k562 hÜcre dİzİsİnde fosfİn bİleŞİklerİnİn s totoksİk etkİsİnİn mtt … ·...

T.C.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANA BİLİM DALI

PEDİATRİK HEMATOLOJİ BİLİM DALI

K562 HÜCRE DİZİSİNDE FOSFİN BİLEŞİKLERİNİN

SİTOTOKSİK ETKİSİNİN MTT (3-[4,5-DIMETHYLTHIAZOLE-2-

YL]-2,5-DIPHENYLTETRAZOLIUM BROMIDE; THIAZOLYL

BLUE) İLE ARAŞTIRILMASI

Nilay OKTAR

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof. Dr. A. Bülent ANTMEN

ADANA - 2009

T.C.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABİLİM DALI

PEDİATRİK HEMATOLOJİ BİLİM DALI

K562 HÜCRE DİZİSİNDE FOSFİN BİLEŞİKLERİNİN

SİTOTOKSİK ETKİSİNİN MTT (3-[4,5 DIMETHYLTHIAZOLE-2-

YL]-2,5-DIPHENYLTETRAZOLIUM BROMIDE; THIAZOLYL

BLUE) İLE ARAŞTIRILMASI

Nilay OKTAR

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof. Dr. A. Bülent ANTMEN

Bu tez Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından SBE TF2007YL10

no’lu proje olarak desteklenmiştir.

Tez no:

ADANA - 2009

iii

TEŞEKKÜR

Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını

esirgemeyen danışmanım Sayın Prof.Dr. A. Bülent ANTMEN’e, Ç.Ü. Pediatrik

Hematoloji Bilim Dalı Başkanı Sayın Prof.Dr. Yurdanur KILINÇ’a ve Doç.Dr. İlgen

ŞAŞMAZ’a teşekkür ederim.

Çalışmamda K562 hücre serilerinin temininde yardımlarını esirgemeyen

Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıp ve Kanser Araştırmaları Merkezi’nden Sayın

Prof.Dr. Ali Uğur URAL’a ve metal komplekslerini sentezleyen Ç.Ü. Fen-Edebiyat

Fakültesi Kimya Bölümü’nden Sayın Prof.Dr. Osman SERİNDAĞ’a teşekkürü borç

bilirim.

Hücre kültürü çalışmalarımda başından bu yana bana olan katkılarından dolayı

Başkent Üniversitesi Adana Araştırma Hastanesi Hematoloji Araştırma

Laboratuvarı’ndan Sayın Yard.Doç.Dr. İlknur KOZANOĞLU’na ve Pediatrik

İmmünoloji Laboratuarı Bilim Dalı’ndan Doç.Dr. Mustafa YILMAZ’a ve Biyolog

Hatice İRDAY’a teşekkür ederim.

Ayrıca her zaman yanımda olan, maddi ve manevi katkılarını hiç bir zaman

esirgemeyen, beni anlayışla karşılayan aileme teşekkürü bir borç bilirim.

iv

İÇİNDEKİLER

TEŞEKKÜR iii

İÇİNDEKİLER iv

ŞEKİLLER DİZİNİ vi

TABLOLAR DİZİNİ vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ viii

ÖZET ix

ABSTRACT x

1. GİRİŞ 1

2. GENEL BİLGİ 2

2.1. Hücre Kültürü Tarihçe 2

2.2. Hücre Kültürü Tanım ve Yöntemleri 2

2.3. Hücre Kültürü Yönteminin Temel Aşamaları 8

2.3.1. Hücre Kültürü İçin Gerekli Cihazlar ve Kimyasal Malzemeler 8

2.3.2. Laminar flow hood 8

2.3.3. CO2 İnkübatörü 8

2.3.4. Mikroskop 9

2.3.5. Hücre Saklama Kapları 9

2.3.6. Kültür Saklama Kapları 9

2.3.7. Besiyeri 10

2.3.8. Serum 12

2.3.9. Addidif Solüsyonlar 12

2.3.10. Hücrelerin İnkübasyonu ve Bakımı 13

2.4. K562 Hücrelerinin Özellikleri 15

2.5. Sitotoksite ve Hücre Canlılığı 18

2.5.1. Hemositometre ile Hücre Sayımı ve Canlılık 20

2.5.2. Neutral Red 21

2.5.3. LDH Assay 21

2.5.4. Floresan Boya Tutucularla Canlılık Sayımı 22

2.5.5. Metabolik Fonksiyonların Değerlendirilmesi: Protein Sentezi 23

Kabul ve Onay ii

v

2.5.6. MTT Testi 23

2.6. Metal Fosfin Kompleksleri 24

3. GEREÇ VE YÖNTEM 27

3.1. Kullanılan Kimyasallar 27

3.2. Hücre Dizileri ve Çoğaltılması 28

3.3. Hücre Canlılığı 28

3.4. Hücre Kültürü 28

3.5. Sitotoksisite 29

4. BULGULAR 30

4.1. Metal-1: [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ] 30

4.2. Metal-2: [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 33

4.3. Metal-3: [PdCl2(dppaEtOH)] 36

5. TARTIŞMA 40

6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 43

7. KAYNAKLAR 44

8.

ÖZGEÇMİŞ 47

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 4.1.1. [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 kompleksin açık yapısı 31

Şekil 4.1.2. 12 lik plağa metal kompleksi eklemeden inkübasyon öncesi

mikroskobik görüntü 40× 31

Şekil 4.1.3. Kontrol (DMSO) 48 saatlik inkübasyon sonrası mikroskobik görüntü 20× 31

Şekil 4.1.4. Medium 48 saatlik inkübasyon sonrası mikroskobik görüntü 20× 32

Şekil 4.1.5. Konsantrasyon-1 (1ng/ml) mikroskobik görüntü 40× 32

Şekil 4.1.6. Konsantrasyon-2 (10-1ng/ml) mikroskobik görüntü 40× 32



Şekil 4.1.9. Konsantrasyon-5(10-4ng/ml) mikroskobik görüntü 40× 33

Şekil 4.2.1. [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 34

Şekil 4.2.2. [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ’ün K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin grafik ile

gösterimi 34

Şekil 4.2.3. 12 lik plağa Metal kompleksi eklenmeden inkübasyon öncesi








Şekil 4.3.1. [PdCl2(dppaEtOH)] 37

Şekil 4.3.2. 12 lik plağa metal kompleksi eklemeden inkübasyon öncesi



Şekil 4.3.4. Medium 48 saatlik inkübasyon sonrası mikroskobik görüntü 40× 38






vii

TABLOLAR DİZİNİ

Tablo 2.1. Yaygın olarak kullanılan hücre serileri 7

Tablo 2.2. Hücre kültürü besiyerinin bileşenleri (Memeli hücresi için) 11

Tablo 4.1.1.[PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi 30

Tablo 4.2.1.[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi 33

Tablo 4.3.1. [PdCl2(dppaEtOH)]’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi 37

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

DMSO : Dimetilsülfoksit

DNA : Deoksiribonükleik Asit

Dulbecco’s PBS : Dulbecco’s Balanced Salt Solution

Earle’s BSS : Earle’s Balanced Salt Solution

EBV : Epstein-Barr virus

FBS : Fetal Bovine Serum

Hank’s BSS : Hank’s Balanced Salt Solution

MLC : mikst lenfosit kültürü

MTT : (3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue)

XTT : (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sülfophenyl]-2H-tetrazolium -5-carboxanilide inner

salt)

WST-1 : 2-[4-iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-[2,4-disulfophenyl]-2H tetrazolium

monosodium salt

PBS :Phosphate Buffered Saline

µg :mikrogram

mL :mililitre

µL :mikrolitre

mM :milimol

μM :mikromol

ng :nanogram

nm :nanometre

ix

ÖZET

K562 Hücre Dizisinde Fosfin Bileşiklerinin Sitotoksik Etkisinin MTT (3-[4,5-

Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) ile

Araştırılması

Bu çalışmada bazı fosfin bileşiklerinin, ([PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ],

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ve [PdCl2(dppaEtOH)]), miyeloid löseminin blastik kriz

evresindeki hücrelerden elde edilmiş olan K562 hücrelerine olan sitotoksik

etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Yeni sentezlenen bu organofosfin

bileşiklerinin K562 hücre dizisindeki sitotoksik etkileri antikanser ilaç

araştırmasının ilk basamağını oluşturmaktadır.

K562 hücre dizisi, çalışmaya başlamadan önce pasajlandı. 12 kuyucuklu

steril plaklara her bir kuyucuğa öncelikle 104 hücre ekilmesinden 24 saat sonra

her bir kuyucuğa 5 farklı konsantrasyonda (1ng/mL, 10-1 ng/mL, 10-2ng/mL, 10-

3ng/mL ve 10-4ng/mL olacak şekilde) organofosfin bileşikleri ilave edildi. 48 saat

37 C° ta %5 CO2 li ortamda inkübe edildikten sonra hücreler 96 kuyucuklu

plaklara aktarıldı. Her bir kuyucuğa 10 µL MTT solusyonu eklendi ve 4 saat süre

ile enkübe edildi. Son olarak vortekste karıştırıldıktan sonra kuyucuklara DMSO

eklendi ve 10 dakika bekletilen plaklar, plak okuyucusunda 545 nm’de okutuldu.

Sonuçlar istatistiksel analizle değerlendirildi.

Yeni sentezlenen üç metal fosfin komplekslerinden sadece bir tanesinde

MTT testi ile sitotoksik etki olduğu saptandı. Bu çalışma ile, anti kanser etkinliği,

deneysel hayvan modellerinde araştırılması en ümit verici olanın

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 adlı metal fosfin bileşiği olduğunu MTT testi kullanarak

K562 hücre dizisinde gösterdik.

Anahtar Sözcükler

: K562, Sitotoksite, Fosfin, MTT

x

ABSTRACT

Cytotoxic Effect Of Phosphine Complexes on K562 Cell Line by Using MTT

((3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue)

In this study, we investigated the cytotoxic effect of phosphine compounds

on K562 cell line that originated by blastic phase of cronic myeloid leukemia. The

possible cytotoxic effect of new synthesized organophosphine compounds on the

some cancer cells especially K562 cell line could be the first step of anticancer

drug investigation.

Before starting this study, K562 cell line was passaged. The 104 K562 cells

was seed out each well of 12-well-culture plate. Two well determined as a blank

and was put medium and DMSO. Organophosphine compounds were added each

wells five different concentrations (1ng/mL, 10-1 ng/mL, 10-2ng/mL, 10-3ng/mL and

10-4ng/mL). MTT (3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide;

Thiazolyl blue was added each wells of 96-well-culture plate and incubated four

hours. After mixing by using vortex, finally DMSO was added each wells.

Microplate plates were incubated 10 minutes in the CO2 incubator and after the

plates were evaluated by microplate reader on the 545 nm and were determined

the absorbance values. The results were analysed by statistically methods.

The only one of the three new synthesized organophosphine compounds

had cytotoxic effect by used MTT test. In this study, we showed that the possible

anti cancer effect of the [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 might be give inspiration to us

with hope in the experimental animal models.

Key words: K562, cytotoxicity, phospin, MTT

1

1.GİRİŞ

K562 hücreleri, kronik miyeloid löseminin blastik kriz evresinden kaynaklı bir

miyeloid seri hücre dizisidir1. Kanser, hücrelerin sürekli olarak kontrolsüz çoğalması ile

karakterize bir düzen bozukluğudur. Bu durum, sürekli çoğalarak aşırı miktarda artan

hücre sayısının, normal olarak gerçekleşen uygun miktarda hücre kaybıyla

dengelenmemesi sonucu gerçekleşir. Bu hücreler invazyon yaparlar ve organizmanın

organlarını hasara uğratırlar. Kanser hücreleri kaynaklandıkları normal hücrelere göre

daha kısa zamanda ölmelerine rağmen yeni hücre oluşumu o kadar hızlıdır ki, sonuçta

hücreler devamlı artar. Aşırı hücre çoğalmasından kaynaklanan bu dengesizlik, hem

kanser hücrelerindeki genetik anormalliklerden hem de organizmanın bu hücreleri

tanımada ve yok etmedeki başarısızlığından dolayıdır2.

Kanser ilaçlarının çoğu, etkilerini kanser hücresinin proliferasyon ve bölünme

fazlarını etkileyerek gösterirler. Bazı kemoterapi ajanları, bazı spesifik kanser

hücrelerine etkiliyken diğer kanser hücrelerinde etkileri sınırlı olabilir. Bu nedenle farklı

sitotoksik maddelerin, farklı hücrelerdeki etkilerinin tam olarak aydınlatılması oldukça

önemlidir.

Çalışmamızda her biri ağır metal olan farklı organofosfin bileşiklerinin, miyeloid

löseminin blastik kriz evresinden kaynaklı K562 hücre dizisine olan sitotoksik etkisini

saptamayı hedefledik. Bu çalışma, yeni sentezlenmiş bu organofosfin bileşiklerinin

ileride antikanser ilaç olarak araştırılması için bir pencere açacaktır. Antikanser etkisi

olabilecek yeni bir bileşiğin sitotoksite testi ile saptanması, antikanser ilaçların

belirlenmesinde ilk adımdır. Bu çalışmaları takiben yapılması zorunlu olan diğer

testlerden, normal lenfosit kültürlerine etki ve hayvan çalışmaları ile kanser için yeni bir

kimyasal madde olabilecek bileşik tıbba kazandırılmış olabilecektir.

2

2.GENEL BİLGİLER

2.1.Hücre Kültürü Tarihçesi

Hücre kültürü, hücrelerin belirli bir besi ortamında çoğaltılmasıdır. Hücre

kültürlerinde yapılan çalışmalarının günümüzde önemli bir yeri vardır. Çeşitli patolojik

durumlarda belli bir maddenin etkilerini, bir hücre ya da dokuda üretilen belli bir

maddenin işlevlerini belirlemek amacıyla belli bir hücre serisinden çoğaltılan hücrelerde

çalışmalar yapılarak in vitro sonuçlar elde edilebilir. Hücre kültürü çalışmalarının

geçmişine bakacak olursak ilk olarak 1885’te Roux embriyonik tavuk hücrelerinin

hayvanın vücudunun dışında tuz çözeltisinde canlılığını sürdürebildiğini göstermiştir.

1907 yılında Harrison, kurbağa embriyonik dokusundan kültür yaparak aksonların

gelişimini göstermiş, daha sonra da 1910 yılında Burrows, tavuk embriyonik dokularını

geliştirmek üzere tavuk plazması kullanmıştır. Lewis&Lewis ise 1911 yılında ilk sıvı

mediumu kullanmıştır. 1913’te Carrel, hücrelerin steril koşullarda düzenli olarak

beslenmeleri halinde kültür ortamında uzun süre artabildiklerini göstermiştir. Earle ve

arkadaşları 1948’de L hücre serisinden izole ettikleri hücrelerin hücre kültüründe

klonlar oluşturduklarını tespit etmiş, Gey ve arkadaşları 1952’de bir insan servikal

karsinomasından türeyen hücrelerin HeLa sürekli serisini ortaya koymuşlardır. 1986’da

Martin, Evans ve arkadaşları fareden pluripotent embriyonik kök hücrelerini izole

ederek bu hücrelerin kültürünü yapmışlardır. 1998’de ise Thomson, Gearhart ve

yardımcıları insan embriyonik kök hücrelerini izole etmeyi başarmışlardır3.

2.2. Hücre Kültürü Tanım ve Yöntemleri

Teorik olarak çekirdeği olan her hücre çoğalma kabiliyetinde ise de

vücudumuzdaki hücreler çoğalma özelliklerinden dolayı üç ana gruba ayrılırlar.

Birincisi kök hücreler, kemik iliği ve gastrointestinal sistemin epitel hücreleri gibi

daima çoğalan hücreler, ikincisi karaciğer, periferal lenfosit ve makrofajlar gibi

uyarıldığı zaman çoğalan hücreler, son grup ise sinir sistemi ve gözün bazı hücreleri

gibi yaşam boyu bir kez çoğalan hücrelerdir. Bunlardan başka normal olmayan bir grup

daha vardır ki; doğal olarak apoptozise uğramayan, ölümsüz olduğu kabul edilen ve

sürekli çoğalan tümör hücreleridir3.

3

Ross Harison’un 1907‘de kurbağa embriyolarıyla yaptığı çalışma ile başlayan

süreç daha sonraki yıllarda çeşitli araştırıcıların sentetik besi yerlerini keşfedip

kullanmalarıyla günümüzdeki modern doku kültürü metodlarının doğmasını sağladı.

Doku kültürü; organ kültürü ve hücre kültürü yerine de kullanılan jenerik bir terimdir.

Bazen bu terimler genellikle birbirlerinin yerine de kullanılırlar. Hücre kültürü; canlı bir

doku veya organdan alınan küçük bir parçanın in vitro ortamda büyütülmesi ve

çoğaltılması işlemine verilen isimdir. Hücre kültürleri primer doku eksplantları veya

hücre süspansiyonlarından meydana gelir. Hücre kültürleri genel olarak süspansiyon

kültür ve monolayer kültür olmak üzere ikiye ayrılırlar. Süspansiyon kültürler;

genellikle kan, kemik iliği ve bazı tümör hücrelerinden yapılan, kültür kabına

yapışmayan kültürlerdir. Monolayer kültürler yapışma ihtiyacı hisseden amniyon

hücreleri ve fibroblastlar gibi hücrelerden hazırlanırlar4.

Hücre kültürü hazırlamak için alınan küçük doku veya organ parçasına eksplant

denir. Çalışmalarda daha çok diploid hücreler kullanılır. Eksplantın doku veya organdan

alınıp ilk ekiminin yapıldığı kültüre primer kültür, burada oluşan yeni hücrelerin bir

başka besi yerine ekimiyle oluşan kültüre ise pasaj veya subkültür denir. Primer hücre

kültürlerinin kültürde belirli süre ömürleri vardır. Süreğen hücre serileri; anormal,

transforme olmuş ve ölümsüz hücrelerdir. Kültür ortamında yetiştirilen hücrelerin belli

zaman aralıklarında çoğalarak hücre sayılarının iki katına çıkma zamanına da katlanma

zamanı denir. Hücre kültürü için çeşitli doku kaynakları kullanılır. Doğum öncesi tanı

için amniyotik hüceler, çeşitli araştırmalar için epitel ve fibroblast hücreleri, non-

invaziv ve çoğalma kabiliyetlerinden dolayı kemik iliği, periferal kan, ayrıca tüm doku

hücrelerinin yanı sıra hücre serileri oluşturmada kullanılan çeşitli tümör hücreleri

günümüzde kullanılmaktadır4.

Hücre ve doku kültürü; aşı, monoklonal antikor, çeşitli enzimler ve hormonların

üretimi için, hücre içi aktivite ölçümü, DNA ve RNA replikasyonu araştırması, protein

sentezi, enerji metabolizmasının araştırılması, çeşitli ilaçların hücre siklusuna etkisi,

hormonal reseptör komplekslerinin davranışları, sinyal iletim mekanizması ve hücre

haberleşmesi, hücrenin beslenme özellikleri, enfeksiyon, viral transformasyon, kimyasal

transformasyon, özel ürünlerin sentezlenip salgılatılması, embriyonik araştırmalar,

hücre populasyon kinetiği, adezyon, sitogenetik analiz, genetik manipulasyon ve

immortalizasyon gibi çeşitli amaçlarla yapılmaktadır4.

4

Hücre kültürleri primer doku eksplantlarından ya da hücre süspansiyonlarından

türetilebilir. Primer hücre kültürleri tipik olarak sınırlı bir yaşam süresine sahiptir, belli

bir bölünme sayısından sonra çoğalma durmaktadır. Devamlılığı olan hücre serileri ise

anormal ya da transformasyona uğratılmış hücre serileridir.

Tek bir hücre tipi hakkında en iyi bilgiyi elde edebilmek için hücrenin

bulunduğu dokudan ve diğer hücre tiplerinden ayrılarak izole edilmesi gerekir. Bu

izolasyon sonucunda oluşan homojen hücre popülasyonu doğrudan ya da kültür

ortamında çoğaltıldıktan sonra analiz edilebilir. Farklı hücre türleri doku

süspansiyonundan değişik yöntemlerle izole edilerek tipleri belirlenebilir. Değişik hücre

türlerinden oluşan bir dokudan tek tip hücre elde edebilmek için yapılması gereken ilk

işlem, hücreleri bir arada tutan ekstrasellüler matriksi ayırmaktır. Bunun için doku

örneği, proteinleri parçalayan tripsin ve kollajenaz gibi proteolitik enzimler ve hücre

adezyonunda rol oynayan Ca+2 bağlayan EDTA gibi ajanlarla muamele edilmelidir5.

Hücre süspansiyonundan farklı hücre türlerini ayırmak için değişik yöntemler

uygulanabilir. Öncelikle hücreler fiziksel özelliklerine göre ayrılabilir. Örneğin büyük

olanlar küçük olanlardan, ağır olanlar hafif olanlardan santrifüj edilerek ayrılabilir. Bir

başka yöntem ise, bazı hücre türlerinin cam ya da plastikten yapılmış yüzeye daha sıkı

yapışması prensibine dayanır. Bu yöntemde antikorlar kullanılarak istenen hücre

türünün yüzeye yapışması sağlanır, daha sonra da uygun işlemlerle o hücrelerin elde

edilmesi sağlanabilir5.

En gelişmiş hücre ayrıştırma yöntemlerinden biri de antikor bağlanmış bir

floresan boya ile özel hücreleri işaretleme temeline dayanır. Böylece elektronik bir

floresanla aktive edilmiş hücre ayırıcı kullanılarak işaretlenmiş hücreler işaretlenmemiş

olanlardan ayrılabilir. Bu yöntem 1000 tane işaretlenmemiş hücrenin içinden bir tane

floresanla işaretlenmiş hücreyi ayırabilecek kadar seçicidir.

Belli bir hücre topluluğu kızılötesi lazer kullanılarak mikroskop altında

mikrodiseksiyon yöntemiyle de elde edilebilir. Bu yöntem özellikle bir tümör

dokusunun çeşitli yerlerinden alınan hücrelerin özelliklerinin belirlenmesinde

kullanılabilmektedir5.

Hangi yöntem kullanılmış olursa olsun elde edilen belli tek tipteki hücreler,

hücre kültürü için başlangıç materyalini oluştururlar ve koşulları belirlenmiş bir kültür

5

ortamında (besiyeri) sayıları hızla arttırılarak bir çok biyokimyasal analiz yapılması için

kullanılabilirler5.

Günümüzde kültürler genellikle dokudan ayrıştırılmış hücre süspansiyonlarından

yapılmaktadır. Ancak birçok doku hücresi süspansiyon ortamında yaşamaya uyumlu

değildirler, bu nedenle bölünmek ve çoğalmak için katı bir yüzeye gereksinim duyarlar.

Bu gereksinim hücre kültürlerinde plastik doku kültür kaplarının yüzeyi ile karşılanır.

Lösemi ve lenfoma hücre serileri gibi kandan türemiş hücre serileri süspansiyon

besiyerlerinde üreme eğilimindeyken, akciğer ve böbrek gibi solid dokulardan türemiş

hücre serileri tutunarak tabaka şeklinde üreme eğilimindedirler. Hücrelerin

gereksinimleri türlerine göre farklılıklar göstermekle birlikte çoğu hücreler, kültür

kapları kollajen ya da laminin gibi özel ekstrasellüler matriks yapılarıyla kaplanmazsa

çoğalmaz ve farklılaşmazlar. Bir organizmanın dokularından in vitro hücre çoğalması

olmaksızın, yani doğrudan hazırlanan kültüre primer kültür denir. Bu hücrelerin kültür

kabından alınıp çoğaltılmasıyla elde edilen kültürlere de sekonder kültür denir. Bu

şekilde elde edilen hücreler asıl kökenlerinin özelliklerini yansıtmayı sürdürürler5.

Çoğu omurgalı hücreleri kültürde sınırlı sayıda bölünmeden sonra hücre ölümü

(cell senescence) denilen bir sürece girerek bölünmeyi durdururlar. Örneğin, insan

fibroblastları kültürde sadece 25-40 kez kadar bölünebilirler. Bu olay telomerlerin

kısalmasıyla açıklanabilir. İnsan somatik hücreleri telomeraz enziminin yapımını

durdurdukları için telomerler kısalmakta ve bunun sonucunda hücrelerin yaşamı da

sınırlı olmaktadır. Bu hücrelere telomeraz enziminin katalitik alt birimini kodlayan bir

gen katılmasıyla sonsuz çoğalmaları sağlanabilir ve böylece ölümsüz (immortalized)

hücre serisi olarak kullanılabilirler5. Bununla birlikte bazı insan hücreleri bu işlemle de

ölümsüz özelliğini kazanamazlar. Telomerleri uzun olarak kalmasına rağmen yine de

kültürde sınırlı sayıda bölünmeden sonra bölünmeyi durdururlar. Çünkü kültür

ortamının koşulları hücre döngüsünün (cell cycle) kontrol noktası mekanizmalarını

uyardığı için hücre döngüsü durmaktadır. Bu kontrol noktası mekanizmasının inaktive

edilmesi için tümör yapıcı virüslerden türetilen kanser başlatıcı onkogenler

kullanılmaktadır5.

Hücre serileri kanser hücrelerinden de elde edilebilirler. Ancak bu hücre serileri

normal hücrelerden farklı özellikler taşırlar. Örneğin, kanser hücre serileri bir yüzeye

tutunmadan çoğalabilirler ve kültür kabında çok yüksek bir yoğunluğa ulaşabilirler. Bu

6

özellikler tümör indükleyici bir virüs ya da kimyasal madde kullanılarak normal

hücrelerin transformasyonuyla da sağlanabilmektedir. Transforme edilmiş ya da

ölümsüz hücre serileri sıvı azotta (-196oC) saklanabildiği ve çözündükleri zaman da

canlılıklarını koruyabildikleri için hücre kültürü çalışmalarında yaygın olarak

kullanılmaktadırlar. Yaygın olarak kullanılan hücre serileri ve köken aldıkları dokular

Tablo 2.1’de listelenmiştir3-5. Bir hücre serisindeki tüm hücreler birbirine çok

benzemekle birlikte genellikle birebir eş (identical) değildirler. Genetik olarak tek tür

hücre serisi ancak hücre klonlamasıyla sağlanabilir. Bu işlemde tek bir hücre izole

edilerek büyük bir koloni oluşturacak kadar çoğalmasına izin verilmektedir. Böyle bir

klonda tüm yeni hücreler tek bir öncül (ancestor) hücreden gelmektedir.

Tablo 2.1’de listelenen hücre serilerinin çoğu tümörlerden türetilmişlerdir. Tümü,

kültürde sınırsız kopyalanma yeteneğine sahiptirler ve kökenleri olan hücrenin

özelliklerinden en azından bir kaçını gösterirler. Geliştirilmek için tıbbi açıdan en umut

verici olan hücre kültürü, insan embriyonik kök hücre serileri gibi görünmektedir. Bu

hücreler erken embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilirler ve sınırsız çoğalma

özelliğiyle birlikte herhangi bir hücreye dönüşme yeteneğine de sahiptirler3.

7

Tablo 2.1. Yaygın olarak kullanılan hücre serileri

Hücre serisi Hücre tipi ve kökeni

K562

ARH-77

RPMI-8226

MCF-7

A2780

HCT-116

A-549

3T3

BHK21

PtK1

L6

PC12

SP2

COS

293

CHO

DT40

R1

E14.1

T24

HepG2

HEK293

HL60

SH-SY5Y

H1, H9

S2

BY2

KML transforme eritrolösemi hücre dizisi

plazma hücreli lösemi hücre dizisi

hafifi zincir sekrete eden plazmasitoma hücre dizisi

meme adenokarsinomu hücre dizisi

yumurtalık kanser hücre dizisi

kolon karsinoma hücre dizisi (insan)

akciğer kanseri epitel hücre dizisi (insan)

fibroblast (fare)

fibroblast (hamster)

epitel hücresi (rat)

miyoblast (rat)

kromaffin hücresi (rat)

plazma hücresi (fare)

böbrek (maymun)

böbrek (insan), adenovirüsle transforme edilmiş

over (hamster)

lenfoma hücresi (civciv)

embryonik kök hücreler (fare)

embryonik kök hücreler (fare)

mesane epitel hücresi (insan)

karaciğer epitel hücresi (insan)

böbrek epitel hücresi (insan)

lösemi hücresi (insan)

nöroblastoma hücresi (insan)

embryonik kök hücreler (insan)

makrofaj benzeri hücreler (Drosofila)

farklılaşmamış meristematik hücreler (tütün)

8

2.3. Hücre Kültürü Yönteminin Temel Aşamaları

2.3.1. Hücre Kültürü İçin Gerekli Cihazlar ve Kimyasal Malzemeler

Hücre kültürü çalışmaları için gerekli donanımdaki araç-gereçler: laminar akımlı

kabin, karbon dioksit (CO2) etüvü, faz kontrast mikroskop, hücreleri saklama ve koruma

için sıvı azot tankı ve hücrelerin üremeleri için gerekli tutunma ve hareketlerine olanak

sağlayacak toksik olmayan, biyolojik olarak inert ve optik olarak saydam, tek

kullanımlık steril plastik kaplardır.

2.3.2. Laminar Akımlı Kabin (Laminar flow hood)

Horizontal ve vertikal olmak üzere iki ana çeşit laminar akım kabini vardır. Her

iki çeşit laminar akım kabini de havadaki partikülleri uzaklaştıran HEPA (high

efficiency particible) filtre kullanılır. Horizontal kabinler ortamı steril ederken, vertikal

kabinde steril edilen hava çalışılan ortamın önünden aşağıya doğru bir şelale gibi akar

ve iç ortam ile dış ortamın karışmasını engeller. Ortamda kısa dalga boylu UV ışığında

her zaman için steriliteye katkıda bulunur. Çalışmadan önce ve çalışmadan sonra UV

10–20 dakika açık bırakılır. Her kullanımdan sonra ortam %70’lik etanol ile temizlenir.

Horizontal kabinler, ameliyathane gibi ortamların havasını steril etmek için

kullanılırlar ve Class C olarak da bilinen doku kültürü laboratuarlarında daha çok ürün

korumaya yönelik olarak kullanılan, kullanıcıyı korumayan kabinlerdir. Biyolojik

güvenlik kabini olarak bilinen vertikal laminar akım kabinleri ise; zararlı organizmalarla

çalışırken ve hücre kültürü yaparken steril bir ortam sağlarlar. Class B olarak bilinen

vertikal kabinler hem ürünü hem de kullanıcıyı koruyan kabinler olup hücre kültürü

laboratuarlarında en çok kullanılan kabinlerdir. Class A olarak bilinen özel odalarda yer

alan diğer tip kabinler, yüksek biyolojik kontaminasyon riski bulunan ürünler için

planlanmış olup Class B kabinlerinin özelliklerinin yanı sıra tamamen kapalı uzaktan

kumanda ile işlemlerin yapıldığı kabinlerdir.

2.3.3. CO2 İnkübatörü

Hücreler %5–10 CO2’li ortamda çoğalırlar. Çünkü ortamın CO2 içeriği medium

NaHCO3 / karbonik asit (H2CO3) dengesinde önemli rol oynar. Bu nedenle kültüre

alınan kültür flasklarının kapakları gaz giriş çıkışına uygun olmalı, ya da gevşek olarak

kapatılmalıdır. İnkübatörlerin kapısı uzun süreli açık kalmamalı, sıcaklık düşmesi ve

9

kontaminasyon riski unutulmamalıdır. Ortamın nemi inkübatördeki su kabının daima

temiz ve dolu olmasıyla sağlanır. Kültür ortamının optimal sıcaklığı kullanılan

organizmanın vücut sıcaklığına uygun olmalı, şayet bölgesel değişimler varsa dikkate

alınmalıdır. Genellikle 36,5–37°C hücre kültürleri için uygun sıcaklıktır.

2.3.4. Mikroskop

İnverted faz kontrast mikroskobu hücre kültürü çalışmalarında çok önemlidir.

Kültür devam ederken hücrelerin büyümesi, morfolojik özellikleri ve kontaminasyon

olup olmadığı invert mikroskopta takip edilir. Normal araştırma ışık mikroskobu

(florasan ataşmanlı) kültür sonrası testler (canlılık, sitogenetik, hücre sayımı vb.) için

gereklidir. Hücreleri gözlemek için de faz kontrast mikroskoplar kullanılır.

2.3.5. Hücre Saklama Kapları

Hücre saklama kapları, sıvı nitrojen içerisinde saklanılan plastik ya da metal

alaşımlı kaplardır. Sıvı nitrojen sıvı fazda -196°C veya gaz fazında -156°C doku kültürü

hücrelerinin saklanması için kullanılır. Dondurma işlemi hücreler için letaldir. Buz

kristallerinin hücreye zararı neticesinde elektrolit konsantrasyonu değişir, hücrede

dehidrasyon meydana gelir ve pH değişir. Dondurma işleminin etkilerini en aza

indirmek için bazı önlemler geliştirilmiştir. İlk olarak önerilen hücrelerin uzun ömürlü

olmaları için dondurma işleminden önce taze besi yerinde 24 saat log fazında

bekletilmeleridir. İkinci olarak soğuktan koruyucu (cryoprotectiv) ajanlar (donma

noktasını düşürmek için gliserol veya DMSO) eklenir. Dondurma ortamı %90 medium

serum %10 DMSO olabilir. Hücreler oda sıcaklığından -80°C ye kadar yavaşça

dondurulmalıdır. Kontrollü yavaş dondurma işlemi için viallerin izoproponole

gömülmesi ile her dakikada 1-3°C düşme sağlanır ve takiben -80°C’lik derin

dondurucuya kaldırılması kaliteli bir dondurma sağlayabileceği gibi -80°C de hücreler 5

sene saklanabilirler.

2.3.6. Kültür Saklama Kapları

Hücreler biyolojik olarak inert, non-toksik ve optik olarak ışığa geçirgen yüzeye

sahip ortamda çoğalırlar. Bilinen çoğu kültür kapları özel polistren plastikten yapılmış,

steril ve tek kullanımlıktır. Petri, çok kuyucuklu plaklar, mikroplaklar, silindirik şişeler,

vidalı kapaklı flasklar (T-25, T-75, T-150 (cm2/yüzey)) çeşitli kültür kaplarına örnek

10

olarak verilebilir. Kültürde kullanılacak tüm malzemeler steril olmalıdır. Bazen bu

kültür kaplarının istenilen amaca yönelik kollagen, gelatin ile kaplı olan modelleri

dışında adheren hücrelerin toplanabilmesi amacıyla üretilmiş ranza tarzı çift tabanlı

tipleri de üretilmektedir (adezyon yüzeyinin geniş tutulması amacı ile).

2.3.7. Besiyeri

Hücrelerin in vitro ortamda yaşabilmeleri büyümeleri ve çoğalmaları için uygun

besiyerlerine ihtiyaçları vardır. İyi bir besiyeri; hücrelerin canlılığını sürdürmelerini,

proliferasyonlarını ve farklanmalarını sağlamalı esansiyel ve non-esansiyel amino

asitleri, vitaminleri, tuzları, şekerleri, serum, penisilin ve streptomisin gibi

antibiyotikleri, Na, K, Ca, Mg, Cl, P, NaHCO3 , CO2 gibi iyonları, Fe, Zn, Se gibi iz

elementleri ve kolin, inositol, gibi lipidleri ihtiva etmelidir. Besiyeri kültürü yapılacak

hücrelerin beslenme özelliklerine göre ampirik olarak ya da özel seçim yapılarak ilgili

tercih yapılır. Hazırlanan besiyerinde zaman içerisinde L-glutaminin yarı ömrü kısa

olduğundan dolayı aktivitesini kaybeder ve böyle besiyerlerine L-glutamin ilavesi

yapılması gerekmektedir. Besiyerine hücrelerin beslenme ihtiyaçlarını gidermek için

mutlaka inaktive serum ilavesi yapılması elzem olarak kabul edilmektedir.

Memeli hücresinin kültürü için gerekli besiyerinin bileşenleri amino asitler,

vitaminler, tuzlar, glukoz, antibiyotikler ve serumu (serum kullanılmıyorsa da gerekli

proteinleri) kapsar. Bu bileşenler Tablo 2.2’de özetlenmiştir.

İyi bir besiyerinin pH’sı 7,2–7,3’e ayarlanmalı (6,8–7,4) ve pH indikatörü

(phenol red) içermelidir. Besiyerinin renk görünümü; pH 7,2–7,4 arası gülkurusu, pH

6,8’den aşağıda sarı ve pH 7,4’ten yukarıda kırmızıdır. Besiyerinin tamponlama

kapasitesi uygun, ozmolaritesi (260–320 mOsm/kg) izotonik ve steril olmalıdır. Kültür

ortamlarında pH’nın tamponlanması görevi bikarbonat ve DMSO tamponları ile

sağlanır. Kısa süreli tampon işlemlerinde basit dengeli tuz solüsyonları kültür için

yeterlidir. Dengeli tuz solüsyonları seçiminde tuzların glukozla basit karışımı kullanılır

ve bu solüsyonlar inkübe edilecek ortamın içerdiği CO2 basıncı ve NaHCO3‘la uyumlu

olmalıdır. Örneğin hava basınçlı klasik etüvlerde yapılacak kültürlerde besiyerine

Hank’s BSS, %5’lik CO2 ‘li etüvlerde yapılacak kültürlerde de besiyerine Earle’s BSS

ilavesinin daha uygun olduğu kabul edilmekte, doku disagregasyonu için ise divalent

11

katyonlardan arındırılmış Dulbecco’s PBS kullanımı önerilmektedir. 24 saatten uzun

kültürlerde zengin içerikli besiyerleri seçilir.

Bütün bu işlemler için toz besiyerleri alınabileceği gibi piyasada hazır

besiyerleri de kullanıma sunulmuş olup kişisel ihtiyaçlara göre glutaminli, NaHCO3’lı,

HEPES, piruvattan zengin vs. çeşitleri mevcuttur. Hazır besiyerlerinin toz besiyerlerine

göre daha kolay kullanımlı olması bir avantaj olarak sunulsa da geçerlilik sürelerinin

kısa oluşu ve pahalı olmaları dezavantajlarıdır. Medium 199 (Morgan ve ark., 1950),

MEM (Eagle, 1959), CMRL 1066 (Parker ve ark.,1957), DMEM (Dulbecco, 1959),

Ham’s F-12 (Ham 1965) ve RPMI 1640 (Moore ve ark., 1967) hücre kültürlerinde

oldukça sık kullanılan besiyerleridir.

Tablo 2.2. Memeli hücresi için hücre kültürü besiyerinin bileşenleri3

Amino asitler Vitaminler Tuzlar Diğerleri Proteinler

(serum yerine)

Arjinin

Sistin

Glutamin

Histidin

İzolösin

Lösin

Lizin

Metiyonin

Fenilalanin

Treonin

Triptofan

Tirozin

Valin

Biotin

Kaolin

Folat

Nikotinamid

Pantotenat

Piridoksin

Tiyamin

Riboflavin

NaCl

KCl

NaH2PO4

NaHCO3

CaCl2

MgCl2

Glukoz

Penisilin

Streptomisin

Fenol

kırmızısı

Tam serum

İnsülin

Transferrin

Büyüme

faktörleri

12

2.3.8. Serum

Besiyerine eklenen serum hücre için elzem olan temel bir besin kaynağıdır.

Serum; hormonları ve büyüme faktörlerini taşır, pH’yı ayarlar ve farklılaşma

faktörlerini ihtiva eder, bağlayıcı proteinleri, mekanik hasara karşı non-spesifik koruma

faktörlerini ve proteaz inhibitörlerini taşır. Serum plazma proteinlerini, peptidleri,

karbonhidratları, lipidleri, mineralleri, büyüme faktörlerini ihtiva ederler. Genellikle

fötal calf serum ve fötal bovin ve horse serum inanktive olarak kullanılır. Normal aktif

serum içeriğindeki komplemandan dolayı hücreler toksik etki gösterebilir. Bu nedenle

kullanılan ürünün inaktive edilmesi gerekir veya hazır inaktive serumlar kullanılır.

İnaktivasyon işlemi için 56°C’ta 30 dakika inkübasyon yeterli olmaktadır.

Böyle kompleks karışık ve besleyici özelliği olan serumun pahalı olmasının yanı

sıra daha bir çok dezavantajları da vardır. Serumdaki minör komponentler kültüre zarar

verebilir, gruplar arasında değişkenlik oluşturabilir, saflaştırmada sorunlar çıkarabilir ve

viral kontaminasyona özellikle mycoplazma enfeksiyonlarına sebep olabilir. Böyle

durumlarda serum desteğinin kesilmesi gerekir. Seruma alternatif olarak analitik,

sentetik ve kısıtlayıcı faktörleri ihtiva eden serumsuz ortamların oluşturulabilmesi

imkanı olabileceği gibi hazır serumsuz besiyerleri de hazır olarak mevcuttur. Serumsuz

besiyeri hazırlarken klasik deneyler için linoleik asit, oleik asit, transferin, insulin, BSA,

Na-piruvat, etanolamin ve selenyum katılması kısmen bu sorunu çözmektedir.

2.3.9. Additif Solüsyonlar

L-glutamin, yarı ömrü kısa olan bir aminoasit olduğundan uzun süre bekleyen

besiyerinde aktivite kaybına uğrar. Böyle besiyerlerine yeniden 292 ug/mL (1mL L-

glut/100 mL besiyeri) L-glutamin ilave edilir. Kontaminasyon riski ve besiyeri

geçerlilik süresinin uzun olması için 2-merkaptoetenol (5 mL/500 mL) stok

solüsyondan 10 mL besiyerine 35 uL ilave edilir. Doku ya da hücrelerin ihtiyacına göre

tercihen o dokuya özgü o ortama kolesterol, albumin, transferin, apolipoproteinler,

büyüme faktörleri, hormonlar, glukoz ve mitojenik aktiviteye sahip lektinler ilave

edilebilir.

Growth faktörler, mitojenik aktiviteye yardımcı olan bir grup polipeptidlerdir.

Epitel hücreler için EGF, fibroblastlar için FGF, kemik iliği ve periferal lenfositler için

interferonlar ve bazı sitokinler hücre çoğalmasına yardımcı olurlar. Adipositler ve

13

kemik iliği hücreleri gibi bazı hücreler yüksek konsantrasyonda glukoza ihtiyaç

duyarken, periferal lenfositler daha düşük glukoz konsantrasyonlu ortamlarda çoğalırlar.

Çoğalırken bir ortama tutunma ihtiyacı hisseden hücrelerin kültür ortamına kollagen ve

fibrin ilavesi hücre mobilitesini arttırır. Sitogenetik amaçlı kültürler yapılıyorsa periferal

lenfositleri uyarmak ve eritrositleri çöktürüp parçalamak için ortama fitohemaglutinin

M ilave edilmesi bu amaca hizmet edebilmektedir. Bazı besiyerleri Ca+2 ve Mg+2

divalent katyonları içermezler. Çünkü bu besiyerlerinin şelasyonun engellenmesi

gereken özel kullanım yerleri vardır. Hücreleri birbirinden ayırmak için yapılan

tripsinizasyon işleminde besiyeri içeriğinde EDTA bulunması avantaj sağlar. Renk

bozulmasını engellemek için ortama sodyum piruvat eklenmelidir. Besiyeri seçiminde

pH’nın gözle takibi amacıyla ortama ilave edilen fenol kırmızısı in vivo çalışmalara

toksik etkili olduğundan bu çalışmalarda kullanılmaması gerekmektedir.

2.3.10. Hücrelerin İnkübasyonu ve Bakımı

Hücreler karanlıkta inkübe edilmelidirler çünkü ışık besiyerindeki ve hücre

yapısındaki bazı organik yapıları bozarak hücre için toksik hale getirebilir. Hücre

kültürleri günlük olarak kontrol edilir. Morfolojik görünüm, mediumun rengi ve

hücrelerin rengi incelenir. Günlük olarak sonuçlar laboratuar defterine kayıt edilir.

Deftere kültürün adı, hücre serisi adı, besiyeri bileşimi, standart mediuma modifikasyon

yapılıp yapılmadığı ve gözlemler yazılır. Büyüme kontrolü invert mikroskopla yapılır;

canlılık testleri, trypan blue ile yapılırsa ışık mikroskobunda, etidyum bromür akridin

oranj ile yapılırsa floresan mikroskobunda kontrol edilir.

Kültürler günlük olarak kontrol edilmelidir. Besiyerinin rengi ve morfolojisi ile

hücrelerin yoğunluğu gözlemlenmelidir. Kültürde hücreler; hücre tipine, ekilme

yoğunluğuna, ortamın yoğunluğuna ve daha önceki işlemlere bağlı olarak önce sessiz

(inaktif) ya da gecikme fazı denilen bir döneme girerler. Bunu en yüksek metabolik

aktivitenin gözlendiği logaritmik artış (üreme) dönemi izler. Bundan sonra da hücreler

hücre sayısının sabit kaldığı bir durağan evreye girer (tüm üreme yüzeyleri

kaplanmıştır). Hücrelerin nüfus yoğunluğu üremeyi baskıladığı zaman besiyerinden

alınırlar (harvesting). İdeal olanı hücrelerin durağan evreye girmeden önce kültürden

alınmalarıdır. Hücrelerin kültür kabından alınmaları için değişik yöntemler

kullanılabilir.

14

Mekanik: Bir spatül kullanarak hücreler yüzeyden fiziksel olarak ayrılabilir.

Ancak hızlı bir yöntem olmasıyla birlikte bu yöntemde hücreler zarar görebilirler. Bu

nedenle ancak hücre canlılığının önemli olmadığı koşullarda bu yöntem tercih edilebilir.

Proteolitik enzimler: Tripsin, kollajenaz ya da pronaz genellikle EDTA ile

kombine edildiğinde hücrelerin üreme yüzeyinden ayrılmasına neden olur. Bu yöntem

de hızlı ve güvenilir olmasına karşın hücre yüzeyine zarar verebilir. Proteolitik

reaksiyon serum içeren tam kültür ortamının katılmasıyla hızlı bir biçimde sona

erdirilebilir.

EDTA: Tek başına EDTA kullanılarak da hücreler yüzeyden ayrılabilir.

Kültür ortamı (besiyeri) için gereken bileşenler ve üreme gereksinimleri Tablo

2.2.’de özetlendiği gibi sağlanmalıdır. Kültür kapları CO2 etüvüne (37oC; %5 CO2)

konduğu zaman gaz giriş çıkışı için kapların ağzı hafif açık olmalıdır. Ayrıca ortamın

nemli olması ve görünür ışıktan sakınılması da gereklidir. Hücre kültürü çalışmalarında

da tüm laboratuar çalışmalarında olduğu gibi güvenlik önlemlerine dikkat edilmelidir.

Toplam ve canlı hücre sayısını belirlemek için hemositometre kullanılmaktadır.

Kullanılan bir protokole göre bunun için 0,1 mL örnek alınıp 2 mL’ye seyreltilir. Bu

seyreltik süspansiyondan hemositometre lamının her dış köşesindeki karelere 1’er

damla damlatılır. Dört dış karedeki hücreler ışık mikroskobu altında sayılır ve her bir

karedeki ortalama sayıyı belirlemek için 4’e bölünür. Bu sonuç hücre sayısı x104 olarak

ifade edilir. Bu da 20 ile (seyreltme faktörü) çarpılarak mililitre süspansiyon başına

hücre sayısı elde edilir. Canlı hücreleri belirleme yöntemlerinden biri bazı boyalarla ölü

hücreler boyanırken canlı hücrelerin boyanmaması temeline dayanır. Böylece ölü ve

canlı hücrelerin oranı bulunur. Tripan mavisi canlı hücreleri belirlemek için yararlanılan

boyalardan biridir. Canlı hücreleri belirlemek için bir tetrazolyum tuzu olan MTT

boyasının indirgenme özelliğine dayanan yöntemde ise, ölü hücrelerin bu boyayı

indirgeme özelliğini yitirmesi prensibinden yararlanılır. Bu yöntem kolorimetrik bir

yöntemdir4.

2.4. K562 Hücrelerinin Özellikleri

Kanser, hücrelerin sürekli olarak kontrolsüz çoğalması ile karakterize bir

patolojidir. Bu durum, sürekli çoğalarak aşırı miktarda artan hücre sayısının normal

olarak gerçekleşen uygun miktarda hücre kaybıyla dengelenmemesi sonucunda

15

gerçekleşir. Bu hücreler invazyon yaparlar ve organizmanın organlarını hasara

uğratırlar. Kanser hücreleri kaynaklandıkları normal hücrelere göre daha kısa zamanda

ölmelerine rağmen yeni hücre oluşumu o kadar hızlıdır ki, sonuçta hücreler devamlı

birikir. Bu aşırı hücre üretimi, hem kanser hücrelerindeki genetik anormalliklerden hem

de organizmanın bu hücreleri tanımada ve yok etmedeki başarısızlığından

kaynaklanmaktadır.

Kanser hücrelerinin bazı eşsiz “unique” özellikleri şu şekildedir.

1. Klonal orijin: Çoğu kanser hücresi tek bir anormal hücreden doğmakla birlikte

bazı kanserler birden fazla sayıda malign klonlardan doğar. Bu klonlar ya bir saha

hasarı “field defect” sonucu (dokunun birden fazla sayıda hücresi karsinojene maruz

kalmasıyla) ya da bazı genlerdeki kalıtımsal defektler sonucu oluşmaktadırlar.

2. İmmortalite: Çoğu normal hücrenin bölünme sayısı sınırlıdır. Kanser hücreleri

ise sınırsız sayıda bölünme özelliğine sahiptirler. İmmortalitenin mekanizmalarından

biri kromozom uçları olan telomerlerdir. Hücre diferansiye olurken, çoğu normal hücre

tipinde telomerler gittikçe kısalır. Fakat kanser hücrelerinde ve stem hücrelerde

telomerler telomeraz enziminin etkisiyle yenilenmektedirler. Bu enzim normal olarak

hücreler diferansiye olurken programlı bir şekilde azalır. Tamamıyla diferansiye olmuş

bir hücre istirahat “senescent” durumuna girer ve sonunda çoğalma kapasitesini

yitirdiğinden ölür. Fakat birçok kanser tipinde telomeraz etkinliğini sürdürür ya da

aktive olur. Sonuçta, telomerlerin uzunluğu sabit kaldığı için hücre sınırsız sayıda

çoğalır.

3. Genetik dengesizlik: Bu durum, DNA onarımındaki ve DNA

“mismatche”lerini tanımadaki defektlerden dolayı gerçekleşir ve kanser hücrelerinin

heterojen olmasına yol açar. Kanser hücreleri proliferasyon kontrol mekanizmalarına

gittikçe daha az yanıt veren klonlar oluştururlar. Bu klonların yabancı ortamlarda

yaşama yeteneği de gittikçe artar ve böylece metastaz yaparlar.

4. Kontakt inhibisyonun ve substratuma tutunarak büyüme özelliklerinin kaybı:

Kültür ortamında büyüyen normal hücreler, hücrelerin normalde yapıştığı substratuma

yapışamazlarsa bölünemezler. Normal hücreler çoğalıp üzerinde büyüdükleri tüm

yüzeyi tek tabaka halinde doldurduklarında da bölünme özelliklerini kaybederler. Hatta

besiyerleri bölünmeleri için gerekli tüm büyüme faktörleri ve diğer besin elemanlarını

(nütrientleri) ihtiva etse bile bölünmezler. Kanser hücreleri ise, yarı katı bir besiyerinde

16

substratuma yapışmaya gereksinim duymadan bağımsız olarak bölünmeye devam

edebilirler. Hatta hücre kültürlerinde birden fazla tabaka oluşsa da büyümeye devam

edebilirler.

5. Proliferasyonun büyüme faktörlerinden ve nütrientlerden bağımsız olarak

devamlı artışı: Bu durum kültür ortamındaki kanser hücrelerinin bir özelliğidir. Kanser

hücreleri beslenmeleri için gerekli besin faktörlerini tüketmelerine rağmen, büyümeye

devam ettiklerinden aslında kendi kendilerini öldürmektedirler.

6. Metastaz: Normal hücrelerde ve bazı tümörlerde bulunmayan bir özelliktir.

Metastaz, ekstrasellüler matrikse yapışmaktan sorumlu hücresel proteinlerin kaybı ya

da anormalliklerinden, hücreler arası etkileşiminin bozukluğundan, hücrelerin bazal

membrana tutunmalarındaki anormalliklerden, bazal membranın üretimindeki

anormalliklerden ve metaloproteaz gibi bazı enzimlerle (kolejenazlar) bazal membranın

yıkılmasından dolayı gerçekleşmektedir2.

KML, diferansiyasyonun her basamağındaki miyeloid elemanların

proliferasyonu ve yapışkan özelliklerinin kaybı ile karakterize klonal bir hematopoetik

kök hücre malignitesidir. İlk olarak 19. yüzyılda tanımlanmıştır. 3 farklı klinik evre ile

karakterizedir: birinci evre (kronik) olgunlaşma gösteren miyeloid hücrelerin artışıdır,

zamanla miyeloid farklılaşma azalarak akselere faza ve sonra blastik krize geçis

gözlenir1.

K562 hücreleri kronik miyeloid löseminin blastik kriz evresinden kaynaklanan

miyeloid seri hücre dizileridir6. Glutatyon sistemi, oksidatif stres, eritroid farklılaşma ve

anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi ile ilgili çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır7-8.

Elektron mikroskobunda bakıldığında K562 hücreleri kolay bağıntılı, düzgün

şekilli, kısa mikrovillüslü, farklılaşmış lösemik hücrelerine benzer şekilde görülebilir1.

Giemsa ile hazırlanmıs preparatlarda K562 hücreleri yaklaşık 20 µM çapında iki ya da

daha fazla parçalı nükleuslu farklılaşmamış blast hücreleri olarak tanımlanabilir.

Basofilik sitoplazmaları hiç granül içermez1-7.

K562 hücreleri granülosit ve monositlerin pozitif reaksiyon verdiği sitokimyasal

maddeler ile pozitif reaksiyon vermezler8. Peroksidaz, Sudan Black B, ASD kloroasetat

esteraz boyalarla boyanmazlar Histokimyasal boyalarla boyandığında K562 esteraz

lipid ve asit fosfataz için pozitiftir1-7-9.

17

Kronik miyeloid lösemi’nin hücresel marker’ının biri olan Philadelphia

kromozomu, hücrelerin granülositik serilerinde bulunur1.

K562 lösemi hücreleri kendini yenileme özelliklerine sahiptir ve bu

özellikleriyle hemopoetik pluripotent hücrelere benzerler. K562 hücre dizilerinde, B

hücrelere ait immunoglobulinler, Epstein-Barr virus (EBV) genomu ve nükleer

antijenine karşı reseptörler yoktur10.

K562 hücre soyu lenfositik karaktere sahip değildir11. K562 hücreleri, T lenfosit

serilerinde bulunan B lenfosit serilerinde görülmeyen C'/Fc reseptörlerini

bulundurmazlar; MLC (mikst lenfosit kültürü) reaksiyonlarını uyaramazlar. Diğer

taraftan T antijeni mevcut olmayan K562, yüksek radyasyon hassasiyetine sahiptir ve

timidin tarafından büyümesinin engellenmesi de söz konusudur. K562,

immunoglobulin Fc alıcıları ve pinositoz için güçlüdür, fakat fagosit değildir veya

antikora bağlı fagositoz ya da sitolize aracılık etmez. K562 bir B hücre serisi değildir.

Bazı T hücre özelliklerine sahipken bunlar K562 hücrelerine özel değildir1.

Miyeloid lösemi hücreleri normal hücrelere göre daha yavaş proliferasyon ve

büyüme hızına sahiptir. Lösemi hücreleri olgunlaşmadıkları sürece bölünmezler.

Olgunlaşma ve proliferasyon birbirlerine bağlı olaylardır7. Kültür mediumunda

süspansiyon olarak büyüyen K562 hücrelerinin iki kat artma süreleri ortalama 12

saattir12-13.

K562 hücrelerinde, normal kromozom sayısının yaklaşık 1,5 katı kromozom

bulunur. Bundan dolayı bu hücre serisinde abl/bcr füzyon geni ekspresyonu nedeniyle

apoptosise karsı direnç vardır14.

K562 hücre membran glikoproteinleri, birçok yönden eritrosite benzerlikler

göstermektedir. Sadece insan eritrositlerinin sentezlediği glikoforin A’yı K562 hücreleri

sentezlemektedir. Bu sentez sadece insan kemik iliğinde kırmızı hücreye

farklılaşmasının geç fazındaki hücrelerde ve bazofilik normoblastlarda

gerçekleşmektedir10-11. K562 hücreleri birçok hemapoetik hücrelerde bulunan HLA ve

timosit antijenleri içermez1-7.

K562 hücreleri çeşitli uyarıcı ajanlarla muamele edilerek eritrositik yolak

boyunda farklılaşabilir. K562 hücre soyunun sodyum bütirat varlığında eritroblast

farklılaşmaya gidebildiği ve hemoglobin sentezleyebildiği gösterilmiştir11. Ayrıca

DMSO, hemin, CO2 azlığı ve glutamin azlığı K562 hücre soyunda farklılaştırıcı ajan

18

olarak görev yapar15. 0,1mM Hemin ile muamele edilen K562 hücreleri fetal ve

embriyonik hemoglobin üretebilir. K562 hücreleri insan eritroid farklılaşması globin

gen expresyonu çalışmaları için oldukça uygundur. Kültür ortamında yetişen K562

hücreleri benzidin pozitif partiküller içerebilir. Kültürde eosinofilik partiküllerin

birikimi bu hücrelerin benzidin pozitif reaksiyonlar vermesine sebep olur bu olay

hemoglobin varlığını gösterir7-10.

K562 hücreleri gen ekspresyonu, hematopoetik düzenlemenin anlaşılması için

yapılan çalışmalarda oldukça kullanışlıdır. K562 hücre soyu granülosit soyunun erken

farklılaşma evresini temsil eder, insan NK hücre tayininde hassas hedef hücre olarak

kullanılabilir7.

Normal hücrelerin uzun süre kültürde tutulması oldukça zordur. Bu nedenle

hücre kültüründe kolayca çoğaltılabilen K562 hücrelerinin sitotoksisite ve apoptosis

çalışmaları için kullanımı yaygındır. Kültürde spontan olarak apoptosise gitmeyen K562

hücrelerinde farklı maddelerle apoptozisi indüklemek başarılı sonuçlar elde edilmesini

sağlar16.

Kanser ilaçlarının çoğu etkilerini kanser hücresinin proliferasyon ve bölünme

fazlarını etkileyerek gösterirler. Bazı kemoterapötik ajanlar bazı spesifik hücrelerde

olumlu sonuç verirken diğer kanser hücrelerinde etkileri sınırlı olabilir. Bu nedenle

farklı sitotoksik maddelerin, farklı hücrelerdeki etkilerinin tam olarak aydınlatılması

oldukça önemlidir.

2.5. Sitotoksite ve Hücre Canlılığı

Toksikoloji zehir bilimidir. Zehir ise canlı organizmada zararlı etki gösteren

herhangi bir madde olarak tanımlanabilir. Uygun yol ve dozda alınmayan her madde

zehir etkisi yapabilir. Bu etki bir yapı değişikliği şeklinde olabileceği gibi biyokimyasal

lezyon şeklinde de olabilir. Ortaya çıkan etki, reversibl olabileceği gibi hücre ölümü

şeklinde de olabilir. Canlı hücreler üzerinde kimyasal maddelere bağlı önemli yapı ve

fonksiyon değişikliklerinin saptanması ve yorumlanması amacıyla deneysel toksikolojik

çalışmalar yapılır17.

Ölçüm performansı için, tekrarlanabilirlik başarısı için ya da çalışmalarda

karşılaştırma yapmak için hücre popülasyonlarının miktarlarının anlamlı bir şekilde

19

belirlenmesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle hücre popülasyonlarında hücre canlılığı ve

proliferasyonlarını çalışabilmek için bazı metodlar geliştirilmiştir18.

Genel olarak direkt hücre sayımında canlı ve cansız hücreleri ayırt etmek için

genellikle hemositometre ile birlikte vital bir boya (trypan blue) kullanılır. Bununla

birlikte tüm vital boyalar özneldir ve kesin değerler alamazlar. Bu metod kolay, çabuk

ve ucuzdur ve toplam hücre süspansiyonundan sadece küçük fraksiyonlar gerektirir.

Hücre sayımında otomasyon elektronik sayaçlarla genellikle kümelenmeyen

süspansiyon hücreleri için kullanılır. Bu metod genellikle hücre çekirdeği

sitoplazmasına dağıldıktan sonra total hücre sayısını saymak için kullanılır. Bu metod

ayrıca genellikle büyük kümeli hücrelerde, hücre matrisine erişilmez olduğunda ya da

hücrelerde substratın tripsinizesi zor olduğunda kullanılır. Eğer canlılığı belirlemede

hücrelerin olgunluğu göz önüne alınırsa hücreleri saymak için en doğru metod hücreleri

mitotik indeksine göre sınıflandırmaktır.

Hücre grubu için hücre sayısından ziyade hücre bileşenlerinin ölçülebilmesi

önemli bir faktördür. Bu seçenekler protein, DNA, protein nitrojen ya da lipidlerin net

ağırlığıdır19.

Monolayer kültürlerde ya da hareketsiz durumdaki hücrelerin matrisi için direkt

hücre sayımı imkanı olmayabilir, bu yüzden indirekt ölçüm yapılmıştır. Örneğin glukoz

veya oksijen tüketim hızı predeterminant standart eğiminden hücre sayısına

dönüştürülebilir. Diğer metabolitler laktik asit, pirüvik asit ve CO2’yi kapsar. Büyüme

döngüsü boyunca spesifik hücrelerin metabolit hızları sabit olmadığı için ve kültür

içindeki değişimler söz konusu incelemelerden etkilendiği için yine de bu metodlar

hakkında şüpheler vardır. Bununla birlikte eğer bunlar kesin değer değilse ve genellikle

kullanımında spesifik kullanım hızını ve büyüme sonucunu veriyorsa bu testler kültür

içinde canlı hücre gruplarının iyi indikasyonunu sağlar. Bu yöntemlerin avantajı hücre

gruplarına zarar vermemesidir. Kullanılan parametreler giderek artan medium içerisinde

laktat dehidrojenaz aktivitesini serbest bırakır. Bu metod ile canlı hücre kümelerinin

reverse titrasyon prosedürü ile hücrelerin lizis olmasının kontrolü ve enzim aktivitesinin

artışının ölçümü ile modifiye edilerek canlılık ölçülebilir.

Bu biyokimyasal ölçümler kültür içinde, seyir zamanı boyunca kullanılır çünkü

ara sıra okuma kültür içinde sabit gelişen ve duran belli bir gidişat izlenecektir. Bu kural

yalnızca bir metod için güvenilir değildir, ayrıca iki ya da daha fazla kombinasyon için

20

de güvenilirdir. Bahsedilen sentez hızı (protein, DNA ve RNA sentezi) ölçümü

radyoizotop kullanılarak yapılabilir. Bununla birlikte bunlar genellikle spesifik

durumlardan ziyade genel kullanım için tercih edilir.

Belirli deneysel amaçlar için ya da belirli durumlar için uygun olan birçok

spesifik metod vardır. Bunlara diochromium sınıflandırma, hücresel ATP, intraselüler

hacim spesifik boyalar (MTT, tryphenyl tetrazolium chloride, neutral red) redoks

potansiyeli, yoğunluk, kalorimetri ve biyokütle gözlemlerini içerir. En fazla kullanışlı

modern analiz örnekleri bir mikroplate de (96lık plateler) geliştirilmiştir. Bu minyatür

plate birçok örneğin çabuk ve eş zamanlı analizine izin verir. Bu formattaki mikroplate

kullanılan kültürdeki medium miktarını ve hücrelerin ihtiyaç duyduğu plastik kapları

azaltır. Kolorimetrik yöntem örneklerin mikroplate içerisinde mikroplate okuyucusunda

doğrudan ölçülmesine izin verir18.

Sonuç olarak ideal metod yoktur ve çalışmalarla sıklıkla belirlenen parametreler

ölçülebilir. Farklı metodların kombinasyonu ötekilere göre daha kesin bir tablo

oluşturduğu için en iyi yöntem yalnız bir metoda dayanmayandır18.

2.5.1. Hemositometre İle Hücre Sayımı ve Canlılık Çalışması

Hemositometre, hücre kültüründe rutin subkültür ve kriyopreservasyon

çalışmasından sonra optimum büyümeden emin olmak amacıyla yapılan çalışmalarda,

hücre sayımı ve hücre popülasyonu içindeki canlılık oranını kesin elde etmekte

yardımcı olur.

Hücre sayımı için en genel rutin metod hemositometre kullanmaktır. Kalın düz

sayım odacıklı lamın üzerine lamel konması temeline dayanmaktadır. Temel olarak lam

üzerinde çizgi ile kesin olarak kazınmış 1 mm kareler ve buna ilaveten daha küçük

kareler içerir. Hücre süspansiyonlarının çember içine doldurulmasına izin verildiği

zaman hücreler mikroskop altında gözlenebilir ve seçili kare çizgisi içindeki hücreler

sayılır. Bu sayımdan süspansiyonun mililitresindeki hücre sayısı hesaplanabilir.

Süspansiyonda yaşayan hibridoma hücreleri ve diğerleri direk olarak sayılabilir

ancak yapışmış hücre serileri hücre kültür flaskından tripsinizasyonla kaldırılmaya

ihtiyaç duyar. Çünkü doğru sayım yaklaşık mL.’de 105 hücre gerektirdiğinden küçük

volümlü mediumda hücreleri resüspanse etmek önemli olabilir.

21

Hücre kültürü hücrelerin gittikçe artarak büyümesinden emin olmak, yüzde

canlılığı bilmek ve ölü hücrelerin yüzde oranını buradan da hücrelerin büyüme

aşamalarını bilmek için kullanılır. Yaşayan sağlıklı hücreler ölü hücrelerle

karşılaştırıldığında genellikle yuvarlak refraktil ve nispeten küçük oldukları, ölü

hücrelerin süspansiyon içinde genellikle görülebilir derecede büyük ve kenarları tırtırlı

oldukları için bu hücrelerin mikroskop altında meydana çıkmasıyla değerlendirilir.

Kullanılan trypan blue gibi canlılık boyası kültür koşullarında kantitatif analiz sağlar.

Trypan blue sadece ölü hücrelerin membranından içeri geçerek onları boyar.

Hücre süspansiyonu trypan blue ile dilüe edildiğinde canlı hücreler küçük,

yuvarlak ve refraktil olarak görünürler. Ölü hücreler şiş, büyük ve koyu mavi hale

gelirler. Her iki hücrenin total sayısı mililitre başına ve canlı hücrelerin yüzdesi olarak

belirlenebilir. Bu metodun temel prensibi, canlı hücreler boyayı almaz iken ölü

hücrelerin almasıdır18.

2.5.2.Neutral Red

Neutral red (3-amino-7-dimethyl-2-methylphenazine hydrochloride) canlı

hücrelerin lizozomunda biriken suda çözünen bir boyadır. Neutral red testi in vitro

sitotoksisite tespiti için geliştirilen hücre canlılığı testidir. İn vitro doku kültür

çalışmalarının başlangıcında neutral red boya, viral sitopatogenetik değerlendirme ve

immunotoksisite testleri için geliştirilmiştir. Neutral red testinde test faktörleriyle

birlikte inkübasyonu sonrası, neutral red’in canlı hücrelerin lizozomunun bünyesine

girmesi temeldir. Hücre içine boya alımı plazma membranından pasif taşıma ile yapılır.

Lizozom içinde neutral red birikmesi ya polisakkaritler gibi lizozomal matris içinde

oluşur ya da lizozomun neutral red içinden asidik ortam ile proton alış verişiyle

gerçekleşir. Hasarlı ya da ölü hücreler neutral red içinde sitoplazmik vakuollerde daha

fazla alıkonmazlar ve plazma membranı, hücre içerisinde neutral red tutulduğu için

görev yapamaz18.

2.5.3. LDH Assay

Çok girdi çıktısı olan işlemler için gerekli yüksek hücre dansiteli yapışık kültür

sistemlerinde, hücre içine doğrudan girilip izolasyonu sonuçlandırılamadığı zaman, yol

göstermek için geliştirilmiştir. Diğer dokulara yayılma göstermeyen metabolik

22

parametreler, kültür canlılığında gözlenebilen değişimler için kullanılabilir. Salıverilen

intraselüler enzimlerin analizi kütürde gözlenen değişimler için kullanılabilir. Kültür

çalışmalarında en yaygın kullanılan enzim LDH tır. Varsayılan intraselüler enzimler

sadece hücre membranı zarar gördükten sonra, zarar görmüş hücrelerden hızla salınır

Bundan dolayı daha yüksek oranda enzim aktivitesi salınımı, daha büyük oranlarda

hücre ölümleri yani kültür canlılığının kaybı aynı periyod içinde gerçekleşir.

Bu gibi metodların avantajları, metabolit seviyesi ölçümü boyunca ölçülen

parametre türleri kültürde canlılık değişimine tepki vermesi ve hücre metabolizmasını

değiştirmemesidir.

Kültürün süpernatantı içinde laktat dehidrogenaz ölçümü canlı hücre kayıpları

için kantitatif değer alır. LDH aktivitesi pirüvattan laktata indirgenmesiyle ölçülebilir.

İndirgenme spektrofotometrede 340 nm de NADH’ın NAD+ a yükseltgenmesi izlenerek

bağlanır. Dengenin bir tarafında NAD+ ve laktat vardır. NADH 340 nm’de NAD+ ile

kıyaslandığında yüksek absorbansa sahip olduğu için reaksiyon 340 nm absorbansta

oran düşürülerek ölçülür. Kalorimetrik yöntemlerde temelde tetrazolium tuzları

kullanılmasına rağmen, non-spesifik yan reaksiyonlardan dolayı bu testler büyük ölçüde

tetrazolim tuzlarının yerini almıştır18.

2.5.4. Floresan Boya Tutucularla Canlılık Sayımı

Basit boyama (hemositometre) dışında alternatif yaklaşım intraselüler

komponentleri floresan boyamadır. Bazı metodlar akridin orange-propidium iodide gibi

kombine boyalardır. Akridin orange plazma membranına girer ve intraselüler nükleik

asidi boyar, düşük boya konsantrasyonunda yeşil flouresan üretir. Propidium iodide

plazma membranına tamamen giremez, fakat hasar görmüş hücrelerin membranına

girebilir, tekrar intraselüler nükleik asidi boyar böylece floresanda kırmızı parlar. Boya

acridin orange yi hasarlı hücrelerin nükleusundan dışarıda tutar. Bu şekilde canlı

hücreler etidium bromid ile yeşil renkli ölü hücreler acridin orange ile portakal renkli

görülür. Böylece ikili boyadan sonra tüm sağlam hücreler ve hasarlı hücreleri aynı görüş

alanı içinde en güçlü floresansa tanımlamak mümkündür20.

23

2.5.5. Metabolik Fonksiyonların Değerlendirilmesi: Protein Sentezi

Canlı testlerinin biyokimyasal aktiviteleri hücre fonksiyonlarının tümüyle ve

canlılıkla ilişkilidir ve bu testler çoğunlukla tanımlamaya ihtiyaç duyulduğu zaman ve

özel biyokimyasal olaylar ölçümünde sınırlıdır. Örneğin glukoneogenesis

çalışmalarında, glukoz sentezi, spektrofotometrik metodla ölçülebilir ancak bu yöntem

zaman alıcıdır. Oksijenin hücre süspansiyonu aracılığıyla içeri alınmasının direk

ölçümü gibi bazı testler aldatıcı bir şekilde açık görülebilir fakat araştırmacılar daima bu

sınırlamaların farkında olmalıdır. Bununla beraber ilk denemelerden sonra izolasyon ve

hücre tipleri ayrıntılı olarak tanımlanır, daha fazla anlamlı, nitelikli hücre ürünleri

kazanmak için bazı dikkat gerektiren testlerin yararı göz önünde bulundurulur. Hücre

metabolizması yönünde canlılık göstergesine duyarlı görünen sıradan bir çalışma yeni

baştan protein sentezler ve [14C] ya da [3H] radyoaktif maddelerle birleştirilmiş

aminoasitlerle hücre proteini içinde çökeltilerek test edilebilir. Bu teknik hücre içinde

protein sentezini ölçmek tanımlamak ve mitokondri gibi organelleri izole etmek için

kullanılır20.

2.5.6. MTT Testi

Mikroplate ölçümü temel farklı parametrelerle birlikte hücre canlılık ve

proliferasyonuna dayalı olarak geliştirilmiştir. Mikroplate formatında kullanılan en

önemli parametreler metabolik aktivite ve DNA sentezidir. Hücresel tahribat kayıp

içerisinde muhafaza kabiliyetinde olan hücreler ve metabolik hücre fonksiyonları ve

büyüme için enerji sağlamak kaçınılmaz hale gelmiştir. Metabolik aktivite ölçümünde

bu dayanak noktası temeldir. Genellikle bu yöntem hücrelerin mitokondrial

aktivitelerini ölçer. Hücreler bir kolorimetrik substratla birlikte (MTT, XTT, WST-1)

inkübe edilir21.

Kolorimetrik yöntem için kullanılan temel parametre canlı hücrelerin metabolik

aktiviteleridir. Örneğin MTT tetrazolium tuzu kullanılan bir mikroliter plate testi

genellikle hücre proliferasyonu ve sitotoksitesinin kantitasyonunu belirlemede

kullanılır.

Tetrazolium tuzunun sadece metabolik aktivitesi olan hücreler tarafından renkli

formazanlara indirgenmesinden dolayı bu yöntem sadece canlı hücreleri saptar. Örneğin

MTT içerisinde canlı hücreler renkli, suda çözünmez formazan tuzu tarafından

24

indirgenir. Formazan kristalleri çözündükten sonra, çabuk ve kolayca klasik mikroplate

okuyucusunda (maximum absorbans) 570 nm de miktarı belirlenebilir18. Çoğalan

hücreler prolifere olmayan hücrelerden metabolik olarak daha çok aktivite gösterdiği

için, bu yöntemle sadece hücre canlılığı ve sitotoksite değil hücre aktivasyonu ve

proliferasyonu da belirlenir.

MTT (3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide;

Thiazolyl blue) kültür ortamındaki mitokondrial aktivitesi devam eden canlı hücrelerin

kantitasyonunu sağlar. En sık kullanım alanları: Sitokinlerin, büyüme faktörlerinin

medium komponentlerinin hücreler üzerine etkilerinin araştırılması ve sitotoksik

ajanların etkinliğinin test edilmesidir22. MTT suda çözünen bir tetrazolium tuzu olup

fenol kırmızısı içermeyen medium veya tuz solüsyonlarında hazırlandığında sarımtırak

bir solüsyon oluşturur. Tetrazolium halkasının dehidrogenaz enzimlerince parçalanması

sonucu MTT mor renkli insolubl formazana dönüşür. Bu dönüşüm canlı hücrelerin

mitokondrileri aracılığı ile olur. Oluşan bu formazan izopropanol veya başka bir çözücü

yardımı ile solubl hale getirilir ve oluşan renk reaksiyonu spektrofotometrik olarak

okunup kantite edilir22.

2.6. Metal Fosfin Kompleksleri

Fosfor insan vücudunda kalsiyumdan sonra en fazla bulunan elementtir. Fosfora

insan vücudu kemik ve diş oluşumu, hücre büyümesi ve onarımı, enerji üretimi, kalp

kasının kasılması, sinir ve kas hareketleri, böbrek işlevleri için ihtiyaç duymaktadır.

Fosfor ayrıca vitaminlerin kullanımı ile besinlerin enerjiye dönüştürülmesinde yardımcı

olarak da vücuda yarar sağlamaktadır23.

Fosfinlerin genel formülleri PR3 olup R=alkil, aril ve hidrojendir [PH3, (fosfin),

PMe3 (trimetilfosfin), PPh3 (trifenilfosfin)], fosfit ligandları ise P(OR)3 genel formülüne

sahiptir23.

Son yıllarda fosfin ligandlarının ve komplekslerinin tıpta antitümör,

antibakteriyal etki ve endüstride hidrojenasyon, hidroformülasyon ve polimerleşmede

katalitik etki gösterdiğinin deneysel olarak saptanmasıyla fosfin komplekslerine

duyulan ilgi artmıştır23-24.

Fosfor içeren metal komplekslerinde bağlanmanın iki bileşeni olduğu kabul

edilebilir. İlk basamakta fosfor, üzerindeki bir çift ortaklanmamış elektron ile metaldeki

25

boş bir orbitale koordine olurken ikinci basamakta dolu bir metal orbitalinden fosfin

ligandı üzerindeki boş bir orbitale geri bağlanma olmaktadır. Bu boş fosfor orbitali ya

bir d orbitali veya bir karşı bağ sigma orbitalidir23. Fosfin metal kompleksleri

incelendiğinde özellikle geçiş metalleri ile sentezlenen kompleksler steryogenik ve

steryospesifik katalizörler olarak kullanım alanı bulmaktadır25. Bir geçiş metaline bir

fosfin ligandının bağlanabilme yeteneği genellikle onun sterik ve elektronik

özelliklerine bağlıdır. Sterik ve elektronik özellikleri değiştirilerek bir fosfin ligandının

geçiş metalleri ile oluşturacağı komplekslerinin, katalitik reaksiyonlardaki aktivitesi ve

seçiciliği arttırılabilir. Ayrıca tıp alanında tedavilerde insan vücuduna kolay

alınabilmesi ise önemli bir avantaj sağlamaktadır26.

1989 yılında Davies ve arkadaşları, aminometildifenilfosfin ligandının molibden

kompleksini [Mo(CO)4(Ph2PCH)2NR] (R=Bu, C6H4Me-4) sentezleyerek kristal yapısını

belirleyip reaktivitesini incelemişlerdir27. 1993 yılındaki diğer bir çalışmada ise

(COD)PtCl2 ile (Ph2PCH2)2NR (R=Bu, C6H4Me-4) reaksiyonundan

aminometildifenilfosfin türevinin platin kompleksi olan [PtCl2{Ph2PCH2)2NR}],

(R=Bu, C6H4Me-4) komplekslerini sentezlemişler ve kristal yapılarını belirlemişlerdir23.

Serindağ ve arkadaşları, sülfolanmış aminometilfosfinlerin Ni(II), Pd(II), Pt(II)

ve Rh(II) komplekslerini sentezleyerek kristal yapılarını belirlemişlerdir. Bu yapıların

hidrojenasyon ve hidroformülasyon reaksiyonlarını katalizlediklerinin belirlenmesinden

sonra birçok metal fosfin kompleksi sentezlenip katalitik özellikleri incelenmiştir28.

Kostas ve arkadaşları, 2003 yılında Heck reaksiyonlarında verimi arttırmak amacıyla

kullanılmak üzere farklı katalitik sistemler için fosfin paladyum kompleksleri

sentezlemişlerdir. Sentezlemiş oldukları amino ve sülfür içerikli fosfinit ligandlarının

paladyum komplekslerinin kristal yapılarını belirlemişler ve aril bromürün stirenle 130

C°’de verdiği Heck reaksiyonunu katalizlediklerini göstermişlerdir29.

Benzer yapıların türevleri olan katı desteğe bağlı metal fosfin kompleksleri de

sentezlenmiş ve katalitik etkilerinin varlığı kanıtlanmıştır. 2001 yılında {4-

[bis(dietilaminoetil)aminometil]difenil}fosfin} ligandının, á-zirkonyum fosfat ile

reaksiyonundan, ligandındaki amonyum grupları ile bünyesinde bulunan

protonlanmamış yüzey hidroksil gruplarının elektrostatik etkileşiminden bağ kuvvetinin

oluştuğu bir yapı elde edilmiş ve bu yapının Rh(CO) ile reaksiyonundan LRh(CO)(acac)

(L= yüzeye bağlı fosfin) yapısında katı desteğe bağlı bir rodyumfosfin kompleksi

26

sentezlenmiştir. Elde edilen kompleksin katalizör olarak gaz fazında propenin

hidroformülasyonunda, sıvı fazda ise 1-hekzenin hidroformülasyonunda orta derecede

aktivite ve seçicilik gösterdiği belirlenmiştir30. Bu çalışmada yapıların kristallenme

sıcaklığını ve oranını belirlemek amacıyla TGA eğrisi alınmış ve 80 C°’de dehidrasyona

bağlı kütle kaybının başladığı ve dehidrasyonu etkilediği bilinen kristallenmenin bu

komplekste fazla olmadığı yapılan termal analiz ile tespit edilmiştir23.

{4–[bis(2-diethylaminoethyl)aminomethyl]diphenyl phosphine} ligandı 2006

yılında diğer bir çalışmada ise azot içerikli bis(fosfinoksit) ligandı ile rodyum

kompleksi sentezlenmiş ve bu yapının da stirenin hidroformülasyonunda yüksek oranda

aktivite ve seçicilik gösterdiği tespit edilmiştir31.

Genel anlamda metal fosfin kompleksleri incelendiğinde altın komplekslerinin

antitümör ve antibakteriyel etkinliklerinden dolayı tıptaki tedavi amaçlı uygulamalarda

ön plana çıktıkları görülmektedir32. Urus ve arkadaşları tarafından 2005 yılında

aminometilfosfin ligandının Cu(I), Ag(I), Au(I), ve Co(II) kompleksleri sentezlenmiş ve

bu komplekslerin antimikrobiyal aktivitelerinin olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmaların

paralelinde “Keleş ve arkadaşları” bis(difenilfosfinometil)amino ligandlarının Pd(II)

komplekslerini sentezlemişler ve bu yapıların bromobenzen ve klorobenzen ile olan

Heck reaksiyonlarını katalizlediklerini kanıtlamışlardır33.

Katalitik etkisi ve antimikrobiyal, antibakteriyal etkinliği kanıtlanmış birçok

türevi bulunan aminometilfosfinlerin sentezlenmesinde ise Coates, Hoye ve Maier

tarafından uygulanan Mannich reaksiyonunun kullanılmaya başlaması yeni bir kapı

açmıştır34. P-C-N bağı içeren aminometilfosfinler formaldehitin, RR'PH fosfini ve farklı

aminler ile reaksiyonundan elde edilmektedir23-35.

27

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Kullanılan Cihazlar ve Kimyasallar

3.1.1. Kullanılan Cihazlar:

Biyogüvenlik kabini Class 2 Metisafe

Mikroplate okuyucu Medispec Esr-200

Işık mikroskobu Nikon

Invert mikroskobu Nikon

Kamera Nikon

Santrifüj Hettich

Hassas Terazi Okaus

Otomatik Pipetler Socorex

Pipet aid Gilson

CO2 inkübatörü Sanyo

3.1.2. Kullanılan Kimyasallar

RPMI-1640 Sigma

Penicilin streptomycine Sigma

L-glutamin Sigma

Hepes Buffer Sigma

PBS (Phosphate Buffered Saline) Sigma

HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) Sigma

FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma

DMSO (dimetilsülfoksit) Sigma

Trypan Blue Sigma

MTT (3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-

diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) Sigma

Çalışmada kullanılan organofosfin bileşikleri Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat

Fakültesi Kimya bölümünde orijinal olarak sentezlenmiştir.

Yeni sentezlenen bu organofosfin bileşikleri şunlardır; [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ],

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ve [PdCl2(dppaEtOH)

28

3.2. Hücre Dizileri ve Çoğaltılması

Kültür Mediumu

10 mL Fetal Bovine Serum,

1 mL penicillin streptomycine,

1 mL L-glutamin,

1mL Hepes Buffer içeren

87 mL RPMI 1640

Bu çalışmada kullanılan K562 hücreleri Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıp ve

Kanser Araştırmaları Merkezi’nden sağlandı ve %10 FBS, %1 penicillin streptomycine,

%1 L-glutamin, %1 Hepes Buffer içeren RPMI 1640 ile hazırlanan medium kullanılarak

hücre flasklarında çoğaltıldı.

48-72 saat CO2 inkübatöründe bekletilen flask içindeki K562 hücrelerinin

yoğunluğuna ışık mikroskobunda bakıldı ve yoğun görünen flasklardan hücreler

pasajlanarak çoğaltıldı.

3.3. Hücre Canlılığı

K562 hücreleri için hücre sayımı yapıldı ve trypan blue atılım testi ile hücrelerin

canlılığına bakıldı. Lam üzerine 10µL. hücre +10µL. trypan blue koyularak ışık

mikroskobunda (Nikon) boya almayan hücreler sayılarak canlılık belirlendi. Alanda 100

hücre sayılarak boya almayan hücrelerin % oranı hesaplandı.

3.4. Hücre Kültürü

Bu aşamadan sonra hücre serisinde mL’de 104 hücre olacak şekilde medium ile

birlikte hücreler hazırlandı. Her bir metal kompleksi için ayrı bir 12 kuyucuklu kültür

plağına 7 kuyucuğa 3’er mL. hücre süspansiyonu koyuldu. Tüm plaklar CO2

inkübatöründe 37 °C’de %5 CO2 içeren ortamda 24 saatlik inkübasyona bırakıldı.

İnkübasyon sonrası K562 hücre serilerinden oluşan 12 kuyucuklu plaklara

eklediğimiz hücre konsantrasyonlarının üzerine 1 kuyucuğa hücre ve medium, 2.

kuyucuğa DMSO içeren çözücünün kontrol olarak belirlenmesi ile her bir kuyucuğa 5

farklı konsantrasyonda (1ng/mL, 10-1 ng/mL., 10-2ng/mL., 10-3ng/mL.ve 10-4ng/mL.

29

olacak şekilde) metaller ilave edildi. Tekrar plaklar CO2 inkübatöründe 48 saat inkübe

edildi.

3.5. Sitotoksisite

48 saat sonunda K562 hücreleri 96 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 100 µL.

hücre süspansiyonu olacak şekilde aktarıldı ve her bir kuyucuğa 10µL. MTT solusyonu

eklendi ve 4 saat süre ile enkübe edildi. MTT solüsyonu 5 mg/mL olacak şekilde PBS

içinde çözülüp steril filtrasyon ile bir şişeye transfer edilerek hazırlandı. Daha sonra

kuyucuklara 100’er µL. DMSO eklenerek MTT ile oluşan formazon kristallerini

çözmek için 10 dakika 37°C’de CO2 inkübatöründe bekletilip mikroplate okuyucu

(Medispec Esr-200) ile her bir kuyucuk 545 nm dalga boyunda okutuldu ve okunan

absorbans değerine göre sitotoksite düzeyi belirlendi. Sitotoksite düzeyleri aşağıdaki

formül ile hesaplandı.

1-(test kuyucuğunun adsorbansı / kontrol kuyucuğunun adsorbansı) x 100

Kontrole göre %50 oranında sitotoksik etki gösteren konsantrasyon sitotoksik doz

olarak kabul edildi.

30

4. BULGULAR

Çalışmada öncelikle mL’de 104 K562 hücresi olacak şekilde 12 kuyucuklu

plakta 7 kuyucuğa ekim yapıldı. 24 saat sonunda her bir metal kompleksini seri

dilüsyonla sulandırarak 5 farklı konsantrasyon elde edildi. Kontrol olarak DMSO

kuyucuğa yerleştirildikten sonra hücre süspansiyonları üzerine farklı

konsantrasyonlardaki metal kompleksleri eklendi. 48 saat metal kompleksi ile inkübe

edilen hücrelerde sitotoksite oranları tespit edildi.

4.1. Metal-1: [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]

48 saat sonunda [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]’ün farklı konsantrasyonlarında

kontrole göre anlamlı farklılıklar gözlenmedi. Kontrole göre sitotoksik etkisi en yüksek

olan konsantrasyon en düşük konsantrasyonlu (10-4 ng/mL) metal kompleksi olduğu

ortaya çıktı.

Tablo 4.1.1. [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi

Kontrol

(DMSO) Hücre mediumu

1.Doz 1ng/mL

2.Doz 10-1

ng/mL

3.Doz 10-2 ng/mL

4.Doz 10-3 ng/mL

5.Doz 10-4 ng/mL

Elisa sonuçları

1,118 1,041 0,901 0,935 0,890 0,846 0,789

% Sitotoksite

6,9 19,5 16,4 20,4 24,4 29,5

31

[PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]: [Platin(II)dikloroN,N bis (difenilfosfinometil) aminometan ] Molekül Ağırlığı: 693 g/mol

N Ph2P

Pt

Ph2P

(H3C)C

Cl

Cl

Şekil 4.1.1. [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 Kompleksin açık yapısı

Şekil 4.1.2. 12 lik plağa metal kompleksi Şekil 4.1.3. Kontrol (DMSO), 48 saatlik eklenmeden inkübasyon öncesi mikroskobik inkübasyon sonrası mikroskobik görüntü 20× görüntü 40×

Şekil 4.1.2. de 12’ lik plağa her kuyucuğa 104 hücre olacak şekilde K562 hücre

serilerinden oluşan hücre süspansiyonunun 24 saat sonraki görüntüsü mevcuttur. Bu

aşamadan sonra kontrol olarak DMSO ve 5 farklı dozda [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3 ]

eklenerek çalışmaya devam edilmiştir. Şekil 4.1.3‘te ise kontrol kuyucuğunun 48 saatlik

inkübasyon sonrası görüntüsü mevcuttur. Hücrelerde çoğalma açıkça görülmektedir.

32

Şekil 4.1.4 Medium 48 saatlik inkübasyon Şekil 4.1.5. Konsantrasyon-1 (1ng/mL) sonrası mikroskobik görüntü 20× mikroskobik görüntü 40×

Şekil 4.1.4.’te 48 saat sonunda %10 fetal bovin serum içeren RPMI içerisindeki

hücre süspansiyonu görülmekte. Şekil 4.1.5.’te 1ng/mL [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3]

eklendikten 48 saat sonraki hücre proliferasyonunun kontrole göre daha az olduğu

görülmektedir.

Şekil 4.1.6. Konsantrasyon-2 (10-1ng/mL) Şekil 4.1.7. Konsantrasyon-3 (10-2ng/mL) mikroskobik görüntü 40× mikroskobik görüntü 40×

10-1ng/mL ve 10-2ng/mL [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3] kullanıldığında 48 saat

sonunda hücre yoğunluğu açısından çok büyük fark görülmemekle birlikte Şekil

4.1.7’de canlılığın daha az olduğu görülmektedir.

33


4. ve 5. konsantrasyonlarda (10-3ng/mL ve 10-4ng/mL) 48 saat sonunda hücre

sayısının kontrole göre azaldığı görülmektedir. En az hücre proliferasyonu en düşük

dozda tespit edilmiştir.

4.2. Metal-2: [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2

Metal-2 ile yapılan sitotoksisite çalışmasında 1. konsantrasyonda (1ng/mL)

kontrole göre anlamlı fark görüldü (%49,6). Fakat doz düşürüldüğünde etkilenen hücre

oranının yani sitotoksitenin azaldığı gözlendi. 1. konsantrasyon dışında diğer 4

konsantrasyonda anlamlı fark saptanmadı. Diğer konsantrasyonlarda sitotoksite oranı

düşük olarak saptandı (Tablo 4.2.1.). En etkili sitotoksik metal kompleksinin

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 olduğu tespit edildi.

Tablo 4.2.1. [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi

Kontrol


1.Doz 1ng/mL

2.Doz 10-1

ng/mL

3.Doz 10-2 ng/mL

4.Doz 10-3 ng/mL

5.Doz 10-4 ng/mL

Elisa sonuçları

1,169 1,057 0,589 0,930 0,967 0,913 0,870

% Sitotoksite

9,6 49,6 20,4 17,3 21,9 25,6

34

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 : [Rodyum(I)dikloroN,N tetrakis (difenilfosfinometil) aminometan ] Molekül Ağırlığı: 1120 g/mol

N Ph2PRh

Ph2P

(H3C)C

HCl

ClH

Rh

Ph2P NC(CH3)3

Ph2P

Şekil 4.2.1. [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2

.

0

10

20

30

40

50

60

konsantrasyon

% s

ito

toksis

ite medium

1.Doz

2.Doz

3.Doz

4.Doz

5.Doz

Şekil 4.2.2. [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 ’ün K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin grafik ile gösterimi

Şekil 4.2.2 de metal-2’nin K562 hücreleri üzerine doza bağımlı sitotoksik etkisi

görülmektedir. 1. dozda sitotoksik etki %50 ye yakın iken diğer dozlarda düşük değerler

görülmektedir. Ancak sitotksisitede değişen konsantrasyonlara paralel bir etki

gözlenmemektedir.

35


Şekil 4.2.3.’ de 12 kuyucuklu plağa her kuyucuğa 104 hücre olacak şekilde K562

hücre serilerinden oluşan hücre süspansiyonunun 24 saat sonraki görüntüsü mevcuttur.

Bu aşamadan sonra kontrol olarak DMSO ve 5 farklı dozda [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2

eklenerek çalışmaya devam edilmiştir. Şekil 4.2.4.’te ise kontrol kuyucuğunun 48

saatlik inkübasyon sonrası görüntüsü mevcuttur. Hücrelerde çoğalma açıkça

görülmektedir.

Şekil 4.2.5. Konsantrasyon-1 (1ng/mL) Şekil 4.2.6. Konsantrasyon-2 (10-1ng/mL) mikroskobik görüntü 40× mikroskobik görüntü 40×

48 saat sonunda 1ng/mL [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 kompleksi ile muamele edilen

K562 hücrelerinde kontrole göre daha az canlı hücre olduğu tespit edilmiştir. En fazla

hücre proliferasyonu 3. konsantrasyonda görülmektedir.

36


48 saat sonunda 10-2ng/mL, 10-3ng/mL ve10-4ng/mL [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2

kompleksi ile inkübe edilen K562 hücrelerinde canlılık bakımından kontrole göre

faklılık tespit edilmedi.

Şekil 4.2.9. Konsantrasyon-5 (10-4ng/mL) mikroskobik görüntü 40×

4.3. Metal-3: [PdCl2(dppaEtOH)]

Metal-3’te hücre proliferasyonunda anlamlı farklar gözlenmedi. En yoğun

konsantrasyonda sitotoksite %12,26 olarak hesaplandı (Tablo 4.3.1). Doz düşürüldükçe

bu oran azaldı. Özellikle 10-3 ng/mL ve 10-4 ng/mL yoğunlukta [PdCl2(dppaEtOH)] ‘a

48 saat maruz kalan hücrelerde proliferasyon kontrol ile aynı sonucu verdi. Sonuç

itibarıyla [PdCl2(dppaEtOH)]’ın K562 hücre dizisine bu metal bileşiğinin bütün

konsantrasyonlarda herhangi bir sitotoksik etki göstermediği tespit edildi.

37

Tablo 4.3.1. [PdCl2(dppaEtOH)]’ün değişik konsantrasyonlarda K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi

Kontrol


1.Doz 1ng/mL

2.Doz 10-1

ng/mL

3.Doz 10-2 ng/mL

4.Doz 10-3 ng/mL

5.Doz 10-4 ng/mL

Elisa sonuçları

0,856 0,842 0,751 0,788 0,841 0,848 0,887

% Sitotoksite

1,62 12,26 7,94 1,75 0,93 0

[PdCl2(dppaEtOH)]:[paladyum(II)dikloroN,Nbis (difenilfosfinometil)aminoetanol]

Molekül Ağırlığı: 634 g/mol

N

PPh2

Ph2P

OH

PdCl

Cl

Şekil 4.3.1. [PdCl2(dppaEtOH)]


38

Şekil 4.3.2.’de 12’ lik plağa her kuyucuğa 104 hücre olacak şekilde K562 hücre

serilerinden oluşan hücre süspansiyonunun 24 saat sonraki görüntüsü mevcuttur. Bu

aşamadan sonra kontrol olarak DMSO ve 5 farklı dozda [PdCl2(dppaEtOH)] eklenerek

çalışmaya devam edilmiştir. Şekil 4.3.3.’te ise kontrol kuyucuğunun 48 saatlik

inkübasyon sonrası görüntüsü mevcuttur. Hücrelerde çoğalma açıkça görülmektedir.

Şekil 4.3.4. Medium 48 saatlik inkübasyon sonrası Şekil 4.3.5. Konsantrasyon-1 (1ng/mL) mikroskobik görüntü 40× mikroskobik görüntü 40×

Şekil 4.3.5.’te 48 saat sonunda 1ng/mL [PdCl2(dppaEtOH)] kompleksi ile

muamele edilen K562 hücrelerinde kontrole göre farklılık gözlenmemiştir.


39


40

5. TARTIŞMA

Son yıllarda fosfin ligandlarının ve komplekslerinin endüstride hidrojenasyon,

hidroformülasyon ve polimerleşmede katalitik etki ve tıpta antitümör, antibakteriyal etki

gösterdiği deneysel olarak saptanmış ve böylece fosfin komplekslerine duyulan ilgi

artmıştır24. Sterik ve elektronik özellikleri değiştirilerek bir fosfin ligandının geçiş

metalleri ile oluşturacağı komplekslerinin, katalitik reaksiyonlardaki aktivitesi ve

seçiciliği arttırılabilir. Ayrıca tıp alanında tedavilerde insan vücuduna kolay

alınabilmesi ise yine önemli bir avantaj sağlamaktadır25. Genel anlamda metal fosfin

kompleksleri incelendiğinde altın komplekslerinin antitümör ve antibakteriyel

etkinliklerinden dolayı tıpta tedavi amaçlı uygulamalarda ön plana çıktıkları

görülmektedir. Urus ve arkadaşları tarafından 2005 yılında aminometilfosfin ligandının

Cu(I), Ag(I), Au(I), ve Co(II) kompleksleri sentezlenmiş ve bu komplekslerin

antimikrobiyal aktivitelerinin olduğu belirlenmiştir32.

Katalitik etkisi ve antimikrobiyal, antibakteriyal etkinliği kanıtlanmış birçok

türevi bulunan aminometilfosfinlerin sentezlenmesinde ise Coates, Hoye ve Maier

tarafından uygulanan Mannich reaksiyonunun kullanılmaya başlaması yeni bir kapı

açmıştır34. P-C-N bağı içeren aminometilfosfinler formaldehitin, RR'PH fosfini ve farklı

aminler ile reaksiyonundan elde edilmektedir35.

Ray ve arkadaşları K562 insan lösemik hücre soyunda tributylin halo benzoat

içeren bazı farklı bileşiklerin sitotoksik etkilerini ve bu hücrelerde ekstraselüler

kalsiyum iyon girişini incelemişler K562 hücrelerinin düşük membran kolesterol

içeriğine sahip olduğunu bulmuşlardır. Sonuç olarak Tributylin benzoatın K562

hücrelerine hücrelerinde toksik etkisinden membran kolesterol içeriğinin sorumlu

olduğunu belirtmişlerdir37.

Metal komplekslerinin yüksek antitümör etki göstermesi için, fosfolipid

yapısındaki hücre zarından geçebilmesi önemlidir. Bunun için lipofilik katyonların

kullanılması gerekmektedir38.

Aminofosfin Pt(II) kompleksleri DNA bazları olan guanin ve timine halka

açılma (ring-opening) reaksiyonlarıyla bağlanabilmektedir ve kanserli hücrelere karşı

sitotoksik etki gösterebilmektedir. Sitotoksik platin komplekslerinin hedefi çoğunlukla

DNA olarak görülmektedir39-40.

41

Dong, HeLa lösemi hücreleri üzerinde yaptığı çalışmalarda Bis[1,2

(difenilfosfino)etan]altın(I) klorür ([Au(dppe)2]Cl), in vitro, mitokondri DNA’sına

bağlanarak, DNA-protein çapraz bağlanmasını engellemekte olduğunu ve böylece HeLa

lösemi hücreleri üzerine antimitokondriyal etkide bulunduğunu bulmuştur41.

Altın (III) ile yapılan çalışmalar, bu bileşiklerin genellikle kanser hücre serileri

üzerine sitotoksik etkileri olduğunu göstermiştir42-43. Shi ve ark. farklı altın III

bileşikleri yaptıkları çalışmalarda A-549 ve HCT-116 hücrelerinde Au(TACN)Cl2]Cl

nin sitotoksik etki gösterdiği ve bu bileşiğin UV-Vis floresan ve CD spektroskopi ile

yapılan çalışmalarla DNA çift zincirli yapısında bozulmalara neden olarak sitotoksik

etki gösterdiğini tespit etmişlerdir44. Coronnello ve arkadaşları tarafından bazı organik

altın bileşiklerinin A2780 insan kanser hücrelerine sitotoksik etkileri araştırıldığında test

edilen bileşiklerin önemli antiproliferatif etkileri olduğunu ortaya koymuşlar ve platin

bileşiklerinden daha fazla hücre döngüsünde değişikliklere sebep olduğunu

göstermişlerdir45.

Giogvanini ve arkadaşları Pt(II), Pd(II) ve Au(III) MSDT kompleksleri ile

yaptıkları çalışmalarda HL60 ve HeLa hücrelerinde Pd(II) ve Au(III) bileşiklerinin doza

bağımlı büyüme inhibitörü olduğu göstermişlerdir46. K562 hücrelerinde Pt (II) ve Pd(II)

fosfin komplekslerinde yapılan çalışmalarda sentezlenen bileşiklerin DNA

replikasyonunu inhibe ederek antiproliferatif aktivite gösterdiği tespit edilmiştir47.

Çalışmamızda kullandığımız metal fosfin kompleksleri yeni sentezlenmiştir bu

nedenle daha önce hiçbir çalışmada kullanılmamıştır. Kullandığımız bileşiğin K562

hücrelerini nasıl etkilediği bilinmemekle birlikte yapılan çalışmalarda fosfin

komplekslerinin genellikle DNA üzerine etki ettiği gösterilmiştir.

Çalışmamızda MTT testi kullanılarak, K562 hücre dizisinde yeni sentezlenmiş

üç metal fosfin kompleksinin anti tümöral etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Yeni

sentezlenen bu üç metal kompleksinden sadece metal-2 olarak adlandırılmış olan

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 kompleksinde yüksek konsantrasyonunda antitümöral

sitotoksik etkinin ortaya çıktığı saptanmıştır. Diğer yeni sentezlenen metal fosfin

komplekslerinde, bakılan bütün konsantrasyonlarda antitümöral etkinin var olabileceği

gösterilememiştir. Ancak [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 adlı metal fosfin kompleksinde

ortaya çıkardığımız sitotoksik etkinin konsantrasyona paralel bir artış göstermemesi bu

42

metal ile olası antikanser etkisinin araştırılması için gereken deneysel hayvan modeli

araştırması için ümit verici olarak görülmemektedir.

Sonuç olarak, bu çalışmada K562 hücre dizisinde sitotoksik etkisini

belirlediğimiz, ancak değişen konsantrasyonlara paralel bir şekilde bu etkiyi

saptayamadığımız en ümit verici bileşik olarak [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]2 adlı metal

fosfin kompleksini saptadık. Bu bileşikle ilgili olarak K562 hücre dizisi ile hayvanlarda

oluşturulacak deneysel kanser ile etkisinin incelenmesi, in vivo etkisinin

gösterilebilmesiyle anlamlı bir aşamaya gelebileceğini düşünmekteyiz.

43

6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Bu çalışmada K 562 hücre dizilerinde bazı organofosfin bileşiklerinin sitotoksik

etkileri araştırıldı. Sitotoksisitesi %50’nin altında bulunan bileşikler etkisiz kabul edildi.

MTT ile yaptığımız sitotoksisite çalışmasında sadece [RhCl(Ph2PCH2)2NCH3]

‘de yüksek konsantrasyonda sitotoksisite tespit edilmiştir. Bu kompleks için daha

değişik konsantrasyonların denenerek doza bağımlı etkinin ve sitotoksik dozun

belirlenmesi gerektiğini ve bunun için farklı bir çalışma planlanabileceği söylenebilir.

[RhCl(Ph2PCH2)2NCH3] ile ilgili olarak K562 hücre dizisi ile hayvanlarda

oluşturulacak deneysel kanser ile etkisinin incelenmesi, in vivo etkisinin

gösterilebilmesiyle anlamlı bir aşamaya gelebilir.

Diğer metal komplekslerinde ( [PtCl2(Ph2PCH2)2NCH3] ve [PdCl2(dppaEtOH)] )

ise sitotoksik etki %50’ nin altında bulunduğu için sitotoksik açıdan bu komplekslerin

antikanser bir kimyasal ajan olamayacağı sonucuna varıldı.

44

7. KAYNAKLAR 1. Klein E, Ben-Bassat H, Neumann H, Ralph P, Zeuthen J, Polliack A, Vánky F. Properties of

the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 1976; Oct 15;18(4):421-31

2. Casciato D, Territo MC. Manual of clinical oncology sixth edition, Lippincott Williams &

Wilkins. 2008; 793:3-4 3. 4. Ovalı E, Uçar F. Hematolojide uygulamalı hücre teknikleri kurs kitabı. Trabzon, 2003; 217:7-16 5. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (Eds.). Isolating cells and

growing them in culture. In: Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., 2002. 6. Lozzio CB, Lozzio BB. Human chronic myolegenous leukemia cell line with positive

Philadelphia chromosome. Blood, 1975; 45(3): 321-33 7. Koeffler HP, Gold DWW. Human myeloid leukemia cell lines. Blood , 1980: 56(3)

8. Nakajima O, Hashimoto Y, Iwasaki S. Enhancement by retinoid of hemin induced

differantiation of human leukemia K562 cell line. FEBS 1993; 330: 81-84 9. Assef YA, Damiano AE, Zotta E, Ibarra C, Kotsias BA. CFTR in K562 leukemic cells. Am J

Physiol Cell Physiol. 2003;285(2):480-488 10. Anderson LC, Jokinen M, Gahmberg CG. Induction of erythroid differentation in the human

leukemia cell line K562. Naature, 1979; 278:364-365 11. Davis MG, Kawai Y, Arinze JI. Involvement of G1a2 in sodıum buthyrate induceed erythroblastic

differentation of K562 cells. Biochemical Journal, 2000; 346: 455-461, 12. Lowry OH. Rosbrough NJ. Farr AL. Randall RS. Protein measurement with the Folin Phenol

reagent. T. Biol Chem. 1951; 193: 265-275 13. Singhal SS, Awasthi S, Oandya U, Piper JT, John Saini MK. Cheng JZ. Awasthi YC.

Theeffect of Curcumin on glutathione-linked enzymes in K562 human leukemia cells. Toxicology

letters. 1999; 109: 87-95 14. Saydam G, Aydin HH. Involvement of protein phosphatase 2A in interferon alfa2b induced

apoptosis in K562 human CML cells. Leukemia Research, 2003; 27: 709-717 15. Erard F, Dean A, Schecter AN. Inhibitors of cell division reversibly modify hemoglobin

concentration in human erythroleukemia K562 cells. Blood, 1981; 58:1236-1238, 16. Şencan S. Warfarinin sitotoksik etkisinin K562 lösemik hücre soyunda çalışılması, Erciyes

Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kayseri, 2006 17. Saygı Ş. Deneysel toksikolojide toksisite testleri ve test sonuçlarının önemi. Gülhane Tıp Dergisi,

2003; 45 (3) : 291 – 298 18. Doyle A, Griffiths JB. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. John

Wiley&Sons. 1998; 57-61:62-64

www.medicine.ankara.edu.tr/temel_tip/biyokimya/files/Hucre%20kulturu.doc Erişim tarihi: 2006

45

19. Freshney RI. Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Techniques. Wiley-Liss. New York 1994; 486

20. Fısher D, Franscıs GE, Rıckwood D. Cell Seperation A practical apprıoach, Oxford University

Pres.1998; 259:21-27 21. https://www.roche-appliedscience.com/ PROD_INF/MANUALS/CELL_MAN/apoptosis_082_

084. pdf. Methods for studying cell proliferation and viability in cell populations. Erişim tarihi: 2008

22. Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicty assays. Journal of

İmmunological Methods. 1983; 65:55-63 23. Altan O. Biyokimyasal Yöntem ile Fosfin Sentezi. Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü, Adana, 2006 24. Unlü F. Geçiş Metali-Fosfin Komplekslerinin Termal Özelliklerinin İncelenmesi. Çukurova

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Adana, 2007 25. Babacan M. Klinikte antimikrobikler, Atatürk Üniversitesi Yayınları No: 624, Erzurum, 1983;1-

21. 26. Serindağ O. “The synthesis of aminobis(methylphosphynes) and their transition metal

complexes”, Phd Thesis, Department of Chemistry, University of Leicester, 1993 27. Urus S, Serindağ O, Dığrak M. Synthesis, characterization, and antimicrobial activities of Cu(I),

Ag(I), Au(I), and Co(II) complexes with [CH3N(CH2PPh2)2]. Heteroatom Chemistry 2005; 16(6): 484-491.

28. Davies DL, Healey FI, Howarth J, Russell DR, Sherry LJS. Synthesis and reactivity of

aminomethyldiphenylposphine complexes of molybdenum. Crystal structure of cis-[Mo(CO)4(Ph2PCH2NHC6H4Me-p)2]. Journal of Organometallic Chemistry, 1989; 376: C31-C34.

29. Serindağ O, Kemmıt RDW, Fawcett J, Russel DR. Synthesis of Sulphonated

aminomethylphosphine and some Nickel(II), Palladium(II) and Rhodium(I) complexes. Crystal structure of [Et3NH][Ph2PCH2)2N(CH2)2SO3]. Transition Metal Chemistry, 1995; 20: 548-551.

30. Kostas ID, Steele BR, Terzıs A, Amosova S V. A palladium complex with a new hemilabile

amino- and sulfur-containing phosphinite ligand as an efficient catalyst for the Heck reaction of aryl bromides with styrene. The effect of the amino group. Tetrahedron, 2003; 59(19), 3467-3473.

31. Karlsson M, Andersson C, Hjortkjaer J. Hydroformylation of propene and 1-hexene catalysed

by a α-zirconium phosphate supported rhodium-phosphine complex. Journal of Molecular

Catalysis, 2001; 166(2): 337-343. 32. Kostas ID, Tolıs EI, Vallıanatou KA, Andreadakı FJ. A new rhodium complex with a nitrogen-

containing bis(phosphine oxide) ligand as an efficient catalyst for the hydroformylation of styrene.

Applied Organometallic Chemistry. 2006; 20: 335-337. 33. Urus S. “The Bazı Metal-Fosfin Komplekslerinin Sentezi ve Antimikrobiyal Aktivitelerinin

İncelenmesi”, Yüksek Lisans Tezi, Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü, Çukurova Üniversitesi. Adana, 2004

34. Keleş M, Aydın Z, Serindağ O. Synthesis of palladium complexes with

bis(diphenylphosphinomethyl)amino ligands: A catalyst for the Heck reaction of aryl halide with methyl acrylate. Journal of Organometallic Chemistry, 2007; 692: 1951–1955.

46

35. Fawcett J, Hoye PAT, Kemmit RDW, Law DJ, Russel DR. Synthesis of

bis(phosphinomethyl)amines via bis(hydroxymethyl)phosphonium salts. Isolation of 9,9-bis(hydroxymethyl)- 9-phosphoniabicyclo[3.3.1] nonane hydrogensulfate and chloride salts and [(C6H11)2PCH2]2-NCHMePh. Journal of Chemical Society, 1993; 2563-2568

36. Fawcett J, Kemmit RDW, Russel DR, Serindağ O. Structure Of o,o -Bls(1-oxo-2,3-dlhydro-lH-

2-benzopyrrol-2-yl) diphenyl disulfide, Department of Chemistry, University of Leicester, Acta

Cryst. 1993; 1434-1436 37. Ala S, El Aziz A. Macromolecules Containing Metal and Metal-Like Elements, Volume 3, Wiley

Interscience, 2004; 218:63-64

38. Mc Keage MJ, Berner-Price SJ, Galletis P, Bowen RJ, Brouwer W, Dıng L, Zhuang L,

Baguley B. Role of lipophilicity in determinig cellular uptake and antitumor activity of gold phosphine complexes, Cancer Chemother. Pharmacol, 2000; 46: 343-350.

39. Reedijk J. Chem. Rev, , 1999; 2509, 99 40. Garcıa-Seıjo MI, Habmerıam A, Murdouch PDS, Gould RO, Garcıa-Fernandez ME, Five-

coordinate aminophosphine platinum(II) complexes containing cysteine derivatives as ligands, Inorg. Chim. Act., 2002; 335:52-60

41. Dong Y. Et. Al. Serine protease inhibition and mitochondrial dysfunction associated with cisplatin

resistance in human tumor cell lines targetsfor therapy, Biochem. Pharmacol. 1997; 53: 1673-

1682. 42. Marcon G, Carotti S, Coronnello M, Messori L, Mini E, Orioli P, Mazzei T, Cinellu M,

Minghetti G. Gold(III) Complexes with bipyridyl ligands: solution chemistry, cytotoxicity, and dna binding properties. J. Med. Chem, 2002; 45: 1672-1677

43. Li C, Sun RWY, Kui SCF, Zhu N, Che CM. Anticancer cyclometalated [AuIIIm

(C^N^C)mL]n+ compounds: synthesis and cytotoxic properties, Chem. Eur. J. 2006;12: 5253– 5266

44. Shi P, Jiang Q, Lin J, Zhao Y, Lin L, Guo Z. Gold (III) Compounds of 1,4,7-triazacyclononare

showing high cytotoxicity against A-549 and HCT-116 tumor cell lines. Journal of İnorganic

Biochemistry, 2006;939-945 45. Coronnello M, Mini E, Caciagli B, Cinellu M, Bindoli A, Gabbiani C, Messori L. Mechanisms

of cytotoxicity of selected organogold(III) Compounds, J. Med. Chem, 2005; 4: 6761-6765 46. Giovagnini L, Ronconi L, Aldinucci D, Lorenzon D, Sitran S, Fregona D. Synthesis,

characterization, and comparative in vitro cytotoxicity studies of Platinum(II), Palladium(II), and Gold(III) Methylsarcosinedithiocarbamate Complexes, J. Med. Chem, 2005; 48: 1588-1595

47. Messere A, Fabbri E, Borgatti M, Gambari R, Di Blasio B, Pedone C, Romanelli A.

Antiproliferative activity of Pt(II) and Pd(II) phosphine complexes with thymine and thymidine, Journal of Inorganic Biochemistry, 2007; 101: 254–260

47

ÖZGEÇMİŞ Nilay OKTAR 1982 ADANA’da doğdu. İlk ve orta öğrenimini sırasıyla

Yıldırım Beyazıt İlköğretim Okulu, Yirmi Üç Nisan İlköğretim Okulu ve Adana Kız

Lisesi’nde tamamladı. 2000–2004 yıllarında Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat

Fakültesi Biyoloji Bölümü’nde lisans eğitimini aldı. 2004–2005 yılları arasında Fen

Bilimleri Enstitüsü tezsiz yüksek lisans programında eğitimine devam etti. 2005 yılında

Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana

Bilim Dalı Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı’nda tezli yüksek lisans eğitimine başladı.

Halen Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı’nda eğitimine devam etmektedir.

k562 hÜcre dİzİsİnde fosfİn bİleŞİklerİnİn s totoksİk etkİsİnİn mtt … ·...

Documents