
20 Cerning J., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud Y. (1992), Isolation and
characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic
acid bacteria, J. Dairy Sci. 75, 692-699.
135
21 Cerning J., Bouillanne M., Desmazeaud M., Landon M. (1986), Isolation and
characterization of exocellular polysaccharides by Lactobacillus bulgaricus,
Biotechnol. Lett. 8, 625-628.
22 Cerning J., Renard C.M.G., Thibault J.E., Bouillance C., Landon M.,
Desmazeand M., Topisirovic L. (1994), Carbon source requirements for
exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure
analysis of the polymer, Appl. Environ. Microbiol. 60, 3914-3919.
23 Coeuret V., Dubernet S., Bernardeau M., Gueguen M., Vernoux J.P. (2003)
Isolation, characterization and identification of lactobacilli focusing on cheeses
and others dairy products, Lait 83, 269–306.
24 Cross. M.L., Stevenson L.M. and Gill H.S. (2001), Anti-allergy properties of
fermented foods: An important immunoregulatory mechanism of lactic acid
bacteria, Int. munopharmacol 1, 891–901.
25 De Souza A.M.D., Sutherland I.W. (1994), Exopolysaccharide and storage
polymer production in Enterobacter aerogenes type 8 strains, Journal of Applied
Bacteriology 76, 463-468.
26 de Vos W., Vaughan M. (1994), Genetics of lactulose utilisation in Lactic acid
bacteria, FEMS Microbiol. Re. 15, 217–317.
27 De Vuyst L. and De Vin F. (2007), Exopolysaccharides from Lactic Acid
Bacteria, 478 – 519.
28 De Vuyst L., and Vandamme E. J. (1994), Bacteriocins of Lactic acid bacteria:
Microbiology, Genetics and Applications, Laboratory of Industrial
Microbiology and Biocatalysis, University of Gent, Belgium.
29 De Vuyst L., Degeest B. (1999), Heteropolysaccharides from lactic acid
bacteria, FEMS Microbiology Reviews 23, 153-177.
30 De Vuyst L., Vanderveken F., Van De Ven S., Degeest B. (1998), Production by
and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in
a milk medium and evidence for their growth-associated biosynthesis, J. Appl.
Microbiol. 84, 1059-1068.
31 Degeest B., Vaningelgem F., De Vuyst L. (2001), Microbial physiology,
fermentation kinetics, and process engineering of heteropolysaccharide
production by lactic acid bacteria, International Dairy Journal 11, 747–757.
32 Degeest, B., and L. De Vuyst. (1999), Indication that the nitrogen source
influences both amount and size of exopolysaccharides produced by
136
Streptococcus thermophilus LY03 and modelling of the bacterial growth and
exopolysaccharide production in a complex medium, Appl. Environ. Microbiol.
65, 2863-2870.
33 Dertli E.,Colquhoun I.J., Gunning A.P., Bongaerts R.J., Mayer G.L.G M.J., and
Narbad A., Bonev B.B. (2013), Structure and Biosynthesis of Two
Exopolysaccharides Produced by Lactobacillus johnsonii FI9785, The Journal
of Biological Chemistry, 288 (44), 31938–31951.
34 Di W., Zhang L., Wang S., Yi H., Han X., Fan R., Zhang Y. (2017),
Physicochemical characterization and antitumour activity of exopolysaccharides
produced by Lactobacillus casei SB27 from yak milk, Carbohydrate Polymers,
171, 307-315.
35 Dick J.C., Van Den Berg D., Robijn G.W., Janssen A.C., Giuseppin M., Vreeker
R., Kamerling J.P., Vliegenthart J.G., Ledeboer A.M., Verrips C.T. (1995),
Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake 0-1 and
characterization of the polysaccharide, Appl. Environ. Microbiol. 61, 2840-2844.
36 Doco T., Wieruszeski J.M., Fournet B., Carcano D., Ramos P., Loones A.
(1990), Structure of an exocellular polysaccharide produced by Streptococcus
thermophilus, Carbohydr. Res. 198, 313–321.
37 Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. (1956),
Colorimetric method for determinationof sugars and related substances.
Analytical Chemistry 28, 350-356.
38 Dueñas-Chascoa M.T., Rodriguez-Carvajalb M. A., Tejero-Mateob P.,
Esparteroc J.L., Irastorza-Iribasa A., Gil-Serranob A.M. (1998), Structural
analysis of the exopolysaccharides produced by Lactobacillus spp. G-77,
Carbohydrate Research 307, 125-133.
39 Faber E.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. (2001), Structure of the
extracellular polysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus 291, Carbohydrate Research 331, 183-194.
40 Farres J., Caminal G. and Lopez-Santin J. (1997), Influence of phosphate on
rhamnose-containing exopolysaccharide rheology and production by Klebsiella
I-174, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 522–527.
41 Fontana C., Li S., Yang Z., Widmalm G. (2015), Structural studies of the
exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum C88 using NMR spectroscopy
and the program CASPER, Carbohydrate Research 402, 87–94.
137
42 Freitas F., Alves V.D. and Reis M.A.M. (2011), Advances in bacterial
exopolysaccharides: from production to biotechnological applications, Trends in
Biotechnology 29(8), 388-399
43 Frengova G.I., Simova E.D., Beshkova D.M. and Simov Z.I. (2002),
Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria of Kefir Grains,
Exopolysaccharide and Lactic Acid Bacretia, 805-810.
44 Fukuda K., Shi T., Nagami K., Leo F., Nakamura T., Yasuda K., Senda A.,
Motoshima H., Urashima T. (2010), Effects of carbon source on
physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus
fermentum TDS030603 in achemically defined medium, Carbon Polymers 79,
1040–1045.
45 Gamar-Nourani L., Blondeau K. and Simonet J.M. (1998), Influence of culture
conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain
C83, Journal of Applied Microbiology 85, 664–672.
46 Gancel F. and Nove G. (1994), Exopolysaccharide Production by Streptococcus
salivarius ssp. thermophilus Cultures. 1. Conditions of Production, J. Dairy Sci.
77, 685-688.
47 Gangoiti M. V., Puertas A. I., Hamet M. F., Peruzzo P. J., Llamas M. G.,
Medrano M., Prieto A., Due˜nas M. T., Abraham A.G. (2017), Lactobacillus
plantarum CIDCA 8327: An α-glucan producing-strain isolated from kefir
grains, Carbohydrate Polymers 170, 52-59.
48 Garcia-Garibay M,, Marshall V.M.E. (1991), Polymer production by
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, J. Appl. Bacteriol. 70, 325-328.
49 Gerwig G.J., Dobruchowska J.M., Shi T., Urashima T., Kamerling J.P. (2013),
Structure determination of the exopolysaccharide of Lactobacillus fermentum
TDS030603—A revision, Carbohydrate Research 378, 84–90.
50 Gill H.S. (1998), Stimulation of the immune system by lactic cultures, Int. Dairy
J. 8, 535–544.
51 Gorret N., Maubois J.L., Engasser J.M. and Ghoul M. (2001), Study of the
effects of temperature, pH and yeast extract on growth and exopolysaccharides
production by Propionibacterium acidi-propionici on milk microfiltrate using a
response surface methodology, Journal of Applied Microbiology 90, 788-796.
138
52 Gorska S., Jachymek W., Rybka J., Strus M., Heczko P.B., Gamian A. (2010),
Structural and immunochemical studies of neutral exopolysaccharide produced
by Lactobacillus johnsonii 142, Carbohydrate Research 345, 108–114.
53 Gorska-Fra˛czek S., Sandstrom C., Kenne L., Pas´ciak M., Brzozowska E., Strus
M., Heczko P., Gamian A. (2013), The structure and immunoreactivity of
exopolysaccharide isolated from Lactobacillus johnsonii strain 151,
Carbohydrate Research 378, 148–153.
54 Gorska-Fra˛czek S., Sandstrom C., Kenne L., Rybka J., Strus M., Heczko P.,
Gamian A. (2011), Structural studies of the exopolysaccharide consisting of a
nonasaccharide repeating unit isolated from Lactobacillus rhamnosus KL37B,
Carbohydrate Research 346, 2926–2932.
55 Grobben G.J., Smith M.R., Sikkema J. and De Bont J.A.M. (1996), Influence of
fructose and glucose on the production of exopolysaccharides and the activities
of enzymes involved in the sugar metabolism and the synthesis of sugar
nucleotides in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 46, 279-284.
56 Gruter M., Leeflang B.R., Kuiper J., Kamerling J.P. and Vliegenthart J.F.G.
(1993), Structural characterisation of the exopolysaccharide produced by
Lactobacillus delbtickii subspecies bulgaricus rr grown in skimmed milk,
Carbohydrate Research 239, 209-226
57 Harding L. P., Marshall V. M., Elvin M., Gu Y., Laws A. P. (2003), Structural
characterisation of a perdeuteriomethylated exopolysaccharide by NMR
spectroscopy: characterisation of the novel exopolysaccharide produced by
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus EU23, Carbohydrate Research 338,
61–67.
58 Harding L.P., Marshall V.M., Hernandez Y., Gu Y., Maqsood M., McLay N.
and Laws A.P. (2005), Structural characterisation of a highly branched
exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NCFB2074, Carbohydrate Research 340, 1107–1111.
59 Harutoshi T. (2013), Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and
Colon Health Applications, Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and
Livestock Purposes 2, 515 - 538
60 Hess S.J., Roberts R.F., Ziegler G.R. (1997), Rheological properties of nonfat
yogurt stabilized using Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus producing
139
exopolysaccharide or using commercial stabilizer systems, J. Dairy Sci. 80, 252-
263.
61 Hussein A.S., Ibrahim G.S., Asker M.M.S. and Mahmoud M.G. (2010),
Exopolysaccharide from Lactobacillus helveticus: Identification of Chemical
Structure and Effect on Biscuit Quality, Czech J. Food Sci. 28(3), 225–232.
62 Kamerling J.P., Gerwig G.J. (2007), Strategies for structural analysis of
carbohydrates. Comprehensive GlycoscienceOxford: Elsevier, 1-67.
63 Kim Y., Oh S., Kim S.H. (2009), Released exopolysaccharide (r-EPS) produced
from probiotic bacteria reduce biofilm formation of enterohemorrhagic
Escherichia coli O157:H7, Biochemical and Biophysical Research
Communications 379, 324–329.
64 Kitazawa H., Yamaguchi T., Itoh T. (1992), B-cell mitogenic activity of slime
products produced from slime-forming, encapsulated Lactococcus Lactis ssp.
Cremoris, J. Dairy Sci. 75, 2946-2951.
65 Kodali V.P. and Sen R. (2008), Antioxidant and free radical scavenging
activities of an exopolysaccharide from a probiotic bacterium, Biotechnol. J. 3,
245–251
66 Kumar A.S., Mody K. and Jha B. (2007), Review Article: Bacterial
exopolysaccharides – a perception, Journal of Basic Microbiology 47, 103 –117.
67 Lapasin R., Pricl S. (1995), Rheology of Industrial Polysaccharides: Theory and
Application, 1st edition.
68 Laws A., Gu Y., Marshall V. (2001), Biosynthesis, characterisation, and design
of bacterial exopolysaccharides from lactic acid bacteria, Biotechnology
Advances 19, 597–625.
69 Laws A.P., Chadha M.J., Chacon-Romero M., Marshall V.M. and Maqsood M.
(2008), Determination of the structure and molecular weights of the
exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus 5e2 when grown on
different carbon feeds, Carbohydrate Research 343, 301–307.
70 Lebeer S., Claes I.J.J., Verhoeven T.L.A., Vanderleyden J., De Keersmaecker
S.C.J. (2010), Exopolysaccharides of LactoBacillus rhamnosus GG form a
protective shield against innate immune factors in the intestine, Microb.
Biotechnol., 1-7.
140
71 Levander F., Svensson M., and Rådström P. (2002), Enhanced
Exopolysaccharide Production by Metabolic Engineering of Streptococcus
thermophilus, Applied and Environmental Microbiology 68(2), 784–790.
72 Li L., Huang R., Shah N.P., Tao X., Xiong Y., Wei H. (2014), Antioxidant and
antibacterial activities of exopolysaccharides from Bifidobacterium bifidum
WBIN03 and Lactobacillus plantarum R315, Journal of Dairy Science, 97(12),
7334-7343.
73 Li W., Ji J., Chen X., Jiang M., Rui X., Dong M. (2014), Structural elucidation
and antioxidant activities of exopolysaccharides from Lactobacillus helveticus
MB2-1, Carbohydrate Polymers 102, 351– 359.
74 Lipin´ ski T., Jones C., Lemercinier X., Korzeniowska-Kowal A., Strus M.,
Rybka J., Gamian A., Heczko P.B. (2003), Structural analysis of the
Lactobacillus rhamnosus strain KL37C exopolysaccharide, Carbohydrate
Research 338, 605–609.
75 Liu C.F., Hsu W.H., Tseng K.C., Pan T.M., Chiang C.C. (2011),
Immunomodulatory and antioxidant potential of Lactobacillus
exopolysaccharides, Sci. Food Agric. 91, 2284–2291.
76 Low D., Ahlgren J.A., Oberg C.J., Horne D., Broadbent J.R., Mahon D.J.M.
(1998), Role of Streptococcus thermophilus MR-1C Capsular
Exopolysaccharide in Cheese Moisture Retention, Applied and Environmental
Microbiology, 2147-2151.
77 Ma(rtenssona O., Duen˜ as-Chascob M., Irastorzab A., Stea R.O., Hols O.
(2003), Comparison of growth characteristics and exopolysaccharide formation
of two lactic acid bacteria strains, Pediococcus damnosus 2.6 and Lactobacillus
brevis G-77, in an oat-based, nondairy medium, Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 36,
353–357.
78 Makino S., Ikegami S., Kano H., Sashihara T., Sugano H., Horiuchi H., Saito T.,
Oda M. (2006), Immunomodulatory Effects of Polysaccharides Produced by
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1, Journal of Dairy
Science 89 (8), 2873-2881.
79 Marshall V. M., Cowie E. N. and Moreton R. S. (1995), Analysis and production
of two exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp. Cremoris LC330, J.
Dairy Res. 62, 621-628.
141
80 Marshall V. M., Rawson H. L. (1999), Effects of exopolysaccharide-producing
strains of thermophilic lactic acid bacteria on the texture of stirred yoghurt, Int.
J. Food Sci. Technology 34, 137–43.
81 Mikelsaar M. and Zilmer M. (2009), Lactobacillus fermentum ME-3 An
antimicrobial and antioxidative probiotic, Microbial Ecology in Health and
Disease 21(1), 1-27.
82 Mirhosseini H. and Amid B.T. (2012), Influence of Chemical Extraction
Conditions on the Physicochemical and Functional Properties of Polysaccharide
Gum from Durian (Durio zibethinus) Seed, Molecules 17, 6465-6480.
83 Morin A. (1998), Screening of polysaccharide-producing microorganisms,
factors influencing the production and recovery of microbial polysaccharides.
In: Polysaccharides –Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu,
S. (Ed.), Marcel Dekker Inc. Publication, New York, 275–296.
84 Nagaoka M., Hashimoto S., Watanabe T., Yokokura T., Moro Y. (1994), Anti-
ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides, Biol.
Pharm Bull 17, 1012–1017.
85 Nakajima H., Hirota T., Toba T., Itoh T., Adachi S. (1992), Structure of the
extracellular polysaccharide from slime-forming Lactococcus Lactis subsp
cremoris SBT 0495, Carbohydr. Res. 224, 245–253.
86 Nicolaus B., Schiano M.V., Lama L., Poli A., Gambacorta A. (2004),
Polysaccharides from extremophilic microorganisms, Origins of Life and
Evolution of the Biosphere 34, 159–169.
87 Nwodo U.U., Green E. and Okoh A.I. (2012), Bacterial Exopolysaccharides:
Functionality and Prospects, Int. J. Mol. Sci. 13, 14002-14015.
88 Oda M., Hasegawa, H., Komatsu S., Kambe M. and Tsuchiya F. (1983), Anti-
tumor polysaccharide from Lactobacillus sp., Agricultural and Biological
Chemistry 47, 1623-1625.
89 Pan D. D., Zeng X. Q., and Yan T. (2011), Characterization of Lactobacillus
fermentum SM-7 isolated from koumiss, a potential probiotic bacterium with
cholesterol-lowering effects, Journal of the Science of Food and Agriculture
91(1), 512-518.
90 Patel A. and Prajapati J.B. (2013), Food and Health Applications of
Exopolysaccharides produced by Lactic acid Bacteria, Adv. Dairy Res., 1-2
142
91 Patel S., Majumder A., Goyal A. (2012), Potentials of Exopolysaccharides from
Lactic Acid Bacteria, Indian J. Microbiol., 52(1), 3–12.
92 Perry D. B., Mc Mahon D. J., Oberg C. J. (1997), Effect of exopolysaccharide-
producing cultures on moisture retention in low fat mozzarella cheese, Journal
Dairy Science 80, 799–805
93 Petersen B.L., Dave R.I., McMahon D.J., Oberg C.J., Broadben J.R. (2000),
Influence of Capsular and Ropy Exopolysaccharide-Producing Streptococcus
thermophilus on Mozzarella Cheese and Cheese Whey, J. Dairy Sci. 83, 1952–
1956.
94 Petry S., Furlan S., Crepeau M.J., Cerning J. and Desmazeaud M. (2000), Factors
affecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium, Appl.
Environ.Microbiol., 66 (8), 3427 –3431.
95 Pham L., Dupont I., Roy D., Lapointe G. (2000), Production of
exopolysaccharide by Lactobacillus rhamnosus R and analysis of its enzymatic
degradation during prolonged fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 66, 2302-
2310.
96 Polak M. & Berecka, Wasko A., Szwajgier D. and Choma A. (2013),
Bifidogenic and Antioxidant Activity of Exopolysaccharides Produced by
Lactobacillus rhamnosus E/N Cultivated on Different Carbon Sources, Polish
Journal of Microbiology, 62(2), 181–189.
97 Poolman B. (1993), Energy transduction in lactic acid bacteria, FEMS Microbiol
Revs. 12, pp. 125–8
98 Postma P. W., Lengeler J. W., Jacobson G. R. (1993), Phosphoenolpyruvate:
Carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria, Microbiol. Rev. 57, 543–
594.
99 Rabha B., Victor L., Miguel A., María F. and Ahmed B. (2011), Effect of
fermentation conditions (culture media and incubation temperature) on
exopolysaccharide production by Streptococcus thermophilus BN1, IPCBEE 24,
1-5.
100 Ramos A., Boels I.C., de Vos W.M., Santos H. (2001), Relationship between
glycolysis and exopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis., Appl.
Environ. Microbiol. 67, 33–41.
143
101 Rani R. P., Anandharaj M., Ravindran A. D. (2018), Characterization of a novel
exopolysaccharide produced by Lactobacillus gasseri FR4 and demonstration of
its in vitro biological properties, International Journal of Biological
Macromolecules 109, 772-783.
102 Robijn G.W., Gallego R.G., van den Berg D.J.C., Haas H., Kamerling J.P.,
Vliegenthart J.F.G. (1996), Structural characterization of the exopolysaccharide
produced by Lactobacillus acidophilus LMG9433, Carbohydrate Research 288,
203-218.
103 Robijn G.W., Thomas J.R., Haas H., van den Berg D.J.C., Kamerling J.P.,
Vliegenthart J.F.G. (1995), The structure of the exopolysaccharide produced by
Lactobacillus helveticus 766, Carbohydrate Research 276, 137-154.
104 Rodríguez A., Gil-Serran A.M. (2008), Structure of the high-molecular weight
exopolysaccharide isolated from Lactobacillus pentosus LPS26, Carbohydrate
Research 343, 3066–3070.
105 Rodríguez C., Medici M., Rodríguez A. V., Mozzi F., de Valdez F. G. (2009),
Prevention of chronic gastritis by fermented milks made with
exopolysaccharideproducing Streptococcus thermophiles strains, J. Dairy Sci.
92, 2423-2434.
106 Ruas-Madiedo P., Hugenholtz J., Zoon P. (2002), An overview of the
functionality of exopolysaccharides produced by lactic acidbacteria,
International Dairy Journal 12, 163–171.
107 Salazar N., Gueimonde M., Hernandez-Barranco A.M., Ruas-Madiedo P., de los
Reyes-Gavilan C.G. (2008), Exopolysaccharides produced by intestinal
Bifidobacterium strains act as fermentable substrates for human intestinal
bacteria, Applied and Environmental Microbiology 74, 4737-4745.
108 Sánchez-Medina I., Gerwig G.J., Urshev Z.L., Kamerling J.P. (2007), Structure
of a neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus LBB.B26, Carbohydrate Research 342 (16), 2430-2439.
109 Savadogo A., Ouattara C.A.T., Savadogo P.W., Barro N., Ouattara A.S., &
Traoré A.S. (2004), Identification of exopolysaccharides-producing lactic acid
bacteria from Burkina Faso fermented milk samples. African Journal of
Biotechnology 3(3), 189-194
144
110 Schellhaass S.M., and Morris H.A. (1985), Rheological and scanning electron
microscopic examination of skim milk gels obtained by fermenting with ropy
and non-ropy strains of lactic acid bacteria, Food Microstruct., 274-279.
111 Seesuriyachan P., Kuntiya A., Hanmoungjai P. and Techapun C. (2011),
Exopolysaccharide production by Lactobacillus confusus TISTR 1498
usingcoconut water as an alternative carbon source: the effect of peptone, yeast
extract and beef extract, Songklanakarin J. Sci. Technol. 33(4), 379-387.
112 Sila A., Bayar N., Ghazala I., Bougatef A., Ellouz-Ghorbel R., Ellouz-
Chaabouni S. (2014), Water-soluble polysaccharides from agro-industrial by-
products: Functional and biological properties, International Journal of
Biological Macromolecules 69, 236–243.
113 Soh H.S., Kim C.S., Lee S.P. (2003), A New In vitro Assay of Cholesterol
Adsorption by Food and Microbial Polysaccharides, J. Med. Food 6, 225-230.
114 Stephen A.M., Phillips G.O., Williams P.A. (2006), Food polysaccharides and
their applications, 2nd edition.
115 Sutherland I.W. (1972), Bacterial exopolysaccharides, Adv. Microb. Physiol. 8,
143-213.
116 Tang W., Dong M., Wang W., Han S., Rui X., Chen X., Jiang M., Zhang Q., Wu
J. Li W. (2017), Structural characterization and antioxidant property of released
exopolysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus SRFM-1,
Carbohydrate Polymers 173, 654-664.
117 Tok E. and Aslim B. (2010), Cholesterol removal by some lactic acid bacteria
that can be used as probiotic, Microbiol Immunol 54, 257–264.
118 Torino M.I., Mozzi F. and Font de Valdez G. (2005), Exopolysaccharide
biosynthesis by Lactobacillus helveticus ATCC 15807. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 68, 259-265.
119 Van den Berg D.J.C., Robijn G.W., Janssen A.C., Giuseppin M.L.F., Vreeker
R., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G., Ledeboer A.M., Verrips C.T. (1995),
Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake 0-1 and
characterization of the polysaccharide, Appl Environ Microbiol 61, 2840-2844.
120 Vaningelgem F., Zamfir M., Adriany T. and De Vuyst L. (2004), Fermentation
conditions affecting the bacterial growth and exopolysaccharide production by
Streptococcus thermophilus ST 111 in milk-based medium, Journal of Applied
Microbiology 97, 1257–1273.
145
121 Vergas-Garcia, M.C., Lopez, M.J., Elorrieta, Suarez F. and Moreno, J. (2001),
Influence of nutritional and environmental factors on polysaccharide production
by Azotobacter vinelandii cultured on 4-hydroxybenzoic acid, J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 27, 5 –10.
122 Vermani M.V., Kelkar S.M. and Kamat Y. (1997), Novel exopolysaccharide
production by Azotobacter vinelandii MTCC 2459, a plant rhizosphere isolate,
Lett. Appl. Bacteriol. 24, 379–383.
123 Wang J., Zhao X., Tian Z., Yang Y., Yang Z. (2015), Characterization of an
exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from
Tibet Kefir, Carbohydrate Polymers 125, 16-25.
124 Wang J., Zhao X., Yang Y., Zhao A., Yang Z. (2015), Characterization and
bioactivities of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum
YW32, International Journal of Biological Macromolecules 74, 119–126
125 Wang K., Li W., Rui X, Chen X., Jiang M., Dong M. (2014), Characterization
of a novel exopolysaccharide with antitumor activityfrom Lactobacillus
plantarum 70810, International Journal of Biological Macromolecules 63, 133–
139
126 Wang K., Li W., Rui X, Chen X., Jiang M., Dong M. (2014), Structural
characterization and bioactivity of released exopolysaccharides from
Lactobacillus plantarum 70810, International Journal of Biological
Macromolecules 67, 71–78.
127 Wang X., Shao C., Liu L., Guo X, Xu Y., Lü X. (2017), Optimization, partial
characterization and antioxidant activity of an exopolysaccharide from
Lactobacillus plantarum KX041, International Journal of Biological
Macromolecules 103, 1173-1184.
128 Wang Y., Ahmed Z., Feng W., Li C., Song S. (2008), Physicochemical
properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens
ZW3 isolated from Tibet kefir, International Journal of Biological
Macromolecules 43, 283–288.
129 Wang Y., Ga¨nzle M.G., Schwab C. (2010), Exopolysaccharide Synthesized by
Lactobacillus reuteri Decreases the Ability of Enterotoxigenic Escherichia coli
To Bind to Porcine Erythrocytes, Applied and Environmental Microbiology,
4863–4866.
146
130 Wang Y., Li C., Liu P., Ahmed Z., Xiao P., Bai X., (2010), Physical
characterization of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum
KF5 isolated from Tibet Kefir, Carbohydrate Polymers 82, 895–903.
131 Welman A. D. (2015), Exopolysaccharides from fermented dairy products and
health promotion, Advances in Fermented Foods and Beverages 2, 23-38.
132 Welman A. D. and Maddox I. S. (2003), Exopolysaccharides from lactic acid
bacteria: perspectives and challenges. Trends in Biotechnology 21, 269-274.
133 Whistler R. L. (1973), Solubility of Polysaccharides and Their Behavior in
Solution, Advances in Chemistry; American Chemical Society: Washington,
DC.
134 Wu C., Liang Z., Lu C., Wu S. (2008), Effect of carbon and nitrogen sources on
the production and carbon composition of exopolysaccharide by submerged
culture of Pleurotus citrinopileatus, Journal of Food and Drug Analysis 16(2),
61-67
135 Xu R., Shang N., Li P. (2011), In vitro and in vivo antioxidant activity of
exopolysaccharide fractions from Bifidobacterium animalis RH, Anaerobe 17,
226-231
136 Yadav V., Prappulla S.G., Jha A., Poonia A. (2011), A novel exopolysaccharide
from probiotic Lactobacillus fermentum CFR 2195: Production, purification and
characterization, Research article, Biotechnol. Bioinf. Bioeng I(4), 415-421.
137 Yang Z., Staaf M., Huttunen E., Widmalm G. (2000), Structure of a viscous
exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus K16, Carbohydrate
Research 329, 465–469
138 Yuksekdag Z.N. and Aslim B. (2008), Influence of Different Carbon Sources
on Exopolysaccharide Production by Lactobacillus delbrueckii Subsp.
bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus thermophilus (W22), Brazilian
Archives Of Biology And Technology 51(3), 581-585.
139 Zhang L., Liu C., Li D., Zhao Y., Zhang X., Zeng X., Yang Z., Li S. (2013),
Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus
plantarum C88, International Journal of Biological Macromolecules 54, 270–
275.
140 Zhang T., Zhang C., Li S., Zhang Y., Yang Z. (2011), Growth and
exopolysaccharide production by Streptococcus thermophilus ST1 in skim milk,
Brazilian Journal of Microbiology 42, 1470-1478.
147
141 Zhang Y., Li S., Zhang C., Luo Y., Zhang H., Yang Z. (2011), Growth
andexopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum F6 in skim milk,
African Journal of Biotechnology 10(11), 2080-2091.
142 Zhou K., Zeng Y., Yang M., Chen S., He L., Ao X., Zou L., Liu S. (2016),
Production, purification and structural study of an exopolysaccharide from
Lactobacillus plantarum BC-25, Carbohydrate Polymers 144, 205-214
143 Zhou X., Li Y. (2015), Atlas of oral microbiology: From healthy Microflora to
Disease, Academic Press.
144 Zisu B., Shah N. P. (2007), Texture characteristics and pizza bake properties of
low-fat mozzarella cheese as influenced by pre-acidification with citric acid and
use of encapsulated and ropy exopolysaccharide producing cultures, Int. Dairy
J. 17, 985–997.
i
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phương trình đường chuẩn D-glucose
Phụ lục 2: Một số hóa chất sử dụng và độ tinh khiết
2.1. Thành phần môi trường MRS lỏng
Thành phần Khối lượng (g/l)
Pepton 10,0
Cao thịt 8,0
Cao nấm 4,0
Glucose 20,0
K2HPO4 2,0
MgSO4 0,2
MnSO4 0,04
(NH4)3C6H5O7 2,0
CH3COONa 5,0
Tween 80 1,0
Nước cất Định mức 1 lít
2.2. Một số hóa chất chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất Nhà sản xuất Độ tinh kiết
MeOH Merck P
CHCl3 Merck P
NaBH4 Merck P
TFA Merck P
TCA Merck P
(CH3)2SO Daejung Chemicals & Metals PA
(CH3CO)2O Daejung Chemicals & Metals PA
C6H6 Daejung Chemicals & Metals PA
CH3COOC2H5 Daejung Chemicals & Metals PA
MRS lỏng Scharlau PA
Phụ lục 3: Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao
Thí
nghiệm
Các chủng vi khuẩn
Lb. fermentum
OD490nm Hàm lượng
EPS trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 TC12 0,342 0,351 0,347 35,484i
2 TC13 1,008 1,03 1,06 119,142a
3 TC14 0,565 0,568 0,572 62,516e
y = 0,0082x + 0,0557
R² = 0,9954
0
0.5
1
1.5
2
0 50 100 150 200 250
Độ
hấ
p t
hụ
(O
D4
90
nm
)
Nồng độ D-glucose (µg/ml)
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn D-glucose
ii
4 TC15 0,619 0,621 0,624 68,980d
5 TC16 1,005 1,004 1,03 116,744a
6 TC18 0,621 0,613 0,615 68,370d
7 TC19 0,407 0,413 0,411 43,248h
8 TC20 0,456 0,457 0,502 50,728g
9 TC21 0,852 0,848 0,946 100,768b
10 MC2 0,523 0,517 0,519 56,581f
11 MC3 0,781 0,783 0,787 88,776c
12 N9 0,539 0,537 0,541 58,939ef
13 N10 0,627 0,622 0,628 69,508d
Phụ lục 4: Kết quả khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ các chủng Lb. fermentum có khả năng sinh tổng
hợp EPS cao (Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3)
4.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp EPS
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Nguồn C Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Glucose
0 1,020 1,050 1,029 119,183d
2 2 1,743 1,689 1,707 202,110c
3 3 1,713 1,722 1,737 203,451bc
4 4 2,016 2,007 2,019 238,817a
5 5 1,752 1,773 1,728 206,744b
6 6 1,767 1,743 1,737 206,500b
7
Lactose
0 1,020 1,050 1,029 119,183d
8 2 1,425 1,458 1,584 174,793c
9 3 1,671 1,695 1,626 196,134b
10 4 1,731 1,632 1,644 196,744b
11 5 1,833 1,824 1,848 216,988a
12 6 1,797 1,845 1,818 215,159a
13
Sucrose
0 1,020 1,050 1,029 119,183d
14 2 1,248 1,266 1,386 151,744c
15 3 1,5 1,374 1,362 165,402b
16 4 1,365 1,455 1,5 168,817b
17 5 1,803 1,761 1,797 211,134a
18 6 1,806 1,782 1,749 210,158a
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm
Nguồn C Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Glucose
0 1,062 0,933 0,975 113,939d
2 2 1,359 1,335 1,425 160,646c
3 3 1,401 1,503 1,362 166,622c
4 4 1,461 1,473 1,359 167,719c
5 5 1,893 1,887 1,902 224,183a
6 6 1,737 1,614 1,692 198,208b
7
0 1,062 0,933 0,975 113,939c
8 2 0,921 0,957 0,939 107,720c
9 3 0,969 0,975 0,981 112,110c
10 4 1,272 1,338 1,335 153,573b
11 5 1,557 1,524 1,605 183,695a
12 6 1,266 1,299 1,323 151,256b
13
Sucrose
0 1,062 0,933 0,975 113,939e
14 2 1,404 1,407 1,41 164,793c
15 3 1,953 1,935 1,986 231,988a
iii
16 4 1,497 1,509 1,518 177,110b
17 5 1,356 1,305 1,272 153,085d
18 6 1,275 1,245 1,233 145,768d
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Nguồn C Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Glucose
0 0,816 0,896 0,863 97,882d
2 2 1,163 1,16 1,215 137,029c
3 3 1,201 1,02 1,214 132,842c
4 4 1,481 1,414 1,417 168,492a
5 5 1,341 1,334 1,339 156,378b
6 6 1,302 1,262 1,297 150,159b
7
Lactose
0 0,816 0,896 0,863 97,882e
8 2 1,293 1,301 1,306 151,744d
9 3 1,351 1,353 1,336 157,435c
10 4 1,533 1,525 1,531 179,752a
11 5 1,492 1,502 1,517 176,581a
12 6 1,442 1,462 1,485 171,622b
13
Sucrose
0 0,816 0,896 0,863 97,882d
14 2 0,936 0,891 0,994 107,882c
15 3 0,956 0,999 1,113 117,923b
16 4 1,106 1,106 1,147 129,752a
17 5 1,095 1,106 1,148 129,345a
18 6 0,808 0,779 0,769 88,980d
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Nguồn C Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Glucose
0 0,755 0,804 0,778 88,207e
2 2 1,131 1,101 1,137 130,159c
3 3 1,208 1,226 1,211 141,378b
4 4 1,525 1,534 1,492 178,207a
5 5 0,969 0,945 0,946 109,467d
6 6 0,986 0,952 0,945 110,402d
7
Lactose
0 0,755 0,804 0,778 88,207d
8 2 0,856 0,876 0,877 99,265c
9 3 0,957 1,07 1,171 123,207b
10 4 1,27 1,275 1,278 148,614a
11 5 1,07 1,093 1,075 124,833b
12 6 1,063 1,054 1,094 123,736b
13
Sucrose
0 0,755 0,804 0,778 88,207e
14 2 0,979 1,077 0,985 116,825d
15 3 1,126 1,159 1,139 132,394c
16 4 1,309 1,299 1,305 152,272a
17 5 1,223 1,236 1,228 143,085b
18 6 1,216 1,241 1,222 142,760b
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ bổ sung
4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp EPS
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm Nguồn N
Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 Pepton 0 2,016 2,025 2,022 239,671d
iv
2 0,2 2,061 2,04 2,004 241,378d
3 0,4 1,98 2,046 2,061 240,647d
4 0,6 2,286 2,301 2,31 273,573c
5 0,8 2,691 2,682 2,706 321,622a
6 1,0 2,604 2,616 2,592 310,768b
7
Cao thịt
0 2,016 2,025 2,022 239,671e
8 0,2 2,214 2,151 2,118 256,744d
9 0,4 2,55 2,493 2,541 301,500c
10 0,6 2,589 2,64 2,607 320,524b
11 0,8 2,904 2,943 2,976 347,476a
12 1,0 2,898 2,922 2,889 343,817a
13
Cao nấm
0 2,016 2,025 2,022 239,671e
14 0,1 2,196 2,217 2,202 262,110d
15 0,2 2,286 2,397 2,313 277,597c
16 0,3 2,535 2,523 2,556 315,646b
17 0,4 2,769 2,799 2,64 357,354a
18 0,5 2,562 2,43 2,499 319,183b
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm Nguồn N
Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Pepton
0 1,923 1,935 1,947 229,183c
2 0,2 1,581 1,536 1,557 183,207e
3 0,4 1,569 1,575 1,59 185,646de
4 0,6 1,617 1,581 1,794 196,134d
5 0,8 2,682 2,646 2,571 314,305a
6 1,0 2,202 2,244 2,226 264,427b
7
Cao thịt
0 1,923 1,935 1,947 229,183d
8 0,2 1,656 1,647 1,665 195,159e
9 0,4 1,884 1,797 1,893 219,793d
10 0,6 2,358 2,172 2,163 265,280c
11 0,8 2,874 2,886 2,877 344,305a
12 1,0 2,628 2,595 2,598 311,134b
13
Cao nấm
0 1,923 1,935 1,947 229,183c
14 0,1 1,395 1,482 1,434 168,451e
15 0,2 1,647 1,632 1,548 189,427d
16 0,3 2,274 2,202 2,28 267,841b
17 0,4 2,616 2,502 2,559 305,280a
18 0,5 2,226 2,268 2,328 270,525b
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm Nguồn N
Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Pepton
0 1,548 1,533 1,527 180,525e
2 0,2 1,626 1,665 1,695 195,890d
3 0,4 1,776 1,8 1,869 214,549c
4 0,6 2,427 2,34 2,379 283,695a
5 0,8 2,421 2,394 2,193 278,085a
6 1,0 2,121 2,223 2,133 256,500b
7
Cao thịt
0 1,548 1,533 1,527 180,525f
8 0,2 1,731 1,785 1,659 203,573e
9 0,4 2,133 2,097 2,163 253,085d
10 0,6 2,211 2,268 2,226 265,768c
11 0,8 2,532 2,517 2,547 301,988a
12 1,0 2,469 2,445 2,427 291,622b
13 Cao nấm 0 1,548 1,533 1,527 180,525f
v
14 0,1 1,89 1,881 1,848 221,622d
15 0,2 2,193 2,166 2,145 257,598c
16 0,3 2,247 2,199 2,187 262,842b
17 0,4 2,352 2,361 2,376 281,378a
18 0,5 1,785 1,761 1,818 211,256e
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm Nguồn N
Nồng độ bổ
sung (%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1
Pepton
0 1,41 1,521 1,539 174,915c
2 0,2 1,119 1,131 1,127 130,484d
3 0,4 1,448 1,389 1,505 169,712c
4 0,6 1,689 1,664 1,685 198,004b
5 0,8 2,147 2,165 2,15 255,890a
6 1,0 2,084 2,096 2,103 248,614a
7
Cao thịt
0 1,41 1,521 1,539 174,915a
8 0,2 0,693 0,711 0,702 78,817d
9 0,4 1,038 1,02 1,011 117,964c
10 0,6 1,056 1,182 1,071 127,720bc
11 0,8 1,179 1,221 1,125 136,500b
12 1,0 1,176 1,188 1,155 136,256b
13
Cao nấm
0 1,41 1,521 1,539 174,915f
14 0,1 2,488 2,515 2,531 299,468d
15 0,2 2,878 2,923 2,892 346,581b
16 0,3 3,147 3,245 3,196 382,963a
17 0,4 2,735 2,738 2,807 329,793c
18 0,5 2,379 2,353 2,328 280,199e
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ bổ sung
4.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Mật độ tế bào nuôi
cấy ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 104 2,597 2,573 2,541 306,663d
2 105 2,736 2,787 2,829 332,719c
3 106 2,948 2,958 2,954 353,370b
4 107 3,267 3,251 3,276 391,338a
5 108 2,666 2,541 2,627 311,662d
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm
Mật độ tế bào nuôi
cấy ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 104 2,585 2,541 2,558 305,565c
2 105 2,885 2,888 2,907 346,053a
3 106 2,972 2,865 2,913 348,898a
4 107 2,67 2,705 2,699 321,419b
5 108 2,027 2,039 2,054 241,988d
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Mật độ tế bào nuôi
cấy ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 104 1,866 1,919 1,847 222,150b
2 105 1,958 1,902 1,944 229,142b
3 106 2,55 2,538 2,57 304,508a
vi
4 107 2,006 1,911 1,865 228,248b
5 108 1,697 1,634 1,674 196,663c
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Mật độ tế bào nuôi
cấy ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 104 1,625 1,554 1,616 188,126e
2 105 3,033 3,014 3,02 361,784b
3 106 3,212 3,2 3,201 383,980a
4 107 2,972 2,984 2,979 356,419c
5 108 2,814 2,82 2,784 335,403d
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mật độ tế bào nuôi
cấy ban đầu
4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm pH ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 Đối chứng 3,228 3,224 3,299 389,589c
2 4,0 2,466 2,459 2,429 292,150e
3 4,5 2,963 2,981 2,978 355,890d
4 5,0 3,222 3,267 3,242 388,776c
5 5,5 3,399 3,348 3,384 405,037a
6 6,0 3,324 3,321 3,312 397,963b
7 6,5 3,272 3,264 3,26 391,419c
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm pH ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 Đối chứng 2,769 2,798 2,826 334,386c
2 4,0 2,148 2,129 2,174 255,443e
3 4,5 2,669 2,715 2,741 323,492a
4 5,0 2,847 2,868 2,889 342,963b
5 5,5 2,922 2,886 2,897 347,069b
6 6,0 3,185 3,159 3,183 380,484a
7 6,5 2,844 2,792 2,795 335,931c
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm pH ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 Đối chứng 2,058 2,09 2,102 247,272c
2 4,0 1,479 1,512 1,562 178,289f
3 4,5 1,673 1,701 1,694 199,224e
4 5,0 1,802 1,763 1,745 209,061d
5 5,5 2,042 2,1 2,03 244,102c
6 6,0 2,724 2,769 2,759 328,654a
7 6,5 2,507 2,573 2,462 299,793b
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm pH ban đầu
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 Đối chứng 3,168 3,174 3,176 380,118d
2 4,0 2,253 2,246 2,27 268,370g
3 4,5 2,829 2,828 2,783 336,297f
vii
4 5,0 2,993 2,972 2,964 356,175e
5 5,5 3,341 3,35 3,356 401,622b
6 6,0 3,503 3,509 3,507 420,809a
7 6,5 3,198 3,197 3,216 383,898c
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mức pH ban đầu
4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm Nhiệt độ (oC)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 30 2,984 3,014 3,092 362,719c
2 35 3,233 3,116 3,236 382,841b
3 40 3,528 3,483 3,468 419,183a
4 45 3,006 3,062 2,964 360,362c
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm Nhiệt độ (oC)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 30 3,071 3,063 3,074 367,516c
2 35 3,386 3,389 3,365 405,402a
3 40 3,144 3,125 3,128 375,199b
4 45 3,05 3,059 3,053 365,646c
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm Nhiệt độ (oC)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 30 2,277 2,33 2,307 274,264d
2 35 3,155 3,128 3,137 376,134a
3 40 2,835 2,81 2,822 337,394b
4 45 2,447 2,481 2,477 294,223c
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm Nhiệt độ (oC)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 30 1,989 1,947 2,04 236,134d
2 35 3,516 3,513 3,518 421,947a
3 40 3,267 3,284 3,278 392,760b
4 45 2,528 2,561 2,495 301,500c
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nhiệt độ nuôi cấy
4.6. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp EPS của các
chủng Lb. fermentum
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 2,892 2,843 2,886 343,655d
2 24 2,889 2,879 2,982 348,898cd
3 36 2,961 2,904 3,114 358,207bc
4 48 3,537 3,507 3,489 421,378a
5 60 3,054 3,093 3,114 369,670b
6 72 2,301 2,334 2,255 273,288e
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD600nm OD600nm trung
bình X1 X2 X3
viii
1 12 1,057 1,058 1,059 1,058d
2 24 1,158 1,156 1,16 1,158c
3 36 1,225 1,225 1,28 1,243a
4 48 1,218 1,214 1,211 1,214b
5 60 1,198 1,202 1,202 1,201b
6 72 1,174 1,174 1,179 1,176c
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
pH pH môi trường
trung bình X1 X2 X3
1 12 5,51 5,46 5,49 5,49a
2 24 5,25 5,27 5,22 5,25b
3 36 4,59 4,61 4,58 4,59c
4 48 4,35 4,36 4,32 4,34d
5 60 4,22 4,25 4,23 4,23e
6 72 4,15 4,13 4,15 4,14f
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 3,246 3,222 3,134 383,532b
2 24 3,102 3,173 3,207 378,655b
3 36 3,282 3,203 3,182 386,175b
4 48 3,389 3,396 3,387 406,703a
5 60 3,029 3,018 3,024 361,947c
6 72 3,02 3,017 3,006 360,809c
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD600nm OD600nm trung
bình X1 X2 X3
1 12 1,034 1,031 1,036 1,034e
2 24 1,168 1,167 1,172 1,169d
3 36 1,196 1,197 1,195 1,196b
4 48 1,203 1,209 1,21 1,207a
5 60 1,184 1,188 1,182 1,185c
6 72 1,179 1,183 1,178 1,180c
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
pH pH môi trường
trung bình X1 X2 X3
1 12 5,53 5,55 5,56 5,55a
2 24 5,39 5,42 5,43 5,41b
3 36 4,33 4,34 4,29 4,32c
4 48 4,22 4,27 4,25 4,25d
5 60 4,13 4,11 4,12 4,12e
6 72 4,11 4,1 4,09 4,1e
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 2,312 2,369 2,345 278,817e
2 24 2,448 2,511 2,445 294,183d
3 36 3,396 3,408 3,344 405,728a
4 48 3,194 3,188 3,192 382,395b
5 60 3,186 3,197 3,2 382,760b
6 72 2,825 2,879 2,856 341,175c
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD600nm OD600nm trung
bình X1 X2 X3
ix
1 12 1,103 1,109 1,101 1,104d
2 24 1,134 1,151 1,156 1,147c
3 36 1,179 1,183 1,185 1,182b
4 48 1,196 1,197 1,195 1,196a
5 60 1,178 1,177 1,18 1,178b
6 72 1,174 1,178 1,172 1,175b
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
pH pH môi trường
trung bình X1 X2 X3
1 12 5,67 5,68 5,67 5,67a
2 24 5,19 5,21 5,22 5,21b
3 36 4,66 4,65 4,66 4,66c
4 48 4,39 4,36 4,39 4,38d
5 60 4,31 4,31 4,28 4,30e
6 72 4,23 4,23 4,21 4,22f
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 1,539 1,547 1,544 181,419e
2 24 2,013 2,087 2,004 241,338d
3 36 2,915 3,027 2,921 353,492b
4 48 3,513 3,509 3,542 422,638a
5 60 2,913 3,108 3,003 360,037b
6 72 2,844 2,844 2,861 340,728c
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
OD600nm OD600nm trung
bình X1 X2 X3
1 12 0,871 0,875 0,874 0,873f
2 24 1,052 1,049 1,051 1,051e
3 36 1,118 1,124 1,126 1,123c
4 48 1,187 1,19 1,201 1,193a
5 60 1,141 1,148 1,143 1,144b
6 72 1,108 1,106 1,115 1,110d
Thí
nghiệm Thời gian (giờ)
pH pH môi trường
trung bình X1 X2 X3
1 12 5,49 5,51 5,52 5,51a
2 24 5,16 5,17 5,16 5,16b
3 36 4,7 4,71 4,72 4,71c
4 48 4,61 4,63 4,64 4,63d
5 60 4,38 4,35 4,39 4,37e
6 72 4,28 4,27 4,27 4,27f
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mốc thời gian nuôi
cấy
4.7. Hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum
Các chủng Lb.
fermentum
EPS thu được trong
môi trường MRS
(µg/ml)
EPS thu được ở các
điều kiện lên men
thích hợp (µg/ml)
Hiệu suất thu nhận EPS ở
các điều kiện đã khảo sát
so với môi trường MRS
(%)
TC13 119,183 421,378 353,56
TC16 113,939 406,703 356,95
TC21 97,882 405,728 414,51
MC3 88,207 422,638 479,14
x
Phụ lục 5: Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy
5.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein và hàm lượng EPS
thu được
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
Hàm lượng
protein còn lại
trung bình
(µg/mL)
X1 X2 X3
1 10 1,90 1,90 1,80 291,573c
2 15 1,60 1,50 1,70 261,280b
3 20 1,50 1,50 1,60 261,280b
4 25 1,40 1,30 1,40 242,583ab
5 30 1,30 1,30 1,40 246,133ab
6 35 1,40 1,20 1,30 249,210ab
7 40 1,20 1,20 1,10 231,933a
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 10 3,655 3,658 3,659 439,224c
2 15 3,933 3,936 3,934 473,004a
3 20 3,792 3,787 3,791 455,402b
4 25 3,639 3,637 3,641 436,988d
5 30 3,513 3,499 3,511 420,972e
6 35 3,488 3,486 3,485 418,370f
7 40 3,398 3,397 3,402 407,720g
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
Hàm lượng
protein còn lại
trung bình
(µg/mL)
X1 X2 X3
1 10 1,80 2,00 1,90 296,780b
2 15 1,80 1,70 1,90 293,940b
3 20 1,80 1,60 1,70 289,680ab
4 25 1,60 1,60 1,70 289,917ab
5 30 1,50 1,60 1,60 289,207ab
6 35 1,40 1,50 1,60 287,550ab
7 40 1,30 1,30 1,40 284,950a
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 10 2,997 3,011 3,012 359,874g
2 15 3,121 3,125 3,129 374,305f
3 20 3,215 3,218 3,212 385,280e
4 25 3,345 3,349 3,343 401,215d
5 30 3,396 3,392 3,410 407,760c
6 35 3,599 3,597 3,601 432,110a
7 40 3,499 3,498 3,493 419,630b
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
Hàm lượng
protein còn lại X1 X2 X3
xi
trung bình
(µg/mL)
1 10 2,10 2,20 2,00 328,020b
2 15 1,90 2,00 2,10 326,600b
3 20 1,60 1,80 1,70 289,680a
4 25 1,60 1,60 1,70 289,917a
5 30 1,40 1,60 1,50 276,900a
6 35 1,40 1,40 1,50 274,770a
7 40 1,40 1,30 1,40 271,690a
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 10 3,767 3,769 3,771 452,841c
2 15 4,087 4,091 4,085 491,703a
3 20 4,08 4,085 4,082 491,053b
4 25 3,734 3,736 3,739 448,858d
5 30 3,417 3,421 3,419 410,159e
6 35 3,307 3,312 3,308 396,744f
7 40 3,283 3,281 3,286 393,614g
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
Hàm lượng
protein còn lại
trung bình
(µg/mL)
X1 X2 X3
1 10 1,90 2,00 2,00 307,193d
2 15 2,00 1,90 1,90 315,713d
3 20 1,40 1,40 1,50 244,240c
4 25 1,30 1,40 1,20 230,750c
5 30 1,30 1,10 1,20 221,52bc
6 35 1,10 1,10 1,00 204,480ab
7 40 0,90 1,00 0,90 185,547a
Thí
nghiệm
Nồng độ TCA bổ sung
(%)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 10 3,497 3,512 3,505 420,606e
2 15 3,985 3,981 4,001 479,671b
3 20 4,144 4,149 4,145 498,817a
4 25 3,974 3,972 3,961 477,232c
5 30 3,524 3,526 3,528 423,207d
6 35 3,526 3,523 3,524 423,004d
7 40 3,525 3,519 3,523 422,760d
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ TCA bổ sung
5.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy đến khả năng tách chiết EPS
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Tỉ lệ dịch nổi:EtOH
(v/v)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 1,0:0,5 1,451 1,513 1,506 174,915d
2 1,0:1,0 4,277 4,335 3,909 502,191a
3 1,0:1,5 3,887 3,945 3,957 472,435b
4 1,0:2,0 3,537 3,518 3,506 422,516c
5 1,0:2,5 3,509 3,512 3,519 421,663c
xii
6 1,0:3,0 3,524 3,518 3,525 422,760c
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm
Tỉ lệ dịch nổi:EtOH
(v/v)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 1,0:0,5 1,123 1,097 1,086 127,598e
2 1,0:1,0 3,722 3,753 3,768 450,24a
3 1,0:1,5 3,56 3,618 3,611 431,785b
4 1,0:2,0 3,389 3,413 3,417 408,614c
5 1,0:2,5 3,323 3,32 3,324 398,370d
6 1,0:3,0 3,33 3,326 3,302 398,004d
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Tỉ lệ dịch nổi:EtOH
(v/v)
OD490nm) Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 1,0:0,5 1,118 1,123 1,088 128,533d
2 1,0:1,0 3,627 3,62 3,621 434,996a
3 1,0:1,5 3,615 3,585 3,596 432,069b
4 1,0:2,0 3,414 3,411 3,405 409,061c
5 1,0:2,5 3,398 3,392 3,387 406,907c
6 1,0:3,0 3,395 3,401 3,39 407,272c
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Tỉ lệ dịch nổi:EtOH
(v/v)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 1,0:0,5 1,157 1,16 1,159 134,508e
2 1,0:1,0 3,752 3,731 3,770 450,646a
3 1,0:1,5 3,686 3,683 3,678 442,273b
4 1,0:2,0 3,534 3,527 3,53 423,736c
5 1,0:2,5 3,342 3,401 3,465 408,166d
6 1,0:3,0 3,338 3,417 3,404 406,175d
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các tỉ lệ dịch nổi và EtOH
nghiên cứu
5.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách chiết EPS
Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Thời gian tủa bằng
EtOH (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 2,015 2,007 2,012 238,492c
2 24 4,247 4,244 4,239 510,687a
3 36 4,215 4,178 4,226 506,175b
4 48 4,175 4,208 4,226 505,768b
Lb. fermentum TC16
Thí
nghiệm
Thời gian tủa bằng
EtOH (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 1,727 1,724 1,736 204,061c
2 24 3,767 3,768 3,764 450,362b
3 36 3,767 3,774 3,768 452,923b
4 48 3,797 3,809 3,807 457,151a
Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Thời gian tủa bằng
EtOH (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 1,565 1,571 1,566 184,346c
xiii
2 24 3,768 3,740 3,731 450,077a
3 36 3,669 3,662 3,666 440,240b
4 48 3,654 3,659 3,660 439,264b
Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Thời gian tủa bằng
EtOH (giờ)
OD490nm Hàm lượng EPS
trung bình
(µg/mL) X1 X2 X3
1 12 1,839 1,845 1,838 217,679b
2 24 3,767 3,734 3,771 451,419a
3 36 3,768 3,767 3,771 452,801a
4 48 3,767 3,746 3,764 451,622a
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mốc thời gian thực
hiện tủa bằng EtOH
Phụ lục 6: Kết quả khảo sát các tính chất của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13,
TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
6.1. Khả năng hòa tan trong nước
Thí
nghiệm
EPS sinh tổng hợp từ
các chủng Lb.
fermentum
Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng hòa tan
trong nước (%)
m1 m2 m3
1 EPS-TC13 0,0375 0,0365 0,0360 73,33 ± 3,81
2 EPS-TC16 0,0385 0,0365 0,0380 75,33 ± 5,17
3 EPS-TC21 0,0330 0,0320 0,0310 64,00 ± 2,49
4 EPS-MC3 0,0435 0,0430 0,0440 87,00 ± 4,97
6.2. Khảo sát khả năng giữ nước
Thí
nghiệm
EPS sinh tổng hợp từ
các chủng Lb.
fermentum
Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng giữ nước
(%)
m1 m2 m3
1 EPS-TC13 0,2807 0,2812 0,2814 140,55 ± 0,45
2 EPS-TC16 0,2712 0,2726 0,2719 136,22 ± 0,60
3 EPS-TC21 0,2429 0,2397 0,2412 120,63 ± 1,99
4 EPS-MC3 0,2740 0,2690 0,2712 135,70 ± 3,11
6.3. Khảo sát khả năng giữ dầu
Thí
nghiệm
EPS sinh tổng hợp từ
các chủng Lb.
fermentum
Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng giữ dầu
(%) m1 m2 m3
1 EPS-TC13 1,1799 1,1830 1,1818 590,78 ± 1,94
2 EPS-TC16 1,1888 1,1904 1,1882 594,57 ± 1,42
3 EPS-TC21 1,2162 1,2169 1,2167 608,30 ± 0,45
4 EPS-MC3 1,2002 1,2007 1,1989 599,97 ± 1,14
6.4. Khả năng chống oxy hóa
EPS từ Lb. fermentum TC13
Thí
nghiệm
Nồng độ EPS
(mg/L)
OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH (%)
X1 X2 X3
1 2,00 0,186 0,1871 0,1868 29,14 ± 0,52
2 2,50 0,1614 0,1622 0,1619 38,56 ± 0,37
3 2,75 0,1188 0,1184 0,1183 55,01 ± 0,25
4 3,00 0,0633 0,0635 0,0628 76,01 ± 0,35
EPS từ Lb. fermentum TC16
OD517nm
xiv
Thí
nghiệm
Nồng độ EPS
(mg/L)
X1 X2 X3 Tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH (%)
1 2,00 0,1964 0,1971 0,1968 27,34 ± 0,32
2 2,50 0,1739 0,1728 0,1736 35,95 ± 0,52
3 3,00 0,1327 0,1322 0,1325 51,08 ± 0,22
4 3,50 0,0752 0,0761 0,0753 72,11 ± 0,45
EPS từ Lb. fermentum TC21
Thí
nghiệm
Nồng độ EPS
(mg/L)
OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH (%)
X1 X2 X3
1 1,00 0,1835 0,1831 0,1839 36,94 ± 0,35
2 1,50 0,1249 0,1243 0,125 57,14 ± 0,32
3 2,00 0,0948 0,0945 0,0952 67,41 ± 0,30
4 2,50 0,0608 0,0611 0,0615 78,99 ± 0,30
EPS từ Lb. fermentum MC3
Thí
nghiệm
Nồng độ EPS
(mg/L)
OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH (%)
X1 X2 X3
1 1,50 0,1877 0,1882 0,1876 27,14 ± 0,30
2 2,00 0,1343 0,1351 0,1354 47,66 ± 0,55
3 2,50 0,0818 0,0826 0,0827 68,05 ± 0,47
4 3,00 0,0496 0,0492 0,0487 80,93 ± 0,45
Acid ascorbic
Thí
nghiệm
Nồng độ EPS (mg/L) OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do
DPPH (%)
X1 X2 X3
1 0,00125 0,2204 0,2201 0,2202 27,05 ± 0,12
2 0,0025 0,1261 0,1259 0,1257 58,3 ± 0,17
3 0,005 0,0316 0,0314 0,0315 89,57 ± 0,10
4 0,125 0,0209 0,0206 0,0208 93,12 ± 0,12
5 0,5 0,0167 0,0163 0,0166 94,52 ± 0,17
6 ODDPPH 0,3019 0,3018 0,3019
Phụ lục 7: Sắc ký đồ phổ GC-MS của EPS-MC3
xv
Phụ lục 8: Sắc ký đồ phân tích khối lượng phân tử bằng sắc ký thẩm thấu gel
xvi
xvii
xviii
Phụ lục 9: Sắc ký đồ phổ NMR
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
2.497
2.500
2.503
2.994
3.002
3.007
3.012
3.020
3.025
3.037
3.419
3.432
3.444
3.454
3.466
3.487
3.491
3.503
3.509
3.527
3.552
3.595
3.615
3.637
3.659
3.662
3.671
3.682
3.685
4.545
4.872
1.00
0.45
2.50
5.27
4.09
1.12
2.07
MC3-DMSO-1H
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 7.26INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG zgprTD 32768SOLVENT DMSONS 16DS 2SWH 10000.000 HzFIDRES 0.305176 HzAQ 1.6384000 secRG 79.36DW 50.000 usecDE 6.50 usecTE 302.9 KD1 2.00000000 secD12 0.00002000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2016657 MHzNUC1 1HP1 10.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW9 0.00008800 W
F2 - Processing parametersSI 32768SF 500.2000051 MHzWDW noSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
2.93.0
3.13.2
3.33.4
3.53.6
3.73.8
3.94.0
4.14.2
4.34.4
4.54.6
4.74.8
4.95.0
5.1p
pm
2.9943.0023.0073.0123.0203.0253.037
3.4193.4323.4443.4543.4663.4873.4913.5033.5093.5273.5523.5953.6153.6373.6593.6623.6713.6823.685
4.545
4.872
1.00
0.45
2.50
5.27
4.09
1.12
2.07
MC3-DMSO-1H
3.003.05
3.103.15
3.203.25
3.303.35
3.403.45
3.503.55
3.603.65
3.703.75
pp
m
2.9943.0023.0073.0123.0203.0253.037
3.4193.4323.4443.4543.4663.4873.4913.5033.5093.527
3.552
3.595
3.615
3.6373.6593.6623.6713.6823.685
1.00
0.45
2.50
5.27
4.09
MC3-DMSO-1H
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm38.99
39.16
39.33
39.50
39.66
39.83
40.00
61.47
61.54
67.07
67.40
70.60
71.41
71.60
73.15
73.81
77.18
93.98
94.14
MC3-DMSO-C13CPD
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 2PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 11.40INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT DMSONS 3074DS 4SWH 31250.000 HzFIDRES 0.476837 HzAQ 1.0485760 secRG 198.57DW 16.000 usecDE 6.50 usecTE 302.5 KD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 125.7892253 MHzNUC1 13CP1 10.00 usecPLW1 88.00000000 W
======== CHANNEL f2 ========SFO2 500.2020008 MHzNUC2 1HCPDPRG[2 waltz16PCPD2 80.00 usecPLW2 22.00000000 WPLW12 0.34375000 WPLW13 0.22000000 W
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7754500 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
6570
7580
8590
95p
pm
61.4761.54
67.0767.40
70.60
71.4171.60
73.15
73.81
77.18
93.9894.14
MC3-DMSO-C13CPD
ppm
2.53.03.54.04.55.0 ppm
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
MC3-DMSO-COSYGP
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 5PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.33INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG cosygpppqfTD 2048SOLVENT DMSONS 4DS 8SWH 5000.000 HzFIDRES 2.441406 HzAQ 0.2048000 secRG 142.98DW 100.000 usecDE 6.50 usecTE 300.9 KD0 0.00000300 secD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD13 0.00000400 secD16 0.00020000 secIN0 0.00020000 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2022509 MHzNUC1 1HP0 10.00 usecP1 10.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 128SFO1 500.2023 MHzFIDRES 78.125000 HzSW 9.996 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000109 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.2000087 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
3.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0 ppm
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
MC3-DMSO-COSYGP
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 5PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.33INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG cosygpppqfTD 2048SOLVENT DMSONS 4DS 8SWH 5000.000 HzFIDRES 2.441406 HzAQ 0.2048000 secRG 142.98DW 100.000 usecDE 6.50 usecTE 300.9 KD0 0.00000300 secD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD13 0.00000400 secD16 0.00020000 secIN0 0.00020000 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2022509 MHzNUC1 1HP0 10.00 usecP1 10.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 128SFO1 500.2023 MHzFIDRES 78.125000 HzSW 9.996 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000109 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.2000087 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
3.03.13.23.33.43.53.63.7 ppm
3.0
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
MC3-DMSO-COSYGP
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 5PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.33INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG cosygpppqfTD 2048SOLVENT DMSONS 4DS 8SWH 5000.000 HzFIDRES 2.441406 HzAQ 0.2048000 secRG 142.98DW 100.000 usecDE 6.50 usecTE 300.9 KD0 0.00000300 secD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD13 0.00000400 secD16 0.00020000 secIN0 0.00020000 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2022509 MHzNUC1 1HP0 10.00 usecP1 10.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 128SFO1 500.2023 MHzFIDRES 78.125000 HzSW 9.996 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000109 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.2000087 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
3.23.33.43.53.63.7 ppm
3.20
3.25
3.30
3.35
3.40
3.45
3.50
3.55
3.60
3.65
3.70
MC3-DMSO-COSYGP
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 5PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.33INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG cosygpppqfTD 2048SOLVENT DMSONS 4DS 8SWH 5000.000 HzFIDRES 2.441406 HzAQ 0.2048000 secRG 142.98DW 100.000 usecDE 6.50 usecTE 300.9 KD0 0.00000300 secD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD13 0.00000400 secD16 0.00020000 secIN0 0.00020000 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2022509 MHzNUC1 1HP0 10.00 usecP1 10.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 128SFO1 500.2023 MHzFIDRES 78.125000 HzSW 9.996 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000109 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.2000087 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
2.53.03.54.04.55.0 ppm
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
MC3-DMSO-HMBC
ppm
4.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.05.1 ppm
68
70
72
74
76
78
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
MC3-DMSO-HMBC
ppm
3.03.13.23.33.43.53.63.73.8 ppm
56
58
60
62
64
66
68
70
72
74
76
78
80
MC3-DMSO-HMBC
ppm
2.53.03.54.04.55.0 ppm
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
MC3-DMSO-HSQC
ppm
4.54.64.74.84.9 ppm
92.0
92.5
93.0
93.5
94.0
94.5
95.0
95.5
96.0
MC3-DMSO-HSQC
ppm
3.03.13.23.33.43.53.63.73.8 ppm
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
MC3-DMSO-HSQC
ppm
2.53.03.54.04.55.05.5 ppm
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
MC3-DMSO-NOESY
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 6PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.53INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 6009.615 HzFIDRES 2.934382 HzAQ 0.1703936 secRG 89.63DW 83.200 usecDE 6.50 usecTE 300.8 KD0 0.00007057 secD1 1.98156798 secD8 0.44999999 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00016660 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2017507 MHzNUC1 1HP1 10.00 usecP2 20.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 40.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 256SFO1 500.2018 MHzFIDRES 46.893757 HzSW 12.000 ppmFnMODE States-TPPI
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0
ppm
3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0 ppm
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
MC3-DMSO-NOESY
Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 6PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.53INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 6009.615 HzFIDRES 2.934382 HzAQ 0.1703936 secRG 89.63DW 83.200 usecDE 6.50 usecTE 300.8 KD0 0.00007057 secD1 1.98156798 secD8 0.44999999 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00016660 sec
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2017507 MHzNUC1 1HP1 10.00 usecP2 20.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 40.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 256SFO1 500.2018 MHzFIDRES 46.893757 HzSW 12.000 ppmFnMODE States-TPPI
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0
xix
Phụ lục 10: Một số hình ảnh thao tác trong quá trình nghiên cứu