histopatología pulmonar en jabalí: influencia del

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA

TESIS DOCTORAL

“HISTOPATOLOGÍA PULMONAR EN JABALÍ: INFLUENCIA DEL

CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2”

Autor:

Jesús María Cuesta Gerveno

Conformidad de los directores:

Fdo. Luis Jesús Gómez Gordo Fdo. Javier Hermoso de Mendoza Salcedo

Departamento de Medicina Animal

Facultad de Veterinaria

2017

HISTOPATOLOGÍA PULMONAR EN EL JABALÍ: INFLUENCIA DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2

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“HISTOPATOLOGÍA PULMONAR EN

JABALÍ: INFLUENCIA DEL CIRCOVIRUS

PORCINO TIPO 2”

Autor:

Jesús María Cuesta Gerveno

Directores:

Luis Jesús Gómez Gordo

Javier Hermoso de Mendoza Salcedo

Unidad de Histología y Anatomía Patológica Comparada

Departamento de Medicina Animal

Facultad de Veterinaria de Cáceres

Universidad de Extremadura


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Agradecimientos


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vii

Hace mucho tiempo, en una Facultad muy muy lejana…

Dicen que las buenas historias comienzan por casualidad, aunque yo no sé si lo que

me empujó a meterme en esta aventura fue casualidad o cosas del destino. Un largo

camino ha pasado desde que decidí meterme en un Departamento de mi Facultad

hasta este momento, en el que me dispongo a leer esta Tesis que tanto esfuerzo,

alegrías, disgustos, horas de sueño y kilómetros ha costado.

Y a lo largo de ese camino he ido conociendo a gente estupenda, que me ha apoyado

y empujado hacia la meta, cada uno a su manera. Y es que también dicen que todas

las personas que conocemos nos marcan de una manera u otra. Y a todos ellos quiero

agradecer todo esto. Y lo haré paso a paso.

A mis padres y mis hermanos. Ellos me han criado y me han ido moldeando hasta ser

como soy, para bien o para mal, pero que siempre han estado ahí cuando lo he

necesitado, sintiendo su cariño y apoyo. Y es que aunque siempre he sido un poco la

oveja negra, nada me alegra más que pertenecer al rebaño que pertenezco.

A mis abuelos. Aunque no podáis estar aquí conmigo en estos momentos, espero que

desde allí arriba os sintáis la mitad de orgullosos de mí, de lo orgulloso que me siento

yo de vosotros.

A mis amigos de Cáceres. A todos. Y es que sería muy largo enumerar a todos y cada

uno de ellos. Desde que me vine de mi pueblo, os fui conociendo poco a poco, y

queriendo cada día más. Unos aparecisteis antes en mi vida, otros después. Sin

embargo, yo no puedo entender ahora mismo un mundo sin vosotros. Y es que por

muy lejos que estemos, siempre tendremos tiempo de echar unas “Frikitardes”,

tomarnos “Unas tapitas” o un “Té y vinitos”, antes de decirnos “Hasta luego cocodrilo”.

A mis amigos de la Facultad de Veterinaria. Pablo, Luismi, Juanmi, Canario, Jose,

Juanma, Alex, Diego, Perico… Sois tantos que me sería imposible enumeraros a todos.

Vosotros sabéis quienes sois, por todos esos momentos vividos juntos durante todos

esos años que echamos para acabar esta carrera vocacional nuestra. Por esos

descansos en la biblioteca, por las jornadas de estudio de muerte del día antes del

examen, por esos días de fiesta, por la fundación del EBI, por todo, gracias.

A los profesores que me motivaron durante la carrera, demostrándome poco a poco

que la veterinaria era algo más que una profesión, era un camino lleno de inquietudes

donde cada día se nos presentarían retos que nos empujarían a no parar de aprender

ni un solo día de nuestra vida.


viii

A mis compañeros en el mundillo de la investigación y muy especialmente...

A Waldo, por enseñarme que se puede ser un gran profesional y acabar impecable

después de toda una tarde tomando muestras.

A Chema, que siempre pondrá el contrapunto correcto a lo mal que puedo hablar yo.

A Remi, por dar ese toque de humor y diversión dentro de esta sección tan seria de la

veterinaria.

A Pilar, por demostrar que aparte de ser bióloga, es toda una princesa guerrera de los

animales salvajes.

A David, por ese incansable afán por aprender, desarrollar ideas y sacar las cosas

adelante.

A Pedro, por enseñarme que hay vida e investigación aplicativa más allá de la caza.

A Elisa y María, un dueto inseparable que hacía los viajes mucho más divertidos.

Mención para mis compañeros de Departamento. A Paula, por la ayuda prestada en el

laboratorio y en todo el procesado de la inmensa cantidad de muestras. A Pilar, a

Diana y a Jose. Pero muy especialmente a mis manos derechas. Sin Galapero y sin Edu

este viaje no habría sido posible. Y es que trabajar no es incompatible con pasar un

buen rato y reír. Por los buenos momentos, por los malos, por madrugar mucho, por

dormir muy tarde, pero sobre todo, por poner una sonrisa en la cara por muy jodidos

que estemos. Por eso y porque siempre nos quedará el Benito.

A la gente de Barcelona. Emmanuel, Ignasi, Gregori, Óscar, Xavi… a todos, muchas

gracias. Y especialmente a mi anfitriona, Roser. Gracias por acogerme, enseñarme

patología y demostrarme que la vocación y sentirte realizado vale más que todo el oro

del mundo.

A mis directores de tesis.

A Javier, por confiar en mí sin apenas conocerme, teniendo como única referencia una

frase que seguramente sería parecida a “es un buen chaval”. Gracias por apoyarme

durante el camino, y más aún en esta recta final que tanto esfuerzo ha conllevado.

A Luis. No puedo expresar con palabras lo agradecido que estoy con todo lo que has

hecho por mí. Por los momentos buenos y los momentos malos. Y es que para mí eres

algo más que un director de tesis. Eres un padre profesional. Tú me has enseñado que

la patología se puede entender de distintas maneras, y así es como debemos

transmitirlo. Porque me has demostrado que la profesionalidad no está reñida con la

simpatía, por saber distinguir cuando hay que ponerse serio y cuando nos podemos

tomar una cerveza. Por todo ello gracias, no sería el veterinario que soy si no hubiera

estado a tu lado aprendiendo. No sería la persona que soy si no hubiera estado a tu

lado disfrutando de esta profesión.


ix

Y quería dejar la persona más especial para el final. Yoli, gracias por aguantarme, tú

has sido la luz que ha alumbrado esta época tan oscura. La luz que me ha guiado

hasta el final de este camino de doctorado. La luz que espero que me guie de aquí en

adelante durante toda mi vida. Y es que no sé qué podría haber hecho sin ti,

probablemente no estaría escribiendo estas palabras ahora mismo y me habría

rendido. Pero gracias a ti aquí estoy, rematando esta etapa de mi vida, esta etapa de

mi educación. Sin ti no sería doctor, sin ti no sería nada. Muchas gracias, eres lo mejor

que tengo en mi vida, y no puedo decírtelo con otras palabras que no sean diciendo:

Te quiero.


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Índice


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xiii

Introducción Pág.1

El jabalí. Pág.3

- Características del jabalí en la Península Ibérica. Pág.4

- Comportamiento del jabalí. Pág.7

- El hábitat del jabalí y sus modificaciones. Pág.15

- Importancia del jabalí en el ámbito sanitario. Pág.18

Circovirus Porcino. Pág.23

- Epidemiologia de PCV2. Pág.27

- Patogénesis. Pág.29

- Medidas de control de PCV2. Pág.36

Tuberculosis y Complejo Mycobacterium tuberculosis. Pág.37

- Complejo Mycobacterium tuberculosis. Pág.39

- Lesión histológica de la tuberculosis en jabalí: el granuloma tuberculoso. Pág.41

- Respuesta inmune innata. Pág.44

- Respuesta inmune adquirida. Pág.46

- Evolución de los patrones lesionales asociados a tuberculosis. Pág.49

Objetivos Pág.51

Bloque I. Identificación de los procesos inflamatorios y los daños

estructurales más habituales presentes en pulmones de jabalíes, así como su

posible etiología y cómo se ven afectados por otros factores. Pág.55

Estudio de los procesos inflamatorios. Pág.59

Estudio de los daños estructurales. Pág.68

Bloque II. Estudio de la relación entre la positividad frente al Circovirus

Porcino Tipo II y el desarrollo del granuloma tuberculoso Pág.77

Estudio de positividad a M.tuberculosis complex y patrón lesional. Pág.80

Estudio histológico de los granulomas. Pág.81

Resultados. Pág.82

Discusión de los resultados obtenidos. Pág.85


xiv

Bloque III. Determinación de la influencia de la vacunación frente a PCV2 en

el desarrollo del granuloma tuberculoso Pág.89

Estudio de la prevalencia de tuberculosis y desarrollo de los granulomas. Pág.93

Estudio inmunohistoquímico de los granulomas. Pág. 96

Resultados por grupo de estudio. Pág.100

Resultados del estudio comparativo de marcadores individuales. Pág.109

Conclusiones Pág.125

Anexo I. Galería de imágenes de los resultados de las pruebas

inmunohistoquímicas Pág.129

Bibliografía Pág.139


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Introducción


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3

El jabalí

El jabalí (Sus scrofa) es un mamífero salvaje, considerado antecesor del cerdo

doméstico (Sus scrofa domestica, Lipowski et al., 2003). Encuadrado dentro de la

Familia Suidae, conforma el Género Sus junto a otras 7 especies.

Reino: Animalia

Filo: Chordata

Clase: Mammalia

Orden: Artiodactyla

Familia: Suidae

Género: Sus

Especie: Sus barbatus

Sus bucculentus

Sus cebifrons

Sus celebensis

Sus salvanius

Sus scrofa

Sus philippensis

Sus verrucosus


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Características del jabalí en la Península Ibérica.

En España han sido descritas dos subespecies del jabalí: Sus scrofa baeticus y Sus

scrofa castilianus (Cabrera et al., 1914). Estos animales presentan un cuerpo muy

compacto, con una cabeza más alargada que el cerdo doméstico que se une al tórax

sin conformar apenas cuello. A diferencia también del cerdo doméstico, el tren

delantero presenta un mayor desarrollo, con unas extremidades ligeramente más

cortas. El dimorfismo sexual en este animal no es muy marcado, pero sí evidente. Los

machos tienen un mayor peso (75-85 kg) que las hembras (55-65 kg) (Fernández-

Llario et al., 2006). Este peso puede variar en función de la localización geográfica de

manera espectacular, llegando a los extremos de las zonas norte y este de Europa,

donde se han llegado a registrar animales de unos 300 kg de peso (Rosell et al.,

2001). En el caso de España, la zona Norte posee animales de menor talla y peso

(Fernández-Llario et al., 2006).

Jabalíes adultos en ambiente. Fotografía Red de Grupos de Investigación Recursos Faunísticos.

Sin embargo, el dimorfismo más evidente viene por el desarrollo de los caninos por

parte de los machos de la especie, siendo en las hembras mucho menos desarrollados.

Los caninos en los machos poseen una función defensiva ante otros animales y ante

competidores de la misma especie, desarrollando un ritmo de crecimiento de unos 3

mm por año (Fernández-Llario et al., 2003). Además, los machos presentan el

“escudo”, que no es otra cosa que el nombre coloquial que se da a un engrosamiento

de la piel situada en la espalda y en zonas posteriores a las extremidades delanteras,


5

con función defensiva en combates con otros machos, con el fin de evitar heridas de

gravedad durante el periodo de celo o por defensa del territorio (Rosell et al., 2001).

Pelea entre machos adultos. Fotografía Red de Grupos de Investigación Recursos Faunísticos.

Además de los 2 caninos, la dentición completa de un jabalí adulto está compuesta por

6 incisivos, 6 premolares y 8 molares por arcada dentaria (44 piezas en total), siendo

esta dentición de mucha utilidad en la determinación de la edad de los animales. Hasta

los 30 meses, momento en el cual todas las piezas dentarias se han desarrollado, es

un método fiable para la estimación de la edad de los animales (Sáez-Royuela et al.,

1989). A partir de esa edad, se debería optar por la estimación de la edad basada en el

grado desgaste de premolares y molares (Fernández-Llario et al., 2006), o por otros

métodos de estimación como puede ser el estudio de la relación entre el canal dentario

de los incisivos y el cemento presente (Gonçalves et al., 2015).

Además de los cambios en la dentición, con la edad los animales presentan cambios de

librea y coloración. Desde su nacimiento hasta aproximadamente los 6 meses, los

animales son conocidos como “rayones”, debido a su coloración, en la cual presentan

unas rayas evidentes oscuras sobre un fondo claro, con el fin de mimetizarse en el

entorno y pasar desapercibidos ante los posibles depredadores. Una vez pasan esa

etapa, los animales “pierden las rayas” mostrando una coloración ocre-rojiza, entre los


6

6 meses y el año de vida, pasándose a denominarse “bermejos”. Al año de vida,

adquieren la tonalidad de adulto, oscureciéndose el color del pelo de manera

generalizada, con presencia de ciertas tonalidades blancas en algunas zonas como

pueden ser flancos, cresta o cabeza. Los machos de muy avanzada edad pueden

presentar esta tonalidad blanca de manera generalizada por todo el cuerpo

(Fernández-Llario et al., 2006).

Madre con rayones. Fotografía Red de Grupos de Investigación Recursos Faunísticos.


7

Comportamiento del jabalí.

Dentro del comportamiento del jabalí podemos distinguir 3 aspectos diferenciados.

Primero, hablaremos sobre el comportamiento general del jabalí, mientras que en

segundo y tercer lugar destacaremos los comportamientos reproductivos y aquellos

relacionados con la alimentación, por ser estos los que ponen en contacto los distintos

grupos que conforman las poblaciones. Dichos contactos serán en gran medida los

determinantes de los riesgos epidemiológicos, principalmente en el caso de

enfermedades infecciosas.

Comportamiento general del jabalí.

El jabalí es un animal de hábitos sociales, con un comportamiento principalmente

nocturno. La estructura familiar de los animales es variable, tanto en número como en

tipos de animales que la conforman, en función de la época del año en la que se

encuentren (Fernández-Llario et al., 1996). Dentro de las estructuras, existen dos

grandes grupos (Martínez-Rica et al., 1981; Fernández-Llario et al., 1996; 2006).

- Estructuras matriarcales: estarían compuestas por una hembra dominante,

hembras adultas y subadultas (normalmente parientes de la hembra

dominante) y animales menores de un año (machos y hembras)

- Grupos de machos: que viven de manera independiente y que mantienen

contacto con los grupos matriarcales principalmente durante la época de celo.

Estos dos grandes grupos presentan variaciones en función de la edad de los animales

y las épocas del año. En el caso de los grupos matriarcales, cuando los machos

alcanzan el año de edad, son expulsados de los grupos durante las épocas de celo,

uniéndose a los grupos de machos (Fernández-Llario et al., 2006). En cuanto a los

grupos de machos, el factor más importante en cuanto a la variación de los grupos es

el celo. En época de celo, los machos tienen contacto con los grupos matriarcales

(sobre todo los animales dominantes), momento en el cual los machos jóvenes del

grupo matriarcal se incorporan a los grupos de machos. Este fenómeno, asociado a las

peleas por dominancia entre machos, nos hace observar cambios muy evidentes entre

los grupos de machos, con cambios de individuos y formación de nuevos grupos. Sin

embargo, durante la época en la que no existe actividad reproductora, los grupos de


8

machos son más estables y más pequeños, formados principalmente por un macho

dominante y otros subadultos, en número reducido normalmente (Rosell et al., 2001;

Fernández-Llario et al., 2006). El caso extremo de esta reducción de los grupos es una

estructura conformada por un adulto dominante y un subadulto. Dicha estructura,

presente en nuestro ecosistema, confiere una ventaja al macho dominante, ya que el

subadulto ejerce funciones de explorador de nuevos territorios o de incursiones en

territorios ajenos; de ahí que se le denomine comúnmente como “escudero”.

Finalmente, otro comportamiento asociado principalmente a machos adultos en el

jabalí es el uso de las denominadas “bañas”. Estas “bañas” no son otra cosa que zonas

cercanas a fuentes de agua, donde los jabalíes recubren su cuerpo con el barro

formado (Rosell et al., 1998). Una vez cubiertos con este material, los animales tienen

tendencia a frotarse, dejando impreso parte de este barro en los árboles cercanos a la

zona de bañas.

Adultos usando bañas. Fotografía Red de Grupos de Investigación Recursos Faunísticos.

Sobre la función de las bañas y la cobertura de barro existen diversas teorías. Se

piensa que el barro que muchos animales dejan fijado en el tronco de los árboles

contra los que se frotan contiene parte de las feromonas del animal, procedente de la

saliva. Este hecho ejercería un efecto estimulante ante las hembras que accedieran al

punto de agua, favoreciendo la entrada en celo de las mismas (Fernández-Llario et al.,

2005). Otra acción del barro es ofrecer una cubierta de tipo defensivo a los machos

ante las peleas en época de celo, frente a una acción mecánica o como antiséptico

ante las posibles heridas sufridas durante el combate (Fernández-Llario et al., 2006).

Otras acciones que puede presentar la cubierta de barro pueden ser la

termorregulación de la temperatura de los animales (Belden et al., 1976), o la


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protección ante los parásitos externos (Rosell et al., 2001), aunque en la zona

mediterránea el uso de las bañas se sitúa principalmente entre los meses de Octubre y

Noviembre, una época de baja actividad de los ectoparásitos, por lo cual esta hipótesis

no tiene mucho sentido dentro de nuestro ecosistema (Fernández-Llario et al., 2005).

Unido a todo esto, el uso de bañas por distintos animales constituye un foco de

contacto entre distintas poblaciones, agravado además si los jabalíes dan este uso a

puntos de agua comunes a diferentes especies en épocas de sequía, considerándose

zonas de alto riesgo epidemiológico.


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Comportamiento reproductivo

El jabalí es un animal con alto éxito reproductivo, en gran medida conferido por las

características propias de la especie.

1. Edad de madurez sexual.

Los jabalíes alcanzan la madurez sexual a edades muy tempranas. Las hembras

la alcanzan antes del año de edad (10-11 meses), al llegar a un peso

aproximado de 30 kg (Sáez-Royuela et al., 1989). Sin embargo, si escasean los

recursos alimenticios presentes en el medio ambiente, esta madurez puede no

venir acompañada de un primer celo, ocurriendo este al año y medio de edad,

cuando el medio ambiente proporciona las condiciones adecuadas (Fernández-

Llario et al., 2005).

Comportamiento reproductivo, momento de cópula. Fotografía Red de Grupos de

Investigación Recursos Faunísticos.

Los machos alcanzan su madurez sexual aproximadamente a los 10 meses de

edad. Sin embargo, debido a que no presentan un desarrollo evidente de los

caninos ni poseen la fuerza necesaria en combate, quedan relegados por los

machos dominantes y sin actividad reproductiva. Una vez los individuos están

completamente desarrollados, aproximadamente a los 2 años de edad, pueden

competir con estos machos, iniciando así su etapa reproductiva (Rosell et al.,

1998; Herrero et al., 2002).


11

2. Corto periodo de gestación y alta protección materna.

El periodo de gestación de una hembra de jabalí oscila entre los 120 y los 130

días de duración (Rosell et al., 2001), un periodo corto en animales salvajes.

Además, la madre posee un instinto de protección de las crías muy marcado. El

nacimiento de los rayones ocurre en un nido preparado expresamente por la

madre, permaneciendo los primeros en ellos durante la primera y segunda

semana de vida (variable en función de las condiciones ambientales).

Compuesto principalmente por ramas y materias vegetales a modo de cama,

estas parideras ofrecen un lugar seguro y cómodo para las crías. Además, las

madres tienden a construirlo cerca de puntos de agua, con cobertura vegetal

abundante para ofrecer protección y en zonas soleadas para controlar la

temperatura (Fernández-Llario et al., 2005).

Estructura de protección, madres protegiendo a las crías. Fotografía Red de Grupos de

Investigación Recursos Faunísticos.


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3. Tamaño medio de la camada y esfuerzos adaptativos.

El tamaño medio de la camada en España varía entre 3,3 y 4,2 crías por

camada (Rosell et al., 2001). Sin embargo, en zonas mediterráneas el tamaño

medio es de 3,5 (Fernández-Llario et al., 1999). Estas variaciones entre el

número de crías por camada vienen dadas por diversos factores. Por ejemplo,

los recursos disponibles en la naturaleza afectan al número de crías. A mayor

cantidad de recursos, mayor cantidad de crías por camada. Este hecho lo

corrobora el tamaño medio de camada en las poblaciones centroeuropeas de

jabalíes, donde la disponibilidad de recursos es mayor y la media de crías por

camada se eleva hasta 5,3 (Rosell et al., 2001). Además, las hembras más

grandes tienen camadas más prolíficas, por lo que tamaño de la hembra

reproductora y número de crías están estrechamente ligados (Sáez-Royuela et

al., 1987). Además, el hecho de que dentro de la misma camada la cría con

mayor peso en el nacimiento suela ser un macho, nos hace pensar en una

desviación adaptativa en cuanto a esfuerzos reproductivos, ya que este macho

accederá a mejores recursos procedentes de la madre, alcanzando un mayor

desarrollo (Fernández-Llario et al., 1999). Esta adaptación reproductiva de la

hembra también se ajusta a la cantidad de recursos presentes en el medio,

siendo mayores el número de hembras gestantes y el tamaño de la camada

durante años lluviosos, decreciendo estos números en años de sequía (Abaigar

et al., 1990; Rosell et al., 1998; Fernández-Llario et al., 2000).


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Comportamiento alimenticio.

El jabalí es una especie omnívora de carácter oportunista con una dieta

extremadamente variada que le permite aprovechar los recursos ofrecidos por el medio

ambiente en función de las estaciones y los ecosistemas donde habite (Fernández-


La mayor parte de su dieta está compuesta por alimentos de origen vegetal, con una

menor parte integrada por alimentos de origen animal (principalmente invertebrados).

Sin embargo, dentro de la dieta del jabalí existe un factor limitante en cuanto a la

conformación de la misma, la proteína. Al ser un animal monogástrico, el jabalí no

puede asimilar más de un 30% de la proteína de origen vegetal ingerida en la dieta,

por mucha cantidad de alimentación vegetal que consuman (Abaigar et al., 1990;

Herrero et al., 2006). Esta situación hace que la ingesta de proteína de origen animal

sea de enorme importancia en esta especie, aunque algunos autores consideren este

comportamiento como ocasional u oportunista (Abaigar et al., 1990; Herrero et al.,

2002; Rosell et al., 1998). Esta necesidad de proteína de origen animal les hace

acceder a otras fuentes de alimentación animal, como pueden ser los cadáveres de

animales (incluso de su misma especie), generando hábitos carroñeros con el

consecuente peligro epidemiológico de contagio de enfermedades (Gortázar et al.,

2006). En periodos de crecimiento tempranos, esta necesidad de proteínas se acentúa

aún más, sobre todo en menores de un año de edad (Groot-Bruinderink et al., 1994).

Madre alimentándose con sus crías. Fotografía Red de Grupos de Investigación Recursos

Faunísticos.


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La alimentación típica del jabalí en España puede variar dependiendo de la estación del

año y la situación geográfica (Abigair et al., 1990; Herrero et al., 1995; Sáenz de

Buruaga et al., 1995; Valet et al., 1994). Entre los vegetales destacan los cereales, la

bellota en la zona mediterránea, plantas acuáticas en zona norte y raíces. En cuanto a

la dieta de procedencia animal básicamente son invertebrados, anfibios, reptiles,

micromamíferos y carroña de otros mamíferos de mayor tamaño que habiten las

mismas zonas, como ciervos, gamos, corzos, ganado doméstico o incluso otros jabalíes

(Fernández-Llario et al., 1996; Rosell et al., 2001). Una fracción de la alimentación del

jabalí está constituida por invertebrados y raíces, alimentos a los que el jabalí tiene

acceso mediante un hábito característico, la hozadura. El animal levanta las capas

superficiales de la tierra con el fin de acceder a estos recursos, sobre todo en zonas de

leguminosas para acceder a mayor cantidad de proteínas. Sin embargo, existe un

factor limitante ante este comportamiento, y es la humedad el terreno, ya que en

suelos extremadamente secos el animal es incapaz de hozar. Esta dependencia de

zonas húmedas limita esta actividad a determinadas épocas del año en determinadas

zonas, mientras que en otras con mayor humedad este comportamiento se mantiene

durante todo el año (Puigdefábregas-Tomás et al., 1981; Fernández-Llario et al.,

1996).


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El hábitat del jabalí y sus modificaciones

El jabalí es un animal ampliamente extendido por el planeta, que podemos encontrar

en casi toda Europa, Asia (exceptuando las zonas más al norte), Oceanía

(principalmente Papúa Nueva Guinea, Australia y Nueva Zelanda), gran parte de

América y la zona norte de África (Rosell et al., 2001). En dichas zonas, se observan

tanto la forma salvaje del animal, como formas asilvestradas. No en todas las zonas

mencionadas el jabalí es autóctono, ya que a lo largo de los años este animal ha ido

colonizando áreas nuevas, ya sea por introducción voluntaria por parte de humanos

(principalmente como enriquecimiento cinegético de una zona) como por la propia

expansión de la especie, ya que es un animal que se adapta fácilmente a los cambios y

a los recursos que ofrecen los nuevos ecosistemas (Rosell et al., 2001; Fernández-


Adultos y crías en una finca con modificaciones en el hábitat. Fotografía Red de Grupos de

Investigación Recursos Faunísticos

Esta capacidad de aprovechamiento de recursos naturales confiere al jabalí la

capacidad de establecerse en hábitats completamente dispares. Concretamente, en

España encontramos jabalíes desde los Pirineos hasta las zonas más al sur del país,

ocupando ecosistemas que van desde bosques cerrados de carácter atlántico húmedo,

hasta zonas de dehesa o bosque mediterráneo, o incluso áreas de marismas costeras,

siendo un caso extremo de esta adaptación al medio la presencia de estos animales en

zonas periurbanas o propiamente urbanas, como se ha dado el caso en Barcelona o

Madrid, con el consecuente riesgo para las personas (Abaigar et al., 1990; Fernández-


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Llario et al., 1996; Rosell et al., 1998; Herrero et al., 2002; Fernández-Llario et al.,

2006).

Sin embargo, no todos los hábitats que ocupa el jabalí son ecosistemas sin

intervención humana. Debido a la demanda que se ha generado en España por el

interés creciente que suscitan estos animales como piezas de caza mayor, hay cada

vez más intervenciones dentro de las fincas cinegéticas para el mantenimiento y cría

del jabalí (Gortázar et al., 2006). En muchas de ellas, los sistemas empleados se

aproximan a los de cría tradicional del cerdo doméstico, cuando no se trata de

instalaciones porcinas reconvertidas. Los 3 tipos fundamentales de intervención son:

1. Vallado de las fincas.

El vallado perimetral de la finca evita la dispersión de la población de jabalíes y

permite una mayor densidad de animales dentro de la misma, a base de

controlar las entradas y salidas, y de la gestión de los recursos y de las

poblaciones de otras especies que compartan el mismo hábitat. Además, con el

vallado se puede efectuar una división interna de la propia finca, facilitando el

manejo de los animales así como la organización de las actividades cinegéticas

mediante el sistema de cercones acotados.

2. Suplementación alimenticia.

Especialmente en el caso de las fincas valladas con densidades de población

artificialmente elevadas, esta medida es imprescindible, ya que con densidades

por encima de lo natural lo normal es que la finca no posea los recursos

suficientes para sustentar dicha población de manera estable. Esta

suplementación se hace principalmente con cereales, pienso formulado

específicamente para animales de carácter cinegético, o subproductos de

industrias agroganaderas. Además, la suplementación se suele aprovechar para

manipular el comportamiento de los jabalíes, facilitando la gestión cinegética de

la finca. Por ejemplo, con la suplementación a base de alimentos atractivos,

como maíz, es posible hacer que los jabalíes se desplacen a zonas donde

posteriormente se realizarán acciones cinegéticas (cebado de manchas de

monte), aumentando las posibilidades de éxito. Otra utilidad de la

suplementación alimenticia con cebos atractivos es tentar a los animales para

que entren en jaulas de captura, facilitando intervenciones veterinarias, como

vacunaciones, marcado o seguimiento (clínico, inmunológico, fenológico, etc.)


17

de los propios animales. Finalmente, la suplementación permite también

reforzar la dieta de los animales con componentes importantes y difíciles de

encontrar en el entorno, pudiendo ser permanente o limitada a la época seca,

algo que se está revelando fundamental para el mantenimiento de un condición

corporal adecuada y un sistema inmunitario competente, incluso en fincas con

recursos suficientes y densidades naturales.

3. Manejo de animales en núcleos de tipo intensivo.

En dichos núcleos se ejerce un mayor control sobre los animales,

aproximándose a lo que sería la gestión de una explotación de cerdo

doméstico. Tienen calificación legal de núcleos zoológicos a efectos sanitarios.

Normalmente el núcleo está en la propia finca, abasteciéndola de animales para

acciones cinegéticas. En estos núcleos, los animales reciben alimentación

específica y controlada, y aunque se tiende a simplificar los manejos sanitarios

se aplican controles y medidas como vacunaciones, desparasitaciones, etc.

También se puede ejercer un control más exhaustivo sobre los periodos y

parámetros reproductivos de los animales, mejorando las camadas de manera

cuantitativa y cualitativa por selección de parentales, destete programado, etc.;

e incluso se puede hacer una gestión de los animales de reposición de la finca,

seleccionando y aislando a los mejores machos jóvenes durante la temporada

de caza para darles la oportunidad de obtener un pleno desarrollo como adultos

reproductores y aumentar así la calidad de los trofeos en temporadas

posteriores.


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Importancia del jabalí en el ámbito sanitario

El jabalí es susceptible de albergar microorganismos patógenos y actuar como

reservorio de enfermedades de distinto origen, considerándose un peligro potencial en

cuanto a diseminación y contagio de las mismas. Además, la expansión de la especie

tanto geográfica como en número de animales, podría facilitar el contacto de estas

poblaciones salvajes con animales domésticos e incluso humanos, considerándose de

hecho un foco de transmisión de enfermedades tan importantes como la tuberculosis

(Gibbs et al., 1997).

1. Peligros potenciales para la salud humana.

Los jabalíes pueden albergar diversos patógenos causantes de zoonosis, lo cual

representa un peligro directo para los humanos. Virus como el Herpesvirus de

la hepatitis E (Sonoda et al., 2004; De Deus et al., 2008); parásitos como

Trichinella spp. (Henriksen et al., 1977) o Toxoplasma gondii (Clark et al.,

1983); y bacterias como Salmonella spp. (Pérez et al., 1999), Escherichia coli

(Rees TA., 1959) o micobaterias ubicadas dentro del Mycobacterium

tuberculosis complex (MTC) (Bollo et al., 2000) pueden ser transmitidas por

estos animales. En algunos casos, la adaptación del patógeno al ciclo biológico

del jabalí es espectacular. Sirva como ejemplo la alta prevalencia serológica de

Brucella suis biovar 2 (con frecuencia entre un 30 y un 60% de positivos) en

poblaciones españolas de jabalí, sin que sea apreciable un efecto negativo en

sus dinámicas (Risco et al., 2014). Igualmente, el jabalí es considerado el

reservorio salvaje más estable de la tuberculosis dentro de la Península Ibérica,

(Parra et al., 2003; Palmer MV., 2013) cuando hace apenas 26 años de las

primeras referencias de casos de tuberculosis en jabalíes de Doñana (León et

al., 1990). Dentro de las posibles modalidades de contagio de humanos

reseñaremos dos como las principales:

o Contagio indirecto en zonas contaminadas por excreciones de los

animales: en este caso, las superficies, materiales y el agua

contaminada por excreciones de jabalíes infectados serán las principales

vías de contagio para los humanos (Van Campen et al., 2010). Dentro

de esta vía de contagio existe el grupo de riesgo constituido por las

personas que viven en zonas limítrofes a los hábitats naturales de los

animales, que pueden sufrir la intrusión en zonas urbanas de jabalíes en


19

búsqueda de alimento o una fuente de agua. El jabalí, al expandir su

territorio, entraría en contacto con zonas urbanas, pudiendo contaminar

con patógenos dichas zonas y aumentando el riesgo de contagio (Casas

et al., 2008; González et al., 2013).

o Contagio directo por mordedura o traumatismo. Igualmente, en las

zonas periurbanas se registran cada vez más incidentes de contacto

directo, agresivo o no, pero con lesiones en personas, lo que implica

contagios directos traumáticos (Cahill et al., 2003).

o Aparte de las zonas urbanas, el contagio directo puede ocurrir también

con personas que entren en contacto directo con los animales o sus

cadáveres, como pueden ser los guardas de las fincas, los veterinarios o

los carniceros encargados del despiece (Massey et al., 2011), lo cual

constituye un riesgo ocupacional muy a tener en cuenta dentro de la

actividad tanto veterinaria como cinegética o de la industria cárnica.

o Contagio directo por consumo de carne contaminada por patógenos.

Contaminada sobre todo durante el proceso de elaboración, constituye

la principal vía de contagio directo de patógenos asociados al jabalí

hacia los humanos (Van Campen et al., 2010). Este riesgo de contagio

se debe a la propia actividad de faenado y recogida de las canales.

Dicho faenado, realizado por norma general al aire libre, y asociado al

tipo de muerte sufrida por el animal, puede propiciar la contaminación

de la canal. Las condiciones de este, así como las heridas sufridas por el

animal, pueden facilitar la contaminación de la canal por diversos

patógenos (Díaz-Sánchez et al., 2013). El mejor ejemplo lo constituyen

los disparos en la zona abdominal, que pueden contaminar ampliamente

la canal con enterobacterias, existiendo también mayores posibilidades

de que la calidad de la canal se vea alterada microbiológicamente

(Avagnina et al., 2012). Aparte de estos mecanismos de contagio, no

podemos olvidar comentar los riesgos de contagio directo por Trichinella

spp. debido al consumo de carnes que no han pasado la preceptiva

inspección veterinaria, algo inusual hoy en día en el mundo cinegético,

pero que sigue ocurriendo, a veces con funestas consecuencias.


20

2. Peligros potenciales para la sanidad animal en ganado doméstico.

Los jabalíes pueden actuar como reservorios de importantes patógenos que

pueden afectar a otras especies animales con las que comparten el hábitat.

Dentro de las bacterias patógenas descritas en el jabalí destacan

Mycobacterium bovis (Mclnerney et al., 1995; Parra et al., 2003), Brucella suis

(Wood et al., 1976; Vicente et al., 2002), Chlamydia suis (Hoetzel et al., 2004;

Risco et al., 2013), o Haemophilus parasuis (Olvera et al., 2007; Cuesta et al.,

2013). En lo referente a los virus, se han descrito algunos tan importantes

como el Circovirus Porcino Tipo 2 (PCV2) (Tischer et al., 1986; Vicente et al.,

2004), el virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS)

(Oslage et al., 1994; Boadella et al., 2012), el virus de la Peste Porcina Clasica

(PPC) (Wise G., 1981), el virus de la enfermedad de Aujezsky (ADV) (Clark et

al., 1983; Gortázar et al., 2002) o el virus de la Hepatitis E (Sonoda et al.,

2004; De Deus et al., 2008). Esta susceptibilidad a ser infectados por

patógenos comunes a otros animales, constituye el principal problema para la

sanidad animal asociado a los jabalíes. En el caso concreto de España, una

enfermedad en vías de erradicación como es la Tuberculosis dentro del ganado

doméstico, se ve ampliamente comprometida por el jabalí como reservorio

salvaje de la enfermedad (Hermoso de Mendoza et al., 2006). Dicha

enfermedad, en proceso de erradicación desde hace unos 50 años, todavía

presenta amplias zonas de alta prevalencia en la cabaña ganadera.

Los estudios epidemiológicos realizados nos permiten relacionar tres factores

fundamentales en esta situación: la prevalencia de tuberculosis en la cabaña

ganadera, la prevalencia de tuberculosis en el jabalí y la densidad de población

de los jabalíes. Las zonas de alta prevalencia de tuberculosis en la cabaña

ganadera coinciden con las zonas de mayor densidad de jabalíes; además la

alta prevalencia de tuberculosis en una población de jabalíes concreta es un

factor de riesgo para la aparición de brotes de la enfermedad en la cabaña

ganadera bovina próxima (Gortázar et al., 2005; Allepuz et al., 2011;

Rodríguez-Prieto et al., 2012).

La coexistencia de los jabalíes y ganado doméstico en las mismas zonas,

asociada a los hábitos del propio jabalí, como pueden ser la expansión en

búsqueda de alimento o la dispersión de grupos de machos, ponen de


21

manifiesto el riesgo potencial que supone la presencia de esta especie dentro

de las explotaciones. Esta situación se puede ver acentuada por diversos

factores, como puede ser la limitación de puntos de agua que favorezca la

concentración de los animales, o que los puntos de acceso a los recursos

alimenticios de las fincas estén ubicados en un mismo sitio o muy próximos, lo

que favorecerá el contagio directo entre los jabalíes y el ganado propio de la

finca (Boehm et al., 2007), y además, el indirecto por contacto con fómites y

excreciones potencialmente infectantes (Van Campen et al., 2010). Con todo

esto, y las propias limitaciones de los patógenos para causar contagio

(condiciones climáticas, vectores, fómites…), cada zona puede representar un

escenario de contagio completamente distinto, con un factor en común, la

presencia del jabalí como reservorio de enfermedad.

Por otra parte, en los últimos tiempos hemos podido encontrar la situación

contraria dentro de las poblaciones de jabalíes. Enfermedades relativamente

comunes que afectaban al cerdo doméstico, podrían empezar a ser habituales

en poblaciones de jabalíes salvajes. El desarrollo de enfermedades clínicas

como el Síndrome de Desmedro Postdestete (Lipej et al., 2007), la enfermedad

de Aujezsky (Gortázar et al., 2002) o la enfermedad de Glässer (Cuesta et al.,

2013) han sido descritas en jabalí recientemente. Este hecho indica dos cosas

fundamentales; que puede existir un contagio de los jabalíes con patógenos

procedentes de los cerdos domésticos, siendo dichos jabalíes susceptibles de

enfermedad; y que poco a poco los investigadores nos estamos centrando más

en la búsqueda de estos procesos morbosos dentro de las poblaciones salvajes.


22

3. Peligros potenciales para la sanidad animal en animales de vida libre.

Muchos de los agentes infecciosos que pueden afectar en mayor o menor

medida a los jabalíes pueden llegar a afectar a otras especies salvajes que

conviven en las mismas fincas. Por ejemplo y por ser uno de los procesos más

importantes dentro de nuestro ecosistema, ciervos o gamos son susceptibles de

padecer tuberculosis causada por Mycobacterium bovis, patógeno habitual en

los jabalíes (García-Jiménez et al., 2013). Al igual que en la cabaña ganadera,

la prevalencia de la tuberculosis dentro de las poblaciones de jabalíes está

íntimamente relacionada con su prevalencia dentro de las poblaciones salvajes

susceptibles que comparten dicho hábitat. De hecho, se ha comprobado que el

control de la población de jabalíes dentro de estas zonas ejerce una fuerte

influencia en los cambios en las prevalencias de esta enfermedad otros

artiodáctilos salvajes presentes en zonas controladas (García-Jiménez et al.,

2013)


23

Circovirus porcino

El circovirus porcino (PCV) es un virus del género Circovirus perteneciente a la familia

Circoviridae (Tischer et al., 1974, 1982, 1986), aislado por primera vez al ser detectado

como contaminante en cultivos celulares de PK-15. A finales de los 90, un circovirus

distinto al contaminante detectado en cultivos celulares, fue aislado en América del

Norte (Allan et al., 1995, 1998, 1999; Ellis et al., 1998). Este virus, asociado con

enfermedad en porcinos, fue designado como Circovirus Porcino Tipo 2 (PCV2);

mientras que el virus apatógeno detectado en los cultivos celulares fue denominado

Circovirus Porcino Tipo 1 (Allan et al., 1999). Recientemente, un nuevo circovirus

lejanamente relacionado con los descritos en porcino, ha sido detectado en cerdos

enfermos de Estados Unidos por distintos grupos de investigación (Palinski et al., 2016;

Phan et al., 2016), siendo denominado como Circovirus Porcino Tipo 3 (PCV3).

Posteriormente, ha sido identificado en China y su genoma ha sido secuenciado (Ku et

al,. 2017; Shen et al., 2017). Sin embargo, no se conocen más datos relevantes de

este nuevo virus y su implicación en procesos patológicos en situaciones distintas a los

brotes detectados es desconocida.

Estructura tridimensional del virión de PCV2. Podemos observar el detalle del capsómero.

Imágen de T. Kekarainen.


24

El PCV2 es un virus ADN monocatenario circular de 1767-1768 nucleótidos (PCV1 tiene

1759 nucleótidos); con una nucleocápside icosaédrica, no capsulada (Tischer et al.,

1982; Hamel et al., 1998; Meehan et al., 1998; Rodríguez-Cariño et al., 2009). Dicha

nucleocápside contiene 60 cápsides proteicas asociadas en pentámeros que protruyen

ligeramente, confiriendo al virión un tamaño total de 20.5 nm de diámetro (Crowther

et al., 2003).

Una vez el virión ha infectado la célula, la hebra monocatenaria de ADN es convertida

en una forma bicatenaria de ADN, conocida como Forma Replicativa (FR) (Mankertz et

al., 2004). Dicha FR posee información génica codificada en ambas hebras de ADN

(tanto la hebra viral como la complementaria).

Los genes de PCV2 están ubicados en 11 Marcos Abiertos de Lectura (Open Reading

Frames u ORFs) (Hamel et al., 1998), de cuya expresión proteica sólo han sido

descritos tres:

- ORF1 o Gen Rep: Codifica las proteínas de replicación Rep (314 aminoácidos) y

Rep’ (178 aminoácidos). Está ubicado en la hebra positiva (virión) en dirección

de las agujas del reloj (Mankertz et al., 1998; Cheung et al., 2003).

- ORF2 o Gen Cap: Codifica la cápside, que es la única proteína estructural de

PCV2 (233 aminoácidos). Está ubicada en la hebra complementaria en dirección

contraria a las agujas del reloj (Nawagitgul et al., 2000; Mankertz et al., 2004).

- ORF3: Codifica una proteína no estructural de 105 aminoácidos. Dicha proteína

ejerce efectos en los cultivos celulares, como la inducción de apoptosis en

células PK-15 (Liu et al., 2005). PCV2 mutantes que carecían de ORF3 han

demostrado ser menos virulentos, comparados con aquellos que sí

desarrollaban ORF3 (Karuppannan et al., 2009). Está ubicado en la hebra

complementaria en dirección contraria a las agujas del reloj, superponiéndose

de manera completa con el gen ORF1.


25

El estudio de las secuencias genómicas de PCV2 ha permitido clasificar la mayoría de

virus aislados en dos grupos principales denominados a y b (Gagnon et al., 2007;

Olvera et al., 2007; Grau-Roma et al., 2008; Segalés et al., 2008; Timmusk et al.,

2008). Las secuencias de nucleótidos analizados son idénticas en más de un 93%

(Mankertz et al., 2000; Larochelle et al., 2002), lo que demuestra una relación

filogenética muy cercana entre los virus aislados en todo el mundo.

Los dos genotipos probablemente surgieren que provienen de un antecesor común,

separándose y comenzando una evolución independiente hace unos 100 años mientras

circulaban conjuntamente dentro de las mismas poblaciones (Firth et al., 2009). Sin

embargo, PCV2a es genéticamente más variable que PCV2b, lo que sugiere una mayor

antigüedad del primero (Grau-Roma et al., 2008). Además, PCV2a es el genotipo que

presentó más prevalencia entre los animales afectados clínicamente durante los brotes

iniciales de la enfermedad (finales de los 90, principios del 2000), mientras que

actualmente es PCV2b el genotipo con mayores prevalencias. Este aumento en la

prevalencia de PCV2b ha estado asociado a cuadros más graves de enfermedad en

Europa y América del Norte (Carman et al., 2006; Timmusk et al., 2008; Wiederkehr et

al., 2009; Cortey et al., 2011).

Mediante estudios genómicos de material de archivo, un tercer genotipo denominado

PCV2c fue detectado en Dinamarca (Dupont et al., 2008; Segalés et al., 2008). Estos

genotipos o cepas del virus han sido detectados circulando conjuntamente por las

mismas poblaciones, siendo aislados en los mismos animales (Boisseson et al., 2004;

Cheung et al., 2007; Gagnon et al., 2007; Grau-Roma et al., 2008; Hesse et al., 2008).

Además, se ha demostrado la recombinación viral entre las cepas, tanto in vivo como

in vitro, por lo que la posibilidad de aparición de nuevas variantes genéticas es una

realidad, teniendo en cuenta la coexistencia de distintas cepas dentro del mismo

animal (Olvera et al., 2007; Hesse et al., 2008; Cheung et al., 2009; Lefebvre et al.,

2009). En 2010, fue detectado en Quebec un virus recombinante que poseía el ORF1

de PCV1 y el ORF2 de PCV2, aunque existen dudas de su procedencia por su parecido

con un virus quimérico de vacuna inactivada, por lo que el origen es incierto (Gagnon

et al., 2010).


26

Aunque existen varios genotipos, las similitudes en la reactividad contra anticuerpos

tanto monoclonales como policlonales parecían indicar que no existían diferencias

antigénicas entre ellos (Allan et al., 1999; McNeilly et al., 2001). Dicho postulado ha

sido considerado erróneo gracias a posteriores estudios, demostrando así que existe

variabilidad genética entre los distintos genotipos de PCV2 (Lefebvre et al., 2008;

Shang et al., 2009). La eficacia de las vacunas desarrolladas (a base de PCV2a), viene

dada por la inmunidad inducida tanto para ese genotipo como para el genotipo PCV2b,

lo que demuestra que existe inmunidad cruzada entre ambos (Fort et al., 2008;

Opriessnig et al., 2008).


27

Epidemiología de PCV2.

Tanto PCV1 como PCV2 son virus ubicuos que afectan a suidos domésticos y salvajes,

siendo la prevalencia del primero mucho menor que la del segundo (Calsamiglia et al.,

2001). Sin embargo, las demás especies (incluidos los humanos) no son susceptibles

de ser infectados (Allan et al., 2000; Ellis et al., 2001; Rodríguez-Arrioja et al., 2003), a

excepción de los ratones, entre los cuales el virus puede replicarse y trasmitirse de

manera limitada, siendo considerados como posibles vectores mecánicos de contagio

entre distintas explotaciones, o simplemente como hospedadores alternativos (Kiupel

et al., 2001; Opriessnig et al., 2009). De hecho, PCV2 ha sido aislado de ratones

procedentes de granjas de cerdos, confirmando así este peligro potencial (Lorincz et

al., 2010).

Viriones de PCV2 aislados de un cerdo afectado y visualizados mediante tinción negativa.

Fotografía: Diseases of Swine.

La principal vía de transmisión del virus es la vía oronasal, aunque ha sido detectado

en secreciones (nasales, tonsilares, bronquiales y oculares), así como en heces, orina,

semen, saliva, leche y calostro (Krakowka et al., 2000; Larochelle et al., 2000; Shibata

et al., 2003; Segalés et al., 2005; Shibata et al., 2006; Park et al., 2009). Otra vía de

infección puede ser la ingesta de carne cruda de cerdos virémicos (Opriessnig et al.,

2009), muy a tener en cuenta en jabalíes debido a su comportamiento carroñero.

Experimentalmente, animales en gestación inoculados por vía intranasal han

demostrado la posibilidad de una infección transplacentaria (Park et al., 2005; Ha et

al., 2008, 2009). En el caso de semen contaminado, los animales infectados presentan

fallos reproductivos, resultando infectados los fetos por el virus (Madson et al., 2009).

Sin embargo, no se conoce si la cantidad de virus presente en el semen de forma


28

natural puede ser suficiente para el desarrollo de ese cuadro reproductivo así como de

la infección fetal.

La transmisión del virus se produce principalmente al entrar en contacto animales

sanos con animales infectados por el virus (Kristensen et al., 2009). Los estudios

desarrollados en cuanto a contabilización de viriones en distintas muestras de cerdos

varían dependiendo de las granjas, no siendo aplicables a animales en estado salvaje,

cuyas pautas de comportamiento y contactos entre animales son completamente

distintas.

Los factores de riesgo de infección asociados a PCV2 han sido descritos en varios

estudios desarrollados en España, Reino Unido, Francia, Países Bajos y Dinamarca

(Rose et al., 2003; Wellenberg et al., 2004; López-Soria et al., 2005; Enoe et al., 2006;

Vigre et al., 2006; Woodbine et al., 2007). En ellos se determinaron varios factores de

riesgo que podrían aumentar la morbilidad de las explotaciones. Dentro de estos

factores, algunos son dependientes de la propia explotación, como puede ser la

presencia de otras afectadas cercanas, el tamaño de las mismas (mayores de 400

madres), seroprevalencias altas de PCV2, y los propios visitantes de la granja si no

tenían las medidas correctas de seguridad (3 días entre visita y visita de explotaciones

porcinas). Otros factores pueden estar relacionados con el manejo reproductivo de los

animales, como son las compras de grandes cantidades de hembras de reposición,

infecciones activas en hembras preñadas y la inseminación artificial con semen

procedente de la misma granja. Finalmente, existen factores derivados del manejo y

de los propios animales, como la infección o vacunación del Síndrome Respiratorio y

Reproductivo Porcino (PRRS) o la presencia de altas cantidades de anticuerpos frente a

PCV2 en los animales a término. También fueron identificados ciertos factores que

disminuyen las prevalencias de PCV2 dentro de las granjas, como pueden ser los altos

niveles de bioseguridad (cuarentena de animales comprados, cambios de ropa a la

entrada y salida o entregas de animales a término en salas especializadas), largos

periodos de descanso y vacío entre ciclos, tratamientos contra ectoparásitos y

vacunación frente a rinitis atrófica porcina.


29

Patogénesis

Circovirosis clínicas por PCV2.

Entre las infecciones clínicas causadas por PCV2 existen diversos síndromes

diferenciados, tanto en su expresión clínica como en sus consecuencias biológicas. Los

principales síndromes causados por PCV2 son los siguientes:

Síndrome del desmedro multisistémico postdestete o enfermedad sistémica por PCV2:

más conocido por sus siglas en inglés PMWS (Postweaning multisystemic wasting

síndrome). Ampliamente estudiado, este síndrome provoca en los animales una

pérdida de peso, ligada a un déficit en su crecimiento así como en su tasa de

conversión. Aparte de la evidente pérdida de peso, los animales pueden presentar

palidez, dificultad en la respiración, diarrea y en menor medida ictericia (Harding et al.,

1997; Rosell et al., 1999; Krakowka et al., 2004). En las primeras etapas del síndrome,

los linfonodos inguinales pueden estar muy aumentados de tamaño, siendo muy

característico de esta enfermedad (Clark et al., 1997; Rosell et al., 1999). Además, los

animales pueden presentar depleción marcada en los tejidos linfoides, así como

inflamación de tipo granulomatoso en otros tejidos. La morbilidad en las granjas de

suinos afectadas varía entre el 4-30% de los animales, siendo su mortalidad de 4-20%

(Segalés et al., 2002). Sin embargo, no existen datos sobre morbilidad o mortalidad en

jabalí, principalmente debido a su condición de especie salvaje y la imposibilidad de

tomar datos de manera fiable en condiciones de campo. Dentro de los cuadros clínicos

causados por el virus, el PMWS es considerado el de mayor importancia, debido

principalmente a su morbilidad, mortalidad y pérdidas económicas asociadas en todas

las partes del mundo, siendo Europa y Asia zonas endémicas con formas epidémicas,

mientras en América del norte lo más común son las formas esporádicas de

presentación.


30

Neumonía proliferativa necrotizante (NPN) o enfermedad pulmonar por PCV2: los

animales afectados por este síndrome presentan como principal manifestación clínica la

dificultad respiratoria y signos asociados (Harms et al., 2002; Kim et al., 2003). Estos

signos respiratorios se deben a lesiones en pulmón, que son principalmente neumonía

broncointersticial, fibrosis o fibroplasia peribronquiolar, y bronquiolitis ulcerativa o

neumonía proliferativa necrotizante, pero sin lesiones asociadas en tejido linfoide (a

diferencia de lo observado en el PMWS). Además, debemos tener en cuenta que PCV2

es un patógeno considerado como causante potencial del Complejo Respiratorio

Porcino o CRP (Kim et al., 2003; Hansen et al., 2010).

Enteritis o enfermedad entérica asociada a PCV2: el signo principal de este síndrome

es diarrea, causada principalmente por una enteritis de tipo granulomatoso con

depleción linfocítica unida a una inflamación granulomatosa en Placas de Peyer (Kim et

al., 2004; Opriessnig et al., 2007). En estos casos, debemos tener en consideración la

posible superposición de este síndrome con el de NPN, y distinguirlo del PMWS

(Opriessnig et al., 2007).

Fallo reproductivo asociado a PCV2 o enfermedad reproductiva por PCV2: los animales

afectados por este síndrome presentan problemas reproductivos al ser infectados a

finales de gestación, cursando con abortos y momificación (West et al., 1999; Madson

et al., 2009). En el caso de los abortos, los fetos pueden presentar miocarditis

necrotizante. Sin embargo, es raro que se den estas circunstancias de abortos, al

menos en condiciones de campo (Pensaert et al., 2004), teniendo en cuenta las

seroprevalencias de la enfermedad dentro de las granjas, ya que los animales

reproductores es difícil que sufran la enfermedad clínica, debido principalmente a

desarrollar inmunidad por una infección previa. Sin embargo, esta circunstancia puede

cambiar en el caso de animales de reposición introducidos, sin contacto previo con el

virus (West et al., 1999; Opriessnig et al., 2007; Togashi et al., 2011). Aunque existen

evidencias de reproductores subclínicos (Larochelle et al., 2000; McIntosh et al., 2006;

Madson et al., 2008), los niveles de virus detectados en animales experimentales y la

cantidad de virus presente en el semen parecen no ser suficientes para provocar la

infección fetal, seroconversión de la hembra o el desarrollo del fallo reproductivo como

tal (Madson et al., 2009).


31

Síndrome de nefropatía y dermatitis porcina (Porcine dermatitis and nephropathy

síndrome, PDNS): este síndrome muestra como signo más obvio la presencia de

máculas o pápulas de un color rojizo o violeta, con una forma irregular. Dichas máculas

se distribuyen en el animal, de manera primaria en el periné y en las extremidades

traseras, aunque también se pueden dar de manera generalizada. Evolucionan

generando costras, que posteriormente se desprenden dejando cicatrices (Segalés et

al., 1998; Drolet et al., 1999). Los animales afectados pueden ser de cualquier edad,

presentando anorexia y depresión, y en raras ocasiones cuadros de fiebre (Drolet et

al., 1999). La mortalidad en este síndrome puede variar en función de la edad de los

afectados, siendo aproximadamente de un 50% en animales menores de 3 meses,

ascendiendo al 100% en aquellos que superan esta edad, muriendo a los pocos días

del inicio de los signos clínicos. Los individuos que se recuperan del cuadro comienzan

a ganar peso a la semana de superar el síndrome (Segalés et al., 1998).


32

Circovirosis subclínicas por PCV2

La forma subclínica de infección es la manifestación más común de la infección por

PCV2. La primera evidencia de infección por PCV2 se describió en Alemania en 1962

(Jacobsen et al., 2009); sin embargo, el primer diagnóstico retrospectivo de PMWS fue

a mediados de los 80 (Rodríguez-Arrioja et al., 2003; Jacobsen et al., 2009). Esta

diferencia de fechas establece la importancia de la situación subclínica de este virus.

Aunque los animales no muestran signos clínicos como tal, la vacunación sistemática

frente a PCV2 ha conseguido avances productivos muy importantes, mejorando la

mayoría de parámetros asociados a producción en zonas de altas prevalencias del virus

(Young et al., 2011). Además, estas infecciones subclínicas pueden tener mucha

importancia en concomitancia con otros patógenos presentes en el animal o con los

que pueda tener contacto, debido principalmente a la interacción del virus con el

sistema inmune del portador, comprometiendo así la salud del animal.

Entre las interacciones del virus con el sistema inmune del animal, las que están más

ampliamente estudiadas son las relativas a animales afectados por PMWS, afectando a

órganos linfoides y a diversos factores de la respuesta inmune innata y adquirida,

afectando principalmente a células presentadoras de antígenos y a la expresión de

citoquinas (Darwich et al., 2012).

1. Afección de órganos linfoides

La depleción linfoide es uno de los principales factores de patogenicidad dentro de la

infección por PCV2, principalmente en el desarrollo del PMWS (Morozov et al., 1998;

Allan et al., 1999; Ellis et al., 1999; Rosell et al., 1999; Kennedy et al., 2000; Krakowka

et al., 2002). En linfonodos afectados por PMWS existe una pérdida de arquitectura,

con depleción de linfocitos B, T y NK (Shibahara et al., 2000; Quintana et al., 2001;

Darwich et al., 2002; Nielsen et al., 2003). En etapas más avanzadas sucede una

proliferación de tejido estromal, con un aumento del número de neutrófilos,

principalmente debidos a la propia reacción inflamatoria (Sarli et al., 2001; Chianini et

al., 2003). En cuanto a la sangre periférica, las proporciones relativas de neutrófilos y

linfocitos están invertidas respecto a animales sanos (Darwich et al., 2002).


33

Además de la destrucción primaria de los órganos linfoides, existe una afección linfoide

asociada a la propia replicación del virus. PCV2 puede ser encontrado en monocitos y

macrófagos (Allan et al., 1994) así como en linfocitos (Morozov et al., 1998). En

estudios experimentales se ha observado en linfocitos CD4+ y CD8+ a los 10 días post

inoculación (Sánchez et al., 2004).

Para determinar qué células eran las que soportaban la replicación viral de forma

mayoritaria, se desarrollaron estudios de cuantificación de ARNm del ORF2. Destacaron

altos niveles de este en linfocitos T y B, indicativos de su importancia como principales

líneas celulares donde el virus se replica (Yu et al., 2007). Además, se ha demostrado

que la replicación de PCV2 puede provocar la lisis de las células infectadas (Rodríguez-

Cariño et al., 2011), agravando así la inmunodeficiencia del animal portador.

La última vía estudiada para explicar la depleción linfoide es la producción de

apoptosis, inducida por el virus o por citoquinas asociadas. Estudios previos sugieren

que PCV puede inducir la apoptosis de los linfocitos B (Shibahara et al., 2000), incluso

en modelos murinos (Kiupel et al., 2001, 2005). Sin embargo, los mecanismos

concretos de inducción de apoptosis no están completamente esclarecidos.

2. Efectos de PCV2 sobre las células presentadoras de antígenos

PCV2 se encuentra comúnmente asociado a células de la línea monocítica-macrofágica

así como a células dendríticas, pero parece que este tipo de células no son eficaces

como células objetivo en la replicación vírica (Gilpin et al., 2003; Vincent et al., 2003,

2005; Chang et al., 2006; Pérez-Martín et al., 2007; Steine et al., 2008). Sin embargo,

en las células dendríticas el virus puede permanecer sin sufrir daño durante días, lo

cual indica que puede utilizar dichas células como un mecanismo de transmisión y

diseminación (Vincent et al., 2003). La baja actividad replicativa de PCV2 dentro de los

macrófagos y la falta de replicación en células dendríticas nos ha hecho asumir que su

presencia dentro de estas células se debe principalmente a los procesos de fagocitosis

de las mismas más que a una infección activa por parte del virus (Vincent et al., 2003;

Steiner et al., 2008; Kekarainen et al., 2010).

La presencia del virus en macrófagos parece inducir una respuesta alterada en este

tipo celular, reduciendo su capacidad de fagocitosis o alterando la producción de

sustancias tales como TNF-α, INF-γ o IL-8 en el caso de macrófagos alveolares (Chang


34

et al., 2006). Todos estos factores son de importancia dentro del contexto del

reconocimiento de patógenos, comprometiendo la activación inicial de las propias

células dendríticas y con ello la propia presentación antigénica (Takeda et al., 2003).

Entre los elementos virales involucrados en estos procesos de inmunomodulación

causada por el virus, se ha demostrado que la proteína capsular no influye de manera

negativa en la respuesta monocitaria o de las células dendríticas (Kekarainen et al.,

2008), mientras que el ADN viral sí que altera esa respuesta, afectando además a los

patrones de citoquinas expresadas en tejidos y sangre periférica (Hasslung et al.,

2003; Vincent et al., 2005, 2007; Wikström et al., 2007; Kekarainen et al., 2010;

Wikström et al., 2011).

3. Efectos del PCV2 en la producción de citoquinas en tejidos y sangre periférica.

Los estudios de patrones de citoquinas realizados en animales afectados por PMWS en

tejidos y sangre periférica han demostrado que el aumento de la expresión de IL-10 es

un hallazgo habitual (Darwich et al., 2003; Kim et al., 2004; Sipos et al., 2004; Doster

et al., 2010). Se ha comprobado que la expresión de IL-10 en el linfonodo se localiza

principalmente en áreas ricas en linfocitos de tipo T, en contraposición con zonas ricas

en linfocitos de tipo B y macrófagos que presentaron una menor expresión (Doster et

al., 2010). En cuanto a los estudios en bazo, la expresión alta de IL-10 estaba asociada

a subpoblaciones CD163+, CD4+ y CD8+ (Crisci et al., 2010). Esta respuesta asociada

a IL-10 ha sido demostrada con el virus íntegro, no siendo encontrada en

experimentos con las proteínas CAP o REP de forma exclusiva (Fort et al., 2009; Crisci

et al., 2010).

Además de afectar a la IL-10, PCV2 puede inducir una respuesta exacerbada en la

producción de IL-1β e IL-8, tanto en animales indemnes, es decir que no han

presentado contacto previo con el patógeno, como en animales ya infectados (Darwich

et al., 2003), asociada al carácter crónico de las infecciones causadas por este virus.

En pulmones de animales afectados por PCV2 se detectaron niveles altos de IL-1α e IL-

8 mientras que no existió expresión de IL-10, lo que sería de esperar en casos de

neumonía intersticial crónica, con un aumento de interleucinas de carácter

proinflamatorio y poca o nula expresión de interleucinas de carácter antiinflamatorio

(Chae et al., 2010).


35

Por último, los animales infectados poseen menos capacidad de producción de IL-2, IL-

4 e IFN-γ después de la estimulación antigénica, en comparación con cerdos sanos

(Darwich et al., 2003), lo cual indica una respuesta alterada en cuanto a la acción de

los linfocitos. Sin embargo, la causa de esta alteración en la expresión de citoquinas

todavía no ha sido clarificada, siendo la única causa real de la disminución de las

citoquinas secretadas por los linfocitos T la propia depleción linfoide asociada a la

infección por el virus y el desarrollo de alguno de los síndromes asociados.

Con todas estas expresiones clínicas y subclínicas de la infección viral, podemos

discernir dos ámbitos completamente diferenciados de enfermedad o de consecuencias

de infección. En el primer ámbito se encuentra el cerdo doméstico, con explotaciones

de producción en su mayoría intensiva, en la que tendría una importancia mucho más

amplia la infección de tipo clínico y las enormes pérdidas económicas asociadas a

estas. En este caso, la vacunación sistemática de los animales ha disminuido de

manera considerable la presentación de casos clínicos, con el consecuente control de la

enfermedad y la mejora de las ganancias económicas de las explotaciones.

En el segundo ámbito situaríamos a los jabalíes, animales de vida libre. En ellos, los

casos de enfermedad clínica serían difíciles de observar, ya que la mortalidad de

animales jóvenes en estado salvaje es difícilmente observable, cuantificable y

valorable, con la excepción de fincas cerradas con un eficaz sistema de vigilancia y

monitorización de los individuos. Sin embargo, las infecciones subclínicas causadas por

PCV2 pueden tener ciertas repercusiones sobre la patología del jabalí, principalmente

derivadas de la inmunosupresión causada por el virus asociada a enfermedades

concomitantes en el animal adulto. Dentro de estas enfermedades concomitantes,

podemos destacar la tuberculosis como enfermedad más importante, tanto

económicamente como sanitariamente, así como otras infecciones de carácter

respiratorio que pueden influir en el desarrollo de lesiones o patologías pulmonares.


36

Medidas de control de PCV2

Debido al carácter ubicuo del patógeno, y los porcentajes de prevalencia presentes en

la mayoría de explotaciones a nivel mundial, el control de la enfermedad se centra

principalmente en la profilaxis vacunal de las explotaciones. Existen numerosas

vacunas comerciales, la mayoría basadas en cepas de PCV2a inactivadas, aunque

existe una vacuna quimera PCV1-2, no disponible en nuestro país. El éxito de la

vacunación frente al virus viene dado principalmente por la activación de la respuesta

tanto humoral como celular frente al virus (Kekarainen et al., 2010). Esta activación

humoral y celular se corresponde con una protección activa y efectiva frente al virus en

primoinfecciones, y con mejoras clínicas en animales enfermos. Además, el uso de

estas dentro de explotaciones afectadas conlleva una mejora de la ganancia media

diaria de los animales (Kristensen et al., 2011), incluso en granjas con brotes

subclínicos de la enfermedad.


37

Tuberculosis y Complejo Mycobacterium

tuberculosis (CMTB)

La tuberculosis es una enfermedad causada por las bacterias pertenecientes al

denominado Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), las pertenecientes al

Complejo Mycobacterium avium (CMA) y algunas otras especies de micobacterias

(Thoen et al. 1975). Sin embargo, en el caso de los jabalíes, las principales

micobacterias implicadas en el cuadro pertenecen al CMTB (García-Jiménez et al.,

2012).

Esta enfermedad es de un carácter crónico consuntivo que puede afectar a gran

variedad de animales, cuyo desarrollo dentro del animal derivará en gran medida de la

capacidad de defensa del hospedador, así como de la capacidad del bacilo acido –

alcohol resistente para superar esas defensas. Aunque la micobacteria debe hacer

frente tanto a la defensa de carácter humoral como a la desarrollada por los

granulocitos en los tejidos, el mecanismo de defensa más efectivo del hospedador

frente al agente infectivo es el desarrollado por el complejo mononuclear fagocítico,

siendo los macrógafos activados la forma celular de defensa más patente y efectiva.

Dicho carácter crónico de la enfermedad, asociada a la gran cantidad de hospedadores

susceptibles de padecer la enfermedad, le confiere una alta persistencia dentro de las

poblaciones creando reservorios, así como una capacidad de diseminación alta en el

medio, pudiendo afectar a otras poblaciones que compartan el mismo hábitat. En

zonas donde la tuberculosis en el ganado bovino ha sido erradicada o persiste de

manera mínima, como pueden ser Estados Unidos o Canadá, la infección por M. bovis

en cerdos domésticos no es nada común (Margolis et al., 1994). Sin embargo, en

zonas como la nuestra, donde la tuberculosis ha pasado a ser una enfermedad

endémica en fauna salvaje, la infección por M. bovis supone un grave riesgo tanto para

la ganadería como para los humanos por su evidente aspecto zoonótico, así como de

aspecto económico, ya que produce elevadas pérdidas dentro del sector ganadero.


38

De la importancia clínica, zoonótica y económica de la enfermedad viene dada la

importancia en el control y posible erradicación de ésta. Para ello, se llevan a cabo

saneamientos sistemáticos en las ganaderías bovinas así como en las caprinas. Dichos

saneamientos conllevan la eliminación de los animales infectados con el fin de una

completa erradicación de la enfermedad. Sin embargo, estás medidas oficiales no

tienen en cuenta uno de los principales problemas existentes en nuestro país, la

convivencia de dichas ganaderías con reservorios salvajes estables, como pueden ser

los jabalíes, y, en menor medida, con especies de cérvidos. Estos reservorios salvajes

representan uno de los grandes escollos para la erradicación de la enfermedad en la

Península Ibérica, existiendo elevadas prevalencias dentro de las poblaciones de

jabalíes (Parra et al., 2003), y por tanto, elevada probabilidad de contacto con

ganadería doméstica. Este problema además, puede estar agravado por el estatus

sanitario de los animales reservorio, siendo un problema incipiente en el caso de las

coinfecciones que pueden estar presentes en ellos, empeorando el cuadro

epidemiológico presente en la zona (Risco et al., 2014).

Mycobacterium bovis en linfonodo. Tinción Ziehl Neelsen.

Una vez tenido en cuenta la problemática existente entre el carácter crónico de la

enfermedad, la existencia de reservorios salvajes en el ecosistema y el agravante de

las coinfecciones, nos podemos hacer una idea de la magnitud que puede alcanzar

tanto a nivel sanitario como a nivel económico, en el caso de que las medidas de

control y erradicación no surtan efecto en nuestra población susceptible.


39

Complejo Mycobacterium Tuberculosis

El denominado Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) es un grupo que incluye

a todas las especies de bacterias causantes de la tuberculosis humana y animal. En él

se incluyen varias bacterias del género Mycobacterium y un par de bacterias bacilares

que son consideradas como similares a éste.

Bacterias pertenecientes al CMTB

- Género Mycobacterium

o M. africanum (Castets et al., 1969)

o M. bovis (Karlson et al., 1970)

o M. bovis variedad BCG (Grange et al., 1983)

o M. canetti (Van Soolingen et al., 1997)

o M. caprae (Aranaz et al., 2003)

o M. microti (Reed et al., 1957)

o M. pinnipedii (Cousins et al., 2003)

o M. tuberculosis (Koch et al., 1882)

o M. orygis (Van Ingen et al., 2012)

o M. mungi (Alexander et al., 2010)

o M. suricattae (Parsons et al., 2013; Dippenaar et al., 2015)

o Casos singulares

Bacilo de Dassie (Wagner et al., 1958)

Bacilo del Oryx (Lomme et al., 1976)

Todas estas especies están muy íntimamente relacionadas entre ellas desde el punto

de vista genético, con una similitud entre sus nucleótidos de un 99,9%, por lo que en

la actualidad se han desarrollado técnicas moleculares de identificación del genoma

con el fin de identificar de manera fiable a las bacterias, desechando para ellos las

pruebas bioquímicas o fenotípicas (Böddinghaus et al., 1990; Sreevatsan et al., 1996;

Huard et al., 2006; Behr et al., 2007; Romero et al., 2008).


40

Dentro de todo el complejo las principales causantes de la tuberculosis en el jabalí son

M. bovis y M. caprae (García-Jiménez et al., 2012). Ambas especies han sido descritas

en diversos animales, tanto domésticos como salvajes.

- Hospedadores confirmados de M. bovis

o Domésticos

Bovino (Smith et al., 1898; Karlson et al., 1970)

Caballo (Monreal et al., 2001; Keck et al., 2010)

Cabra (Cousins et al., 1993; Crawshaw et al., 2008; Cadmus et

al., 2009; Hiko et al., 2011)

Cerdo (Parra et al., 2003; Rodríguez et al., 2009; Barandiaran et

al., 2011)

Gato (Aranaz et al., 1996; Fenton et al., 2010)

Perro (Ellis et al., 2006)

o Dentro de los hospedadores confirmados presentes en España podemos

destacar:

Ciervo, gamo, jabalí, liebre, lince, primates, tejón y zorro

(Gallagher et al., 2000; Aranaz et al., 2004; O’Brien et al., 2004;

Corner et al., 2006; Une et al., 2007; Balseiro et al., 2011)


41

Lesión histológica de la tuberculosis en jabalí: el granuloma

tuberculoso

El granuloma tuberculoso es la lesión característica de la tuberculosis. Dicha lesión

proviene de la tendencia del organismo hospedador a controlar y focalizar la infección,

como resultado de una estimulación antigénica crónica (Fuller et al., 2003). Este

intento de focalizar la infección cursa con una acumulación local de células de carácter

inflamatorio, entre las cuales podemos destacar las células gigantes multinucleadas

(CGMNs), linfocitos (principalmente linfocitos T CD4+ y CD8+), macrófagos y

macrófagos epitelioides (González-Juarrero et al., 2001; Fuller et al., 2003).

Diversos estudios han descrito los estadios, fases o etapas del desarrollo lesional

dentro del granuloma tuberculoso en infecciones experimentales de M. tuberculosis en

roedores (Rhoades et al., 1997; González-Juarrero et al., 2001). En 2005, mediante un

estudio similar de infección experimental en bovinos por M. bovis se describió la

evolución del granuloma en cuatro etapas o estadios distintos, caracterizados por

cambios concretos a nivel histológico (Wangoo et al., 2005).


42

Etapas o Estadio de Desarrollo del Granuloma según Wangoo y cols. (2005):

Estadio I: También denominado estadio “inicial”. En él encontramos una concreción de

macrófagos de tipo epitelioide, junto con algunos linfocitos y en menor medida

presencia de neutrófilos. En esta fase podemos observar la presencia de algunas

Células Gigantes MonoNucleadas (CGMNs), no existiendo todavía una capsula fibrosa

delimitante.

Estadio II: También denominado estadio “sólido”. En esta fase el granuloma está

delimitado parcial o totalmente por una cápsula de tejido conectivo, estando

compuesto principalmente por macrófagos epitelioides. La infiltración celular dentro del

granuloma va creciendo, observándose una mayor presencia de CGMNs, linfocitos y

neutrófilos. En ocasiones se pueden observar pequeños focos de necrosis de escasa

importancia.

Estadio III: También denominado estadio “asociado a necrosis”. En estos granulomas

la cápsula fibrosa ya es completa y de mayor entidad, con una gran presencia de

caseum en la zona central derivada de una extensa necrosis. En la periferia de esta

zona caseificada encontramos CGMNs, y en la periferia de todo una población celular

conformada principalmente por linfocitos, neutrófilos y gran cantidad de macrófagos

que se extienden hasta la propia cápsula de tejido conectivo. En ocasiones en la zona

de caseum podemos encontrar una ligera calcificación central de escasa entidad.

Estadio IV: También denominado estadio “calcificado” o “mineralizado”. En este

estadio final, el granuloma está caracterizado por la presencia de uno o varios focos de

necrosis caseosa con gran presencia de calcificación o mineralización de la lesión.

Dicha mineralización en ocasiones puede llegar a ocupar la totalidad de la lesión.

Alrededor de la zona de mineralización, nos encontraremos agrupaciones de CGMNs y

macrófagos epitelioides, así como otras linfocitarias que se extenderán hasta la

periferia, conformada por la cápsula de tejido conectivo, que en función del

hospedador en el que nos encontremos puede encontrarse mejor o peor delimitada.


43

Estadios del granuloma tuberculoso. A: Estadio I o Inicial. B: Estadio II o Sólido. C: Estadio III o

Asociado a Necrosis. D: Estadio IV o Calcificado.

Dichos estadios o etapas descritos se adaptan perfectamente a la evolución del

desarrollo lesional del granuloma tuberculoso en el jabalí. Además, dentro de estas

etapas de desarrollo podemos distinguir 2 grupos epidemiológicos concretos: los

animales de alto riesgo epidemiológico o animales excretores, que presentan un mayor

riesgo de diseminación de la bacteria al medio ambiente y que se corresponden con los

animales que desarrollan granulomas de tipo I y II; y los animales de bajo riesgo

epidemiológico, que presentan un desarrollo principal de granulomas de tipo III y IV,

microbiológicamente menos activos y en consecuencia con un riesgo menor de

excreción al medio ambiente (Phillips et al., 2003).

La formación del granuloma y el desarrollo o contención de la infección por bacterias

del CMTB viene conferida por la respuesta inmune del hospedador, tanto innata como

adquirida.


44

Respuesta inmune innata

Respuesta no específica del hospedador ante un agente patógeno. En el caso de la

tuberculosis animal, la especie más representada en los estudios de respuesta innata

ante la tuberculosis es el ganado bovino (Pollock et al., 2002). Una vez la micobacteria

penetra en el organismo, la célula de defensa más importante es el macrófago, ya que

es el tipo celular encargado de la respuesta en el primer contacto. El macrófago es la

principal célula dentro de las que tienen capacidad fagocítica y dentro del grupo de las

células presentadoras de antígenos (CPA).

La acción primaria de los macrófagos, asociada a la fagocitosis y la digestión de las

bacterias mediante fagolisosomas, puede ser efectiva o no (Van Crevel et al., 2002).

Dependiendo de los factores asociados a la bacteria y al hospedador, la acción de los

fagolisosomas puede destruir a la bacteria y por lo tanto proteger eficazmente al

hospedador. Pero, en otras circunstancias, la micobacteria puede sobrevivir a la acción

del macrófago, consiguiendo reproducirse en su interior hasta conseguir la lisis de la

célula infectada (Ulrichs et al., 2003). Este suceso provoca una reacción en cadena,

acudiendo un mayor número de macrófagos y otras CPA como monocitos y células

dendríticas, en los cuales la micobacteria continuará su multiplicación, extendiéndose

por el organismo. La falta de éxito en la destrucción de las micobacterias por parte de

los fagolisosomas resulta de la capacidad de las micobacterias para impedir la unión

del lisosoma y el fagosoma, gracias a la presencia de sulfátidos en los bacilos (Gordon

et al., 1980; Raja et al., 2004).


45

En menor medida, la respuesta innata celular deriva de los neutrófilos y las células

natural killer o NK. En el caso de los neutrófilos, su acción de defensa es doble. Por

una parte tienen capacidad fagocítica, de menor entidad que la desarrollada por los

macrófagos y asociada a gránulos y no a lisosomas; y por otro son las células de

primera respuesta ante la quimiotaxis ejercida por las citoquinas segregadas por los

propios macrófagos y los linfocitos T (Johnson et al., 2006; Korbel et al., 2008). Las

células NK también poseen una doble acción ante las micobacterias. Por una parte

provocan la lisis de las células infectadas y del propio patógeno, contribuyendo a la

activación de los macrófagos; por otra parte tienen capacidad de síntesis de INF-γ, que

es un estimulante de la actividad macrofágica (Molloy et al., 1993). La falta de acción

de las células de tipo NK ha sido asociada a la presencia de tuberculosis

multirresistente, lo que nos indica la importancia de estas células en el sistema de

defensa del hospedador ante una infección primaria (Ratcliffe et al., 1994).


46

Respuesta inmune adquirida

En ella podemos distinguir dos tipos de respuesta claramente diferenciadas:

Respuesta inmune adquirida de base celular

Se basa en una interacción efectiva entre las diversas CPAs del organismo y los

linfocitos T, tanto CD4+ como CD8+ (Van Crevel et al., 2002).

Mientras los linfocitos T CD8+ se encargan principalmente de la lisis tanto del propio

microorganismo como de las células infectadas, dentro de las dos poblaciones

específicas de linfocitos T CD4+ debemos distinguir entre la acción de los linfocitos Th1

y los Th2. Los linfocitos Th1 son los encargados de promover la actividad macrofágica

mediante la secreción de citoquinas proinflamatorias tales como el INF-γ., siento estos

la principal población celular productora de esta citoquina (Tsukaguchi et al., 1995).

Por otra parte, los linfocitos Th2 son productores de citoquinas de carácter

antiinflamatorio, como pueden ser la IL-10 o IL-4, que reducen la actividad de los

macrófagos, desviando la respuesta de defensa a una respuesta de tipo humoral, que

favorece la diseminación de la micobacteria y el progreso del cuadro patológico.

Además, incrementan la producción de eosinófilos y mastocitos, elevando la

producción de inmunoglobulinas como la IgE y respondiendo ante antígenos

presentados por los linfocitos B (Wangoo et al., 2001). Estos hechos nos hacen

confirmar que el equilibrio o balance entre Th1 y Th2 es determinante en la evolución

de la infección en el hospedador (Surcel et al., 1994; Pollock et al., 2002, 2005, 2006).

La presentación de antígenos por parte de las CPAs se produce mediante dos

Complejos Mayores de Histocompatibilidad (CMH). El CMH-I, es el encargado de la

presentación de antígenos hacia los linfocitos T CD8+, desencadenando su acción

citolítica. Por otra parte, el CMH-II presente en la superficie de células dendríticas y

macrófagos se encarga de la presentación antigénica ante los linfocitos T CD4+

desencadenando la acción Th1 y Th2. Esto determina que una mayor expresión de

CMH implica una mayor activación de las acciones de los linfocitos T CD4+ y CD8+, y

una mayor protección ante la micobacteria. Esta expresión de los CMH viene regulada

en gran medida por la presencia de citoquinas, dado que la presencia de citoquinas

antiinflamatorias, como pueden ser la IL-4 o la IL-10, disminuye dicha expresión

(Gercken et al., 1994). El equilibrio entre las citoquinas puede ser modificado tanto por

la propia micobacteria como por la acción de las CPAs. Mientras la micobacteria induce


47

la estimulación de citoquinas antiinflamatorias, las CPAs producen citoquinas de perfil

de activación Th1, lo que genera un estado de competición entre el patógeno y una

respuesta inmune efectiva.

Esta acción de las citoquinas producidas puede tener también efectos a nivel de

diferenciación celular. En el caso de la diferenciación Th1/Th2, la influencia de las

citoquinas es clara y ha sido demostrada ampliamente. Cuando un linfocito CD4+ se

encuentra bajo presencia de citoquinas proinflamatorias como pueden ser el IFN-γ o la

IL-12, se produce una tendencia a la diferenciación hacia linfocitos Th1, que confieren

una mayor protección frente a la micobacteria. Por el contrario, la presencia de una

citoquina antiinflamatoria como la IL-4 hace que exista una tendencia a la

diferenciación hacia linfocitos Th2, derivando hacia una respuesta humoral menos

efectiva.

En síntesis, la respuesta inmune eficaz ante la infección por micobacterias viene

determinada por una acción mayoritariamente Th1, promovida por las citoquinas

antiinflamatorias y promotora de una actividad macrofágica mayor y más efectiva. Esto

conllevará un control y eliminación parcial de la bacteria, quedando en parte

acantonada en algunas CPAs, no existiendo progreso de enfermedad, excepto en

episodios de inmunosupresión, en los que puede ser reactivada.


48

Respuesta inmune adquirida de base humoral

Como ya hemos dicho anteriormente, esta inmunidad humoral viene determinada por

una respuesta inicial de tipo Th2, que provoca una disminución de la actividad de los

macrófagos desviando la acción hacia una subida en la actividad de los linfocitos B y

diferenciación en células plasmáticas productoras de anticuerpos. Todo esto viene

dado por un ambiente en el hospedador con predominio de citoquinas antiinflamatorias

cuando ocurre el reconocimiento de los antígenos por parte de los linfocitos CD4+.

Como en todas las respuestas de carácter humoral, la IgM es la primera

inmunoglobulina en detectarse en caso de respuesta frente al antígeno, mientras que

la IgG tarda más en ejercer su acción, por lo que el patrón IgM/IgG nos puede indicar

si la infección es relativamente reciente o por el contrario se encuentra ya en fase

avanzada. Además, los patrones de inmunoglobulinas presentes aportan otras

informaciones, como puede ser la asociación entre los animales con lesiones graves y

la presencia de niveles altos de IgA e IgG; o la baja expresión de IgG en animales de

edad avanzada, asociada a una mayor susceptibilidad de este tipo de animales.

Por norma general, la respuesta humoral ante la tuberculosis parece tener una acción

limitada, confiriendo el papel protagonista a la inmunidad de carácter celular (Glatman-

Freedman et al., 2000). Además, está relacionada con la carga antigénica o dosis

infectiva, lo que condicionará la intensidad de la respuesta humoral, asociada también

a la especificidad de los anticuerpos generados. Sin embargo, la expresión de

inmunoglobulinas del hospedador nos puede ofrecer gran cantidad de información

estudiando su patrón de expresión, distinguiendo entre infecciones recientes o crónicas

o incluso entre animales que presentan ya lesiones graves.


49

Evolución de los patrones lesionales asociados a tuberculosis

Por norma general, la infección por micobacterias del CMTB consta de dos fases o

periodos diferenciados una vez llega a provocar una infección efectiva, a saber, fase

primaria y fase secundaria.

En la fase primaria, la micobacteria ha penetrado en el organismo superando las

barreras iniciales de defensa y conformando un foco infeccioso primario en un órgano

diana. A este foco acuden los macrófagos como mecanismo de defensa celular,

fagocitando a la micobacteria y dirigiéndose a los linfonodos regionales por vía

linfática. Una vez en el linfonodo, se materializa el denominado complejo primario,

quedando contenida en aquél la infección o formándose nuevas lesiones. En el caso

del jabalí, los complejos primarios más comunes son la lesión pulmonar y los

linfonodos mediastínicos afectados en caso de contagio oronasal; o la lesión intestinal

y linfonodos mesentéricos afectados en caso de contagio por consumo de carroña

infectada (Gortázar et al., 2008; García-Jiménez et al., 2013). Si las defensas del

hospedador son capaces de resolver con éxito la infección en el órgano diana, las

lesiones se limitarán a los linfonodos regionales creándose un complejo primario

incompleto. En el caso del jabalí, los linfonodos de la región cervical, el mandibular

principalmente, representan los complejos primarios incompletos más comunes. De

hecho, existen estudios que demuestran que el 90% de los jabalíes infectados pueden

ser diagnosticados mediante la inspección macroscópica única del linfonodo mandibular

(Parra et al., 2006; Martín-Hernando et al., 2007). Con estudios histológicos se pueden

detectar lesiones no visibles, habiéndose comprobado que entre un 10,7 y un 17% de

los jabalíes presentan solo este tipo de lesiones (Martín-Hernando et al., 2007; García-

Jiménez et al., 2013).

Una vez formado el complejo primario (tanto completo como incompleto) se pueden

dar 3 supuestos en el transcurso de la infección: puede existir una curación total, con

una eliminación eficaz de las micobacterias del organismo, sin ninguna consecuencia

patológica; por otra parte, puede suceder una diseminación masiva de la micobacteria

de manera generalizada vía hemolinfática, causando lesiones granulomatosas en todo

el organismo, principalmente en membranas serosas, conformado la denominada

tuberculosis de patrón miliar; finalmente, la micobacteria puede quedar acantonada en

un estado de latencia, tanto en linfonodos regionales como en órganos diana, con el

riesgo de padecer un episodio de exacerbación en el futuro.


50

Una vez concluida la fase primaria, puede desarrollarse una fase secundaria,

consecuencia principalmente de una reinfección endógena procedente de un complejo

primario latente, o de una reinfección exógena. Al ser reinfecciones, los linfonodos

regionales no se ven excesivamente afectados, centrándose las lesiones en los órganos

diana. Este tipo de cuadros presentan zonas amplias de caseificación en sus lesiones,

que pueden provocar generalizaciones del proceso al invadir las micobacterias las vías

hemolinfáticas. En el caso de las reinfecciones endógenas o reactivación de

micobacterias latentes, los factores asociados a fenómenos de inmunodepresión como

pueden ser el estrés, las altas densidades de población, el manejo excesivo de los

animales, etc., son determinantes en la reactivación de dichas lesiones latentes, o, en

el caso de primoinfecciones, de una generalización primaria y en consecuencia del

desarrollo de una tuberculosis miliar (Gortázar et al., 2003; Martín-Hernando et al.,

2007; Vicente et al., 2007).


51

Objetivos


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53

Una vez tenidos en cuenta los antecedentes mostrados en la introducción, para la

realización de esta tesis nos planteamos los siguientes objetivos:

- Identificación de los procesos inflamatorios y los daños estructurales más

habituales presentes en pulmones de jabalíes, así como su posible etiología y

cómo se ven afectados por otros factores, especialmente con el Circovirus

Porcino Tipo II.

- Estudio de la relación entre el Circovirus Porcino Tipo II y la tuberculosis del

jabalí, principalmente su posible influencia en la evolución del granuloma

tuberculoso.

- Determinar los efectos de la vacunación frente a Circovirus Porcino Tipo II en el

desarrollo del granuloma tuberculoso, mediante el estudio inmunohistoquímico

de las principales poblaciones celulares implicadas en la respuesta inmune y la

producción de mediadores de la inflamación.


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55

Bloque I.

Identificación de los procesos

inflamatorios y los daños estructurales

más habituales presentes en pulmones de

jabalíes, así como su posible etiología y

cómo se ven afectados por otros factores.


56


57

Para la realización de este estudio se recogieron muestras de 60 animales durante la

temporada de caza 2011-2012. Dichos animales fueron clasificados por sexo y edad. La

edad exacta de los animales fue determinada mediante examen del desgaste de la

dentición (Iff et al., 1978), estableciéndose tres grupos completamente diferenciados.

Grupo 1: formado por los animales de hasta 18 meses de edad, abarcando desde el

nacimiento hasta la edad considerada de transición de juvenil a adulto.

Grupo 2: animales subadultos, es decir entre los 18 y los 48 meses de edad, en que

alcanzan la madurez completa.

Grupo 3: animales adultos, o mayores de 48 meses. A partir de este momento no es

posible la estimación de edad a partir del desgaste dentario. En este grupo además se

encuentran los animales de mayor valor cinegético, principalmente machos trofeo.

Además de la determinación de sexo y edad, se recogieron muestras biológicas para

los diferentes análisis, muestras de sangre, así como de tejidos procedentes de

linfonodos submandibulares y pulmón.

Preparación de la toma de muestras en montería.


58

La muestra de sangre de cada animal se dejó coagular y posteriormente fue

centrifugada para la obtención de suero, que más tarde sería utilizada para la

detección de anticuerpos frente a los siguientes patógenos mediante prueba ELISA

comercial: Virus de la Influenza Porcina (Ingezim Influenza Porcina®, Ingenasa),

Circovirus Porcino Tipo 2 (Ingezim Circovirus IgG/IgM®, Ingenasa) y Adenovirus

porcino (Ingezim ADV Total®, Ingenasa). Las muestras de tejido del linfonodo

submandibular, así como parte de las de parénquima pulmonar, sirvieron para la

detección de Mycoplasma spp. mediante técnica PCR (Sibila et al., 2010).

Se realizaron más análisis complementarios: ELISA para la detección en suero de

anticuerpos frente a otros patógenos, como pudieron ser el Virus del Síndrome

Respiratorio y Reproductivo Porcino (ELISA Ingezim PRRS Universal®, Ingenasa), el

Parvovirus porcino (ELISA Ingezim PPV®, Ingenasa); y pruebas moleculares mediante

PCR para detectar ADN de los propios patógenos, como Haemophilus parasuis (Oliveira

et al., 2001). No obstante, debido a los resultados de baja prevalencia obtenidos

fueron desestimados para establecer grupos representativos de estudio.

El resto del parénquima pulmonar fue fijado en formaldehído al 3,5% para su posterior

procesado y tinción mediante hematoxilina-eosina. Los cortes histológicos fueron

sometidos a estudio microscópico para determinar los procesos inflamatorios presentes

en cada muestra así como los daños estructurales presentes en el mismo, con el fin de

desarrollar dos estudios diferenciados.


59

Estudio de los procesos inflamatorios

Los procesos inflamatorios considerados en el estudio fueron los procesos inflamatorios

generales descritos en el Jubb, Kennedy & Palmer’s Pathology of Domestic Animals (6ª

Edición, 2016):

Neumonía intersticial: conformada principalmente por presencia de infiltrado

inflamatorio en el intersticio pulmonar, con el consecuente engrosamiento de las

paredes intersticiales, no encontrándose afectados ni los alveolos, ni las vías aéreas.

Neumonía intersticial. Hematoxilina Eosina.

Bronquitis: en este caso el infiltrado inflamatorio se limita a las paredes de las vías

aéreas bajas, principalmente en la capa mucosa de los bronquios, que provoca su

engrosamiento.

Bronquitis. Hematoxilina Eosina.


60

Peribronquitis: en el caso de los pulmones, las células inflamatorias se agrupan

conformando el BALT (o Bronchus Associated Lymphoid Tissue, en español, tejido

linfoide asociado a los bronquios) en la periferia de las vías aéreas bajas. En caso de

estimulación antigénica, estas estructuras sufren una hiperplasia, cambiando su

conformación y tamaño, extendiendo las células inflamatorias por la zona periférica de

los bronquios. Dichas células inflamatorias conforman las imágenes histológicas

asociadas a peribronquitis.

Peribronquitis; Hiperplasia del BALT. Hematoxilina Eosina.

Bronconeumonía: en los fenómenos bronconeumónicos, el infiltrado inflamatorio se

extiende por la luz de los alveolos gracias a fenómenos exudativos, conformando focos

de consolidación pulmonar asociados a pérdida de funcionalidad alveolar.

Bronconeumonía. Hematoxilina Eosina.


61

Pleuritis: en este caso concreto, nos referiremos a la afectación de la pleura visceral,

que en casos de pleuritis sufre un engrosamiento debido principalmente a la presencia

de infiltrado inflamatorio, y en menor medida, a fenómenos vasculares como el edema

o fenómenos patológicos como la fibrosis o la presencia de adherencias.

Pleuritis. Hematoxilina Eosina

Todas ellas se evaluaron asignándoles una “puntuación patológica” (score o scoring)

en función de la extensión y gravedad del proceso, consistente en otorgar en cada

caso una puntuación del 0 al 6 (0, ausente; 1, leve focal; 2, leve generalizada; 3,

media focal; 4, media generalizada; 5, grave focal; 6, grave generalizada). Además de

estas puntuaciones individuales para cada tipo de fenómeno inflamatorio, se determinó

una puntuación total mediante la suma de los 5 valores individuales, otorgando a cada

animal un valor entre 0 y 30 puntos.

Finalmente, se realizaron estudios estadísticos mediante el uso del programa SPSS

20.0®. Se realizaron análisis descriptivos de los datos. También se aplicó la prueba no

paramétrica de Kruskal-Wallis para muestras independientes con los datos obtenidos

de sexo, grupo de edad y positividad a patógenos (Influenza, PCV2, ADV y

Mycoplasma spp.). Para las comparaciones dos a dos se realizó la prueba no

paramétrica de U de Mann-Whitney.


62

Los resultados obtenidos en el estudio estadístico están reflejados en las siguientes

tablas.

Neumonía Intersticial

Sexo Macho 1.48 ± 0.37 P valor

Hembra 1.23 ± 0.229 0.975

Edad Grupo 1 1.69 ± 0.454 P valor

Grupo 2 1.42 ± 0.277 0.255

Grupo 3 0.69 ± 0.328

ELISA Influenza Positivo 1.17 ± 0.325 P valor

Negativo 1.43 ± 0.261 0.445

ELISA PCV2 Positivo 1.34 ± 0.22 P valor

Negativo 1.31 ± 0.472 0.458

ELISA ADV Positivo 1.05 ± 0.216 P valor

Negativo 2.07 ± 0.508 0.100

PCR Mycoplasma spp. Positivo 1.17 ± 0.293 P valor

Negativo 1.44 ± 0.277 0.615

Bronquitis


Hembra 0.99 ± 0.276 0936


Grupo 2 0.74 ± 0.222 0.119

Grupo 3 0.54 ± 0.369


Negativo 1.03 ± 0.256 0.611


Negativo 0.69 ± 0.254 0.831


Negativo 0.36 ± 0.248 0.074


Negativo 0.78 ± 0.219 0.460


63

Peribronquitis


Hembra 1.94 ± 0.357 0.069


Grupo 2 1.71 ± 0.319 0.015

Grupo 3 2.00 ± 0.408


Negativo 2.19 ± 0.310 0.745


Negativo 1.88 ± 0.446 0.443


Negativo 2.29 ± 0.507 0.923


Negativo 1.94 ± 0.276 0.240

Bronconeumonía


Hembra 0.49 ± 0.198 0135


Grupo 2 0.42 ± 0.190 0.333

Grupo 3 0


Negativo 0.22 ± 0.135 0.263


Negativo 0.38 ± 0.272 0.905


Negativo 0 0.152


Negativo 0.25 ± 0.146 0.323


64

Pleuritis


Hembra 0.74 ± 0.218 0.090


Grupo 2 1.00 ± 0.282 0.235

Grupo 3 0.62 ± 0.331


Negativo 1.11 ± 0.253 0.414


Negativo 0.50 ± 0.274 0.110


Negativo 1.29 ± 0.438 0.553


Negativo 1.08 ± 0.256 0.579

Puntuación total


Hembra 5.37 ± 0.809 0.190


Grupo 2 5.29 ± 0.619 0.036

Grupo 3 3.85 ± 0.926


Negativo 5.97 ± 0.759 0.749


Negativo 4.75 ± 0.878 0.283


Negativo 5.84 ± 0.729 0.767


Negativo 5.50 ± 0.686 0.496


65

El estudio de los datos no ofrece diferencias estadísticamente significativas, excepto en

el caso de la peribronquitis asociada a la edad, siendo los más afectados los animales

más jóvenes (grupo 1). Sin embargo, al realizar un análisis descriptivo de los datos, se

observa una tendencia en las puntuaciones, siendo éstas de manera general más altas

en los animales más jóvenes, y decreciendo al ir aumentando la edad. Dicha tendencia

puede observarse en el siguiente gráfico.

Los niveles de inflamación del grupo 1 son casi siempre más altos que en los otros

grupos. Dichos niveles de inflamación presentes en casi todas las categorías estudiadas

decrecen al aumentar la edad de los animales, con la excepción de un repunte en la

peribronquitis en los animales más viejos, como se puede observar en el siguiente

gráfico.


66

El grupo 1 está constituido por animales de hasta 18 meses de edad, desde rayones

hasta subadultos. Existen distintos factores de riesgos asociados a la edad que

favorecen el riesgo de contagio de patógenos. En el caso de los rayones radica en la

convivencia en grupos con la madre. Además, los animales jóvenes no poseen un

sistema inmune completamente desarrollado, debido en parte a la lactación como los

demás mamíferos, así como la ausencia de contacto previo con patógenos y la

respuesta de inmunoglobulinas asociadas a un primer contacto con un patógeno,

principalmente basada en IgM. Todos estos factores hacen de ellos una población de

alto riesgo.

En el caso de subadultos, existen otros factores que favorecen el riesgo de contagio,

como la búsqueda de su propio territorio. Especialmente en el caso de los subadultos

machos, la situación de búsqueda de territorio puede verse agravada por la expulsión

de los grupos matriarcales, y en consecuencia, por unos elevados niveles de estrés.

Unido a esto, los nuevos territorios ocupados por los subadultos suelen ser territorios

menos ricos en recursos, lo que provoca una pérdida sustancial de la condición

corporal de los animales. El estrés junto con este empeoramiento de la condición

corporal de los animales pueden ser los principales factores que afecten al sistema

inmune en este rango de edad, desembocando en una respuesta inmune menos


67

efectiva y, con ello, convirtiendo a estos animales en parte de la población de riesgo

susceptible de sufrir procesos inflamatorios pulmonares.

Todos estos datos nos llevan a pensar que los animales más jóvenes (grupo 1) son la

población más importante en cuanto a los procesos inflamatorios pulmonares, por lo

que constituyen la diana principal para el establecimiento de medidas preventivas y de

control que limiten los procesos patológicos respiratorios.


68

Estudio de los daños estructurales pulmonares

Para la realización de este estudio se estableció una clasificación de las distintas partes

que lo integran el pulmón. A cada una de las partes se le atribuyó un rango de

puntuación dependiente de la presencia o ausencia de los diversos cambios posibles en

cada una de las estructuras, siendo la puntuación obtenida el sumatorio de dichos

cambios, si estaban presentes (valor 1) o ausentes (valor 0), o mediante una

graduación en el caso del estudio del tejido linfoide asociado a bronquios.

Las distintas partes de estudio, así como los aspectos analizados en cada uno se

detallan a continuación.

Bronquios: se estableció una puntuación de 0 a 7 puntos, procedentes del estudio de

los siguientes fenómenos, siendo su puntuación el sumatorio de todos los observados,

teniendo la ausencia un valor 0 y la presencia un valor 1.

- Hiperplasia del epitelio.

- Inflamación.

- Edema.

- Hemorragia.

- Pérdida de cilios.

- Necrosis.

- Presencia de exudado.

Tejido linfoide asociado a bronquios (BALT): se estableció una puntuación del 0 al 4 en

función del estado que presentaban las estructuras, siendo las puntuaciones:

- 0. Ausencia de alteraciones.

- 1. Ligera hiperplasia.

- 2. Hiperplasia estructurada en un nódulo simple.

- 3. Hiperplasia estructurada en nódulos múltiples.

- 4. Hiperplasia estructurada en nódulos múltiples separados por tejido conectivo.


69

Alveolos: en el estudio del daño estructural asociado a alveolo se estableció una

puntuación entre 0 y 5, dependiente del sumatorio de ausencia (valor 0) o presencia

(valor 1) de los siguientes fenómenos.

- Edema.

- Hemorragia.

- Presencia de exudado.

- Pérdida de neumocitos tipo I.

- Hiperplasia de neumocitos tipo II.

Intersticio: para el estudio del daño estructural intersticial, la puntuación establecida

fue de 0 a 4, y los fenómenos que conformaron dicha puntuación fueron los siguientes,

siendo el valor el sumatorio de todos ellos (Ausencia, valor 0; presencia, valor 1).

- Edema.

- Congestión.

- Inflamación.

- Presencia de tejido conectivo.

Pleura: en cuanto al daño estructural asociado a la pleura, el rango de puntuación fue

de 0 a 4, establecido mediante el sumatorio de los valores de la presencia (valor 1) o

ausencia (valor 0) de los siguientes fenómenos.

- Engrosamiento de la pleura.

- Componente seroso pleural.

- Presencia de fibrina.

- Hemorragia.

Los estudios estadísticos se realizaron mediante el uso del programa SPSS 20.0®. Se

realizó el análisis descriptivo de los datos, así como la aplicación de la prueba no

paramétrica de Kruskal-Wallis para muestras independientes para el estudio de los

datos asociados a sexo, grupo de edad y positividad a patógenos (Influenza, PCV2,

ADV y Mycoplasma spp.). Para las comparaciones dos a dos se realizó la prueba no

paramétrica de U de Mann-Whitney.


70

Los resultados obtenidos están reflejados en las siguientes tablas.

Daño estructural: Bronquio


Hembra 1.46 ± 0.260 0.845


Grupo 2 1.45 ± 0.285 0.033

Grupo 3 0.69 ± 0.398


Negativo 1.54 ± 0.297 0.918


Negativo 1.50 ± 0.354 0.631


Negativo 1.36 ± 0.341 0.948


Negativo 1.44 ± 0.263 0.900

Daño estructural: BALT


Hembra 1.69 ± 0.242 0.914


Grupo 2 1.58 ± 0.221 0.168

Grupo 3 1.23 ± 0.231


Negativo 1.51 ± 0.200 0.396


Negativo 1.94 ± 0.232 0.132


Negativo 1.57 ± 0.272 0.922


Negativo 1.56 ± 0.184 0.564


71

Daño estructural: Alveolos


Hembra 0.89 ± 0.191 0.499


Grupo 2 0.77 ± 0.195 0.966

Grupo 3 0.69 ± 0.237


Negativo 0.62 ± 0.166 0.134


Negativo 0.50 ± 0.183 0.343


Negativo 0.57 ± 0.025 0.491


Negativo 0.72 ± 0.181 0.430

Daño estructural: Intersticio


Hembra 0.97 ± 0.139 0.568


Grupo 2 0.97 ± 0.143 0.661

Grupo 3 1.23 ± 0.281


Negativo 1.00 ± 0.123 0.936


Negativo 0.81 ± 0.209 0.261


Negativo 1.07 ± 0.221 0.973


Negativo 1.03 ± 0.152 0.962


72

Daño estructural: Pleura


Hembra 0.46 ± 0.155 0.024


Grupo 2 0.71 ± 0.187 0.531

Grupo 3 0.46 ± 0.268


Negativo 0.84 ± 0.176 0.134


Negativo 0.56 ± 0.258 0.430


Negativo 1.07 ± 0.355 0.282


Negativo 0.78 ± 0.179 0.455


73

El estudio estadístico de los datos ofrece diferencias estadísticamente significativas en

el daño estructural de los bronquios asociados a la edad, así como el de la pleura

asociada al sexo. En el caso del daño estructural asociado a la edad, aparte de esta

relación, si se realiza un análisis descriptivo de los datos, se aprecia una tendencia

entre los distintos grupos de edad. Las puntuaciones de daños estructurales son

normalmente más elevadas en los grupos que incluyen los individuos más jóvenes,

decreciendo con el avance de la edad, como se puede observar en el siguiente gráfico.

Con la edad, por norma general la puntuación de daño estructural va disminuyendo, a

excepción del caso del intersticio, como destaca en el siguiente gráfico.


74

Al igual que en el caso de los procesos inflamatorios, los animales del grupo 1

representan el grupo de mayor riesgo de padecer daños estructurales. Esto puede ser

debido a las mismas causas que en el caso anterior. En los rayones, la falta de

desarrollo del sistema inmune o una respuesta ineficiente de éste debido a la ausencia

de contacto anterior con patógenos, junto con la mayor probabilidad de infecciones por

la convivencia con las madres y otros hermanos de menos de 18 meses; y en los

subadultos, la pérdida de condición corporal, los episodios de estrés provocados por la

expulsión de los grupos matriarcales, la búsqueda de nuevos territorios y la escasez de

recursos son las causas más probables de la puntuación lesional apreciada.

La única excepción que encontramos en el estudio descriptivo de los datos es el daño

estructural del intersticio. Esto puede ser debido a la inclusión del parámetro

“Presencia de tejido conectivo”, normalmente asociado a animales de edades

avanzadas. Posiblemente la presencia de esta lesión se deba a procesos de curación,

regeneración, esclerosis o fibrosis del tejido, procesos asociados mayoritariamente a

animales de edad avanzada; de ahí esa posible desviación en la tendencia observada.


75

Aun así, los datos observados determinan que el grupo 1 de edad es el de principal

riesgo en el caso de los daños histológicos estructurales pulmonares.

El daño estructural pleural asociado al sexo está presente en los machos, con valores

que duplican el de las hembras. Este hecho puede ser consecuencia de factores de

comportamiento asociado a los machos, principalmente la agresividad. Durante la

búsqueda de territorio y, principalmente, durante la época de apareamiento, las peleas

entre machos son comunes, con golpes y mordiscos, principalmente en los laterales del

pecho; de ahí el desarrollo de una zona de piel hiperqueratinizada en esa zona,

denominada “escudo”. Esta tendencia a localizarse las lesiones en una zona

determinada puede desencadenar una respuesta inflamatoria local en dicha área, que

podría explicar un incremento en la puntuación del daño estructural pleural. Si se

consideran de manera conjunta edad y sexo, los machos de los grupos 1 y 2 tienen

puntuaciones más elevadas que las hembras incluidas en sus mismos grupos de edad.

En cambio, en el caso del grupo 3, las puntuaciones de machos y hembras son

similares. Este hecho viene dado probablemente por dos factores principales: el

desarrollo total del “escudo” y a una menor frecuencia de peleas debido al propio

desarrollo corporal de los machos. Esta menor frecuencia de peleas viene dada por la

superioridad física evidente de los mayores de 48 meses ante subadultos y adultos

jóvenes, y por la capacidad de estos para evaluar a los adversarios sin entablar una

pelea propiamente dicha.

Todos estos datos determinan que, al igual que en el caso de los procesos

inflamatorios, los animales encuadrados en el grupo 1 de edad son los que presentan

mayor riesgo de desarrollar daños estructurales pulmonares. Asimismo, debe

considerarse a los jabalíes machos como otra población de riesgo en los mismos

términos, principalmente por su propio comportamiento. Estos datos hacen de estos

dos grupos los perfectos receptores de medidas preventivas y de control de

enfermedades con el fin de evitar los daños estructurales pulmonares.


76


77

Bloque II.

Estudio de la relación entre la positividad

frente al Circovirus Porcino Tipo II y el

desarrollo del granuloma tuberculoso.


78


79

Una vez obtenidos y analizados los resultados del anterior experimento, y comprobado

que la presencia del Circovirus Porcino Tipo 2 no influye ni en los procesos

inflamatorios ni en los daños estructurales del pulmón de jabalí, se estudió la posible

relación entre el Circovirus Porcino Tipo 2 y la tuberculosis, concretamente en la

formación de los distintos tipos de granulomas tuberculosos.

La relación entre la presencia de PCV2 y la tuberculosis, y la posible influencia sobre la

propagación y evolución de esta última enfermedad se ha observado en poblaciones de

jabalíes, asociando la presencia de una alta prevalencia de la tuberculosis a las zonas

con prevalencias altas de PCV2, así como la asociación de la infección por este virus al

desarrollo de tuberculosis generalizada (Risco et al., 2013). Considerando las lesiones

causadas por PCV2 en tejidos linfoides y las implicaciones de Mycobacterium spp. en el

desarrollo de lesiones en los mismos territorios orgánicos, nos propusimos hacer un

estudio para determinar la posible influencia de la infección por PCV2 sobre el

desarrollo de los distintos tipos de granulomas tuberculosos presentes en los animales,

que puede ser determinante en el control de la enfermedad, o por el contrario, en el

empeoramiento de la evolución de la misma y, en consecuencia, provocar un mayor

riesgo de diseminación del patógeno tanto a nivel sistémico como al medio ambiente.

Para la realización de este estudio, fueron analizados 290 jabalíes del suroeste español

durante la campaña de caza de 2012-2013 (Octubre de 2012, Febrero de 2013). El

examen de estos animales incluyó un análisis macroscópico detallado mediante

inspección e incisión de los linfonodos (retrofaríngeo, mandibular, traqueobronquial,

mediastínicos, hepáticos y mesentéricos). También se realizó una inspección de los

demás órganos, con especial atención a los pulmones (mediante incisión y palpación),

así como el bazo y el hígado (García-Jiménez et al., 2012). Además, durante la

inspección se determinó sexo y edad del animal mediante procedimientos standard (Iff

et al., 1978; Risco et al., 2013), así como una toma de muestra de sangre para la

obtención de suero para análisis.


80

Estudio de positividad a M. tuberculosis complex y

patrón lesional

El tejido de los linfonodos mandibulares y pulmón de unos animales seleccionados al

azar fueron usados para el estudio histopatológico y los análisis microbiológicos.

El cultivo microbiológico fue llevado a cabo según lo descrito previamente por García-

Jiménez en 2012, para detectar la presencia de Mycobacterium spp. Los cultivos

sospechosos fueron sometidos a PCR para confirmar la identificación de M. tuberculosis

complex (García-Jiménez et al., 2012).

El estudio histopatológico de los linfonodos y pulmones se realizó para evaluar la

infección tuberculosa y el grado de diseminación de la enfermedad. Un fragmento de

linfonodo mandibular y pulmón de cada animal fue fijado en formaldehído al 4%

durante 7 días. Una vez procesado, se realizaron cortes de 5 µm, y fueron teñidos

mediante técnicas de rutina (hematoxilina-eosina) para su examen histológico. Dicho

examen fue usado para establecer un criterio de positividad-negatividad a la presencia

de granulomas tuberculosos en los tejidos. Los animales que presentaron granulomas

tuberculosos fueron considerados positivos a tuberculosis y seleccionados para el

estudio histológico de los granulomas.

Tanto los criterios macroscópicos como los microscópicos fueron usados para clasificar

a los sujetos positivos a tuberculosis en 2 grupos diferentes de patrones lesionales:

- Tuberculosis localizada: si las lesiones o el microorganismo sólo fue encontrado

en un solo órgano.

- Tuberculosis generalizada: si las lesiones o el microorganismo fue encontrado

en más de un órgano.

Estudio de positividad a PCV2.

Para determinar si los animales de estudio habían tenido contacto con el PCV2, se

realizaron análisis ELISA (INGENASA Ingezim Circo IgG®), siguiendo las instrucciones

del fabricante. Los animales fueron clasificados en positivos (animales que han tenido

contacto anterior con PCV2 y tienen IgG positivas) y animales negativos (que no han

tenido contacto anterior con PCV2 y no tienen IgG contra él).


81

Estudio histológico de los granulomas.

Los animales que fueron histológicamente positivos (n=66) fueron estudiados para

determinar el número total de granulomas, y en el estadio en que se encuentran según

lo descrito por Wangoo y colaboradores (2005). Estos tipos de granuloma, estudiados

en bovino, han sido confirmados en otras especies como pueden ser el gamo (García-

Jiménez et al., 2012) o, como en nuestro caso, el jabalí (García-Jiménez et al., 2013).

Este estudio permitirá determinar un patrón de expresión de los distintos tipos de

granulomas para un posterior análisis estadístico. Un total de 1418 granulomas fueron

analizados para su posterior estudio estadístico.

Análisis estadístico.

El análisis estadístico fue realizado usando el programa SPSS® 20.0 para Windows. Los

parámetros incluidos en el análisis fueron los siguientes: sexo, edad, positividad a M.

tuberculosis complex, positividad a PCV2, número total de granulomas, número de

granulomas de cada tipo y patrón lesional de M. tuberculosis complex. Para el análisis

de los datos se realizaron estudios descriptivos, análisis de contingencia, test de Chi

Cuadrado y de U de Mann Whitney. Las diferencias observadas fueron consideradas

estadísticamente significativas cuando el p-valor fue menor de 0.05.


82

Resultados

Las prevalencias observadas en la población de estudio fueron un 74.8% de positividad

frente a PCV2 (n=345), mientras que la prevalencia de M. tuberculosis complex fue

del 41.1% (n=345).

En cuanto al estudio de edad y sexo, no existen diferencias estadísticamente

significativas entre los animales positivos o negativos a PCV2 (n=510). La edad media

de los animales positivos a PCV2 fue de 2.35±0.07 años, mientras que la de los

animales negativos a PCV2 fue de 2.15±0.11 años. En cuanto al sexo, la distribución

poblacional tampoco presenta diferencias entre los animales positivos y negativos. Los

machos presentaron una positividad del 74.8% frente a un 25.2% de animales

negativos, mientras que las hembras presentaron una positividad del 76.4% frente a

un 23.6% de hembras negativas.

Tampoco se observa tendencia en la distribución cuando comparamos los animales

positivos y negativos a PCV2 con los animales positivos o negativos a M. tuberculosis

complex.

Una vez realizado el estudio histológico detallado de los animales positivos (n=66) se

realizaron distintos análisis. El número total de granulomas entre los animales positivos

y negativos a PCV2 no presentó diferencias estadísticamente significativas ni

tendencias observables. Los animales positivos a PCV2 mostraron un número total de

granulomas medio de 21.41±3.01, similar a los detectados en los animales negativos a

PCV2, con una media de 21.38±5.79 granulomas.


83

Sin embargo, al estudiar los granulomas de manera cualitativa (establecida por los 4

estadios o fases descritas) en referencia a la positividad del animal a PCV2, pudimos

observar dos tendencias diferenciadas entre los animales positivos a PCV2 y los

negativos.

Los animales positivos a PCV2 muestran una tendencia a la formación de granulomas

de tipo 1 y tipo 2, con un menor desarrollo de los granulomas de tipo 4, siendo los

granulomas de tipo 3 casi inexistentes. En cambio, los animales negativos a PCV2 se

caracterizan por un menor desarrollo de los granulomas de tipo 1 y 2, con un aumento

del de los granulomas de tipo 4, siendo los de tipo 3 igual de escasos que en los

animales positivos.


84

Conociendo la relación que existe entre el desarrollo de cuadros generalizados de

tuberculosis y la positividad a PCV2, se realizó un estudio comparativo entre los

patrones lesionales de los animales con tuberculosis localizada y generalizada, que

mostraron 2 patrones lesionales completamente distintos.

En resumen, encontramos dos patrones lesionales completamente diferenciados, en los

que los animales con tuberculosis localizada presentaron un patrón lesional donde los

granulomas de tipos 1 y 2 representan un bajo número, mientras que la mayoría de los

granulomas encontrados son de tipo 4, con un escaso o nulo desarrollo de granulomas

de tipo 3. Por el contrario, los animales con tuberculosis generalizada mostraron un

gran número de granulomas de tipo 1 y 2, con un bajo número de granulomas de tipo

4 y un escaso o nulo desarrollo de granulomas de tipo 3.


85

Discusión de los resultados obtenidos.

La prevalencia obtenida de M. tuberculosis complex es similar a la descrita por otros

autores en la España mediterránea, un 43% (Vicente 2006). Sin embargo, la

prevalencia de PCV2 es ligeramente más alta que la descrita anteriormente en la

misma área, un 58% (Vicente, 2004). Además, en las distintas zonas y climas dentro

de la península existen prevalencias distintas de PCV2. Este hecho implica una mayor

probabilidad de infección en la población mediterránea, comparada con otras regiones

españolas de clima atlántico, donde la prevalencia es mucho menor (<10%) y los

patrones de tuberculosis generalizadas son mucho menos comunes entre los animales

afectados (Muñoz-Mendoza et al., 2013; Parra et al., 2006; Vicente et al., 2006).

En resumen, las prevalencias de PCV2 y M. tuberculosis complex determinadas en este

estudio son similares a las anteriormente publicadas en España en otras áreas con

clima mediterráneo, zonas geográficas con unas condiciones medioambientales y clima

similares (Diez-Delgado et al., 2014). Por otra parte, la infección por PCV2 detectada

mediante ELISA IgG, al estar relacionada con una respuesta humoral de producción de

IgG frente a PCV2 que en esta infección tarda en establecerse de manera efectiva,

debe ser considerada como expresión de infecciones crónicas o infecciones a largo

plazo. Este hecho nos permitirá detectar animales que hayan tenido contacto con el

virus con suficiente anterioridad, expresando cuadros crónicos.

La infección por PCV2 asociada a sexo o categoría de edad no está probada en los

jabalíes. Las múltiples vías de infección usadas por el virus, y el comportamiento propio

de los jabalíes, especialmente la relación entre rayones y madres y los grupos de

machos jóvenes, pueden indicar una infección temprana durante el desarrollo de los

grupos sociales, como ocurre en los cerdos domésticos (Rose et al., 2012). Este hecho,

asociado al uso de áreas comunes, como pudieran ser los puntos de agua o las zonas

de suplementación de comida, pueden facilitar la diseminación del virus dentro de la

población en todos los rangos de edad y sin tener en cuenta el sexo de los animales

infectados (Acevedo et al., 2007; Acevedo et al., 2014)

La ausencia de relación entre la positividad a PCV2 y la positividad a M. tuberculosis

complex dentro de la población, puede venir dada por la similitud entre los modos de

transmisión del agente viral y el agente bacteriano. La ruta de infección oronasal es la

ruta más importante de contagio en ambas enfermedades (Grau-Roma et al., 2011;

Hermoso de Mendoza et al., 2006). Al compartir el mismo modo de transmisión, los


86

factores de riesgo asociados a ambas enfermedades pueden ser comunes, siendo

influenciadas tan sólo por características particulares de cada uno de los agentes

infecciosos. Por ejemplo, la resistencia en el medio ambiente o la capacidad infectiva

del agente, que pueden explicar la diferencia entre las prevalencias observadas.

Los resultados de prevalencia indican una mayor facilidad de contagio del virus, frente

a la posibilidad de infección bacteriana. Además, las prevalencias observadas en el

estudio pueden estar influenciadas por el uso de áreas comunes como las

anteriormente mencionadas zonas de suplementación, puntos de agua, o incluso la

estancia en fincas valladas (Acevedo et al., 2014; Parra et al., 2006). En estas fincas,

dichas áreas comunes pueden ser modificadas mediante cambios de manejo para

intentar disminuir las prevalencias de tuberculosis en la zona. El incremento del

número de zonas de suplementación y puntos de agua, así como la suplementación del

pienso en hileras largas en el suelo, pueden ayudar a disminuir la probabilidad de

contacto entre animales, y con ello, la probabilidad de contagio (Castillo et al., 2011).

El resultado del estudio cuantitativo de los granulomas indica que no hay diferencias

en cuanto al número total de granulomas presentes entre los animales infectados por

PCV2 y los que no están infectados. Sin embargo, los resultados del estudio cualitativo

de los granulomas indica la existencia de dos tendencias diferenciadas entre los

animales infectados por PCV2 y los no infectados. Los animales infectados tienen

tendencia al desarrollo de los estadios iniciales de los granulomas, asociados

principalmente a un bajo control de la infección de M. tuberculosis complex. El efecto

inmunosupresor del PCV2 puede alterar la respuesta inflamatoria contra los patógenos.

Las lesiones asociadas a PCV2, como pueden ser la depleción linfoide en las zonas

foliculares e interfoliculares asociadas a infiltración macrofágica de los tejidos linfoides

(Chianini et al., 2003; Darwich et al., 2012; Segalés et al., 2012), están relacionadas

con un incremento del número de monocitos y macrófagos en sangre periférica y

tejidos linfoides, y con una disminución de los linfocitos T y B en los órganos linfoides

(Sarli et al., 2001; Segalés et al., 2001). Este hecho, asociado a los efectos directos de

la replicación vírica en células que forman parte de la respuesta inmune (Choi et al.,

2000; Nielsen et al., 2003; Yu et al., 2007), causan cambios en el propio

funcionamiento del sistema inmune. Cambios en la inducción de apoptosis en células

del sistema inmune, inhibición del complemento, interferencias en la presentación de

antígenos, actuaciones como inhibidores y estimuladores de citoquinas, o propiamente

actuando como citoquinas (Kekarainen et al., 2008; Resendes et al., 2011; Darwich et


87

al., 2012), pueden ser la principal causa del desarrollo de los cambios lesionales

asociados a otras enfermedades (Segalés et al., 2004; Ostanello et al., 2005; Yu et al.,

2007). En el caso de la tuberculosis, estos efectos pueden modificar el correcto

desarrollo del granuloma, impidiendo a este alcanzar sus estadios finales. El efecto de

PCV2 sobre linfocitos T y B puede influir en el correcto desarrollo de la inmunidad

humoral en los animales, interfiriendo en la formación de los granulomas con el

consecuente riesgo asociado a la no encapsulación de la lesión (Gil et al., 2010;

García-Jiménez et al., 2013). Por lo tanto, al no existir una evolución habitual con una

encapsulación de la lesión y un inicio de necrosis central, características que favorecen

el depósito de calcio, no es posible la calcificación correcta del granuloma, considerada

como un signo de control de la infección por M. tuberculosis complex y asociado a un

menor riesgo de propagación de la micobacteria. Este hecho permite considerar a los

animales positivos a PCV2 como importantes excretores de micobacterias, que facilitan

una mayor diseminación de la enfermedad en el medio ambiente, considerándose un

riesgo de contagio ante otros animales susceptibles (Phillips et al., 2003). Además, el

efecto inmunosupresor del PCV2 puede afectar el estado de la inmunidad humoral,

pudiendo interferir en el uso de test basados en la detección de IgG.

Estos hechos se complementan con los resultados del estudio cualitativo de los

granulomas entre los animales con tuberculosis localizada y generalizada

anteriormente descrito. Los individuos con tuberculosis localizada muestran una

tendencia a la formación de granulomas de tipo 4, lo que indica un correcto

funcionamiento del sistema inmune que permite el desarrollo del propio granuloma

hasta los estadios finales y hacia un control de la enfermedad (Hermoso de Mendoza et

al., 2006; García-Jiménez et al., 2013). Este patrón de granulomas es el mismo que

hemos observado en los animales seronegativos a PCV2.

Por otro lado, los animales que presentan una forma generalizada de tuberculosis

muestran el mismo patrón de expresión de granulomas que los animales seropositivos

a PCV2, con un desarrollo de granulomas de tipo 1 y 2 principalmente. La incapacidad

del organismo para alcanzar los estadios últimos de desarrollo del granuloma,

constatados por la ausencia de granulomas de tipo 4, puede ser el principal factor que

permite la diseminación del patógeno al resto de los órganos, causando la

generalización del proceso tuberculoso y empeorando el estado sanitario del animal

infectado. Además, los animales con lesiones tuberculosas generalizadas tienen un

mayor potencial como excretores de M. tuberculosis complex, hecho que puede ser


88

agravado en caso de infecciones concurrentes con PCV2, aumentando el peligro

potencial de dichos animales (Martin-Hernando et al., 2007).

Todos estos detalles, unidos al hecho de la relación existente entre la infección por

PCV2 y el desarrollo de tuberculosis generalizadas (Risco et al., 2013), sugieren una

fuerte relación entre tres factores: la infección por PCV2; el incompleto desarrollo de la

lesión tuberculosa; y la facilidad de diseminación de la micobacteria, que permite el

desarrollo de cuadros generalizados y la diseminación de la micobacteria hacia otros

animales susceptibles (contagios directos) hacia el medio ambiente (contagios

indirectos).

Todos estos factores hacen de los jabalíes coinfectados por PCV2/M. tuberculosis

complex animales de alto riesgo en cuanto a su efectividad para la diseminación de la

tuberculosis. Esto demuestra la importancia del control de PCV2 en los jabalíes, ya que

estos juegan un papel importante como diseminador y reservorio principal de la

tuberculosis en el ecosistema Mediterráneo, y, en consecuencia, del importante riesgo

de contagio que representa ante otros animales susceptibles de padecer la enfermedad

cohabitantes del mismo ecosistema, como pueden ser los ciervos, gamos, corzos, y

obviamente el ganado bovino extensivo.

En consecuencia, las coinfecciones PCV2/M. tuberculosis complex deben ser tenidas en

cuenta a la hora de diseñar medidas de control eficaces de ambas enfermedades

cuando están presentes en la misma población, especialmente en zonas con altas

prevalencias de tuberculosis, como puede ser el suroeste de España. Sin ir más lejos,

vacunaciones contra la tuberculosis usando cebos con vacuna inactivada, aun en el

caso de que fuera muy eficaz, pueden resultar un dispendio inútil sin un estudio previo

de las poblaciones diana, para descartar la presencia de agentes inmunosupresores

como PCV2.


89

Bloque III.

Determinación de la influencia de la

vacunación frente a PCV2 en el desarrollo

del granuloma tuberculoso.


90


91

Al haber comprobado con los anteriores estudios una posible relación entre la infección

por PCV2 y el desarrollo incompleto del granuloma tuberculoso, nos planteamos la

posibilidad de realizar otro sobre los efectos de la vacunación frente a PCV2 en una

finca controlada. Esta finca, de clima mediterráneo, posee una extensión de 2000

hectáreas, con una densidad de 40 jabalíes por cada 100 hectáreas. Además, posee 5

cercones de captura distribuidos por toda la finca. Dicho estudio se llevó a cabo entre

2013 y 2015.

Durante los veranos de 2013 y 2014, se procedió a la captura de los animales en

edades juveniles, sujetos de estudio. En los cercones de captura los animales

seleccionados fueron vacunados frente a PCV2 con una vacuna comercial porcina

(CIRCOVAC® Lab. Merial) e identificados mediante microchips electrónicos para su

posterior reconocimiento. Más tarde, estos animales fueron liberados en la finca, con el

fin de realizar su muestreo durante las actividades cinegéticas llevadas a cabo en las

temporadas de caza de 2013-2014 y 2014-2015.

Detalle del momento de la captura y microchipado de los animales.


92

Los sujetos seleccionados durante los muestreos de estas dos temporadas de caza

fueron todos los animales abatidos con microchip, y por tanto vacunados (n=18); y

una selección aleatoria de animales no vacunados frente a PCV2 (n=39), donde sólo se

tuvo en cuenta que tuvieran una edad similar a los animales vacunados muestreados

(6-8 meses aproximadamente en los animales nacidos el mismo año, 18-20 meses

aproximadamente en los animales nacidos el año anterior). De todos ellos se tomaron

muestras de sangre para análisis serológicos y linfonodos retrofaríngeos o linfonodos

submandibulares, tanto para su fijación en formaldehído al 4% para los estudios

histopatológicos, como frescos, para cultivos microbiológicos o posibles estudios

moleculares.


93

Estudio de la prevalencia de tuberculosis y

desarrollo de los granulomas.

Dentro de nuestra población de estudio, y al estar enfocado este al desarrollo de la

lesión tuberculosa, se estableció como criterio de positividad frente a tuberculosis la

presencia de granulomas en los cortes histológicos de los linfonodos muestreados,

determinando así la prevalencia de la tuberculosis mediante valoración histológica. Una

vez establecida la positividad de la muestra, se procedió al contaje y clasificación de los

granulomas presentes mediante la escala establecida por Wangoo y colaboradores en

2005. Ello nos permitiría determinar un patrón de expresión de los mismos,

diferenciando a la vez entre animales vacunados y no vacunados, lo que nos permitiría

estudiar las posibles diferencias entre las dos subpoblaciones. Los estudios estadísticos

se llevaron a cabo usando el software SPSS® 20.0, mediante análisis descriptivo y

estadístico con las pruebas de Kruskal Wallis y U de Mann Whitney.

En el estudio sobre la prevalencia de tuberculosis en los dos grupos de estudio se

determinó un porcentaje menor entre los animales vacunados (33%; 6/18), mientras

que los animales no vacunados presentaron valores del 59% (23/39), no existiendo

diferencias significativas entre los grupos. Sin embargo, los datos obtenidos mediante

el análisis estadístico determinan unos p-valor muy próximos a la significación, lo que

nos hace pensar en una posible relación estadística entre la vacuna de PCV2 y la

prevalencia de tuberculosis en caso de aumentar el n de estudio. Los datos estadísticos

se muestran en la siguiente tabla.

Estudio estadístico sobre las prevalencias de tuberculosis entre animales

vacunados frente a PCV2 y no vacunados

Prevalencia de animales vacunados: 33%

(6/18)

Prevalencia de animales no vacunados:

59% (23/39)

U de Mann Whitney 0.074

Kruskal Wallis 0.074


94

Al completar el estudio con el número de los distintos tipos de granulomas en los

animales histológicamente positivos y realizar el análisis estadístico, observamos

diferencias estadísticamente significativas entre la cantidad de granulomas de tipo 1 y

tipo 2 presentes en los animales vacunados de PCV2 y los no vacunados. Sin embargo,

los granulomas tipo 3 y 4 no presentan diferencias estadísticamente significativas en

cuanto a su número. Los datos de dicho análisis están resumidos en la siguiente tabla.

Estudio estadístico de las diferencias en el desarrollo de los distintos tipos

de granulomas entre animales vacunados frente a PCV2 y no vacunados.

Desarrollo de granulomas

tipo 1

U de Mann-Whitney 0.001



tipo 2




tipo 3




tipo 4



El estudio descriptivo de los tipos de granulomas presentes en los animales vacunados

y los no vacunados nos permite confeccionar un gráfico en el que se muestra el patrón

de expresión de granulomas en los distintos grupos de estudio.


95

En el gráfico se observa una clara diferencia entre los dos patrones de expresión.

Destacamos una tendencia en los animales no vacunados frente a PCV2 a la formación

de granulomas de tipos 1 y 2, granulomas microbiológicamente más activos. Dichos

granulomas presentan un mayor riesgo potencial de diseminación de micobacterias al

medio ambiente, y, en consecuencia, un mayor riesgo de propagación de la

enfermedad (Phillips et al., 2004). Esta diferencia entre los grupos de estudio en la

formación de granulomas y en la correcta evolución de la lesión hacia su estadio final

(granuloma tipo 4), nos hace apoyar la teoría de que la infección subclínica de los

animales infectados por PCV2 puede afectar al normal desarrollo de las lesiones

tuberculosas granulomatosas (Ellis et al., 2004). Esta incapacidad para desarrollar de

manera normal los granulomas hasta alcanzar el estadio 4 calcificado,

microbiológicamente más inerte, puede conllevar, además de un aumento del riesgo

epidemiológico en su entorno, un empeoramiento clínico de la salud del propio animal

(Martin-Hernando et al., 2007).


96

Estudio inmunohistoquímico de los granulomas.

Para determinar la posible influencia de la infección por PCV2 en el desarrollo de los

granulomas tuberculosos, una vez determinadas las prevalencias y los patrones de

expresión de los granulomas de los animales vacunados y no vacunados frente a PCV2,

se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico con el fin de determinar las posibles

variaciones o cambios entre los grupos de estudio. Para ello se seleccionaron animales

positivos histológicamente a tuberculosis (con presencia de granulomas) para

conformar 3 grupos de estudio diferenciados.

- Grupo I: animales negativos a PCV2 mediante serología (ELISA INgezim

Circovirus IgG®).

- Grupo II: animales positivos a PCV2 mediante serología (ELISA INgezim

Circovirus IgG®).

- Grupo III: animales vacunados frente a PCV2, seleccionados mediante la

identificación por microchip.

Todos los animales procedían de la misma finca, por lo que tanto las condiciones

ambientales como los recursos e interacciones entre grupos, serían las mismas para

todos los integrantes del estudio.

Las muestras de linfonodos retrofaríngeos o submandibulares fueron fijadas,

procesadas y embebidas en parafina, de las que posteriormente se realizarían los

cortes histológicos para el estudio inmunohistoquímico. Para la realización de este

estudio se tomaron las muestras de cada grupo (n=6, n total= 18) y se utilizaron 7

marcadores inmunohistoquímicos en cada animal, para su posterior análisis y contaje.

El proceso de tinción inmunohistoquímica se realizó mediante el método de avidina-

biotina-peroxidasa (ABC Vector Elite; Vector laboratories®). Las muestras fueron

desparafinadas en estufa, rehidratadas y tratadas con peróxido de hidrógeno al 3% en

metanol durante 15 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena. Se

lavaron posteriormente con TBS 0,01M, pH 7,2.


97

Para el desenmascaramiento antigénico se utilizaron uno de los siguientes métodos:

- Tripsina/α-quimotripsina (0,5% tripsina y 0,5% α-quimotripsina) (Sigma-

Aldrich®) a 37ºC durante 10 minutos.

- Tween 20® (Fórmula comercial, Sigma-Aldrich®) a 37ºC durante 10 minutos.

- Tris–EDTA pH 9,0; durante 20 minutos en microondas de 700W.

- Citrato de sodio pH 4,0; durante 20 minutos en microondas de 700W.

Tras el montaje de las muestras en Centros de Inmunotinción Sequenza (Shandon

Scientific®), la reactividad cruzada de los tejidos con los anticuerpos primarios fue

bloqueada mediante el uso de normal serum block (1,5%) de la especie huésped del

anticuerpo primario, aplicado durante 20 minutos.


98

Los anticuerpos primarios utilizados, tipo, laboratorio de procedencia, dilución utilizada

y método de recuperación antigénica utilizado están detallados en el siguiente cuadro.

Marcador Tipo Laboratorio Dilución Recuperación

antigénica

CD3

Linfocitos T

Policlonal,

conejo anti-

humano

DAKO® 1/500 Tripsina/α-

quimotripsina

CD79α

Linfocitos B

Monoclonal,

ratón anti-

humano

DAKO® 1/100 Buffer Tris-

EDTA en

microondas

CD68

Macrófagos y

monocitos

Monoclonal,

ratón anti-

humano

AbD Serotec® 1/100 Buffer Tris-

EDTA en

microondas

IFN γ Policlonal,

conejo anti-

humano

AbD Serotec® 1/100 Buffer Citrato

de Sodio en

microondas

IL1 Policlonal,

conejo anti-

humano

Cultek SLU® 1/400 Tween 20®

IL10 Policlonal,

conejo anti-

humano


iNos Policlonal,

conejo anti-

humano



99

Las muestras fueron lavadas en TBS y posteriormente incubadas durante 30 minutos

con el anticuerpo secundario biotinilado (Vector Laboratories®). Después de aplicar dos

lavados en TBS, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con el

Complejo Avidina–Biotina (Vector Elite Kit, Vector Laboratories®). Posteriormente el

marcaje fue detectado mediante el uso de 3, 30 – diaminobencidina tetrahidrocloruro

(DAB) y una tinción de contraste con hematoxilina de Mayer (Surgipath®) durante 5

minutos.

Una vez realizada la tinción inmunohistoquímica, se procedió a la toma de

microfotografías de las muestras. Para el estudio de cada anticuerpo se realizaron 10

microfotografías a 20x de cada una de las muestras (n=180), determinándose en cada

una de ellas el número de células inmunomarcadas; los resultados obtenidos se

expresaron en número de células marcadas por campo de 20x. Posteriormente, se

realizó un estudio estadístico de los resultados, mediante el software SPSS 20.0®,

realizando un estudio descriptivo, test ANOVA y un test de Tukey para comprobar las

posibles diferencias entre los distintos grupos de estudio.

Para una mejor comprensión dividiremos el estudio en dos partes: primero

mostraremos los resultados de las poblaciones celulares y de las citoquinas analizadas

en cada uno de los grupos de estudio; y posteriormente los resultados obtenidos en el

estudio de cada marcador mediante un análisis comparativo entre los grupos.


100

Resultados por grupo de estudio.

Grupo I: Animales negativos a PCV2.

Estudio de poblaciones celulares.

El estudio de los marcadores celulares reveló los detalles que a continuación se

describen. Los animales negativos a PCV2 destacaron por un elevado número de

células CD79α+ (Linfocitos B) y valores muy inferiores para CD68+. Los valores de

CD3 fueron ligeramente inferiores al primero. Los datos obtenidos se encuentran

reflejados en el siguiente gráfico.

Esta distribución de la población celular se debe a la propia conformación de la lesión

tuberculosa. Estudios inmunohistoquímicos realizados en jabalí confirman una mayor

presencia de linfocitos B y linfocitos T, acompañada de un menor número de

macrófagos conforme avanza el desarrollo de las lesiones tuberculosas desde los

granulomas iniciales (tipos I y II) hasta las etapas finales (tipos III y IV) (García-

Jiménez et al., 2013). En nuestro caso, los animales negativos a PCV2 presentaron un


101

patrón de expresión de granulomas que tiende a la formación de granulomas de tipos

III y IV, de ahí la mayor presencia de células CD79α+ y CD3+, y la menor de células

CD68+. Todo ello indica la evolución orgánica hacia lesiones más inertes.

Estudio de mediadores de la inmunidad

En el caso del estudio de mediadores de la inmunidad, los mayores recuentos los

obtenemos en la producción de IL1 e IFNγ, siendo notablemente inferiores los

obtenidos para de IL10 y de iNOS; este último marcador estableció el recuento

mínimo. Los resultados obtenidos en el estudio se pueden observar en el siguiente

gráfico.

En los animales negativos a PCV2, la diferente producción de mediadores de la

inmunidad sólo puede venir influenciada por el proceso tuberculoso. En el caso de la

tuberculosis, se ha demostrado que tanto la expresión del IFNγ como del iNOS decrece

ligeramente al avanzar los estadios de las lesiones tuberculosas (García-Jiménez et al.,

2013). Los recuentos en la expresión de IL1 e IL10 derivan de la presencia, activación


102

y equilibrio de acciones de los linfocitos T y macrófagos principalmente (Tehmina et

al., 2006). Además, los bajos recuentos de expresión de IL10 se encuentran

relacionados con una mayor activación de la respuesta inmunitaria ante la infección

por Mycobacterium bovis (Jacobs et al., 2002). La sincronía entre altos niveles de IFN-

γ y bajos niveles de IL10 será la determinante del correcto equilibrio entre la acción de

linfocitos Th1 y Th2, y por tanto, de la adecuada evolución del cuadro tuberculoso en

el animal (Surcel et al., 1994; Tsukaguchi et al., 1995; Pollock et al., 2002, 2005,

2006).


103

Grupo II: Animales positivos a PCV2.


En los animales que presentaron anticuerpos frente a PCV2, los mayores recuentos

obtenidos en los linfonodos de estudio corresponden a la presencia de linfocitos B en

las lesiones tuberculosas. En cotas inferiores se encuentran los recuentos de linfocitos

T y cercanos a estos, los macrófagos. Dichos valores están representados en el

siguiente gráfico.

Los datos obtenidos en este estudio muestran valores más próximos entre sí que los

mostrados por los animales negativos a PCV2. Este cambio en la expresión viene dado

por el propio desarrollo de la lesión granulomatosa en este grupo de individuos. Estos

animales positivos, como hemos visto anteriormente, tienen una mayor tendencia a la

formación de granulomas de tipos I y II. En estos tipos de granulomas, la presencia de

macrófagos es mucho mayor, de ahí esos recuentos superiores. Además, la ausencia

de evolución de los granulomas a estadios más avanzados, excluye la ligera subida en

los marcadores CD3 y CD79α descrita en la bibliografía (García-Jiménez et al., 2013) y


104

la diferenciación de los valores de estos con aquellos de CD68. Este efecto se debe a la

propia acción de PCV2, que provoca depleción linfoide de linfocitos B, T y NK

(Shibahara et al., 2000; Quintana et al., 2001; Darwich et al., 2002; Nielsen et al.,

2003), lo cual se manifiesta en la propia lesión tuberculosa.


En el estudio de los mediadores de la inmunidad nos encontramos con dos situaciones

completamente distintas. Las interleucinas IL10 e IL1 poseen unos recuentos elevados,

mientras que los recuentos de IFNγ e iNOS son bastante más discretos. Cabe destacar

los recuentos similares de iNOS y de IFNγ. Los detalles de los recuentos se encuentran

expresados en el siguiente gráfico.

El perfil de mediadores de la inmunidad presente en los animales positivos a PCV2 nos

da idea de su nivel de defensa frente a la infección tuberculosa. La diferencia de

expresión entre los niveles de IL10 e INF-γ, y por tanto entre la acción de linfocitos

Th1 y linfocitos Th2, determinante en el empeoramiento del cuadro clínico, apunta a

que los animales positivos a PCV2 presentan una peor evolución del proceso


105

tuberculoso (Surcel et al., 1994; Pollock et al., 2002, 2005, 2006). Esta diferencia entre

la expresión de IL10 e INF-γ viene dada por la propia acción del PCV2, ya que está

demostrado que aumenta los niveles de IL10 (Darwich et al., 2003; Kim et al., 2004;

Sipos et al., 2004; Doster et al., 2010) y disminuye la capacidad de producción de INF-

γ (Darwich et al., 2003). Los valores elevados de expresión de IL1 también pueden ser

explicados por la sobreexpresión de esta interleucina asociada a PCV2 (Darwich et al.,

2003), así como a un mayor número de macrófagos, más frecuentes en granulomas de

tipos I y II. Además, este aumento de macrófagos asociados a granulomas tipos I y II,

concuerda con los valores obtenidos en los recuentos de iNOS, superiores a aquellos

observados en los animales negativos, y con estudios anteriores en los que se observó

un aumento del iNOS en esos tipos de granulomas (García-Jiménez et al., 2013).


106

Grupo III: Animales vacunados frente a PCV2.


Los animales vacunados destacan por unas poblaciones celulares donde predominan

los linfocitos B y en menor medida los T, con recuentos mínimos en el caso de los

macrófagos. Los resultados obtenidos se encuentran resumidos en el siguiente gráfico.

Si comparamos estos datos con los obtenidos en los animales negativos a PCV2,

observamos gran similitud entre ellos. Por el contrario, si los comparamos con los

obtenidos en los animales positivos a PCV2, aun siendo las poblaciones predominantes

las mismas, las diferencias son mucho más marcadas. El efecto de depleción linfoide

que podría ejercer PCV2 sobre las estirpes de linfocitos B y T se encuentra mitigado,

aunque los niveles no lleguen a los obtenidos en los animales negativos (Shibahara et

al., 2000; Quintana et al., 2001; Darwich et al., 2002; Nielsen et al., 2003). Por lo

demás, las poblaciones representadas expresan la evolución en el desarrollo de los

granulomas hacia fases avanzadas de la lesión, principalmente granulomas tipos III y


107

IV, con una población predominante de linfocitos B y T, y un menor número de

macrófagos (García-Jiménez et al., 2013).


En los animales vacunados, destaca la elevada presencia de IL1 e INF-γ en los

recuentos de las muestras de estudio. IL10 e iNOS evidencian valores menores dentro

del estudio, con una marcada diferencia frente a los otros dos mediadores

inmunitarios. Los resultados obtenidos se encuentran representados en el siguiente

gráfico.

El grupo de animales vacunados presenta unos niveles elevados de INF-γ asociados a

niveles bajos de IL10. Esta circunstancia nos hace constatar que la relación entre la

acción de los linfocitos Th1 y Th2 está encaminada a una mayor protección y mejor

evolución del procesos tuberculoso en el animal (Surcel et al., 1994; Pollock et al.,

2002, 2005, 2006). Los bajos niveles de expresión de iNOS concuerdan con la descrita

en los granulomas avanzados, microbiológicamente menos activos, predominantes

dentro de este grupo de animales, como hemos visto anteriormente y como apuntaran


108

García-Jiménez et al. (2013). Finalmente, en cuanto a los niveles de IL1, similares a los

presentes en los animales negativos, son presumiblemente consecuencia de una acción

inflamatoria de defensa frente a la infección bacteriana.


109

Resultados del estudio comparativo de marcadores

individuales.

CD3

ANOVA

Test de Tukey

Los test estadísticos realizados demuestran la existencia de diferencias en los niveles

de expresión de CD3 entre los distintos grupos. Los animales positivos a PCV2

presentan una menor expresión de células CD3+, mientras que los animales que no

han tenido contacto con PCV2 presentan recuentos superiores. Los animales

vacunados de PCV2 muestran valores intermedios de expresión del marcador celular.

El hecho de la existencia de una mayor expresión de células CD3+ en los animales

negativos a PCV2 puede ser consecuencia de la mayor presencia de este tipo de

células en la evolución de las lesiones tuberculosas, especialmente marcada en los

granulomas de tipos III y IV (García-Jimenez et al., 2013). En nuestro caso, los valores

se sitúan en una posición intermedia, posiblemente por los escasos granulomas de tipo

III que evidencian, por lo que los recuentos celulares CD3+ son casi exclusivamente

debidos a la presencia de dichos granulomas de tipo IV. Además de esto, dichos

resultados se ajustarían a lo esperado del consabido efecto viral de depleción linfoide

en diversos órganos (Shibahara et al., 2000; Quintana et al., 2001; Darwich et al.,

2002; Nielsen et al., 2003).


110

Por lo tanto, la vacunación de los animales favorece la proliferación de linfocitos T, sin

llegar a los niveles presentes en los animales que no han sufrido contacto previo con el

patógeno viral. Este hecho puede deberse a que la vacuna mitiga el efecto del propio

virus y su acción de depleción linfoide, uno de los principales factores de patogenicidad

del virus.

Los resultados obtenidos se encuentran resumidos en el siguiente gráfico:


111

CD79α

ANOVA

Test de Tukey

Ambos test estadísticos demuestran la existencia de diferencias estadísticamente

significativas entre los tres grupos de estudio en cuanto a la presencia de células

CD79α+. Los mayores recuentos de linfocitos B se observan en los animales negativos

a PCV2, mientras que los menores son atribuidos a los animales positivos a PCV2; los

sujetos de estudio vacunados poseen valores intermedios. Sin embargo, estos valores

son mucho más cercanos a aquellos presentes en los animales seronegativos

(p=0.032). Esta situación hace pensar que la expresión de linfocitos B por parte de los

animales vacunados tiende a asemejarse a la expresión de los animales sin contacto

con el patógeno viral.

Los cambios observados entre los animales seropositivos a PCV2 frente a los otros dos

grupos posiblemente se deben al diferente desarrollo de la lesión granulomatosa y al

efecto de depleción linfoide ejercida de manera directa por el virus.

Al igual que ocurre con los linfocitos T, en la lesión tuberculosa los linfocitos B se

encuentran en mayor número en los granulomas de tipo III y IV (García-Jiménez et al.,

2013). Por lo tanto, al ser estos tipos de granulomas los más habituales en los

animales no infectados así como en los animales vacunados, los recuentos de linfocitos

B son sustancialmente mayores en estos grupos. A este dato debemos sumar la propia

acción vírica, que provoca una disminución de los linfocitos B en el animal de manera


112

general, lo que concuerda también con los resultados obtenidos en el experimento. En

cuanto a la ligera diferencia de expresión entre el grupo de vacunados y el grupo de

negativos, esta puede deberse a la casi completa ausencia de granulomas de tipo III

en los primeros, de manera similar a lo sucedido con CD3+.

En este caso, la vacunación mejora sustancialmente la expresión de linfocitos B frente

al grupo de animales seropositivos, acercándose dicha expresión casi a los niveles

presentes en los animales sin contacto viral. Esta mejora se debe principalmente a dos

hechos, el completo desarrollo de las lesiones tuberculosas hacia los estadios más

avanzados y la disminución del efecto depresor del virus en cuanto a la estirpe

linfocítica.

Los resultados del análisis se encuentran reflejados en el siguiente gráfico:


113

CD68

ANOVA

Test de Tukey

El estudio de la expresión de células CD68+, principalmente macrófagos y monocitos,

arroja los mayores contajes en el grupo de animales positivos a PCV2. Los grupos

negativos a PCV2 y vacunados, sin embargo, presentan valores considerablemente

inferiores y sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos (p=0.259).

La diferencia de expresión entre los animales positivos a PCV2 y los otros dos grupos

de estudio puede ser debida al diferente desarrollo de las lesiones. Estudios anteriores

donde se utilizó MAC387 como marcador para macrófagos y monocitos, determinaron

una mayor presencia de dichas células en los granulomas de tipos I y II, decreciendo

su número cuando las lesiones evolucionaban hacia granulomas de tipos III y IV

(García-Jiménez et al., 2013). Al existir en los animales seropositivos una mayor

proporción de granulomas de tipos I y II, los recuentos de células CD68+ son más

elevados con respecto a los otros dos grupos de estudio, en los que predominan

principalmente los granulomas de tipos III y IV (en el caso de animales vacunados,

casi exclusivamente granulomas de tipo IV).

Además, la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de

seronegativos y vacunados, apunta a que la vacuna frente a PCV2 ayuda al animal a

alcanzar un estatus de inmunidad similar a los animales sin contacto previo con el

virus.


114

Los datos del estudio se encuentran resumidos en el siguiente gráfico:


115

IFN γ

ANOVA

Test de Tukey

En el caso de la expresión de IFN-γ (producida por linfocitos T y NK), la mayor

expresión de esta citoquina estimulante de macrófagos se encuentra en el grupo de

animales vacunados frente a PCV2. Con valores inferiores se encuentran los animales

seronegativos, aunque próximos a los primeros (p=0.031); finalmente, los animales

seropositivos presentan una expresión mínima de IFN-γ, con aproximadamente la

mitad de células inmunomarcadas de los valores obtenidos en los grupos restantes.

En estos cambios observados entre los distintos grupos pueden influir dos factores. Por

una parte, estudios realizados con anterioridad en jabalí demostraron que la expresión

de IFN-γ está presente en todos los estadios de la lesión granulomatosa, aunque sufre

un decremento significativo en los estadios últimos de la misma, los granulomas tipo

III y IV (García-Jiménez et al., 2013). Además, la expresión de esta interleucina por

parte de animales infectados por PCV2 es mucho menor en comparación con cerdos no

infectados (Darwich et al., 2003), por lo que el efecto inmunosupresor del virus puede

influir en la expresión de ésta. En nuestro caso concreto, teniendo en cuenta los bajos

recuentos de IFN-γ obtenidos en los animales seropositivos, nos hace pensar que el

efecto inmunosupresor ejercido por el virus es mucho más patente que la disminución

de dicha expresión al avanzar los estadios de los granulomas. Este hecho hace que los

animales seropositivos tengan recuentos mucho más bajos que los animales


116

seronegativos o vacunados, que tienen sólo un ligero descenso por la propia evolución

de los granulomas.

Por tanto, pensamos que la vacunación del animal no sólo mejora la capacidad de

expresión de IFN-γ frente a animales infectados, si no que presenta incluso una mayor

que los animales seronegativos, ejerciendo la vacuna como estimulante en la

producción de IFN-γ. Dicha estimulación de la expresión del IFN-γ puede conducir a un

mejor control de la enfermedad tuberculosa, estimulando los mecanismos de defensa

del animal que originan una más rápida evolución en las lesiones hacia aquellas

microbiológicamente más inertes y controladas.

Los resultados obtenidos se encuentran reflejados en el siguiente gráfico:


117

IL-1

ANOVA

Test de Tukey

En el caso de la citoquina proinflamatoria IL1, los mayores niveles de inmunomarcaje

se encuentran en el grupo de estudio de los animales seropositivos; los menores se

atribuyen al grupo de animales seronegativos, mientras que el grupo de animales

vacunados se encuentra en una posición intermedia, mucho más cercana a los valores

presentados por los seronegativos (p=0.018).

Estos valores tan superiores en el grupo de animales positivos podrían explicarse

basándonos en dos factores: por una parte, la producción mayoritaria de IL1 por parte

de macrófagos activados concuerda con la presencia de este tipo de células en ese

grupo de estudio al tener mayor porcentaje de granulomas de tipos I y II, confirmados

con el estudio del marcador CD68, y anteriormente con el marcador MAC387 (García-

Jiménez et al., 2013); por otra, el efecto marcadamente estimulante del PCV2 sobre la

producción de ciertas citoquinas, como pueden ser la IL1 (especialmente la IL1β), ha

sido demostrado tanto en cerdos infectados (Darwich et al., 2003) como en animales

con patologías pulmonares propiamente dichas (Chae et al., 2010). Estos dos factores

determinan la respuesta exacerbada encontrada en los animales positivos.

En cambio, en el grupo de animales vacunados, los valores descienden hasta rozar

aquellos encontrados en los animales sin contacto con el patógeno viral, por lo que


118

podemos vislumbrar un aspecto inmunorregulador de la vacuna según la producción de

IL1. Este aspecto inmunorregulador de la vacuna se debe a la acción ejercida contra el

virus, eliminando su efecto estimulante en cuanto a la producción de IL-1, y en

consecuencia, de la mejora en la defensa y control de la enfermedad, con una

evolución del granuloma hacia estadios más avanzados, en las que existe un menor

número de macrófagos activados.

El siguiente gráfico resume los resultados obtenidos en el análisis:


119

IL-10

ANOVA

Test de Tukey

Al igual que lo ocurrido en el estudio de la IL1, los niveles más altos de expresión de

IL10 (antiinflamatoria) corresponden a los animales seropositivos, con unos valores

del doble de aquellos obtenidos tanto en los animales seronegativos y en los individuos

vacunados, siendo estos últimos valores prácticamente iguales (p=0.927).

Esta sobreexpresión de IL10 encontrada en los animales positivos a PCV2 se debe al

efecto inmunomodulador del virus. Muchos estudios han confirmado el aumento de los

niveles de IL10 en animales infectados por PCV2 o animales que han desarrollado

PMWS, tanto en tejidos como en sangre periférica (Darwich et al., 2003; Kim et al.,

2004; Sipos et al., 2004; Doster et al., 2010). Sin embargo, al estar relacionada la

presencia de linfocitos T con la mayor producción de IL10 (Doster et al., 2010), dichos

resultados discrepan con los nuestros obtenidos para el marcador CD3, que reflejaban

una menor presencia de linfocitos T en los animales seropositivos. Esta producción y

sobreexpresión de IL10 causada por el virus es sensiblemente más potente que las

posibles interferencias del propio virus en cuanto a la presencia o ausencia de linfocitos

T en las lesiones tuberculosas. Por ello, cabe pensar que la sobreexpresión ejercida por

el virus es mucho más marcada de lo presumiblemente esperable, ya que los datos de

expresión de IL-10 obtenidos son marcadamente más altos en el grupo de

seropositivos, aun teniendo menos linfocitos T en las muestras de estudio.


120

En cuanto al efecto vacunal, los niveles de expresión de IL10 del grupo vacunado son

prácticamente iguales a los presentados por los animales seronegativos, lo que apunta

un efecto claro de la vacuna ante la acción inmunorreguladora ejercida por el virus,

determinando la desaparición de la sobreexpresión de IL10 provocada por este.

Los datos obtenidos están resumidos en el siguiente gráfico:


121

iNOS

ANOVA

Test de Tukey

El estudio de niveles de expresión de iNOS arroja diferencias estadísticamente

significativas entre los tres grupos de estudio. Los contajes más elevados corresponden

a los sujetos del grupo de seropositivos, muy lejanos de los expresados por

seronegativos y vacunados. En cuanto a estos dos grupos, los niveles de expresión en

los animales seronegativos muestran los valores mínimos, con los vacunados en

registros intermedios, más cercanos a los seronegativos que a los seropositivos,

aunque con diferencias estadísticamente significativas al compararlos.

Esta mayor expresión de iNOS se debe a su dependencia de macrófagos en las

lesiones. Estos se describen en mayor número en los granulomas de tipos I y II, y

menor en los granulomas de tipos III y IV (García-Jiménez et al., 2013), dato

confirmado anteriormente en este mismo estudio mediante el marcador CD68. El

número más elevado de macrófagos en lesiones biológicamente más activas, los

granulomas de tipos I y II, y teniendo en cuenta su mayor presencia en los animales

del grupo de positivos a PCV2, hace que los valores de expresión de iNOS en dicho

grupo sean los mayores detectados. Por otra parte, los grupos de seronegativos y de

animales vacunados presentan contajes mucho menores, debido al predominio de

granulomas predominantes tipos III y IV, en los que el número de macrófagos es


122

menor por ser lesiones biológicamente menos activas, y por ende, con menor número

de células productoras de iNOS.

En cuanto al efecto del virus sobre la capacidad de fagocitosis de los macrófagos,

relacionada con la expresión de iNOS y descrito por otros autores en experiencias in

vitro (Chang et al., 2006), parece no estar presente o tener una menor entidad que la

posible influencia de los distintos tipos de granulomas observados. Aunque está

descrita una menor capacidad de fagocitosis por parte de los individuos infectados y,

con ello, una menor expresión de iNOS, la mayor presencia de macrófagos en

granulomas de tipos I y II es la causante de la mayor expresión global de iNOS.

El efecto vacunal en este caso determina una expresión de iNOS de menor cuantía,

posiblemente debido a la presencia de menos macrófagos activados, por una evolución

más rápida de las lesiones hacia estadios más inertes. Sin embargo, la acción de la

vacuna presenta diferencias estadísticamente significativas frente a los animales

seronegativos, por lo que, aunque existe un efecto evidente de la vacuna sobre el

iNOS, esta no llega a mejorar el estatus del animal tanto como la ausencia de contacto

con el patógeno.


123

Los resultados del análisis estadístico se encuentran resumidos en el siguiente gráfico:


124

Gráfico resumen

Para una mejor comprensión de los resultados globales del estudio inmunohistoquímico

hemos confeccionado un gráfico resumen en el que se ponen de manifiesto las

posibles diferencias o semejanzas entre los tres grupos de estudio.

Gráfico. Valores obtenidos en los recuentos de los tres grupos de estudio.

Como podemos observar en dicho gráfico, los datos referidos a los animales negativos

a PCV2 y los animales vacunados frente a PCV2 discurren de manera similar con todos

los marcadores. Por el contrario, los animales positivos a PCV2 presentan siempre unos

valores muy alejados de los dos grupos anteriormente referidos. Esto pone de

manifiesto, por una parte, la diferencia entre los grupos de estudio, y por otra, la

efectividad de la vacunación frente a PCV2 demostrada tanto por el estudio de la

población celular presente en los granulomas como por la expresión de citoquinas y

componentes mediadores de la inmunidad.

0

20

40

60

80

100

120

Positivos PCV2

Negativos PCV2

Vacunados PCV2


125

Conclusiones


126


127

Conclusiones.

Una vez estudiados los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis,

podemos apuntar las siguientes conclusiones teniendo en cuenta los objetivos

planteados.

1. Primer objetivo: Determinar los procesos inflamatorios y daños estructurales

presentes en el pulmón de jabalí, así como las posibles relaciones con otros

factores de estudio, especialmente con el Circovirus Porcino Tipo II.

a. Los animales jóvenes son los más propensos a presentar procesos

inflamatorios de mayor entidad, especialmente peribronquitis, y daños

estructurales más severos.

b. Los machos presentan daños estructurales en la pleura más marcados

que las hembras, posiblemente causados por su propio comportamiento.

c. No existe relación evidente entre el Circovirus Porcino Tipo II y los

daños estructurales pulmonares o los fenómenos inflamatorios

presentes en este órgano.

2. Segundo objetivo: Estudiar la posible relación entre el Circovirus Porcino Tipo II

y la tuberculosis, principalmente su posible implicación en el desarrollo del

granuloma tuberculoso.

a. No existen diferencias cuantitativas en el número medio de granulomas

entre animales positivos y negativos a PCV2. Los animales positivos a

PCV2 desarrollan granulomas patológicamente menos evolucionados;

los animales negativos, por el contrario, muestran granulomas

completamente desarrollados.

b. Los animales con tuberculosis generalizadas tienen mayor tendencia a la

formación de granulomas no desarrollados; en aquellos con formas

localizadas predominan los granulomas completamente desarrollados

(Diferencias cualitativas).

c. Los animales positivos a PCV2 presentan patrones de expresión de

granulomas similares a los casos de tuberculosis generalizada. Así

mismo, los animales negativos a PCV2 desarrollan patrones de

expresión de granulomas comunes en tuberculosis localizada.


128

3. Tercer objetivo: Determinar la posible influencia de la vacunación frente a

Circovirus Porcino Tipo II en el desarrollo del granuloma tuberculoso, mediante

el estudio inmunohistoquímico de las principales poblaciones celulares

implicadas en la respuesta inmune y la producción de mediadores de la

inflamación.

a. Los animales vacunados frente a PCV2 tienen una marcada tendencia a

presentar granulomas completamente desarrollados. En los no

vacunados, por el contrario, destacan los granulomas inmaduros.

b. El grado de inmunomarcaje de los animales vacunados frente a

Circovirus Porcino Tipo II presenta, de manera general, valores similares

en los animales negativos al virus.

c. En el estudio de las poblaciones celulares observadas, los animales

vacunados y negativos al virus presentan una respuesta linfocitaria

mayor que los animales positivos al virus. Por el contrario, la respuesta

macrofágica es menor que en los animales positivos al virus.

d. En el estudio de mediadores de la inmunidad, los animales vacunados y

negativos al virus presentan niveles similares e inferiores a los

observados en animales positivos, a excepción del INF-γ, en el que los

niveles de expresión son superiores.

e. A tenor de los estudios inmunohistoquímicos, el parecido observado

entre los animales vacunados y negativos a PCV2, a diferencia de los

positivos, indica un efecto beneficioso de la vacunación sobre la

respuesta inmune del individuo frente a tuberculosis.


129

Anexo I.

Galería de imágenes de los resultados de

las pruebas inmunohistoquímicas.


130


131

Estudio inmunohistoquímico para la expresión de

CD3.


132


CD79α.


133


CD68.


134


INF-γ.


135


IL1.


136


IL10.


137


iNOS.


138


139

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