La protéomique d’expression différentielle

L’analyse différentielle consiste à comparer au travers de la présence des molécules biologiques, deux situations.

Ceci est réalisé quotidiennement dans les LAM : détection d’un syndrome d’inflammation révélé par la présence de la protéine CRP. Si on cherche à comprendre l’amplitude et l’évolution du syndrome, il est nécessaire de corréler la concentration sérique de la CRP avec celles de l’orosomucoïde et de l’haptoglobine.

Pour découvrir sans a priori de nouvelles molécules d’intérêt

Transcriptome : évènements post-traductionnels pas vus et les aspects cinétiques au niveau des protéines pas considérés

Protéome : la méthode la plus utilisée actuellement : la 2D-PAGEUne nouvelle méthode : l’ICAT (Isotope Coded Affinity Tag)

Patrick O’FARRELL 1970 Actuellement responsable

d’un laboratoire à l’Université de Californie

John YATESActuellement responsable

d’un laboratoire au Scripps Research Institute

La Jolla en californie

La protéomique d’expression différentielle par gel 2D

Deux conditions (ex : cancer – pas cancer, traitée-non traitée)

Les protéines modifiées entre deux situations cellulaires distinctes doivent être effectivement détectables sur gels 2D et à un taux permettant leur identification

Les variations détectées devront être répétitives et statistiquement validées

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D

Les protéines impliquées dans la transduction de signaux sont rarement mises en évidence sur les gels 2D (100 à 1000 protéines par cellule). Or ces protéines assurent des fonctions très importantes en terme de régulation. Il faut donc utiliser des moyens qui permettent de faire des tris sélectifs de molécule.

Tri par différences de solubilité

Pas la cellule entière mais seulement un des compartiments ou organites : noyau, cytoplasme, mitochondrie

Extraction sans détergent va favoriser l’extraction des protéines cytoplasmiques

L’utilisation de solutions ayant un pouvoir d’extraction croissant va favoriser la solubilisation des protéines hydrophobes

Sur un gel le rapport d’intensité entre le plus petit et le plus gros spot est de 104

Dans une cellule la dynamique d’expression est au moins de 105 voire de 106

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D

Pré-fractionnement des extraits par chromatographie et méthodes dérivées

Fractionnement de l’extrait protéique selon un critère physico-chimique (charge, hydrophophilie,…). Toutes les fractions sont ensuite analysées par 2D.

Sélection d’une famille de protéines : phosphoprotéome, glycoprotéome

Sans a priori

Avec a priori

Anti-phosphotyrosine

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D

Pré-fractionnement des extraits par isoélectrofocalisation

Rotofor®

Deux approches d’analyse différentielle des gels 2D

Comparaison statistique entre plusieurs gels

DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis

Acquisition des images

Gel 2D Données numériques

x

y

Les pixels ont une valeur de densité optique (DO) proportionnelle à l’intensité du signal enregistré

Dans un gel le rapport de DO entre le plus petit spot et le plus gros est de 104

Méthode de détection•Sensible •Linéaire

Méthode de détection

Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdalMétaux lourdSonde fluorescente

µg0,2 ng2 ng

Gamme étroite

Instrumentation de digitalisation

Tube photosensible + scanner (lampe fluorescente ou faisceau laser)

Trans-illuminateur à décharge gazeuse + caméra CCD refroidie

PhosphorImager Typhoon

Écran phosphorescent

Les logiciels d’analyse d’image

Année 70 : Gellab, Tycho, Lips ou Elsie

Année 80 : Quest, Mélanie et Kepler

Année 90 : Mélanie II, PDQuest, Phoretix 2D

Aujourd’hui :Progenesis développé par NonLinear Dynamics NewcastleMélanie 4 developpé par SIB à Genève

Unix

Système d’exploitation non programmable

Windows 95 ou NT

Windows XP

Progenesis

≈ 80 000 €

Mélanie

Version gratuite sans la 3D

Analyse statistique

Une analyse différentielle fiable nécessite une comparaison entre des séries d’au moins trois à quatre gels

Outils statistiques•Analyse heuristique•Analyse par correspondance

Détermination de la dispersion entre les gels des différentes séries

NT NT

NT NT

951 spots

Les protéines cytoplasmique des cellules humaines du lymphome de Burkitt

Michel CARON Paris 2002

antiIgM

Lymphome malin non différencié, retrouvé en Afrique centrale mais également dans d'autres régions du monde. La principale manisfestation est une grande lésion ostéolytique de la mâchoire inférieure ou une masse abdominale.

Analyse protéomique du carcinome hépatocellulaire

Jean Rosenbaum Bordeaux 2002

Nicotinamide N-methyltransferase

Ig Kappa Chain V

Nicotinamide N-methyltransferase

Ig Kappa Chain VTissu non tumoral

CHC

Reproductibilité des gels d’electrophorèse 2D: gels résultant de 4 expériences indépendantes réalisées sur le même échantillon

Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4

Tissu non tumoral

CHC

Diminution de la formininotransferase cyclodesaminase dans les CHC

Clusterisation hiérarchique

Cas 1 2 3 4

Cas 1 2 3 4

Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral

Cas 1 2 3 4

Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral

DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis

N-hydroxy-succinimidyl ester : réaction de substitution nucléophile avec le groupe amine en des lysines pour former une amide

Differential 2D-Gel Electrophoresis (DIGE)

Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers

DIGE gel images of normal and cancer cells

Cy3 image of proteins from normal cells

Cy5 image of proteins from tumor cells

SYPRO Ruby-stained gel image

Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers

Effects of Culture on Abundance of Myocyte Proteins

The iTRAQ™ reagents consist of a charged reporter group, a peptide reactive group and a neutral balance group. The peptide reactive group reacts with primary amines and labels all peptides. An increase in the overall protein coverage results from all peptides being labeled.

iTRAQ™ développé par Applied Biosystem

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As these tags are isobaric in MS, quantitation occurs in MS/MS using reporter ions. Investigation of 75,000 accumulated MS/MS spectra identified a quiet region between m/z of 113-119. Reporter ions reside in this quiet region.

Depiction of a multiplexed reaction of 4 different samples. MS/MS spectra of iTRAQ™ reagent labeled peptide shows good y- and b- ions for peptide sequencing. Zoomed section shows the reporter ions used for quantitation. Efficient multiplexing (n=4) allows multiple comparisons across samples that enable the inclusion of duplicates and triplicates into experimental design.

MS/MS spectra of BSA peptide AEFVEVTK labeled with iTRAQ™ reagents shows a significant enrichment of both the y- and b- ions (without peak splitting), providing higher confidence in peptide identifications. Data collected on Q TRAP® System.