identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*7 pada subjek …

i

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Marisa Hayuningsih

NIM : 168114021

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Marisa Hayuningsih

NIM : 168114021

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020


iii


iv


v


vi


vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sebab Aku ini mengetahui rancangan-rancangan apa yang ada pada-Ku

mengenai kamu, demikianlah firman TUHAN, yaitu rancangan damai sejahtera

dan bukan rancangan kecelakaan, untuk memberikan kepadamu hari depan yang

penuh harapan”

(Yeremia 29 : 11)

Kupersembahkan karya ini kepada Tuhan Yesus Kristus,

keluarga yang telah memberikan kasih sayang, doa, dan dukungan,

dosen yang telah mendidik selama ini,

teman-teman yang selalu memberi dukungan dan semangat,

Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat untuk menimba

ilmu dan pengalaman.


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan penyertaan-Nya, sehingga penelitian dan penyusunan skripsi dengan

judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok

Suku Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” dapat

penulis selesaikan. Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine

Patramurti Apt. dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel *4, *7, dan *9 pada

Subjek Uji Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di Indonesia dengan

Metode Polymerase Chain Reaction”.

Penulis sadar bahwa proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari

dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini

penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada :

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma sekaligus dosen pembimbing yang telah

bermurah hati meluangkan waktu untuk membimbing dan memberi masukan

serta arahan kepada penulis.

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc. selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk

penggunaan segala fasilitas laboratorium selama penelitian, sekaligus dosen

penguji yang telah memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam

penelitian ini.

4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang telah

memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.

5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah memberikan bimbingan selama ini.

6. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.


ix


x

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i

HALAMAN JUDUL ............................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................. vi

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... vii

PRAKATA ........................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ........................................................................................................... x

DAFTAR TABEL .................................................................................................. xi

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiii

ABSTRAK ........................................................................................................... xiv

ABSTRACK ........................................................................................................... xv

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

METODE PENELITIAN ........................................................................................ 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 6

KESIMPULAN ..................................................................................................... 13

SARAN ................................................................................................................. 14

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 15

LAMPIRAN .......................................................................................................... 16

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 29


xi

DAFTAR TABEL

Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7…………………………12


xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis………………………………………………………………..……..8

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1…………………10

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR alel gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7

(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer

ditunjukkan oleh warna biru) …………………………………………..…..……11

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai isolat DNA…………...12


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian .......................................................... 17

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ......................... 18

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix .......................... 19

Lampiran 4. Product Datasheet of CYP2A6*7 Forward and Reverse Primer ... 20

Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers ........................... 21

Lampiran 6. Karakteristik Sampel....................................................................... 22

Lampiran 7. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum .................. 23

Lampiran 8. Frekuensi Alel Gen CYP2A6*7 pada Suku Tionghoa ................... 24

Lampiran 9. Hasil Kuisioner ............................................................................... 25

Lampiran 10. Perhitungan Jumlah Sampel ......................................................... 28


xiv

ABSTRAK

Sitokrom P450 2A6 atau CYP2A6 adalah gen pengkode enzim yang

memiliki peran dalam aktivasi senyawa nitrosamin, sehingga senyawa tersebut

dapat menjadi karsinogenik. Gen ini diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi

di Asia. Adanya polimorfisme tersebut akan berpengaruh pada aktivitas enzim

CYP2A6 dalam mengaktivasi nitrosamin. CYP2A6*7 adalah salah satu variasi

yang terjadi akibat Single Nucleotide Polymorphism (SNP), yaitu substitusi

nukleotida tunggal T menjadi C pada urutan basa nukleotida 8454 yang

menyebabkan penurunan aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin. Variasi alel gen

ini ditemukan pada suku Tionghoa dengan frekuensi yang cukup tinggi, yaitu

6,98%. Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alel gen CYP2A6*7 pada 30

subjek uji nonperokok suku Tionghoa Indonesia dengan metode Polymerase

Chain Reaction (PCR) dan analisis dengan elektroforesis. Hasil penelitian

menunjukkan tidak adanya alel CYP2A6*7 pada subjek uji nonperokok suku

Tionghoa Indonesia, sehingga tidak terjadi penurunan aktivitas enzim CYP2A6

hingga 35% dalam mengaktivasi nitrosamin.

Kata kunci : CYP2A6*7, PCR, Polimorfisme, Tionghoa


xv

ABSTRACT

Cytochrome P450 2A6 or CYP2A6 is an enzyme coding gene that

activates the nitrosamine compounds, so these compounds can be carcinogenic.

This gene is known to have high polymorphisms in Asia. The presence of

polymorphisms will affect the activity of the CYP2A6 enzyme in activating

nitrosamine. CYP2A6*7 is one of the variations that occur as a result of Single

Nucleotide Polymorphism (SNP), a single-nucleophile substitution of T to C in

8454 sequence which decreases the activity of nitrosamine activation by CYP2A6.

The variant of this gene is found in Chinese ethnic with a high frequency, which is

6.98%. This study identifies CYP2A6*7 gene allele in 30 Indonesian Chinese

ethnic non-smokers using Polymerase Chain Reaction (PCR) method and its

analysis using electrophoresis. The results showed there is no CYP2A6*7 allele in

Indonesian Chinese ethnic non-smokers, so there is no decrease up to 35% in the

activity of nitrosamine activation by CYP2A6.

Keywords : CYP2A6*7, PCR, Polymorphism, Chinese


1

PENDAHULUAN

Kanker merupakan penyakit penyebab kematian kedua di dunia dengan

angka kematian 9,6 juta pada tahun 2018 (WHO, 2018). World Health

Organization (WHO) melaporkan bahwa kanker paru merupakan salah satu dari

lima besar jenis kanker penyebab kematian di dunia, baik pada laki-laki maupun

perempuan. Menurut data GLOBOCAN (IARC) tahun 2012, kanker paru

merupakan penyebab utama kematian akibat kanker pada penduduk laki-laki

(30,0%) dan penyebab kematian akibat kanker kedua pada penduduk perempuan

(11,1%). Faktor risiko kematian akibat kanker paru yang paling dominan adalah

penggunaan tembakau, seperti kebiasaan merokok (Kementerian Kesehatan

Republik Indonesia, 2015).

Bahaya dari merokok tidak hanya mengancam jiwa perokok (perokok

aktif) saja, tetapi juga mengancam orang yang ada di sekitarnya (perokok pasif)

(Susana, 2003). Individu yang pernah menghirup asap rokok memiliki risiko

terkena kanker paru karena asap rokok mengandung senyawa yang berbahaya,

seperti nitrosamin (Hecht, 1998). Senyawa ini akan menjadi karsinogen apabila

telah diaktivasi oleh enzim sitokrom P450 2A6.

Sitokrom P450 2A6 atau CYP2A6 adalah salah satu enzim dari sub

famili gen sitokrom P450 yang memiliki peran penting dalam metabolisme

beberapa senyawa kimia (Patramurti et al., 2015). CYP2A6 juga mengaktivasi

beberapa senyawa prokarsinogen, seperti aflatoxin B1, butadiena, dan nitrosamin.

Enzim ini dapat mengalami polimorfisme yang akan berpengaruh pada ekspresi,

stabilitas, dan fungsi dari enzim (Hodgson, 2010). Penyebab terjadinya

polimorfisme ini bervariasi, seperti Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs),

delesi, duplikasi, konversi dan frameshift (Pharmvar, 2019). Hingga Februari

2012, terdapat sejumlah 38 variasi alel CYP2A6 dan beberapa di antaranya

mengalami SNPs (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

CYP2A6*7 adalah salah satu variasi yang terjadi akibat SNP pada urutan

basa nukleotida 8454, yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim pengaktivasi

nitrosamin. Hal ini terjadi karena substitusi satu basa nukleotida T menjadi C pada

urutan 8454 yang menyebabkan ekspresi dari gen tersebut menjadi tidak normal,


2

sehingga aktivitas dari enzim yang dikode oleh gen tersebut juga terpengaruh.

Individu yang memiliki alel CYP2A6*7 dikategorikan sebagai kelompok

intermediate metabolizer, yang berarti aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin

mengalami penurunan hingga 35%. Hal ini menyebabkan nitrosamin menjadi

kurang karsinogenik dan tidak menyebabkan risiko kanker paru (Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012). Informasi terkini menunjukkan bahwa CYP2A6*7 adalah

salah satu polimorfisme CYP2A6 utama yang umum di Asia (Minematsu et al.,

2006). Frekuensi CYP2A6*7 pada perokok maupun nonperokok suku Tionghoa

cukup tinggi, yaitu sebesar 6,98% (Nurfadhlina et al., 2006). Penelitian ini telah

mengidentifikasi alel gen CYP2A6*7 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa

Indonesia dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu proses amplifikasi atau

penggandaan untaian basa-basa DNA yang dibatasi oleh pasangan primer

pengapitnya melalui teknik pengaturan suhu dan penggunaan enzim yang tahan

terhadap suhu tinggi (Matfutchah et al., 2014). Proses PCR merupakan proses

dengan siklus berulang, yang meliputi denaturasi rantai double helix (rantai

double helix DNA terurai menjadi dua untai cetakan DNA tunggal), annealing

(pengenalan primer ke pita DNA yang sesuai), dan ekstensi (proses polimerasi

untuk pembentukan untai DNA baru) oleh enzim Taq DNA polymerase.

METODOLOGI PENELITIAN

Alat

Alat yang digunakan adalah vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4

mg, PCR tubes, spuit injeksi 3 mL, Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set

Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific), timbangan

analitik dengan ketelitian 0,0001 g (Metler Toledo), dispossable gloves, centrifuge

(Fisher Scientific), elution tubes, collection tubes, kolom FABG, water bath, hot

plate (Ika Combinag-red), kamera mirrorless fujifilm XA3, blue tip, yellow tip,

white tip, ice box, mikropipet ukuran 10 L dan 1000 L (Socorex Swiss), gelas

beaker (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), dan pipet volume

(Pyrex).


3

Bahan

Bahan yang digunakan adalah sampel darah subjek uji nonperokok suku

Tionghoa Indonesia, primer forward (5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-

3’) dan primer reverse (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’) (Minematsu et

al., 2006), Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA polymerase,

dNTPs, MgCl2, dan reaction buffer), FavorPrepTM

Blood Genomic DNA

Extraction Mini Kit (berisi FABG buffer, W1 buffer, wash buffer, dan proteinase

K), agarose, Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer (10x), DNA Ladder 1 KB (0,25-10

kb), loading dye (berisi bromophenol blue, xylene cyanol FF, glycerol), etanol

70%, etanol absolut, aqua pro injection, nuclease free water, FluoroVueTM

Nucleic Acid Gel Stain, alkohol swab, dan es batu.

Kriteria Subjek Uji

Penelitian ini menggunakan subjek uji berjumlah 30 (tiga puluh) dengan

kriteria subjek uji yaitu tidak merokok, pernah terpapar asap rokok, dan suku

Tionghoa asli minimal third degree relatives (diketahui dari hasil wawancara).

Semua subjek uji bersedia menandatangani informed consent. Penelitian ini

mengecualikan subjek uji yang sedang mengonsumsi obat rutin, subjek uji dengan

penyakit yang mengharuskan untuk beristirahat total selama lebih dari 10

(sepuluh) hari dalam sebulan, penyakit hepar, dan penyakit lain yang disebabkan

oleh virus dan bakteri.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Pengambilan sampel darah dilakukan oleh tenaga kesehatan profesional,

dalam hal ini adalah perawat. Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek

uji menggunakan spuit injeksi 3 mL dan ditampung dalam vacutainer K2 yang

mengandung EDTA 5,4 mg. Darah yang diperoleh disimpan pada suhu 4 .

Isolasi DNA dari Sampel Darah

Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan reagen

FavorPrepTM

Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sampel darah yang

digunakan sebanyak 200 µL, dipindahkan ke dalam elution tube 1,5 mL.

Sebanyak 20 µL Proteinase K dan 200 µL FABG buffer ditambahkan ke dalam

sampel (Proteinase K jangan dicampurkan ke dalam FABG buffer), lalu divortex


4

sebentar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu 60°C selama 15 menit untuk

melisiskan sampel, setiap 3 menit divortex selama 30 detik. Sentrifugasi pada

kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Ditambahkan 200 µL etanol absolut ke

dalam sampel, kemudian divortex selama 30 detik. Sentrifugasi kembali pada

kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kolom FABG dipasangkan pada

collection tube, kemudian sampel pada elution tube dipindahkan ke dalam kolom

FABG dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 1 menit. Kolom FABG dilepas,

cairan pada collection tube dibuang, dan kolom FABG dipasangkan pada

collection tube baru. Kolom FABG segera dicuci dengan 500 µL W1 buffer,

disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit, lalu sisa cairan

dibuang. Kolom FABG kembali dicuci dengan 750 µL wash buffer, lalu

disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit dan sisa cairan

dibuang. Sentrifugasi selama 4 menit untuk mengeringkan kolom FABG. Kolom

FABG dipasangkan pada elution tube baru, kemudian ditambahkan 200 µL

elution buffer dan dibiarkan berdiri diam selama 3 menit. Setelah itu,

disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA

dan fragmen DNA disimpan pada suhu -20°C.

Penyiapan Gel Agarosa 1%

Gel agarose 1% digunakan sebagai fase diam dalam elektroforesis untuk

analisis kualitatif isolat DNA. Pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara

melarutkan 0,25 g agarose dalam 1 x larutan TBE sebanyak 25 mL, lalu

dipanaskan pada hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic

stirrer hingga larut. Kemudian ditambah 2,5 µL larutan nucleic acid gel stain dan

diaduk hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam cetakan yang telah

diberi sisiran pada bagian tepi dan gel dibiarkan mengeras. Setelah mengeras,

sisiran dicabut hingga terbentuk sumur-sumur sebagai tempat dimasukkannya

sampel yang akan diidentifikasi.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan metode elektroforesis.

Gel agarose ditempatkan dalam gel tray elektroforesis berisi buffer 1 x TBE

hingga permukaan gel terendam. Isolat DNA sebanyak 3,0 µL ditambah dengan


5

2,0 µL aquabidest dan 1,0 µL loading dye, kemudian dicampur pada platelet.

Campuran tersebut diambil dengan mikropipet, lalu dimasukkan ke sumuran gel

agarose. Salah satu sumuran diisi dengan DNA ladder sebanyak 5,0 µL,

kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 45 menit. Hasil

elektroforesis diamati di bawah UV transilluminator dan didokumentasikan

dengan menggunakan kamera mirrorless fujifilm XA3. Panjang pita akan

diketahui dengan menarik garis lurus masing-masing pita DNA sampel dengan

pita DNA ladder.

Amplifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7

Amplifikasi fragmen DNA alel gen sitokrom P450 2A6*7 dilakukan

dengan menggunakan primer forward: (3’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA

CAT-5’) dan primer reverse: (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’)

(Minematsu et al., 2006). Sebanyak 12,5 μL Promega Go Taq Green Master Mix,

1,25 μL forward primer, 1,25 μL reverse primer, 5,0 μL isolat DNA, dan 5,0 μL

nuclease free water dicampurkan hingga volume akhir 25,0 μL. Amplifikasi

dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR

yang digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95˚C selama 5 menit;

dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95˚C selama 20 detik; annealing pada

suhu 56,5˚C selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72˚C selama 30 detik. Siklus

amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final

ekstensi pada suhu 72˚C selama 5 menit.

Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis

Untuk melihat hasil produk PCR, dilakukan elektroforesis menggunakan

gel agarose 1,5 % sebagai fase diam. Gel agarose ditempatkan dalam gel tray

elektroforesis berisi buffer 1 x TBE hingga permukaan gel terendam. Produk PCR

sebanyak 5,0 μL dicampurkan dengan 1,0 μL loading dye, lalu diambil dengan

mikropipet dan dimasukkan ke sumuran gel agarose. Salah satu sumuran gel

agarose diisi dengan 3,0 μL DNA ladder, kemudian elektroforesis dijalankan

pada tegangan 110 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis dilihat dengan

menggunakan lampu UV transilluminator. DNA yang terekspresi

didokumentasikan dengan menggunakan kamera mirrorless fujifilm XA3.


6

Analisis Hasil

Hasil yang dianalisis adalah ada atau tidaknya dan frekuensi alel gen

sitokrom P450 2A6*7. Terbentuknya pita pada 439 bp menunjukkan tidak adanya

alel gen sitokrom P450 2A6*7. Adanya alel gen sitokrom P450 2A6*7

ditunjukkan dengan tidak terbentuknya produk. Frekuensi alel gen sitokrom P450

2A6*1 dan sitokrom P450 2A6*7 dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :

Frekuensi *1 =

100 %

Frekuensi *7 =

100 %

Frekuensi alel gen CYP2A6*1 didapatkan dari jumlah pita pada 439 bp

yang terbentuk dibagi dengan jumlah sampel yang digunakan (30 sampel),

kemudian dikalikan 100 %. Frekuensi alel gen CYP2A6*7 didapatkan dari jumlah

pita pada 439 bp yang tidak terbentuk dibagi dengan jumlah sampel yang

digunakan (30 sampel), kemudian dikalikan 100 %.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian polimorfisme CYP2A6 dilakukan empat tahapan utama,

yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari sampel darah subjek uji, analisis

kualitatif isolat DNA, dan analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis. Alel

CYP2A6*7 merupakan alel yang akan diidentifikasi pada penelitian ini.

Pemilihan alel CYP2A6*7 didasarkan pada terjadinya polimorfisme pada gen

CYP2A6 yang dapat mempengaruhi aktivasi senyawa nitrosamin dan risiko

terjadinya kanker paru.

Pemilihan Subjek Uji

Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 orang. Hal ini telah

sesuai dengan jumlah minimum subjek uji untuk penelitian polimorfisme genetik

(B-Rao, 2001). Subjek uji dipilih sesuai dengan kriteria inklusi yang telah

ditetapkan oleh peneliti. Subjek uji yang didapat berusia antara 17-25 tahun

dengan rata-rata usia subjek uji adalah 20 tahun, dengan 13 subjek uji laki-laki

dan 17 subjek uji perempuan. Keseluruhan subjek uji rata-rata pernah menghirup

asap rokok dengan frekuensi sedang.


7

Isolasi DNA dari Sampel Darah

Isolasi DNA dari 30 sampel darah dilakukan dengan menggunakan

FavorPrepTM

Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Isolasi DNA dilakukan

untuk memisahkan DNA dari bahan lain, seperti protein, lemak, dan karbohidrat.

Isolasi DNA harus menghasilkan DNA tanpa mengandung kontaminan seperti

protein maupun RNA (Surzycki, 2000). Sampel darah yang digunakan adalah

whole blood, yang mengandung sel darah putih (leukosit) dan komponen lainnya.

DNA terkandung dalam leukosit, sehingga dilakukan teknik sentrifugasi untuk

memisahkan leukosit dari komponen whole blood yang lain. Sampel darah

tersebut diisolasi dengan menggunakan Proteinase K dan FABG buffer untuk

melisiskan sel karena DNA terdapat pada nukleus. Penambahan buffer pada

isolasi DNA berfungsi untuk mencegah terjadinya degradasi DNA atau kerusakan

DNA akibat ion logam berat yang dapat mempengaruhi hasil deteksi

menggunakan gel pada elektroforesis. DNA yang telah dilisiskan diendapkan

dengan menggunakan etanol absolut, tujuannya adalah agar DNA yang telah lisis

tidak larut pada saat proses penghilangan kontaminan dengan W1 buffer dan wash

buffer. DNA yang telah dicuci kemudian dilarutkan dengan menggunakan elution

buffer, yang berfungsi untuk menjaga DNA yang dihasilkan agar tidak mengalami

kerusakan (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014). Isolat DNA dapat disimpan pada

suhu -70 untuk penyimpanan dalam waktu yang lebih lama, yaitu 5 tahun atau

lebih, serta penggunaan suhu ini juga dapat menjaga untai DNA agar tidak

mengalami kerusakan pada saat penyimpanan (Surzycki, 2000). Isolat DNA yang

dihasilkan dapat dilihat kemurniannya secara kualitatif dengan menggunakan

elektroforesis.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif dengan menggunakan

elektroforesis, tujuannya adalah untuk mengetahui kualitas DNA yang didapat.

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada

pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik

isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,

ukuran, besar muatan, dan sifat kimia dari molekul. Pemisahan dilakukan


8

berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung

oleh makromolekul tersebut (Pratiwi, 2001). Hasil elektroforesis dapat dilihat

dengan menggunakan lampu UV transilluminator. Apabila pita yang dihasilkan

berukuran lebih dari 10.000 bp serta merupakan pita tunggal dan tebal,

menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan murni, tidak tercemar, dan tidak

terdegradasi. Namun apabila terjadi variasi bentuk pita seperti pita ganda,

menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan sudah tercemar ataupun

terdegradasi menjadi fragmen yang lebih kecil, yaitu nukleotida penyusun DNA

atau penyusun nukleotida itu sendiri (karbohidrat, fosfat, dan basa nitrogen)

(Patramurti et al., 2015). Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa isolat DNA

menghasilkan pita tunggal dan tebal dengan ukuran lebih dari 10.000 bp, yang

berarti bahwa isolat DNA yang digunakan murni. Pita tunggal dan tebal dengan

ukuran lebih dari 10.000 bp tersebut menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi

masih utuh (Gambar 1).

M 1 2 3 4 5

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis

Keterangan :

M : DNA ladder 1 KB (0,25-10 kb) sebagai marker

1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1%; fase gerak larutan 1 TBE;

kecepatan 110 V/cm selama 45 menit; volume injeksi 6

µL

Isolat

DNA 10.000 bp

Lubang

injek


9

Amplifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7

Identifikasi alel CYP2A6*7 pada penelitian ini dilakukan dengan

menggunakan metode PCR (Minematsu et al., 2006). Prosedur identifikasi alel

dari CYP2A6*7 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian yang telah

dilakukan oleh Gaurine dan Agnes tahun 2017. Kondisi tiap tahap PCR yang

digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95˚C selama 5 menit; denaturasi pada

suhu 95˚C selama 20 detik; annealing pada suhu 56,5˚C selama 30 detik; dan

ekstensi pada suhu 72˚C selama 30 detik. Siklus amplifikasi tersebut dilakukan

sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72˚C selama 5

menit.

Proses penggandaan fragmen DNA pada proses PCR dimulai dengan

denaturasi atau pemutusan rantai DNA double helix menjadi rantai tunggal oleh

suhu tinggi. Rantai tunggal hasil denaturasi selanjutnya mengalami tahap

annealing, yaitu penempelan primer pada posisi forward dan reverse dengan

pengaturan suhu tertentu. Primer berfungsi sebagai penanda dan fragmen yang

memulai proses penggandaan DNA pada lokasi yang diinginkan.

Tahap kritis yang harus diperhatikan pada metode PCR adalah tahap

annealing. Berjalannya tahap ini ditentukan oleh suhu dan ketepatan primer. Suhu

pada tahap ini berpengaruh terhadap proses penempelan primer pada sekuen

DNA. Suhu yang tidak tepat menyebabkan primer tidak menempel pada sekuen

DNA target, sehingga proses penggandaan DNA tidak akan berjalan. Suhu

annealing ditentukan oleh komposisi primer yang digunakan, sehingga dalam

desain primer harus memperhatikan komposisinya agar bisa menempel pada

sekuen DNA target. Primer harus memenuhi syarat dalam hal jumlah maupun

komposisi karena primer harus cukup spesifik dan cukup sederhana agar bisa

menempel dan mengawali proses penggandaan sekuen DNA target. Primer juga

harus mengandung basa G/C dengan komposisi 40-60% dan jumlah basa pada

rentang 15-30. Urutan basa pada primer harus komplementer dengan sekuen DNA

target agar bisa menempel (Hans-Joachim et al., 2006). Primer yang digunakan

dalam penelitian ini yaitu primer forward (5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA

CAT-3’) dan primer reverse (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’)


10

(Minematsu et al., 2006). Pada penelitian ini digunakan primer dengan target alel

normal, yaitu CYP2A6*1 dengan menempel di daerah exon 9. Situs penempelan

primer pada fragmen DNA target ditunjukkan pada Gambar 2.

5’ 3’

CTCCCAGTCACCTAAGGACAT TTTTACCCGTACTTGCGGG

GAGGGTCAGTGGATTCCTGTA AAAATGGGCATGAACGCCC

5’ 3’

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1

Keterangan :

: Arah penempelan primer forward

: Arah penempelan primer reverse

Tahap terakhir adalah ekstensi, yaitu proses pemanjangan (pembentukan

rantai double helix oleh bantuan enzim DNA polymerase). Proses ini akan terus

terulang dari jumlah siklus yang diinginkan dan akan menghasilkan jumah DNA

sebanyak 10n (n adalah jumlah siklus) (Hans-Joachim et al., 2006). Ekstensi

dilakukan pada suhu 72 selama 30 detik dan final ekstensi pada suhu 72

selama 5 menit.

Produk PCR yang dihasilkan pada penelitian ini berupa fragmen DNA

dengan panjang 439 bp yang merupakan alel CYP2A6*1. Alel CYP2A6*7 pada

isolat DNA nonperokok suku Tionghoa tidak akan menghasilkan produk PCR

karena primer forward yang digunakan tidak menempel pada DNA target akibat

perbedaan satu basa nitrogen pada basa ke 21, yaitu pada tempat penempelan

primer forward (Gambar 3). Alel CYP2A6*7 muncul karena terjadi SNP, yaitu

perubahan 1 basa T (timin) menjadi C (sitosin) pada exon 9 yang menyebabkan

penurunan fungsi alel (Xu et al., 2002).


11

A. CTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTTT B. CTCCCAGTCACCTAAGGACACTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTTT

A. GCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA B. GCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA

A. GGGCTGTGCCGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGG B. GGGCTGTGCCGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGG

A. CCAAGACCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATG B. CCAAGACCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATG

A. GCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGC B. GCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGC

A. GGCTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGG B. GGCTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGG

A. AAACCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATT B. AAACCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATT

A. TCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCAGCT B. TCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCAGCT

A. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT B. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR alel gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7

(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer

ditunjukkan oleh warna biru)

Keterangan :

A : potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank

B : urutan basa CYP2A6*7 menurut Minematsu et al. (2006)

Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis

Produk PCR hasil amplifikasi isolat DNA nonperokok suku Tionghoa

dianalisis menggunakan elektroforesis dengan gel agarose 1,5% dan

didokumentasikan dengan kamera mirrorless fujifilm XA3. Produk PCR hasil

amplifikasi dalam penelitian ini ditunjukkan oleh pita dengan ukuran 439 bp,

yang berarti bahwa sampel DNA tersebut merupakan alel CYP2A6*1. Alel

CYP2A6*7 tidak ditemukan pada penelitian ini yang ditunjukkan oleh

terbentuknya pita 439 bp pada semua sampel (Gambar 4).


12

M 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai isolat DNA

Keterangan :

M : DNA ladder 1 KB (0,25-10 kb) sebagai marker

1-7 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang

berbeda

Kondisi elektroforesia : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak 1 TBE;

kecepatan 110 V/cm; volume injeksi 6 µL

Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa produk PCR yang dihasilkan

merupakan produk dari alel aktif CYP2A6*1 dan dari 30 sampel yang

diidentifikasi, tidak ada subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*7 (Tabel I). Hasil

tersebut dapat diartikan bahwa sebanyak 30 sampel yang tidak memiliki alel

CYP2A6*7 tidak mengalami penurunan aktivitas enzim CYP2A6 dalam

mengaktivasi nitrosamin, sehingga risiko terjadinya kanker paru juga tidak

mengalami penurunan.

Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7

Alel Jumlah Frekuensi

CYP2A6*1/ CYP2A6*1 30 100%

CYP2A6*1/CYP2A6*7 0 0%

Individu yang memiliki alel gen CYP2A6*7 dikategorikan dalam

kelompok intermediate metabolizer, yang berarti aktivitas enzim CYP2A6 dalam

10.000 bp

Produk PCR

dengan

panjang pita

439 bp


13

mengaktivasi senyawa nitrosamin mengalami penurunan hingga 35% (Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012). Penurunan aktivitas enzim ini terjadi karena adanya SNP,

yaitu penggantian satu basa T pada urutan 8454 menjadi C. Terjadinya

penggantian satu basa tersebut mempengaruhi ekspresi dari gen, sehingga

aktivitas dari enzim yang dikode oleh gen tersebut juga menjadi tidak normal.

Apabila aktivitas dari enzim pengaktivasi nitrosamin mengalami penurunan, maka

jumlah senyawa nitrosamin yang menjadi karsinogen juga menurun, sehingga

risiko terjadinya kanker paru juga akan menurun. Hasil penelitian menunjukkan

bahwa semua subjek uji dalam penelitian ini tidak memiliki alel gen CYP2A6*7,

sehingga aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin tidak mengalami penurunan

seperti individu yang memiliki CYP2A6*7, dan risiko terjadinya paru tidak

menurun.

Enzim CYP2A6 juga berperan penting dalam metabolisme beberapa

senyawa, seperti nikotin, metoksifluran, halotan, asam valproat, disulfiram,

kumarin, dan tugafur (Hodgson, 2010). Pada individu yang memiliki alel gen

CYP2A6*7, aktivitas enzim dalam metabolisme beberapa senyawa tersebut akan

mengalami penurunan hingga 35% (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012), sehingga

jumlah senyawa yang termetabolisme juga mengalami penurunan. Oleh karena

itu, individual dose sangat penting untuk diperhatikan karena adanya

polimorfisme dan efek dari suatu senyawa yang ditimbulkan akibat adanya

polimorfisme pada setiap individu berbeda.

KESIMPULAN

Hasil identifikasi alel gen sitokrom P450 2A6*7 pada subjek uji

nonperokok suku Tionghoa Indonesia adalah tidak terdapat alel gen sitokrom

P450 2A6*7 dengan frekuensi 0%, sehingga tidak terjadi penurunan aktivitas

enzim P450 2A6 hingga 35% dalam mengaktivasi nitrosamin dan nitrosamin

menjadi kurang karsinogenik.


14

SARAN

Untuk penelitian selanjutnya, penulis menyarankan untuk dilakukan

identifikasi polimorfisme alel gen CYP2A6 pada alel non aktif yang berbeda,

yang diduga memiliki peran terhadap proses aktivasi nitrosamin pada populasi

nonperokok suku Tionghoa.


15

DAFTAR PUSTAKA

B-Rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.

Human Heredity, 007(52), 191–200.

Chacon-Cortes, Griffiths, L.R., 2014. Methods for extracting genomic DNA from

whole blood samples : current perspectives. Journal of Biorepository for

Applied Medicine, 1–9.

Hans-Joachim, D., Annette, D., Doris, E., Stefanie, G.-J., Joe, K., 2006. PCR

Applications Manual 3rd edition. Roche, Germany.

Hecht, S.S., 1998. Biochemistry, Biology, and Carcinogenicity of Tobacco-

Specific N-Nitrosamines 11(6), 5–8.

Hodgson, E., 2010. Modern Toxicology, 4th ed. North Carolina State University,

Raleigh, North Carolina.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2015. Situasi Penyakit Kanker.

Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan,.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,

H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4,

*7 and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.

Nurfadhlina, M., Foong, K., Teh, L.K., Tan, S.C., 2006. CYP2A6 polymorphisms

in Malays , Chinese and Indians 36(August), 684–692.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., Martono, S., 2015. Polymorphism of

Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese

Indonesian Smoker and Non Smoker. Indonesian J. Pharm, 26(1), 11–19.

Pratiwi, R., 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana, XXVI(1), 25–31.

Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,

and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.

Surzycki, S., 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer, New York.

Susana, D., 2003. Penentuan Kadar Nikotin Pada Asap Rokok. Makara

Kesehatan, 7(2), 2–5.

Xu, C., Rao, Y.S., Hoffmann, E., Jones, J., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2002. An

in Vivo Pilot Study Characterizing the New. Biochemical and Biophysical

Research Communications, 290(1), 318–324.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.


16

LAMPIRAN


17

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


18

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


19

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


20

Lampiran 4. Product Datasheet of CYP2A6*7 Forward and Reverse Primer


21

Lampiran 5. Product Information of DNA Ladder and Markers


22

Lampiran 6. Karakteristik Sampel

Nomor sampel CYP2A6*7 Risiko terjadi kanker paru

1 Tidak ada Normal

2 Tidak ada Normal

3 Tidak ada Normal

4 Tidak ada Normal

5 Tidak ada Normal

6 Tidak ada Normal

7 Tidak ada Normal

8 Tidak ada Normal

9 Tidak ada Normal

10 Tidak ada Normal

11 Tidak ada Normal

12 Tidak ada Normal

13 Tidak ada Normal

14 Tidak ada Normal

15 Tidak ada Normal

16 Tidak ada Normal

17 Tidak ada Normal

18 Tidak ada Normal

19 Tidak ada Normal

20 Tidak ada Normal

21 Tidak ada Normal

22 Tidak ada Normal

23 Tidak ada Normal

24 Tidak ada Normal

25 Tidak ada Normal

26 Tidak ada Normal

27 Tidak ada Normal

28 Tidak ada Normal

29 Tidak ada Normal

30 Tidak ada Normal


23

Lampiran 7. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum

M 29 30

M 15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28

1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14 15


24

Lampiran 8. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *7 pada Suku Tionghoa

Alel Jumlah Frekuensi

CYP2A6*1/ CYP2A6*1 30 100%

CYP2A6*1/ CYP2A6*7 0 0%

- Frekuensi *1/*1 =

100 %

=

100 %

= 100%

- Frekuensi *1/*7 =

100 %

=

100 %

= 0%


25

Lampiran 9. Hasil Kuisioner


26


27


28

Lampiran 10. Perhitungan Jumlah Sampel

Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal

pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah :

Nmin log (1 – )/2 log (1- fmin)

Keterangan :

Nmin : jumlah sampel minimal

: probabilitas alel utama

fmin : frekuensi alel minor

Pada penelitian ini, jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu

CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 (minor). Maka, menurut B-Rao (2001), nilai dan

fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah = 0,95 dan fmin = 0,05.

Jadi, jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah :

Nmin log (1 – )/2 log (1- fmin)

log (1 – 0,95)/2 log (1- 0,05)

28,89

29 orang

Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang,

sehingga jumlah tersebut sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian

genetik polimorfisme.


29

BIOGRAFI PENULIS

Skripsi dengan judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom

P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok Suku

Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain

Reaction” ditulis oleh penulis dengan nama lengkap

Marisa Hayuningsih. Penulis lahir di Boyolali pada

tanggal 27 November 1996 dan merupakan anak

kandung keempat dari pasangan Jiyanto dan Sri Harjani.

Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK

Pertiwi Trosobo (2001-2003), SD Negeri 1 Trosobo (2003-2009), SMP Negeri 1

Simo (2009-2012), dan SMA Negeri 1 Simo (2012-2015). Pada tahun 2016,

penulis melanjutkan pedidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam

kegiatan UKF, yaitu Paduan Suara Fakultas (PSF) Veronika. Penulis merupakan

anggota PSF Veronika periode 2016/2017 hingga 2018/2019. Penulis pernah

mengikuti Pekan Olahraga dan Seni Farmasi Indonesia (PORSFI) 2017 kategori

vocal group dan berhasil meraih juara I. Penulis juga aktif dalam beberapa

kegiatan, yaitu Titrasi 2017 sebagai anggota Bandzen dan Pekan Seni Mahasiswa

Daerah (Peksimida) Yogyakarta 2018 Tangkai Lomba Vocal Group sebagai

sekretaris. Penulis menyelesaikan tugas akhir ini berdasarkan ketekunan dan

pengalaman bekerja keras selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma. Semoga skripsi ini berguna bagi pembaca.


identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*7 pada subjek …

Documents