immobilization and stabilization of invertase on cajanus cajan lectin support

7
Immobilization and stabilization of invertase on Cajanus cajan lectin support Shama Ahmad a, * , Adil Anwar a,b , M. Saleemuddin a a Department of Biochemistry, Faculty of Life Sciences and Institute of Biotechnology, Aligarh Muslim University, Aligarh 202002, Uttar Pradesh, India b Department of Pharmaceutical Sciences, Box C-238, School of Pharmacy, University of Colorado Health Sciences Center, 4200 E 9th Ave., Denver, CO 80262, USA Received 24 July 2000; received in revised form 8 February 2001; accepted 21 March 2001 Abstract Use of lectins as ligands for the immobilization and stabilization of glycoenzymes has immense application in enzyme research and industry. But their widespread use could be limited by the high cost of their production. In the present study preparation of a novel and inexpensive lectin support for use in the immobilization of glycoenzymes containing mannose or glucose residues in their carbohydrate moiety has been described. Cajanus cajan lectin CCL) coupled covalently to cyanogen bromide activated Seralose 4B could readily bind enzymes such as invertase, glucoamylase and glucose oxidase. The immobilized and glutaraldehyde crosslinked preparations of invertase exhibited high resistance to inactivation upon exposure to enhanced temperature, pH, denaturants and proteolysis. Binding of invertase to CCL-Seralose was however found to be readily reversible in the presence of 1.0 M methyl a-D mannopyranoside. In a laboratory scale column reactor the CCL-Seralose bound invertase was stable for a month and retained more than 80% of its initial activity even after 60 days of storage at 4°C. CCL-Seralose bound invertase exhibited marked stability towards temperature, pH changes and denaturants suggesting its potential to be used as an excellent support for the immobilization of other glycoenzymes as well. Ó 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. Keywords: Immobilization; Glycoenzymes; Lectin-support 1. Introduction Reports on immobilization of proteins/enzymes on solid supports ®rst appeared about 30 years ago. Since then, immobilized proteins have been widely used for the processing of a variety of products spanning indus- tries from food to environmental control. However, in recent years there has been a phenomenal increase in the use of immobilized enzymes as industrial catalysts. Im- mobilized enzymes oer advantages over the use of conventional chemical catalysts for numerous reasons for example they exhibit high catalytic activity, a high degree of speci®city, can be produced in large amounts and are economically viable Anwar and Saleemuddin, 1998). Hence, immobilization of enzymes is an eective means of enzyme stabilization making studies on this technique all the more important. Stabilization of en- zymes by immobilization can be categorized according to whether the protein becomes immobilized by chemi- cal binding or by physical retention. However, proce- dures that utilize the anities of biomolecules and ligands for the immobilization of enzymes are gaining increasing acceptance in construction of sensitive en- zyme-based analytical devices, separation techniques as well as for other applications. The strong anity of poly/monoclonal antibodies for speci®c enzymes and those of lectins for glycoenzymes bearing appropriate oligosaccharide have been generally employed for this purpose reviewed in Saleemuddin, 1999). Eectiveness of immobilization strategies in which enzyme glycosyls form the point of attachment between the glycoenzyme and support has been adequately documented Hsiao and Royer, 1979; Woodward and Wiseman, 1978; Saleemuddin and Husain, 1991). The bioanity based procedures of glycoenzyme immobili- zation employing the lectin concanavalin A con A) Saleemuddin and Husain, 1991; Farooqui et al., 1997) or glycosyl speci®c antibodies Jafri et al., 1993, 1995, Bioresource Technology 79 2001) 121±127 * Corresponding author. Present address: Department of Pediatrics, National Jewish Medical and Research Centre, D201 Neustadt Building, 1400 Jackson Street, Denver, CO 80206, USA. E-mail address: [email protected] S. Ahmad). 0960-8524/01/$ - see front matter Ó 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S 0 9 6 0 - 8 5 2 4 0 1 ) 0 0 0 5 3 - 0

Upload: shama-ahmad

Post on 05-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������������ �� ���������� � ������� �������� ����� ���� ������

����� ����� ���� ���� ���� ���� �� ���������� �

� ���� �� �� ����� ������ ������� �� ��� ������ ��� �������� �� ������������� ������� ����� ���������� ������� ! !! � ����� "������ ������ ���� �� �� "��� �������� ������� ��# �$ %&� ������ �� "��� ���� ��������� �� �������� '���� ������ ����� ( !! ) *�� ��+�

����� �, &! - � ���

�������� �� ��� �!!!" �������� � ������� ��� # $������ �!!%" ������� �% ����� �!!%

��������

&�� � ����� �� ��'��� �� �� ������������ �� ���������� � '� ���� ��� ��� ������ ��������� � �� �� ��������

�� ����� � (� ���� ���������� ��� ����� �� ������ � �� ��'� ��� � ���� ��������� � �� ����� ��� ��������� � �

���� �� ��)������ ���� ������ �� ��� � �� ������������ � '� ���� ��� �����' ����� �� '������ �������� � ����

������ ���� ���� ��� ��� ���������� ������� ����� ���� *++,- ������� ������� � � ��'� ������� ������� �������� �(

����� ������ ��� �� ��� ���� �� �������� '������ ���� �� '������ �)������ .�� ����������� �� '��������� �� �������/��

���������� � ������� �)������ ��'� �������� � �������� ��� �)������ � ������ ���������� �0� ������� ��

������ ���� (���' � ������� � ++,1�������� ��� ������� ��� � �� ������ ���������� � �� ������� � %�! � ��� � �12���� �������� � � �������� ����� ����� ������ �� ++,1�������� ���� ������� ��� ����� �� � ��� �� ������

���� �� #!3 � �� ����� ����� ��� � �� 4! �� � � ����'� � ��+� ++,1�������� ���� ������� �)������ ���/�� ������

������ ���������� �0 ���'�� �� ������� ��''���' �� ������ � �� ���� �� � �)����� ������ �� �� ������������

� ���� '� ���� ��� �� ����� � �!!% 5������� ������ ,�� ��� ��'�� ���������

.�/����0 ������������" 6� ���� ���" ,���1������

� ���� ������

������ � ������������ � ������7�� ��� ������ ������� 8�� �������� ���� 9! ���� �'�� ������� ����������� ������ ���� ��� ����� ���� ���� ��������' � � ����� � ������� ����' ����1���� ��� ��� � ��������� ������ 0������� ����� ���� ���� ��� ��� � �������� ������� � ����� � ����������� �� ��� �� �������� ���� ��� ��1��������� �� ��� �:�� �����'�� ���� �� ��� � �������� �������� ���� �� �� ������� ������ �� �)����� �� �)���� ��'� ���� �� ����� � � ��'���'��� � �����8�� � �� �� �������� � ���'� ������� ��� ���������� ������ *���� �� �����������%;;#-� 0���� ������������ � �� ��� �� � �:��������� � �� �� ���������� ��/�' ������ � ���

����<�� ��� �� ���� ������� ���������� � �1� ��� � ������������ �� �� ���'������ �������'� ������ �� ����� ������� ����������� � �����1��� ����' �� � �� ����� ������ 0������� �����1����� �� ������ �� �=���� � ������������ ����'��� �� �� ������������ � �� ��� ��� '���'�������' �������� � �������� � ������� �1� ��1����� ��� ���� �������� �������� ����<��� ������ �� �� ���� ����������� .�� ���' �=� � ��� 7�������� �������� �� �����8� �� ��� ������ � ����� �� '� ���� ��� �����' �������������'����������� ���� ��� '������ ����� �� �� ���������� *�������� � ����������� %;;;-�

5:�������� � ������������ ����'��� � ������� �� '� ��� �� ��� �� ��� � ������ ������� '� ���� �� �� ������ ��� ��� ���<���� �������� *0���� �� �� ��� %;>;" ?������� ��?������ %;>#" ���������� �� 0����� %;;%-� .������=� ����� ���������� � '� ���� �� ��������1���� ����� �' �� ���� ��������� � *�� �-*���������� �� 0����� %;;%" $����<�� � ���� %;;>-�� '� ��� � �����8� �������� *�� �� � ���� %;;9� %;;@�

(���������� .������' >; *�!!%- %�%A%�>

�+���������' ������ B���� �������C 2������ � B���������

D����� ������ ������� �� �������� +���� 2�!% D�����

(�����'� %�!! ���/�� ����� 2����� +E #!�!4� &���

)$ ��� ������0 ������FG����' *�� �����-�

!;4!1#@��7!%7H 1 ��� �� ���� � �!!% 5������� ������ ,�� ��� ��'�� ���������

B��C � ! ; 4 ! 1 # @ � � * ! % - ! ! ! @ 9 1 !

%;;>- �:�� �� �������� �����'� � ��'� ����������� � �� ���� �� �� �� ���� �� ����������� �� ������������� � �� ������ ����)� ?���� �� ����� ������ �� �� ��'�� �����8� �� � '��� '� ���� ����� � ������� ��� � ����� � '� ���� ��� �����'���������� ����� �������� � ���� ���'�����������*����������� %;;;" ����������� � ���� %;;>-� +� �������� ���� ��� ������� ���� � ��� ���� '� 1���� ��� ���/� *I����� �� (��/�� %;>>-� ���������� ��� ��� ���'� ��/�' �� ��������� ����������������� *����������� � ���� %;;@-� � ��� ��� ������� �� ��� ����� � �� ��'�� ��� *������� �����-����� *���� ��� �� ����� �� ++,- �� �)����� �=1� �� '������ �� ����� �������� *�����<�� � ����%;;@" ����� � ���� %;;;- �� � ������ �������� ��� � �� �� ������������ � '� ���� ���� ������������ � ��'��� ���� �� ������ ��������� � ������ �� ���� �� �� ������ ������� ��� �� ��������' � �� ��� �������� ��������� *�����<�� � ����%;;@-�

� ����� �

J��� ������� ��� ������ ��� 5� ����/*2������� 6���� -� 6������ �)����� �� '������1��� �� ���� ��������� ��� I���1,�'� *+������/�5'���-� B���)������ �� ��'����������� ���������� +���������� �� ��� � �12 ���� ������� ���� ������� � ��'�� +������� +���� *�� ,����� �E�&��- E1���������10+� ��� +��� �� (������������+���� 2����� ���� �� �������� �(� � ��'� ��������� ��������� ���� ������ ��� ����� ��������,������� � (���� � �����

++, ��� ������� ��� �� ����� � ������� ����� � �� ����� ��������� ��������� *�����<�� � ���� %;;@-�?���� �� ���� ��/���� ������� ��� ������� ��� �������� '�� � ������ � �1��2�� �������' � ������ ���������� *%;;>-� ��� ���� ��������� �� ��1�'�� ���� � ��� ���� '���� �� ���� ���� ����� ����� ����8�����

+3+ � �1���4����� �� ����� �� ������ (�

++, ��� ������� � �� � ��'� ������� ��������������� ���' �� ��������� ��������� � B���� � ���*%;4>-� .� %�! �� � ������� ����) ��� ����� %�! ��� ��! �'7�� ���� � �� ������' ��:�� *!�% � ��1���� ��������� ��:�� �0 #�@-� � �� ����������������� �� ����� ���� ��� ������ �: �� ��'�� ��� ����� ��� !�%3 � ��������� � ����/ ��������' ������� '����� � �� ����)� .�� �������� ��� ��������� � �������' �� ����� ���1�� � �� �����' ��� �� � �� ��� ����� ��1����

+ + "�������� �� �����$������ (� 1���� ������4�

J��� ������� *%�!! ���� !�� ' �����- ��� ���1���� �� %� � � ��+ ��� %�! �� ++,1�������� �( � ���� ������ � ��! �� !�% � ����� ��:�� �0 ��;� .������� �� �� ��� ������� � ���� �'��� ��������� �����' ��� �� ���� ��:��� .�� ����������� � �� ������ ��� ����/�� � ����' �� �� ������ � �� ����) ��� %�! � ��� � �12 ���1� �������� �������� ������������ � '������ �����'������ �)����� �� ��������� ��� ��� ����� � ��++,1���������

+%+ ��������5��� �� �����$������ (� 1���� ������$4�

.�� �� � ������� ����1�������� �( � !�!@ ������� �������� ��:�� �0 >�! ��� ����� ��� !��3'��������� �� � ��+ �� % � ��� ������� �����'���' � ��'��� ������� .�� '�� ��� ������ 9A� ������� �� ��:�� �� �� ������� '��������� �� ������������ ��� !�%3 ���������� .�� �������/����������� ��� ������ ��� ������ �� �������� �!�% � ����� ��:�� �0 ��;� .�� ������ ������' � ������� � �� ����1�������� ��� �������� � �1�����' �������/�� �� ��������/�� ������������� � 8�� �������� � %�! � ��� � �12���� ������� � �� ����� ��:��� ������� ����1� ����������� ��� ���� �� � �� �������� � �� �1������� ��������� � ���� �'����

+(+ )6������� ������ 7� ����8

5:�������� ���� � � ����������� �� �� �� �������� � ����� ��:���� �:��� �� ��K��� �� � 18���� � �� ������������ ���������� .�� �:�����1��� ���� *�- ������ � �� ����������� ���������������� �� ����� � ����� �� ��������� ����� � �� ����������� �� ��� *������ �� L��'� %;#�-������ ����� � �� �� �� ��� �������� � ��1�� �' � ���������� ���<�� � ����������� �� ���.��������� ����� ��� �������� � �������' ��������� �� �� ����� ������' *� �� ������������- ��� �� ����� �� �������������

+9+ )�4� ������

.�� ����� ������ � ��� �� �������� ���������� ������� ��� �������� � �� ����� � 6�������� ,���� *%;>@-� 6������ �)����� ��� ���� �� ��1�����' � �� ��������� ��������� � 0�� ����'����� *%;>4- �� ����8�� � �<��� �� ����������*%;#9-� 6������ ���� ����� ��� �������� � ������� � ���� �� .���� *%;;!-� .�� ���� � ���������� �� ��������� ��� ��� ����� �� ��������� � ?������� �� L����� *%;#�-� .���� �����'

%�� �+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 <

�������� ���������� ���� �������� �'���� � ���������� ���/�� ����' �� ���� �

.�� ������' ��'�� '����� '������ ����' �� 1���� ������� ���� ������� � �� ��������� � (�� ��� *%;@@- ���' 2D� *�1@ ����� ��� ����� ����-���'� �� ���� �� � �� �� ���� ����� ������' ����� � '������ �)����� � �������� ��� ����)������� E1��������� � ������������ B���� ������������� �������� ������ � �� ����� � ,��� � ���*%;@%- �� ���������� � �������' ��������� � �#!� �������� �� ������ � �����8� �)���� ���=������� /���

+-+ ����������� ��������

��� �������� ���������� ���� ��� ����� ��� ��B�� ���� *��� ������ +�� � D+-� ���� ���� ���1����� � ��1�� ��� ��� � ������� ������� � ��1����� � �� �� ��������� ����� �� '����� �� ��.�/� AI����� �� �� ������� ����������� � � ������ �!�!@ ��� ��������� ��'�8�� *�2 �������������� �������-�

� ������� �� ���������

& ����' � �� �� �� ��'� � �����8� ������ ��1'���� ����� � ����/�� � ����8���� �� ���� � ������������ � �� �� ��� *����� � ���� %;;4-� (����� �������� ������ *?������� �� ?������ %;>#"�<��� �� ����������� %;#9- � ���������� ��������� ����������' '� ���� ��� ��� ������ ���� ��������' ������� ����'���� � ��� ��� ��''���� �� �������� �� �� ������ ����� � ���� � '� ��� ���������� � ��� *%;;4� %;;#- ���� �������� ���� ��������� ��� �� �� ��� � ���� � �� ���� � ������������

6������7����� �����8� ++, �� ��'�� �:����� ��� ���������� � ������� ��� ������ �� ��1���)����� ;!3 � �� �� �� ����� �� ������������ �� ���� ������� ���� � ;C%� .�� ���������� ����� ���������� ������� � ���������' �� ���� � %�!� ��� � �1���� ������� ����� ������� �������8�� � ������ ���� ������� ������� ������� �� �������

6������ �)������ ������� �� '������ ���� ���������� ���� ��� ��'� ����� ��� ������� ����������� ����) ���������� ��� 9�! �'7�� ++,*.���� %-� ?�� �� �)����� � ���������� ��� ��'� ���� ��� ������� � �� ����� ��� �)������ ���'� ����� � ���� ����� � ����� ��� �� ��'� �������� .�� ��'� ����� �)������ � �� �� ��� ���������� �� ���� �� ������ � �� ++, ���' �� ����'� ������ ����� �� �� �� �� ������ �� ������������ � �� �� '� ��� ��� �� ��� � �������� �� ���� �� ������� ����' ����'� � ������� ������������� ��� ��� �������� ���� ���� �������� � ������� ��������� �� '� ���� ��� ����������� � ��� ������� *0���� � ���� %;;�-� � ��� ��� � ����������� � ++,1�������� ���� �������� ��'� ����������� � �� ������� *�������- ����� ��� ����� ��� �� ��

������ ����� ���� ������ ���'���� ����� �� ��������� �� �� *$�'� %-� +������� � ������� � ������� � �� �� �� ������� � �� ��'� �=� �1����� ++, �� ������� � �� �������� �:�������� � �� >������ �� ���� ���� � ��������������� ��� ���� ��� � � I�/� �� � ��� *%;##- �������� �� ��� ������ � ��'��� ������� �1'�1����������� .�� �������� �������� � ���) �� �� ��1���� � �� � ��������� ������� � � ����� ������ �� ����������� ������� ����������

� �������� ����� ����� ������ ��� �� � ����/�� ������ � �� ++,1�������� ���� ������� ���� ������� � ���� � ��� ��� �� ���� ��� � ���'� ��� ����� � ����������� ������� �� � ������ � 9!�� �� 0������ ���� ������� ������� �� ������ �� � ������ ��� ����� ��� � �� ����� ���� ����/ *��� � ����-� ������'� ���� �� #!3 � �� ����� ����� ��� ������ ��� �� ������ �������� �� �� � � ���� � ��+ *$�'� �-� (���� � �������������� � �� ��''���� �� �� ����������� ����1��� � ++,1�������� �( ��������� ����������� ����'������� �� ����� ?�� ���� � � ����� ������ �� �������� � �������� ����� �� ����� � �� ����1������� �� �� �� 9! �� � ����� � ���� � �� ����� �� ��������� �� ��������� ��� ���������

�������� � �� ������� � �� ��� ������ ���1����� ������� � �� ������ ������ �� � ����� � ������������ � �� ++, ����)� &��/� �� ����������� �� �)����� � ��������� ������ � @!�+

.���� %

������������ � '� ���� ��� � ������� ����� ����1��������

5� �� 5� �� ���� ����� �����

��� ���� *+-

3J�������(�

� %!!

� ������ ��(+

����� *�- &���� *(- �����������

������� %�!! �#���@ ;%4 >@@��@ >4 !�#�

6������ ���� %�!! 94>�%# #99 @!!�9@ 4; !�4

+�������� %�!! %%>@�4! �@ ��!�@ � !�%4

6������

�)�����

%�!! ;9�%! %%!> ##@�@9 ;� !�#

������ � ������� �� ��� ��������� ��� ���� �� �� ��������� � �� ������� M����� ������� ���� �2 � ���� ������� �����������

�+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 < %�9

�� �����<�� ����� ������ ��� ������� � ������1��� *$�'� 9-� �� ++,1�������� ����������� �� �� ����<���� ����� � @!�+ �� 4!�+" �� ������ � ��'����� ����� � �� ���� ����� � >!�+� .���1�� ��� '��������� �� �������� � ����� ��'���� ���������������� �� �� ++,1���� �� ���������/�� ������� ��������� ������ ���� #@3 � ��)���� ����� ��� ��� ���� �� � >!�+� .�� �1������ � �� ������ ������ � �� �� ������������

� �� ������� � � ++, �� ��� ���� �� ������'����������� �� �� �� �� �� �� �� ���� � �)������ ��������� � �� ��� ������� ����� � ��� � ��������� ����� &��� ���� �������� ���� ����������/�� ++,1�������� ����������� ��������������� %@3 �� �@3 ��������� ���������� � .�������������� ��� ��������� � �)������� � ������������ �� ����������� ������� ���������� �����)����� �� ������� ������� � 4!�+ *$�'� �-� ���������� � �� ������� ������� �� ����� � ����� ������ � �� ++,1�������� ���� �� �� ��� ��'1�8��� ��'��� * �� ��'� #@� 43 �� 44� ���3 � %�!��- ����' �� ���� ������ � �� �)������� .���������/�� ��������� ������ ���� ��� �� ����� ��� � �� %#! �� � ������� � 4!�+�

5������ � �������� � �)����� � �0 ������1������ �������� ��� ���� �������� ��� ��++,1�������� ����������� ���������� *$�'�� @ �� 4-�?�� �� �������� � ���� �� ����������� �������1��� ���� ������� � ��:��� �0 *$�'� @-� � ����������� �� �� ����������� ���������� � ����������� ���� ����� �� ������ ��'��� ����� �� ���1����� � ���� �������� � �����' ;#3 *������������� �������/�� �������- �� >!3 *����������� �1������- � ����� � �0 >�!� ����� �� ���� ������������� �� �!3 ����� ���� ������� ��������.�� ����������� ���������� ���� ����� ���� � �������'� � �0� ����� �� ���� �� �� ����� � �������

$�'� 9� 5:�� � ��������� � �� ����� � ������� �� ������1

����� �������� .�� ����� � ������� ���� ++,1�������� ���� ����� ++,1�������� ���� �� �������/�� ��� ������� �)����� �

������� ����������� ��� ��������� .�� ����� ������ � @!�+��� �/� �� %!!3 �� �� ������� ���������� � �������� *.��

������ ��� ���� �2 � �� � ���� ������� �)������� ���1

����� � ���������-

$�'� �� ������ � ++,1�������� �( ����������� ������� � � ���

����� ����� ������� .�� ++,1�������� ���� �� �������/�� ���������� ��� ���/�� � � ����� �� �� ���� � ������� � ���1

� ��� ��� �������� � ��'���� ��� �������� *.�� ������ ���

���� �2 � ���� ������� �)������� ��� ����� � ���������-

$�'� %� 5:�� � ������� �������� � �� ����� � ������� ��

����������� ���������� � �������� .�� �������� ++,1��������

���� �� �������/�� ������� ��� ������� ��� ������� ����1

����� *4A4! ��- � �������� ������� ����� ��� �������� �

�� ������ ��������� �� �� ��� ���� ����� � �� ��� �

���������A��� ��� �� ���� �� ,��������A(��/ ��� *���-� .��

� ����� ���� ��� �� ��� ������� �������� ++,1�������� ���� ��

++,1�������� ���� �� �������/�� �������� ���������� �

%�� �+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 <

�� ������� � �0 ������ ��/���� � $����� ����� ������������� ������� ���������� ���� ��������� ��� ����1������ �������� *$�'� 4-� ����� 4!3 � �� ����� ����� ��� �������� ��� � � ���� ����1���� � 4 � � �� ����������� �� �������/����������� � ��������

� � ���� � ������� �� ����������� � �������������� ��� �)������ � ������ ��� ���� � ������� ���� � �)������ ��� ������� �� � ����� ������������ ���� �)����� � ������� ����� � ���1����� ��� ���� ��:��� ���'�� *������ ��� ������- ���� � ���� ����� �� ���� ��/���� �������*$�'� >-� � ��� ������� '��������� �� ����� ��1��� �������� �� ������ � �� ����������� �� ����.�� �������/�� ����) ��������� ������� ��� ������� ��������'� �� � ������ ������' � ���� �� � �� ����) ���� ++,� ��/�' �� ����� � �� ������ �����������

.�� ����' ���'� � ������� � ������������� � ��� ����� ��� �����'��� �� � ��� ������� �� ����� � ������� ��<����� ��� � ��'���������� � ������� ���� ������ � ������������ *����������� � ���� %;;@-� 0�'� ������ � ++,���� ��������� ��������� � �� ����� ��� �������� ����������� �)����� � �0 �� � ���1���' ������� ��''�� �� ��������� � ���������� ++, �� <��� ������ .�� ����' ������� � �������� ���������� � �� ������� � ������� ��'1'���' �� ������ � ++,1������� �� ��������������� ��� �� �� ��� ��/� �������� ��� �)�����'� ��� ���� �� ��� ��'� �=� �� �� �� .����� ������ ��� �� �)������� ������� �� ���'�� ������� ����������� � ++,1�������� �( ������

$�'� @� �0 ����� ���8�� � �������� ++,1�������� ���� �� ++,1

�������� ���� �� �������/�� �������� ������� �� �����������

������� ���������� ���� ������� � ���������� ��:�� �� ��1

�� �� � �� ������� �0 �� ��������� � �� �)� .�� ��:��� ���� ��

������� �0 ��'�� ����C 6� ���10+� *�0 9�!-� ������ ����� ����1

���� *�0 9�@A4�!-� ������ �������� *�0 >�!A#�!-� .���10+� *�0 #�@A

;�!- �� '� ��� D�E0 *�0 %!�!-� .�� ������ � ��� ��:�� �������

��� !�!@ �� ���������� � ������� � ����� � �� ��:��� �1

������ ���������� �� �� ��������� � �� ��'��� � $�'� %� *.�� ������

��� ���� �2 � ���� ������� �)������� ��� ����� � ��1

�������-

$�'� 4� 5:�� � ���� � ������� �� ����������� ��������� � �1

������� ������� ������� ���� ++,1�������� ���� ��� �� ++,1

�������� ���� �� �������/�� ��� ������� ���� ������� � ��

������� ��������� � ���� *!A>�! �- � !�� � ������ �����

��:�� �0 ��; �� 9! �� � 9>�+� .�� ����� � �� ������� �����1

����� ��� �������� �� ��������� � �� �)� ��� ����� �� ��1

���� � �� ������� ������� ���������� � ��! � ����� *.�� ������

��� ���� �2 � ���� ������� �)������� ��� ����� � ��1

�������-

$�'� �� .������ �������� � �������� ����������� �� �����������

�� �������/�� ���������� � ������� � 4!�+� ������� �� ��1

��������� ������� ���� ������� � 4!�+ � !�% � ������ �����

��:�� �0 ��;� ���<��� ���� ������� � ������� ��� �������� �������

<���/� � ��� �� �� �� ����� ��� ��������� $�� ������ ��1

'����' �� ���������� � ������� ���������� �� �� � �� ��'���

� $�'� %� *.�� ������ ��� ���� �2 � ���� ������� �)�������

��� ����� � ���������-

�+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 < %�@

��''�� �� ++, �� � �������' ���� ������ �� �������������� � ������� �� ���� '� ���� ������ �� �� ���� �� � ������ �������� � ������������ ������������ ������� �� � �� �����1����� ������ �� �� �� ����� �������� .�� �� ������ ����������� �� �� �� ���� �� ��������� �� �� ����8���� �� �������� � ������ ���� ����1��� � ��� �� �������� ����� �

����������

������ ��� I��� ��0�� ������ ��� %;;;� B� ������������ ������1

������� � ������� ����� ����C �:�� � �0 �� ���� ��� �

���� ������ ���� �������� (������� (���� �� ��� %��>�

9>#A9#��

����� ��� ����������� ��� %;;>� ��/���� �0 ���' ��'�����

�� ��� � �� ��� ���'��� ���� ��� ������ � �1��2�C ������

�� ������ �� ����'� ��������� (�������� ����� (�������

�@� �9A�4�

����� ��� ����������� ��� %;;#� ��/���� ��������C � �������

(���������� .������ 4�� %>@A%#9�

������ &�� ���/�'��� I�B�� ���������� ��� &������ 0� ��� ���

%;;4� .������ � ����' �� ������ �� ����������� � ������1

����� �� 5��� �� (������� �9>� #4�A#4;�

������ &�� ���������� ��� &������ 0� ��� ��� %;;#� �K���� �

�� ������ ���� ���� � �� ������ �� ������'� ���� �

����������� (� �� B���� +���� %>� 9;>A�!@�

(�� ���� B�� %;@@� �C +������/� ��B�� I����� D�E� *5���-�

������ � 5� ����' � ���� �� �������� B����� D�� J��/�

��� %�;A%@%�

$����<��� ��� ����������� ��� &����� ��� ������� B�� ��������

.�� %;;>� (���=� �� ���'C � ���� ����' �� �� ������1

������ � ���'� <������ � '� ���� ���� �� (�������� @@�

%>%A%>;�

6������� ��� ,����� ��E�� %;>@� �C +������/� ��B�� I����� D�E�

*5���-� ������ � 5� ����' � ���� ��� �������� B����� D��

J��/� ��� @!�A@%%�

0��� ��?�+�� ��'������ 5�� %;>4� .�� ������ �� ���� �

���������� ������� � '������� �)������ B���8���� � ��

�� �� � � ������ �=� ���������� (������� (���� �� ���

�9#� 99;A9�4�

0����� 0�� �� ��� 6�B�� %;>;� ������������ � '� ���� ���

����'� ������ ���� ���� ������ ����� (������� (���� �� %;#�

9>;A9#@�

0����� ��� 0����� N�� ����������� ��� %;;�� �������� ��

��������� � ����� ������ ����)����� ����������� � �������

����������� ��� �� (������� (���� �� �;� �#9A�#4�

�<���� ��� ����������� ��� %;#9� B�������� �� ��������� �

��������� � ��������� ������������ '������ �)������ ��� ��

(������� (���� �� �!� 99A9#�

�� ��� $�� 0����� ��� ����������� ��� %;;9� ������������ ��

���������� � ������� ���' �����8� ��� ����� ���������

(�������� ����� (������� %#� �!%A�!#�

�� ��� $�� 0����� ��� ����������� ��� %;;@� ���������� � ���

������� � �������� ����� ������) ������ ���' � ���1

����� '� ��� � �����8� �� ������ �����8� ��� ����� �����1

���� (�������� .���� ;� %%>A%���

�� ��� $�� ����������� ��� %;;>� ������������ � ������� �

���������1��/�� �� �� '� ��� � ����'���' ��� ����� �����1

���� (�������� (���'� @4� 4!@A4!;�

I������ ��� (��/�� +�� %;>>� .�� ������������ � ��������� ������

���1�������� ��'������ �� �� ��� � ������� ��'��� '����

(�������� (���'� %;� 9#>A9;>�

I�/� ��� 5�� J��� �� J�� ������� ��� D�/������ ��� %;##� B����1

�� � �����' ������� ��:���� � � ����������� �� ��

������ � ���C ���� ������ ������� � '�� ������� � 2

'������������ (�������� ,�� %!� 9!%A9!>�

,��� � E�0�� ��������'�� D���� $���� ��,�� ������� ����� %;@%�

B���� ��������� ��� $���1����� ���'�� �� (���� +����

%;9� �4@A�>@�

������������ 2�� +�������� ��� 6������� B�� 2��������/ � B��

%;;@� �=� �������'���� � ������� � ��������� �

���� ��������� ����)C �� ���� � � �)�������� ���'

����' '� ���� ��� �� +������'�� ( (������ ����� 44��

%�@A%@9�

������������ 2�� M�/�����/�� ��� 6������� B�� %;;>� .�� '� ��� 1

���� �� �� ����' ���� �� �� ��� � �� ������� � ���

�� ����������� ����� ��� ������ ������ �� (������� (���� ��

���� 9@� 9>A�#�

������� ��� L��'� .�� %;#�� � �)�������� ����8���� � �� ����

� ��:���� ������� � ����������� �� ���� (������� (���� ��

��� >!@� %%>A%�9�

����� E�� .����� 2�� %;;!� ������������ ������������� �

'������ ���� ��� ��������� ���� �� ��������������� �

�������� ����8���� � �����) � '������ (������� (���� �� ���

%!�%� %%%A%%4�

B����� ��� �)�� ��� 5����/� ��� %;4>� +������� ������' � ������

� �'������ D���� �%@� %�;%A%�;��

$�'� >� B����� �� ������ � ������� �� ����������� ��������

����� � �� ������� ���������� � ������� ��� �������� �� ���

�� � �� ������' ��� ��� ������� ��������� *!A9�- ����

����� �������� � � ��� *�-� ����� *(- �� ���� ��/����

������� *+-� .�� � ����� ������� �� ������� ���������� �� �1

������ � �� ��'��� � $�'� %� *.�� ������ ��� ���� �2 � ����

������� �)������� ��� ����� � ���������-

%�4 �+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 <

����������� ��� 0����� N�� %;;%� +�������� �C � ��� �� ��'��

�� '� ���� �� ������������� 5� �� ���������� .������ %9�

�;!A�;;�

����������� ��� %;;;� (���=� ����� ������������ � �� ����

���� (������� 5'� (�������� 4�� �!9A��4�

�����<��� ��� 0���� ��� ���������� ��� %;;@� ������� �� ������1

������� � ������� ����� ����� ����� (������� (���� �� 9%;�

��4A�9%�

?�������� ��� L����� � 6���� %;#�� ������������ � ���������

����'� �� ������ ���� ���� ����C � ������� �� �� �������

�� ������ 5� �� ���������� .������ �� ��@A��#�

?�������� ��� ?������ ��� %;>#� .�� �������� � ��� ��/�'�� �

�� ���������� � ��/��� ��� �������� (������� (���� �� ���

@�>� #A%4�

�+ �� �� � ��+ : ��������� ;�������� <* 7 !!38 3 3=3 < %�>