1

Izboljšanje ločljivosti pri fluorescenčni

mikroskopiji

Avtorica: Meta Kokalj

Mentorja:

Doc. dr. Zoran Arsov

Prof. dr. Igor Muševič

Ljubljana, Maj 2011

Povzetek

Fluorescenčna mikroskopija je ena najbolj uporabljenih tehnik pri opazovanju in proučevanju

bioloških vzorcev, celic in njihovih struktur. Prednost tehnike je, da lahko opazujemo celice pri

fizioloških pogojih. To nam posledično omogoča tudi opazovanje celičnih procesov. Ločljivost tehnike

je omejena z valovno dolžino elektromagnetnega valovanja, ki ga uporabljamo, torej vidne svetlobe.

Želeli pa bi seveda opazovati manjše strukture oziroma celo slediti posameznim molekulam, ki

potujejo po celici. V ta namen se znanstveniki trudijo z odkrivanjem novih pristopov, s katerimi bi

lahko prišli celo do ločljivosti pod vrednostjo uklonske limite. V seminarju so predstavljeni principi in

metode za izboljšanje ločljivosti fluorescenčne mikroskopije.

2

KAZALO

1. UVOD ...................................................................................................................................... 2

2. UKLONSKA LIMITA LOČLJIVOSTI ............................................................................................. 2

3. FLUORESCENCA ...................................................................................................................... 4

4. KAKO POD UKLONSKO LIMITO? ............................................................................................. 4

4.1 KONFOKALNA MIKROSKOPIJA ....................................................................................................... 4

4.2 DVOFOTONSKA FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA ........................................................................ 6

4.3 MIKIROSKOPIJA S STRUKTURIRANO OSVETLITVIJO VZORCA ......................................................... 7

4.4 MIKROSKOPIJA, KI TEMELJI NA NASIČENJU STANJ ........................................................................ 9

5. ZAKLJUČEK ............................................................................................................................ 15

LITERATURA .............................................................................................................................. 15

1. UVOD

Ena izmed osnovnih metod proučevanja celic, celičnih struktur in procesov je fluorescenčna

mikroskopija. Velikosti struktur, ki jih še lahko opazujemo, so omejene z valovno dolžino ekscitacijske

svetlobe, ki je v vidnem delu spektra elektromagnetnega valovanja. Če hočemo opazovati bolj fine

strukture od nekaj sto nanometrov, uporabimo elektronski mikroskop ali rentgensko svetlobo. Pri teh

metodah pa celice niso pri fizioloških pogojih. Zato ne moremo opazovati dinamike, torej časovnega

poteka celičnih procesov. Pri fluorescenčni mikroskopiji so celice, ki jih opazujemo pri fizioloških

pogojih, zato bi želeli ločljivost izboljšati vse do velikosti posameznih molekul [1]. Vendar kako

zmanjšati ločljivost pod valovno dolžino svetlobe s katero sistem opazujemo?

Naprednejše tehnike, ki omogočajo izboljšanje ločljivosti pod uklonsko limito svetlobe lahko

razdelimo v dve skupini. V tako imenovane ˝near-field˝ metode, pri katerih lahko opazujemo le tanko

površino vzorcev in ˝far-field˝ metode pri katerih lahko opazujemo tudi strukture iz notranjosti. Eden

izmed primerov ˝near-field˝ metode izkorišča pojav popolnega odboja pri velikih kotih. Pri popolnem

odboju eksponentno pojemajoči evanescentni val prehaja preko površine odboja in tam vzbuja

fluorescentne molekule. Na ta način omejimo debelino rezine, ki jo opazujemo na 100 do 200 nm.

Principi ˝far-field˝ metod pa so bolj podrobno predstavljeni v nadaljevanju seminarja [18].

2. UKLONSKA LIMITA LOČLJIVOSTI

S pomočjo Fraunhoferjeve teorije uklona na okrogli odprtini lahko izpeljemo, da ima porazdelitev

svetlobe točkastega izvora v goriščni ravnini zbiralne leče obliko

, (1)

pri čemer je ; je razdalja od optične osi v goriščni ravnini, je numerična

apertura leče definirana s kotom (Slika 1) in lomnim količnikom snovi med predmetom in lečo:

, je valovna dolžina svetlobe. je prva Besselova funkcija. pa je intenziteta

svetlobe na optični osi v goriščni ravnini [3].

3

Slika 1: Na sliki je shematsko prikazan kot , s katerim je

definirana numerična apertura leče. To je kot med optično osjo in

zveznico, ki povezuje gorišče (F) in rob leče [4].

Na sliki 2 je prikazana porazdelitev intenzitete svetlobe v goriščni ravnini v odvisnosti od .

Intenziteta pade na nič pri vsaki ničli prve Besselove funkcije. Dva točkasta izvora svetlobe lahko

ločimo, če maksimum intenzitete slike prve točke pade na prvi minimum intenzitete slike druge

točke. Torej sta maksimuma oddaljena za vrednost , ki ustreza prvi ničli Besselove funkcije, to pa je

pri vrednosti argumenta . Od tod dobimo ločljivost v goriščni ravnini:

(2)

Slika 2: Porazdelitev intenzitete svetlobe v goriščni ravnini v

odvisnosti od . Intenziteta pade na nič pri vsaki ničli prve

Besselove funkcije. Prvi minimum ustreza vrednosti

[3].

Za ločljivost vzdolž optične osi z pa velja podobna zveza [5]:

(3)

Najboljši objektivi dosegajo vrednosti 1,2, lomni količnik imerzijskega olja je 1,5, če vstavimo te podatke v enačbi (2) in (3) pri valovni dolžini svetlobe 400 nm, dobimo ločljivost v goriščni ravnini okoli 200 nm vzdož optične osi pa okoli 800 nm. Na sliki 3 je prikazana porazdelitev intenzitete svetlobe v gorišču. Razvidno je, da ima porazdelitev intenzitete v optični smeri večjo širino kot v prečni, kar je v skladu z enačbama 2 in 3.

Slika 3: Porazdelitev intenzitete svetlobe v gorišču zbiralne leče.

Rdeča barva označuje večjo, modra pa manjšo intenziteto

svetlobe. Porazdelitev ima večjo širino v optični (vodoravno) kot

v prečni (navpično) smeri [6].

F

4

3. FLUORESCENCA

Fluorescenca je pojav, pri katerem lahko s svetlobo primerne valovne dolžine molekulo vzbudimo v

višje energijsko stanje, nato pa vzbujena molekula izseva foton ter preide nazaj v osnovno stanje. Na

sliki 4 so energijski pasovi take molekule s katerimi lažje razložimo pojav. Osnovno (S0) in vzbujeno

(S1) stanje sta razcepljeni zaradi različnih vibracijskih energetskih stanj (L0, L0', L1, L1'). Ko na molekulo

posvetimo s svetlobo ravno prave valovne dolžine ta lahko preide iz osnovnega S0L0 v neko vzbujeno

S1L1' stanje, nato se preko vibracijskih prehodov relaksira do nižjega vibracijskega stanja S1L1 v

vzbujenem pasu in šele nato preide v osnovno S0L0' stanje pri čemer izseva foton, ki ima manjšo

energijo od absorbiranega. Ker gre tukaj za molekule pri katerih so ta vibracijska stanja zelo na gosto,

ima spekter svetlobe, ki jo molekule izsevajo neko širino in torej ni popolnoma monokromatska. V

fluorescenčnem mikroskopu uporabimo poseben optični element, t.i. dikroično zrcalo, ki je do

določene valovne dolžine nepropustno in vso svetlobo odbije, za višje pa propustno. Tako lahko

opazujemo le fotone, ki jih sevajo vzbujene molekule in nas svetloba s katero svetimo na vzorec pri

tem ne ovira [7].

Slika 4: Shema energijskih pasov molekul, ki se uporabljajo pri fluorescenčni

mikroskopiji [7].

4. KAKO POD UKLONSKO LIMITO?

Če velja, da z valovanjem ne moremo opazovati struktur, ki so manjše od reda velikosti valovne

dolžine, kako potem pristopiti k izboljšanju ločljivosti fluorescenčnega mikroskopa? V praksi se izkaže,

da so stvari slabše kot v teoriji in se lahko teoretičnim limitam le zelo dobro približamo, v tem

primeru pa bi celo radi prišli pod teoretično limito? Jasno je torej, da moramo v sistem vnesti

informacijo, ki ni optične narave. Pri konfokalni mikroskopiji je princip izboljšanja ločljivosti,

odstranitev svetlobe, ki ne prihaja iz goriščne ravnine. Pri dvo-fotonskem mikroskopu je vzbujanje

molekul prostorsko omejeno na velikost gorišča. Pri tehnikah kjer lahko celo pridemo pod uklonsko

limito svetlobe pa vzorec osvetljujemo s svetlobo, ki ima dobro prostorsko definirano porazdelitev

intenzitete [5,7,8].

4.1 KONFOKALNA MIKROSKOPIJA

Konfokalna mikroskopija predstavlja močno orodje v mikroskopiji bioloških vzorcev. Pri tem tipu

mikroskopije odstranimo svetlobo, ki prihaja iz delov vzorca, ki ne ležijo v goriščni ravnini [8]. To

naredimo tako, da postavimo zaslon z majhno luknjico na pot svetlobe in s tem fizično zaustavimo

žarke, ki prihajajo iz delov vzorca, ki ne ležijo v goriščni ravnini (Slika 5). Tanjšo rezino vzorca želimo

opazovati, manjša mora biti luknjica. Pri manjšanju velikosti luknjice pa smo omejeni, saj skozi manjšo

luknjico pride manj fotonov pa tudi sipanje svetlobe je na majhni luknjici večje. Optimalna velikost

luknjice je enaka širini porazdelitve svetlobe, ki je definirana z enačbo 1, običajno pa so v praksi

luknjice večje. Prednost konfokalne mikroskopije je v tem, da omogoča 3D snemanje. Posnete 2D

5

slike posameznih optičnih rezin, lahko sestavimo v 3D objekt [8]. Na sliki 6 je prikazana postavitev

takega mikroskopa.

Slika 5: Če fizično omejimo žarke v ravnini nastanka slike, s tem

zaustavimo žarke, ki so prišli iz delov vzorca izven goriščne

ravnine. Na detektor pride le signal iz ene točke vzorca, tako lahko

skeniramo vzorec točko za točko in sestavimo bolj ostro sliko [9].

Slika 6: Postavitev pri konfokalni mikroskopiji. Lasersko

svetlobo s katero vzbujamo molekule usmerimo na

vzorec s sistemom leč. Nato s tem istim sistemom leč

usmerimo svetlobo iz vzorca na detektor pri čemer v

pot žarkov postavimo dikroično zrcalo, ki prepusti

svetlobo z daljšo valovno dolžino, s krajšo valovno

dolžino pa ne. Svetloba z daljšo valovno dolžino potem

pade na zaslon, v katerem je luknjica, ki prepusti na

detektor le svetlobo, ki prihaja iz določene točke vzorca

[10].

Problem pri fluorescenčnem mikroskopu je, da ekscitacijska svetloba povzroči fluorescenco celotnega

vzorca. Pri običajnem t.i. slikanju v širokem polju prihaja več kot 90 % svetlobe, ki pade na detektor, iz

delov vzorca, ki ležijo izven goriščne ravnine. Če si predstavljamo biološko celico, ki je debela 5 – 15

μm v primerjavi z debelino optične rezine, ki je definirana z ločljivostjo z smeri (enačba 3) in je okoli

800 nm, vidimo, da se le majhen del celice nahaja znotraj optične rezine. Poleg te svetlobe pa

prispeva k slabši ločljivosti tudi sipanje fluorescenčnih žarkov. Pri tem se moramo zavedati, da se

žarki iz globjih predelov vzorca večkrat sipljejo in zato za te strukture dobimo slabše posnetke [8].

Pri opazovanju s konfokalnim mikroskopom želimo dobiti slike tankih rezin vzorca, ki jih nato lahko

sestavimo v 3D sliko. Poznamo dva osnovna načina. Prvi je, da sočasno naredimo dve stvari: sliko

skeniramo z ekscitacijsko svetlobo, torej točko za točko, in potem izsevano (emitirano) svetlobo, ki

pride iz vzorca omejimo le na tisto, ki prihaja iz gorišča, torej tudi posnamemo signal točko za točko

(Slika 7 levo) [8]. Drugi način pa temelji na vrtečem disku z luknjicami, kjer snemamo več točk

sočasno. Pri snemanju vrtimo disk in pri tem sočasno snemamo več točk (Slika 7 desno) [11]. Na sliki

8 je predstavljena primerjava posnetkov celice s slikanjem v širokem polju in s slikanjem v

konfokalnem načinu.

6

Slika 7: Primerjava dveh načinov snemanja pri

konfokalni mikroskopiji. Levo je prikazan način

kjer sočasno osvetljujemo in zajemamo signal,

točko za točko. Desno pa način pri katerem

vrtimo disk in pri tem sočasno snemamo več točk

[9].

Slika 8: Primerjava slike celice med delitvijo

posnete s slikanjem v širokem polju (levo) in

s konfokalnim mikroskopom (desno).

Velikost celice na sliki je 20 µm [9].

4.2 DVOFOTONSKA FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA

Osnova dvofotonske fluorescenčne mikroskopije je vzbujanje molekule z dvema fotonoma daljše

valovne dolžine (Slika 9). Molekula mora absorbirati dva fotona sočasno, da preide v višje energijsko

stanje. Kar pa pomeni, da mora biti gostota fotonov za ta proces zelo velika, oziroma, da moramo

imeti lokalno zelo veliko intenziteto svetlobe. To dosežemo z zbiranjem žarka v gorišče. Samo v

gorišču leče je intenziteta dovolj velika da pride do vzbujanja. Pri vzbujanju z enim fotonom pride do

vzbujanja med celotno potjo žarkov, kar pomeni, da signal dobimo iz celotnega vzorca, pri

dvofotonskem pa le iz gorišča (Slika 10) [12].

Slika 9: Levi diagram prikazuje energijske nivoje in prehod z

absorpcijo enega fotona, desni pa prehod z absorpcijo dveh

fotonov [13].

7

Slika 10: Pri vzbujanju z enim fotonom,

dobimo fluorescenco (rumena svetloba) iz

celotne poti žarka za vzbujanje (spodaj), pri

dvofotonskem vzbujanju pa je intenziteta

dovolj velika le v gorišču, zato dobimo

flourescenco le iz tega omejenega območja

(zgoraj) [14].

Dvofotonska absorpcija je nelinearni optični pojav. Nelinearne optične pojave opišemo z

, (4)

kjer je polarizacija v snovi, in sta linearna in nelinearna polarizacija. je linearna

susceptibilnost,

in

pa sta nelinearni susceptibilnosti drugega in tretjega reda, pa je

električno polje. Pri dvofotonski absorpciji pride v poštev člen

, kjer sta in električni

polji obeh fotonov. Pomembno dejstvo je, da so velikosti koeficientov

veliko manjše od tistih pri

. Za opazovanje teh pojavov potrebujemo torej veliko večja polja, kar pa dosežemo le z laserji.

Posledično je pri dvofotonski mikroskopiji področje vzbujanja veliko manjše, saj lokalno zelo močno

polje dobimo le v ožjem delu gorišča [15].

Pri dvofotonski mikroskopiji torej vzbujamo molekule le v ožji okolici gorišča in tako posnete slike ne

moti svetloba iz drugih delov vzorca. Če primerjamo dvo fotonsko mikroskopijo z enofotonsko

konfokalno mikroskopijo, ugotovimo, da sta obe še omejeni z uklonsko limito svetlobe, ki je odvisna

od valovne dolžine. Pri dvofotnski mikroskopiji uporabljamo svetlobo daljše valovne dolžine, kar

pomeni da je uklonska limita dvakrat večja. Ima pa uporaba daljših valovnih dolžin to prednost, da se

ti fotoni manj sipljejo. Torej je uporabnost ene ali druge tehnike predvsem odvisna od vzorca. Če se v

vzorcu svetloba močno siplje ali so ti zelo debeli, potem je bolj primerna dvofotonska mikroskopija, v

nasprotnem primeru pa konfokalna enofotonska [16].

4.3 MIKIROSKOPIJA S STRUKTURIRANO OSVETLITVIJO VZORCA

Poglejmo kakšen je princip izboljšanja ločljivosti pri mikroskopiji, ki temelji na strukturirani osvetlitvi

(ang. Structured illumination microscopy). Za razumevanje principa bomo morali iti v recipročni

Fourierov prostor. Če so najmanjše strukture, ki jih še razločimo velikosti , potem v recipročnem

prostoru lahko opazujemo valovne vektorje v področju omejenem z radijem . Te omejitve

so vezane na fluorescenco vzorca , le ta pa je odvisna od koncentracije molekul , ki

fluorescirajo in od intenzitete svetlobe s katero jih vzbujamo :

(5)

Če se preselimo v recipročni Fourierov prostor postane produkt konvolucija:

(6)

8

Poenostavljeno povedano konvolucija meša informacijo iz različnih točk v prostoru in tako premakne

nekaj informacije iz zunanjega dela področja omejenega z v notranjost. Bolj natančno, je

odvisna od v drugih točkah, npr. , torej je lahko v točki odvisna od vrednosti

v točkah izven območja omejenega z . torej vsebuje informacijo o , ki je iz

področja izven . Pri tem izberemo strukturo osvetljevanja , iz katere zlahka odkodiramo

želeno informacijo. mora biti netrivialna funkcija, ki ima v realnem prostoru neko prostorsko

strukturiranost na najmanjši možni skali. Na primer . Fourierova

transformacija take funkcije je vsota treh delta funkcij

, torej je konvolucijski integral za iz enačbe 6

(7)

Če posnameno sliko, posnamemo vsoto vseh treh prispevkov, ki jih ne moremo ločiti med sabo.

Vendar pa se posamezni prispevki med sabo ločijo po fazi . Če spremenimo fazo osvetljevanja

in posnamemo tri slike pri treh različnih fazah pa izmerimo tri neodvisne linearne kombinacije ,

in .

Opazujemo lahko le za znotraj področja omejenega z , prav tako to velja za , to

pomeni, da je , lahko največ . Tako lahko opazujemo le informacijo, ki leži v območju, ki sega

izven za največ (Slika 11). Ločljivost lahko torej na ta način izboljšamo le za faktor dva [17].

Slika 11: Na sliki (a) je predstavljeno

območje, ki ga lahko opazujemo in je

omejeno z . Na sliki (b) pa je

shematsko prikazano, kako lahko z

vektorjem dostopamo tudi do

informacij izven tega prostora, vendar

za največ [17].

Princip lahko povzamemo bolj poenostavljeno. Na sliki 12 vidimo, kako dobimo iz dveh periodičnih

vzorcev, ki se prekrivata (to sta npr. in ), nov vzorec z daljšo periodo. Ta vzorec z daljšo

periodo je in ga lahko posnamemo do ločljivosti omejene z . Enega izmed bolj finih vzorcev

naredimo v svetlobi s katero vzbujamo molekule in je torej poznan ( ), tako lahko iz izmerjene

slike in z upoštevanjem strukture , dobimo tisto, kar nas zanima, to je porazdelitev molekul, ki

fluorescirajo v vzorcu ( ) [18].

Slika 12: Iz slike je razvidno, kako iz dveh bolj finih vzorcev (Δx), ki

predstavljata in nastane vzorec z bolj grobo strukturo, ki

ga lažje opazujemo (Δx') in predstavlja [18].

Postavitev pri takem mikroskopu je shematsko predstavljena na sliki 13. Svetlobo za vzbujanje najprej

pošljemo skozi uklonsko mrežico, da dobimo strukturirano osvetlitev, s katero potem vzbujamo

molekule v vzorcu [17].

9

Slika 13: Shema mikroskopa, ki temelji na strukturirani osvetlitvi: (a) izvor svetlobe, (b) zbiralna leča,

(c) linearni polarizator, (d) uklonska mrežica s katero naredimo strukturirano osvetlitev, (e) zaslon, ki

prepusti le prvi red uklonjenih žarkov, (f) detektor, (g) dikroično zrcalo, (h,i) optika za usmerjanje

žarkov na vzorec, (j) vzorec *17].

Obdelava slik je predstavljena na sliki 14. Običajno posnamemo več slik pri različnih vektorjih , ki jih

potem sestavimo v sliko v prostoru, ki pa ima premer . Ko to sliko transformiramo v realni

prostor, dobimo sliko z dvakrat izboljšano ločljivostjo. Na sliki 15 je primerjava slik fluorescenčnih

mikrosfer premera 120 nm posnetih z običajnim in konfokalnim mikroskopom, ter mikroskopom z

uporabo strukturirane osvetlitve [17].

Slika 14: Običajno posnamemo 7

slik pri različnih vektorjih , pri

in pri treh različnih smereh

parov in , ki jih potem

sestavimo v sliko v prostoru, ki

ima premer [17].

Slika 15: Primerjava slik fluorescenčnih

mikrosfer premera 120 nm posnetih z

običajnim (a) in konfokalnim (b)

mikroskopom, ter mikroskopom z

uporabo strukturirane osvetlitve (c). Na

sliki so obkroženi trije delci, pri katerih je

izboljšanje ločljivosti lažje oceniti, pri

skupjih delcev namreč lahko izgleda, da je

ločljivost boljša kot za faktor dva [17].

4.4 MIKROSKOPIJA, KI TEMELJI NA NASIČENJU STANJ

Poglejmo kakšna je limita ločljivosti pri mikroskopiji, ki temelji na nasičenju stanj. Molekula, ki

fluorescira, je lahko v dveh stanjih A in B, ki sta na primer vzbujeno in osnovno stanje. Označimo

hitrostni konstanti teh prehodov s in , potem opišemo delež molekul v posameznih stanjih

kot

10

, (8)

kjer sta in normirana deleža molekul v stanju A in v stanju B in zavzemata vrednosti med 0 in

1. Značilni relaksacijski časi teh prehodov so v območju piko in nanosekund. Če imamo ob času

vse molekule v stanju A (začetni pogoj), potem je čez nekaj časa delež molekul v stanju A

(9)

Po daljših časih dobimo stacionarno stanje .

Želeli bi pretvoriti molekule iz stanja A v B. To dosežemo s svetlobo valovne dolžine , proces pa

poteka s hitrostjo , kjer je absorpcijski presek in gostota svetlobnega toka. Če

želimo biti pri izpeljavi bolj splošni, predpostavimo, da povzroči tudi neželeni prehod B → A s

presekom . V najbolj splošnem primeru prehaja stanje B v A po treh različnih poteh. Preko

zunanjih vplivov , spontano s hitrostno konstanto in pod vplivom svetlobnega toka

,

skupno hitrostno konstanto prehoda torej lahko izrazimo kot

(Slika 16). Če

vse opisane predpostavke vstavimo v enačbo 9 dobimo

(10)

Slika 16: Na sliki je shematsko prikazano prehajanje molekule med

stanjema A in B s hitrostnima konstantama in [19].

Enačba 10 ima dve limiti, ko gre , je , torej molekule ostanejo v stanju A. Ko pa je

intenziteta velika je

, za in zanemarljiv ,

torej so vse molekule v stanju B. Za intenzitete večje od neke mejne vrednosti , je torej v

stacionarnem stanju večina molekul v stanju B. Intenziteto definiramo tako, da je pri taki

vrednosti intenzitete polovica molekul v stanju A in polovica v stanju B. Iz enačbe

dobimo

.

Vzemimo, da je gostota svetlobnega toka funkcija prostorske koordinate in da

ima pri lokalno ničlo . Funkcija je normalizirana funkcija, ki opisuje

porazdelitev intenzitete svetlobe, kot jo narekuje uklonska limita. Če na vzorec posvetimo s svetlobo

velike intenzitete

potem dobimo

(delež molekul definiran pod pogoji

velike intenzitete osvetljevanja) povsod razen v ožji okolici , kjer je (vse molekule so

vstanju A, saj ). Torej lahko ustvarimo z dovolj močno svetlobo relativno ostro omejeno

področje, kjer so molekule le v stanju A. Izrazimo razsežnost področja s stanjem A z za

. Iz

pri pogoju

dobimo limito

ločljivosti pri mikroskopiji, ki temelji na nasičenosti stanj (Slika 17):

11

(11)

Ta ločljivost je velikostnega reda nekaj deset nanometrov.

Slika 17: Shema, kako do ločljivosti pri

mikroskopiji, ki temelji na nasičenju stanj. Z

modro barvo je označena intenziteta

osvetljevanja , z rdečo

barvo je označena . Z zeleno barvo pa je

označen normiran delež molekul, ki ostanejo

v stanju A . je področje, v katerem je

večina molekul v stanju A in ga lahko

zmanjšamo z večanjem .

Če sliko posnamemo točko za točko, uklonska limita optičnih komponent ne igra pomembne vloge,

saj vsa svetloba, ki jo zaznamo na detektorju prihaja iz dobro definiranega področja, kjer je molekula

v stanju A. Pomembna je le če želimo snemati več točk sočasno, pri tem moramo paziti, da so te

točke medsebojno oddaljene za večjo razdaljo kot jo narekuje uklonska limita [19].

Pri fluorescenčni mikroskopiji s stimulirano emisijo (poglavje 4.4.1), ki temelji na opisanem principu,

stimuliramo prehod iz vzbujenega stanja, ki fluorescira (A) v osnovno stanje, ki ne (B). Organski

fluorofori, ki se običajno uporabljajo imajo in stabilno osnovno stanje B

( , stanje A pa tudi spontano razpada preko fluorescence s konstanto

, torej

potrebujemo intenzitete svetlobe večje od

. Pri mikroskopiji, ki temelji na zasičenosti stanj se običajno uporabljajo sunkovni laserji,

ki delujejo na principu uklepanja faz, ti nam omogočajo kratke sunke svetlobe močne intenzitete.

Za

prevladuje stimulirano prehajanje iz vzbujenega v osnovno stanje. Do sedaj so

dosegli ta razmerja do 120, kar pomeni da so presegli uklonsko limito za desetkrat (enačba 11). Za

doseganje še boljše ločljivosti bi potrebovali močnejšo intenziteto svetlobe (npr. vrednosti razmerja

103 ali večje), tako visoke intenzitete pa v fluorescenčni mikroskopiji niso več mogoče. Lahko

pogledamo še drug primer v katerem je najmanjša. To je, ko sta

in enaki nič. Ker ni več

nasprotnih procesov lahko področje zmanjšamo že pri zmernih svetlobnih tokovih , pri čemer

je velikost odvisna od časa osvetljevanja. Daljši časi pa so možni saj so stanja brez spontanih

razpadov bolj dolgoživa, ta pristop je uporabljen pri mikroskopiji s praznenjem osnovnega stanja

(poglavje 4.4.2). Pri tem načinu daljšega osvetljevanja pa nas lahko na nanoskali omeji Brownovo

gibanje molekul, ki fluorescirajo, ki pri daljših časih seveda ni zanemarljivo [19].

4.4.1 Fluorescenčna mikroskopija s stimulirano emisijo (STED, ang. stimulated emission depletion)

Pri STED mikroskopiji prostorsko omejimo vzbujanje molekul z različnimi laserji. Najprej s točkasim

laserjem vzbudimo molekule nato pa z žarkoma, ki povzročita stiimulirano emisijo in sta usmerjena

12

malo iz gorišča to področje omejimo (Slika 18). Torej, ko dobimo signal na detektorju, ta prihaja iz

točno določene točke *19].

Slika 18: Shematsko prikazana žarka za vzbujanje

molekul in za deekscitacijo preko stimulirane

emisije, ter ozko področje vzbujenih molekul, ki

fluorescirajo [2].

Na sliki 19 je shematsko prikazana postavitev pri STED mikroskopu. Svetloba, ki povzroča vzbujanje iz

stanja S0L0 v stanje S1L1' (Slika 3), izvira iz točkastega izvora, ki je laser usmerjen na majhno

odprtinico. Ta točkast izvor svetlobe preslikamo na vzorec s pomočjo zbiralne leče. Porazdelitev

intenzitete ( svetlobe v goriščni ravnini je omejena zaradi uklona svetlobe: je sorazmerna z

, pri čemer je (poglavje 2.). Odvisnost intenzitete svetlobe v goriščni

ravnini v odvisnosti od razdalje od optične osi je narisana na desni strani slike 19 [7].

Širino porazdelitve zmanjšamo tako, da onemogočimo fluorescenco v zunanjih področjih. To

naredimo s pomočjo dodatnega žarka svetlobe (ang. STED beam). Na sliki 19 ta žarek izvira iz drugega

laserja in ga razdelimo na dva žarka, ki sta usmerjena malo iz gorišča, za , v primerjavi z žarkom

za vzbujanje molekul. Če ta premik primerno izberemo, se bosta žarka prekrivala z žarkom za

vzbujanje, iz ene in iz druge strani (Slika 19 desno). Vloga STED žarka je, da povzroči prehode iz

vzbujenega v osnovno stanje preko stimulirane emisije in tako izprazni vzbujena stanja preden pride

do fluorescence. Torej prispevajo k signalu fluorescence le molekule iz najbolj notranjega področja

žarka s katerim smo molekule vzbujali *7].

Razpadni čas vzbujene molekule, za fluorescenco je reda 10 ns, vibracijski prehodi pa so reda ps. S

primerno izbiro zakasnitev med pulznimi laserji, lahko časovno ločimo vzbujanje in stimulirano

emisijo. Optimalno je, da STED pulz pride na vzorec takoj za tem, ko je konec vzbujanja. Pulzi za

stimulirano emisijo so malo daljši od vibracijskega razpolovnega časa, ki je približno 1-5 ps [7].

Slika 19: Postavitev pri STED

mikroskopiji. Žarek za vzbujanje in

dva malo izmaknjena STED žarka

usmerimo na vzorec, nato pa

svetlobo iz vzorca usmerimo na

detektor. Na desni strani je graf

porazdelitve intenzitet žarka za

vzbujanje in STED žarkov [7].

13

Slika 20 prikazuje populacijo molekul v S1L1 stanju po tem, ko je STED pulz zapustil vzorec (na podlagi

numeričnih izračunov) pri različnih jakostih toka fotonov. Ko povečujemo intenziteto žarka opazimo,

da dobi krivulja precej strme robove, kar pomeni, da lahko območje vzbujanja dobro omejimo. Ta

moč pa je za tri velikostne rede manjša od tiste, ki se uporablja pri dvofotonski fluorescenčni

mikroskopiji [7].

Slika 20: Izračunane verjetnosti za molekulo, da ostane

v S1L1 stanju, po tem ko STED žarka zapustita goriščno

ravnino. Krivulje so za različne intenzitete STED žarkov:

(a) 3.4, (b) 34, (c) 170 in (d) 1300 MW/cm2 [7].

Ločljivost pri STED mikroskopiji je torej lahko bistveno boljša od tiste, ki jo narekuje uklonska limita.

Slika 21 prikazuje dva vzorca posneta s konfokalno in STED mikroskopijo. Pri slikah posnetih s STED

mikroskopom lahko razločimo veliko manjše strukture kot pri konfokalni mikroskopiji.

Slika 21: primerjava konfokalne in STED

mikroskopije. Na slikah (a) so urejeni

delci, ki so pri STED mikroskopiji lepo

vidni, pri konfokalni pa ne, na (b) pa so

nevrofilamenti človeških celic

nevroblastoma [20].

4.4.2 Mikroskopija s praznenjem osnovnega stanja (GSD, ang. ground state depletion)

Pri STED fluorescenčni mikroskopiji uklonsko limito ločljivosti premagamo z odstranjanjem vzbujenih

stanj v okolici gorišča. Vzbujena stanja v okolici odstranimo s pomočjo stimulirane emisije.

Deekscitacija molekul pa mora biti hitrejša od fluorescenčnega razpada in počasnejša od vibracijskih

relaksacij. Torej pri STED fluorescenčni mikroskopiji uporabljamo pikosekundne laserje. GSD pa je

metoda pri kateri lahko dosežemo izboljšano ločljivost s svetlobo nižje intenzitete skozi daljši čas.

Slika 22 prikazuje energijska stanja fluorofora z dolgoživim tripletnim stanjem T1. S0 je osnovno stanje

S1 pa vzbujeno singletno stanje. Ker bomo vzorec osvetljevali skozi daljši čas, moramo upoštevati tudi

tripletno stanje T1. L0, L1 in L2 so vibracijsko nevzbujena L0', L1' in L2' pa vibracijsko vzbujena stanja,

njihovi razpadni časi so reda pikosekund. Razpad tripletnega stanja je najpočasnejši v procesu,

razpadni čas tega stanja je v območju mikro in milisekund. Ko prižgemo kontinuitetni val vzbujanja,

pričakujemo da se v nekaj milisekundah vzpostavi ravnotežje, število molekul v posameznem stanju

14

se ne spreminja več s časom. Slika 23 prikazuje odvisnost posamezne populacije od intenzitete žarka

vzbujanja. Pri tem procesu opazimo, da je v ravnovesju večina molekul v dolgoživem tripletnem

stanju. Posledično je zelo malo molekul v osnovnem stanju, od koder tudi izvira samo ime metode.

Osnovno stanje ostane izpraznjeno dokler vzorec osvetljujemo in še povprečen razpadni čas

tripletnega stanja po tem, ko smo nehali z osvetljevanjem [21].

Slika 22: Slika prikazuje energijska stanja tipičnega

fluorofora z dolgoživim tripletnim stanjem. S0 je

osnovno stanje S1 pa vzbujeno singletno stanje. Ker

bomo vzorec osvetljevali skozi daljši čas, moramo

upoštevati tudi tripletno stanje T1. L0, L1 in L2 so

vibracijsko nevzbujena L0', L1' in L2' pa vibracijsko

vzbujena stanja, njihovi razpadni časi so reda

pikosekund. Razpad tripletnega stanja je najpočasnejši v

procesu in je v območju mikro in milisekund [21].

Slika 23: Iz slike je razvidno, da nad neko določeno močjo

vzbujanja dobimo večino molekul v najdlje živečem

tripletnem stanju (n2), manj v vzbujenem singletenem stanju

(n1), nič pa v osnovnem stanju (n0). V tem primeru je razpadni

čas iz vzbujenega singletnega v osnovno singletno stanje 4,5

ns, razpadni čas vzbujenega singletnega v tripletno stanje je

100 ns in tripletnega v osnovno 1 μs. Molekule prehajajo iz S0

v S1 in zopet v S0, vendar se pri vsaki zanki nekaj molekul

ujame v dolgoživeče tripletno stanje. Osnovno stanje je

prazno, dokler je svetloba prižgana, ko jo ugasnemo pa še

povprečen življenski čas razpada tripletnega stanja, torej

reda 1 μs [21].

Kako vpliva nezasedenost osnovnega stanja na izboljšanje ločljivosti. Za enakomerno osvetljeno lečo

je intenziteta svetlobe v gorišču podana z , (enačba 1) [21].

Predpostavimo, da imamo dva žarka, ki sta simetrično zamaknjena za od gorišča. Za premik

, prva minimuma obeh žarkov sovpadata v geometrijskem gorišču. Ta dva žarka

povzročita, da je po daljšem času osvetljevanja, molekula ujeta v tripletno stanje. Na sliki 24 je

prikazan graf verjetnosti, da molekula ni ujeta v tripletno stanje v odvisnosti od razdalje od gorišča.

Pri večjih intenzitetah osvetljevanja dobimo, zaradi nasičenosti procesov, bolj strmo omejena

področja molekul, ki niso v tripletnem stanju. Razpolovni čas tripletnega stanja je reda mikrosekund,

torej, ko izklopimo svetlobo, ki črpa molekule iz osnovnega stanja, ostane dovolj časa za vzbujanje

molekul iz osnovnega singletnega v vzbujeno singletno stanje v ozkem goriščnem območju in

snemanje fluorescence, ki poteče v nekaj nanosekundah. S to tehniko lahko dosežemo ločljivosti 10 –

20 nm brez uporabe laserjev visokih intenzitet [21].

15

Slika 24: Odvisnost verjetnosti, da molekula ni v tripletnem

stanju od oddaljenosti od geometrijskega gorišča pri

različnih intenzitetah žarkov: (a) 0,001; (b) 0,01; (c) 0,1; (d) 1

MW/cm2. Vidimo, da z naraščanjem intenzitete dobimo

dobro omejeno področje molekul v osnovnem stanju (d)

[21].

5. ZAKLJUČEK

Velika potreba po natančnejšem proučevanju celičnih procesov je privedla do razvoja mikroskopskih

tehnik, ki omogočajo opazovanje celičnih struktur, ki so manjše kot uklonska limita. Najbolj razširjeno

se uporabljajo konfokalni mikroskopi, ki temeljijo na zastiranju svetlobe, ki prihaja iz dela vzorca, ki ni

v gorišču. Mikroskopija, ki temelji na strukturirani osvetlitvi, lahko izboljša ločljivost za faktor dva, v

primerjavi s konfokalno mikroskopijo. Želeli pa bi si ločljivost reda posameznih molekul, torej

nanometrskih struktur. Najbolj obetavna je STED mikroskopija pri kateri je v teoriji ločljivost

neomejena in jo lahko izboljšujemo z večanjem intenzitete svetlobe s katero osvetljujemo vzorec. V

praktičnem pogledu pa smo seveda omejeni saj so biološki vzorci občutljivi na visoke intenzitete

svetlobe, pride tudi do sprememb v molekulah, ki fluorescirajo in fluorescence ne opazimo več.

LITERATURA [1]R. Heintzmann and G. Ficz, Brief. Funct. Genomic. Proteomic. 5, 289 (2006)

[2]L. Schermelleh, R. Heintzmann and H. Leonhardt, J. Cell. Biol. 190, 165 (2010).

[3] E. Hecht, Optics 4th edition (Addison Wesley, San Francisco 2002)

[4] Numerical aperture, http://www.classle.net/bookpage/numerical-aperture, 17.05.2011

[5] F. Querciolli, Fundamentals of Optical Microscopy v A. Diaspro, Optical Fluorescence Microscopy (Springer-Verlag,

Berlin Heidelberg 2011).

[6]Point spread of confocal laser scanning microscopy, http://www.bme.cornell.edu/gallery.cfm?id=14, 17.05.2011

[7] S. W. Hell and J. Wichmann, Opt Lett. 19, 780 (1994).

[8] J. A. Conchello and J. W. Lichtman, Nature Methods 2, 920 (2005).

[9] Multipoint confocal scanning, http://www.biovis.com/carv-ii.htm, 17.05.2011

[10] Confocal Microscopy, http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html, 09.05.2011.

[11] Yokogawa Spinning Disk Scanning Unit, http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spinningdisk/yokogawa/index.html, 09.05.2011.

[12]A. Nakano, Cell. Struct. Funct. 27, 349 (2002).

[13] Two-photon Microscopy, http://research.stowers-

institute.org/microscopy/external/Technology/NLO/index.htm, 09.05.2011.

[14] One vs two-photon excitation, http://belfield.cos.ucf.edu/one%20vs%20two-photon%20excitation.html,

17.05.2011

[15] M. Čopič, Elektrooptika, skripta, Ljubljana 2003.

[16] W. Denk, K.R. Delaney, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B.W. Strowbridge, D.W. Trank and R. Yuste, J Neurosci Methods.

54, 151 (1994)

[17]M. G. L. Gustafsson, D. A. Agard and J. W. Sedat, Proceedings of SPIE 3919, 141 (2000).

[18] M. G. L. Gustafsson, J. Microsc. 198, 82 (2000).

[19] S. W. Hell, Phys. Lett. A 326, 140 (2004).

[20] S. W. Hell, Science 316, 1153 (2007).

[21] S. W. Hell and M. Kroug, Appl. Phys. B 60, 495 (1995).