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Journal of Plastic Dermatology 2015; 11, 2 75

L’aggiunta esogena di Plasma Ricco di Piastrine(PRP) nel sito di una ferita accelera il processonaturale di guarigione e fornisce un sostegno

Le membrane L-PRF® utili in chirurgia

L-PRF membranes utility in surgery

The PRF is distinct in P-PRF (platelet rich Fibrin pure) and L-PRF (Fibrin rich in plateletswith leukocytes). In vivo at the height of the formation of the fibrin clot, platelets bind tofibrin β-integrin and the clot shrinks. The PRF clot forms a strong fibrin matrix with a com-plex three-dimensional architecture. Quantifying PDGF-BB, TGF-1β and IGF-1 in the PPPand the PRF, the analyzes revealed that the slow fibrin polymerization during the processingof PRF leads to the intrinsic constitution from platelets of cytokines and glycan chains in themeshes of fibrin. The central part of the PRF has massively platelets trapped in the mesh offibrin. The localization of platelets in the PRF was examined by immunostaining andScanning Electron Microscope (SEM). Compared to the membrane PRF tablet dry gauze (G-PRF), the conservation of the level of the plasma, of the fibrin 3D, and platelets is more intactin preparations of membrane PRF with compression system (PRF-C) metal. The distributionof platelets in the membranes C and G-PRF-PRF was analyzed by SEM and immunicitochi-mica. The fibrin rich platelet pure (P-PRF) and the leukocyte-platelet rich fibrin (PRF-L) arebiomaterials solid fibrin or not containing leukocytes. The problem of the concentration ofplatelets does not exist in the PRF, in that all the platelets of the blood sample taken are acti-vated and integrated in the matrix of fibrin in the clot. Approximately 97% of platelets, andmore than 50% of the leukocytes are concentrated in the PRF clot that showed a specific three-dimensional distribution.Almost all platelets (> 97%) were absent from tubes of the groups tested after extraction ofthe membrane PRF. In the red part of the PRF clot, clots have GR in fibrin network.

KEY WORDS: Growth Factors, Fibrin Rich of Platelets, L-PRF Wound Box.

SUMMARY

Service of Dermosurgery and SkinTransplantation, Nursing Home

"Villa del Sole" Caserta,Italy

Ales

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Alessandro Crisci

Introduzione

Recenti evidenze suggeriscono che lepiastrine possono avere un nuovo ruolo nellariparazione dei tessuti e nel rimodellamentovascolare, oltre ad essere soggetti attivi nellerisposte infiammatorie ed immunitarie.Liberano proteine biologicamente attive ed altresostanze che sono in grado di influenzare unaserie di processi che favoriscono l’assunzione, lacrescita e la morfogenesi delle cellule. Tali sostanze vengono liberate o presentate sullasuperficie delle piastrine attivate. La capacitàdelle piastrine di rilasciare sostanze dall’internodi un coagulo rende quest’ultimo una fontenaturale autologa di fattori di crescita e citochi-ne che possono essere utilizzate terapeutica-mente per accelerare la guarigione naturale.Molte di queste sostanze sono accumulate negliα-granuli facilmente identificabili con ilMicroscopio Elettronico e con la colorazioneall’immunofluorescenza (Figura 1).

Figura 1.Microfotografia elettronica di piastrina

di sangue umano.

Crisci_Stes Black 19/10/15 10:17 Pagina 75

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A. Crisci

supplementare per il legame non solo di pia-strine, ma anche di altre cellule, endoteliali,muscolari lisce, fibroblasti, leucociti, cheratino-citi e cellule staminali. Tra i vantaggi nell’usodel coagulo ricco di piastrine vi è la sicurezzafornita dall’influenza antibatterica delle piastri-ne. Le piastrine, infatti, non solo secernonoproteine neutralizzanti i batteri, ma partecipanoanche direttamente alla loro eliminazionedurante la sepsi. Abbastanza sorprendente èanche la capacità che esse hanno, recentementericonosciuta, di ridurre il dolore. La base mole-colare di questo effetto è sconosciuta, una pos-sibile spiegazione è il rilascio di proteasi indot-ta dalle piastrine (PAR-4) che ha proprietà anti-nocicettiva.Le piastrine autologhe sono particolarmente utiliper i tessuti molli in chirurgia ricostruttiva.Valbonesi et al. hanno usato colla di piastrine-fibri-na autologa in 14 pazienti con perdita di pelle edi tessuti molli causata da traumi o patologia cro-nica. Già nel 1986, fattori cicatrizzanti derivantida piastrine umane autologhe (PDWHF) sonostati proposti da Knighton et al. per facilitare laguarigione delle ulcere cutanee recalcitranti, pro-muovendo la formazione di tessuto di granula-zione nella fase di guarigione precoce.Non ci sono differenze morfologiche al SEMnelle fibre spesse di fibrina in tre tipi di PRP.Sono presenti fibre sottili di fibrina scarse nellaLPRP e FPRP, mentre nella HPC (concentrato dipiastrine) formano uno strato denso che coprele fibre spesse (Figura 2).Le fibre sottili presenti nella HPC potrebberoessere correlate all’elevata concentrazione inizia-le di piastrine nel HPC (3-5 x 1011 piastrine/l), incui l’attività procoagulante locale può anche esse-re migliorata con l’avvio dell’amplificazione dellostimolo protrombotico, esso porta ad una produ-zione di trombina quasi esplosiva con conse-guente aumento della fibrogenesi sulla superficiedelle piastrine con conseguente formazione difibrina e sua polimerizzazione. La HPC ha ancheuna concentrazione di fibrinogeno elevata (3,5mg/ml) rispetto al FPRP e al LPRP e contribuiscealla formazione della rete secondaria sopra lefibre spesse (Pretorius e al. 2007).Abbondanti sono sul reticolo di fibrina le pro-teine adesive: Fibrinogeno (Fg), Fibronectina(Fn), Vitronectina (Vn), Trombospondina-1 (TSP-1). La Fn partecipa alla riparazione delle ferite epromuove l’attività mitogena del Fattore diCrescita derivato dalle Piastrine (PDGF). Tra i fat-tori di crescita immagazzinati nelle piastrine ed

essenziali per la riparazione delle ferite ci sonoil PDGF, con la -AB e -C (isoforme predomi-nanti nelle piastrine); sono presenti anche il fat-tore di crescita vascolare endoteliale (VEGF)essenzialmente VEGF-A, il fattore di crescitatrasformante β1(TGF-β1), il fattore di crescitabasale dei fibroblasti (bFGF) specie FGF-2; ilfattore di crescita epidermico (EGF), il fattore dicrescita degli epatociti (HGF) e l’insulin-likegrowth factor-1(IGF-1). I membri della famigliaTGF-β sono importanti nella riparazione delleferite e nella formazione delle cicatrici. La fun-zione di TGF-β1 è regolata nella sua attivazioneda una forma latente secreta e può influenzarenegativamente l’angiogenesi sebbene favoriscela produzione di proteine della matrice. Con unimportante ruolo nella guarigione, le piastrinesono una ricca fonte di citochine e chemiochi-ne. Un esempio è RANTES, una chemiochinadepositata sull’endotelio infiammato da unmeccanismo P-selectina-piastrine-dipendente.Le piastrine sono anche una potenziale fonte dimetalloproteasi della matrice (MMP) (MMP-2,

Figura 2.Fotografia al SEM che mostra a) un aggregato piastrinico da coagulodi fibrina da concentrato di piastrine umane (HPC) (ingr.10.000 x),nonché fibre di fibrina. L’etichetta A dimostra pseudopodi. b) fibre difibrina da HPC (ingr.5.000 x). L’etichetta B dimostra fibre minori conaspetto liscio formando una rete secondaria sulle fibre principali difibrina. c) ingrandimento maggiore (10.000 x). L’etichetta B dimostrale fibre minori. d) ingrandimento maggiore (10.000 x) in cui sono pre-senti fibre di fibrina in cui è assente il reticolo di fibrina minore. Soloraramente sono presenti fibre spesse senza una copertura reticolarefine (modificata da Pretorius et al. 2007).


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MMP-9, ADAM-10, ADAM-17, ADAMTS-13)così come di inibitori tissutali delle metallopro-teasi (TIMP 1-4). Le MMPs sono presenti negliα-granuli e anche nelle vescicole della mem-brana citoplasmatica. Il fibrinogeno può migliorare la cicatrizzazionedi una ferita, aumentando sia la proliferazioneche la migrazione cellulare, esso si assemblacon Fn in fibrille indipendentemente dalla for-mazione di fibrina. La fibrina è un partecipanteimportante nella guarigione delle ferite, infattil’esito della guarigione di una ferita è influenza-to dalla struttura della fibrina (spessore dellefibre, numero di punti di ramificazione, poro-sità e permeabilità del coagulo) (Figura 3) alsito della ferita (Del Corso et al. 2007).Se una ferita non guarisce in una sequenzaordinata e tempestiva, o se il processo di guari-gione non risulta in un’integrità strutturale, laferita viene considerata cronica. La guarigionedella ferita cronica si verifica con gli stessi pro-cessi della guarigione della ferita acuta, ma siforma abbondante tessuto di granulazione,spesso con fibrosi eccessiva che porta alla con-trazione cicatriziale e alla perdita di funzione.Le ferite croniche e il loro trattamento sono unonere adeguato sul sistema sanitario e conti-nuerà ad essere una sfida terapeutica. A causadell’eterogeneità dei pazienti, di molteplicieziologie e della mancanza di modelli animali,la ricerca in questo campo è difficile e comples-sa. Nonostante questi problemi, vari fattoripatogeni locali cellulari e molecolari possibilisono stati identificati. La terapia medica rimanelo standard di cura per il trattamento delle ulce-re. Se fallisce, però, la gestione chirurgica puòessere necessaria. L’innesto cutaneo a spessoreparziale è fondamentale nel trattamento delleulcere croniche ed è spesso utilizzato per copri-re o chiudere grandi ulcere non-guarite. Prima

di un effettivo trapianto, l'ulcera è sbrigliatacioè la pelle lipodermatosclerotica, i tendiniesposti e le calcificazioni sottocutanee vengonorimosse per realizzare una ferita vascolarizzata,idoneo letto per la pelle tagliata a maglie perrendere un intimo contatto con il letto dell'ul-cera e favorire l’afflusso di sangue. Se questa tra-sformazione di una ulcera cronica crea proble-mi, si può creare una ferita acuta, in quanto lamorbosità di base che in primo luogo ha causa-to l'ulcera è ancora presente. I coaguli di fibrina ricchi di piastrine costitui-scono un serbatoio bioattivo. Un ematocritoalto o un basso numero di piastrine possonoessere un fattore limitante ed ulteriori ricerchesono necessarie per stabilire il numero ottimaledi piastrine per la loro utilizzazione. Oltre asecernere proteine le piastrine rilasciano com-posti diffusibili a basso peso molecolare e gran-di quantità di microparticelle che trasportanoproteine come TF o IL-1 che sono sostanze pro-trombotiche. Pertanto può essere controindica-ta l’utilizzazione in pazienti con fattori dirischio trombotici ereditari o acquisiti (comeipertensione arteriosa, Fattore V di Leiden). L’uso contemporaneo di farmaci antipiastrinepotrebbe teoricamente limitarne l’efficacia.L’aspirina riduce la secrezione piastrinica edovrebbe quindi essere evitata nei giorni prece-denti alla preparazione di PRP autologo, inquanto inibisce l’enzima ciclossigenasi (COX).Dopo il primo rilascio massivo di fattori di cre-scita, le piastrine ne sintetizzano e secernono dinuovi per il resto della loro vita (≅ 7-10 gg).

La PRF® (Fibrina ricca di piastrine) è una nuovagenerazione di concentrato piastrinico, ottenu-to dalla centrifugazione di sangue perifericoautologo, senza l’aggiunta di agenti biologici.Contiene il polimero matrice della fibrina, leu-cociti, citochine e cellule staminali. È distinto inP-PRF (Fibrina ricca di piastrine pura) e L-PRF(Fibrina ricca di piastrine con leucociti). Il PRP(Plasma ricco di piastrine) ha un effetto transito-rio sulla guarigione delle ferite ed inoltre latrombina bovina aumenta il rischio di coagulo-patia, cosa che non avviene con il PRF®. In essosi verifica un processo di coagulazione naturale

Figura 3.Differenza tra l’architettura molecolare della fibrina prodotto con la tec-nica del PRP (a) e del PRF (b). Si noti la differenza di elasticità tra ledue strutture (modificata da Del Corso et al. 2007).



a giri alti ed uno Stop Low finale (Nurden 2008)e deve svolgersi ad una determinata temperatu-ra e per un determinato tempo.

Preparazione di L-PRF

Il protocollo di preparazione di PRF®

è molto semplice: il sangue viene immediata-mente centrifugato entro 2 minuti dal prelievoseguendo la seguente programmazione: 30” diaccelerazione, 2’ a 2700 rpm, 4’ a 2400 rpm, 3’a 3000 rpm, e 36” di decelerazione ed arresto. Icoaguli di PRF risultanti sono raccolti e la partedei globuli rossi vengono eliminati con le forbi-ci senza nessun danno del PRF a livello macro-scopico (protocollo di processo, Nizza, Francia). Ilprodotto risultante è costituito da tre strati: PPP(Plasma privo di piastrine in alto), PRF (coagu-lo al centro), globuli rossi in basso (Figura 4).Il fibrinogeno è inizialmente concentrato nellaparte centrale e superiore della provetta, pro-prio tra i globuli rossi in basso e il plasma acel-lulato in alto. Il coagulo PRF forma una fortematrice di fibrina con una complessa architettu-ra tridimensionale (Figure 2, 3, 7), in cui lamaggior parte delle piastrine e di leucociti sonoconcentrati dal sangue raccolto. La compressio-ne del coagulo con garza asciutta (G-PRF)determina una riduzione di isoforme di PDGFrispetto ad una membrana di PRF preparata conun sistema di compressione (C-PRF) (PRF®Box)

che permette una facile raccolta di leucociti ePRF® (L-PRF®) nel coagulo.I gel di fibrina sono desiderabili come scaffoldsper ingegneria tissutale per diversi motivi. Laragione più importante è inerente la compatibi-lità con la vita cellulare della fibrina, che èdiversa in base ai molti componenti ed ai pro-cessi coinvolti nella fabbricazione di scaffolds.La fibrina prodotta è una sostanza naturalecompletamente biodegradabile, che facilita latransizione verso una nuova matrice extracellu-lare. In vivo al culmine della formazione delcoagulo di fibrina, le piastrine legano la fibrinaalla β-integrina e il coagulo si contrae. Esso sicontrae anche contro i margini del letto dellaferita generando tensioni ed orientando lanuova matrice provvisoria. Il coagulo PRF èprodotto da un processo di polimerizzazionenaturale durante la centrifugazione, e la suaarchitettura di fibrina naturale sembra respon-sabile di un lento rilascio di fattori di crescita eglicoproteine dalla matrice > =7 gg. Tale rilascio lento è inimmaginabile nella mag-gior parte delle tecniche di produzione di PRP acausa dell’attivazione brutale delle piastrine.In chirurgia plastica i coaguli di PRF possonoessere direttamente utilizzati per riempire unacavità durante una lipostruttura. Anche se i fat-tori di crescita piastrinica svolgono un’impor-tante ruolo nella biologia del PRF, l’architetturadella fibrina e il contenuto dei leucociti sonodue parametri chiave. La distribuzione dellepiastrine e dei leucociti all’interno del coagulodi fibrina è stata evidenziata attraverso la contaematologica, la microscopia fotonica e la SEM.Un valido metodo di preparazione di PRF® deveefficacemente separare le piastrine dagli eritro-citi e concentrarle senza danneggiare o lisare lepiastrine stesse. I fattori di crescita contenutiall’interno dei granuli α non sono attivi duran-te la secrezione, essi si fondono con la membra-na piastrinica attivandosi. Di conseguenza se lepiastrine vengono danneggiate durante la pro-duzione di PRF, non secerneranno più i fattoridi crescita bioattivi. Esse, infatti, sono partico-larmente labili e sensibili ad ogni tipo di eventostressante durante la fase di lavorazione e diapplicazione; per tale ragione anche la concen-trazione di fattori di crescita può venire influen-zata dalla manipolazione durante la processa-zione del sangue. Quindi è determinante ancheil tipo di centrifugazione che viene effettuato,essa deve avere determinate caratteristiche,quali sono: la Start Low iniziale, la fase centrale

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A. Crisci

Figura 4.Il PRF di Choukroun è un biomateriale (A)con una specifica architettura 3-dimensiona-le e distribuzione delle cellule. Il corpo prin-cipale del materiale è acellulare e costruitocon filamenti di fibrina (B, hemalaun-eosina,ingr. 52 x), leucociti e aggregati piastrinicisono concentrati in alcune aree (C, hema-laun-eosina, ingr. 52 x ). Il PRF può essereusato come un coagulo (A, alto), un cilindrocondensato (A, centrale), o una membranadensa (A, in basso).

A B

C



il quale stimola in modo più significativo la pro-liferazione cellulare e la neovascolarizzazione(Kobayashi et al. 2012). Quantificando PDGF-BB, TGF-β1 e IGF-1 nelPPP e nel PRF, le analisi hanno rivelato che lalenta polimerizzazione della fibrina durante lalavorazione di PRF porta alla costituzioneintrinseca dalle piastrine di citochine e cateneglicaniche nelle maglie di fibrina. Analizzandotre citochine proinfiammatorie (IL-1β, IL-6,TNF-α), una citochina antinfiammatoria (IL-4)e il promotore dell’angiogenesi (VEGF), si èvisto che il PRF potrebbe essere un nodo nellaregolazione immunitaria con abilità nel control-lo dell’infiammazione. Il PRF a differenza deglialtri concentrati piastrinici, sarebbe in grado dirilasciare progressivamente citochine durante ilrimodellamento della matrice di fibrina.Diversi studi hanno dimostrato che la L-PRP haeffetti antimicrobici, ma senza azioni infiamma-torie indesiderate. Il PRF permette al chirurgodi fornire direttamente una risposta di guarigio-ne naturale e può stimolare la produzione divasi sanguigni vitali, cellule di grasso, depositidi collagene che sembrano persistere nel tempoanche in assenza di una ferita (Zhao et al. 2013). Le citochine sono immediatamente utilizzatenella guarigione delle ferite. Una colla di fibrina, arricchita con citochine(come il PRP) con grande effetto incontrollabi-le è di breve durata, è quindi più utile unamatrice fisiologica di fibrina (come il PRF)(Naik et al. 2013).I vantaggi del PRF rispetto al PRP sono:1) nessuna manipolazione biochimica del san-

gue;2) processo semplificato e conveniente;3) l’uso di trombina bovina e anticoagulanti

non sono richiesti;4) guarigione favorevole a causa di una poli-

merizzazione lenta;5) migrazione e proliferazione cellulare più

efficiente;6) un effetto favorevole sul sistema immunita-

rio;7) maggiore aiuto all’emostasi.

Il meccanismo coinvolto nella formazione diPRF è il fibrinogeno concentrato nella partesuperiore della provetta il quale si combina conla trombina circolante, dovuta alla centrifuga-zione, per formare fibrina. La parte centrale delPRF presenta piastrine intrappolate massiccia-mente nelle maglie di fibrina. Il successo di

questa tecnica dipende interamente dall’inter-vallo di tempo trascorso tra la raccolta di san-gue e la sua centrifugazione che deve esserefatta in meno tempo possibile, nonché dallatemperatura di lavorazione e dal tipo di provet-ta usato. I campioni di sangue infatti devonoessere prelevati da pazienti senza storia diassunzione di aspirina o altri farmaci anticoagu-lanti nelle due settimane antecedenti. Dohan et al. (1988) hanno rivelato un rilasciopiù lento di fattori di crescita nel PRF rispetto aPRP e osservato migliori proprietà curative conPRF. È stato dimostrato anche che le cellulesono in grado di migrare nel reticolo di fibrina.La modalità di polimerizzazione lenta conferi-sce alla membrana di PRF® un’architettura fisio-logica particolarmente favorevole per supporta-re il processo di guarigione.

Considerazioni generali

La localizzazione delle piastrine nelPRF è stata esaminata mediante immunocolora-zione e al Microscopio Elettronico a Scansione(SEM). In studi precedenti, la compressione delcoagulo per formare una membrana PRF è stataeffettuata convenzionalmente con una garzaumida o secca e non si ci è preoccupati se que-sta compressione può danneggiare le piastrine efà trasudare quantità significative di fattori dicrescita. Su e Burnouf hanno dimostrato chenotevoli quantità di fattori di crescita sonorimossi con la spremitura. Pertanto il processodella spremitura potrebbe influenzare l’efficaciae la qualità clinica dei preparati PRF comemateriale da innesto.I livelli dei fattori di crescita dopo vari tipi dicompressione sono stati valutati con dosaggi bio-logici e tecniche citochina-anticorpo. La conservazione del livello di plasma, del retico-lo di fibrina 3D, e di piastrine è più intatta neipreparati di membrana PRF con sistema di com-pressione (C-PRF) metallica, rispetto alla mem-brana PRF compressa con garza asciutta (G-PRF).Il peso umido della membrana PRF da 2,18 grè passato a 0,35 gr nella compressione metalli-ca e a 0,04 gr in quella con garza (diminuzionedel 84% vs il 98%).Tra i fattori di crescita testati, il PDGF contenu-to nel C-PRF è maggiore e stimola, in modosignificativo la proliferazione cellulare e la neo-vascolarizzazione. Il C-PRF può essere utile perl’innesto, riducendo al minimo la perdita di fat-

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membrana di PRF ma solo all’interno di essacon una densità superiore a quella del C-PRF. Nel confrontare i fattori di crescita contenuti inC-PRF e G-PRF il primo contiene una maggioreconcentrazione di TGF-β, PDGF-AB, PDGF-BB,EGF, FGF-4, IGF-II,e VEGF-D.La scoperta dello studio di Kobayashi et al. 2012è che le piastrine non sono equamente distri-buite all’interno e sulla superficie del coaguloPRF, anche se esso è stato ritenuto essere un gelcon un uniforme concentrato di piastrine.Pertanto in una condizione clinica in cui i fatto-ri di crescita forniti dalle piastrine sono attesi edesiderati, deve essere usata una regione adia-cente al trombo rosso in quanto è più ricca dipiastrine.Basato sul concetto che il siero trattenuto nelcoagulo PRF potrebbe contenere elevati livellidi fattori di crescita rilasciati dalle piastrine chesono più o meno attive durante la centrifuga-zione, non è stato tentato di spremere tutto ilplasma con la compressione completa dei coa-guli di PRF. La tendenza ad un maggiore livellodi fattori di crescita nel C-PRF rispetto al G-PRFpuò essere attribuito alla presenza di FG deriva-

tori bioattivi. Una caratteristica importante delPRF è che il gel di fibrina risultante è più rigidodi quello preparato con l’aggiunta di trombina(PRP). La densità delle fibre e la densità deipunti di ramificazione della rete di fibrina rego-lano principalmente la rigidità del gel di fibrinae questi parametri sono in rapporto alla ric-chezza di trombina in modo dose-dipendente(Figura 3).È stato necessario quindi stabilire un protocollostandardizzato per preparare il PRF soddisfa-cendo i seguenti criteri:1) i fattori di crescita presenti nelle piastrine

devono essere conservati per stimolare lecellule circostanti ospiti;

2) le piastrine devono essere conservate nelreticolo di fibrina con il minimo danno oattivazione;

3) il reticolo di fibrina tridimensionale deveessere utilizzato come scaffold per le celluleospiti circostanti.

I campioni di membrana PRF sono stati esami-nati al S.E.M. e col metodo immunocitochimicoda Kobayashi et al. 2012.Il C-PRF è stato diviso in 3 regioni di ugualelunghezza e la presenza di piastrine in ogniregione è stata osservata al S.E.M. (Figura 5). La regione 1 è quella più vicina al coagulo rossoe presenta numerose piastrine aggregate e visono alcuni linfociti e globuli bianchi. Il nume-ro di piastrine diminuisce con l’aumentare delladistanza dal coagulo rosso. Nella regione 2(centrale) sono presenti fibre di fibrina e qual-che piastrina. Nella regione 3 il reticolo di fibri-na è molto evidente, mentre le piastrine sonoscarse. La distribuzione delle piastrine nellemembrane C-PRF e G-PRF della regione 1 èstata analizzata al SEM e all’immunicitochimica.Nel C-PRF il reticolo di fibrina è stato ricopertoda molti aggregati piastrinici e linfociti (Figura6), mentre nel G-PRF il reticolo di fibrina ècompletamente premuto in una forma di film epossono essere osservate poche piastrine.Questi risultati sono stati verificati dal rileva-mento di cellule positive all’anticorpo anti-CD41 all’immunocitochimica, infatti nel C-PRFsu un lato della membrana si trovano accumu-late numerose piastrine CD41-positive ed alcu-ne piastrine si trovano all’interno della mem-brana. Al lato opposto di questa vi sono scarsepiastrine. Nel G-PRF al contrario non sono stati trovatiaggregati piastrinici su entrambi i lati della

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A. Crisci

Figura 5.Le tre regioni del C-PRF e osservazioni SEM delle piastrine sullasuperficie della membrana. (A) C-PRF è stato diviso in tre regioni:Regione 1 adiacente al coagulo rosso (RBC), Regione 2 è la partecentrale e la Regione 3 è la parte distale del trombo rosso. La loca-lizzazione delle piastrine è stata osservata nella regione 1 (A), nellaregione 2 (B) e nella regione 3 (C). Le piastrine sono più concentratenella regione 1 e meno nella regione 3 (modificata da Kobayashi etal. 2012).

A B

C D



ti dalle piastrine (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB). Questo effetto può essere dovuto alla fibri-na perché il reticolo di fibrina può assorbiredirettamente i FG o potrebbe intrappolare lasieroalbumina o l’eparina e quindi, indiretta-mente mantenere i FG.È quasi impossibile da contare e regolare ilnumero di piastrine nelle preparazioni di PRFprima dell’utilizzo clinico. Pertanto il modo cli-nicamente più efficace per controllare la qualitàdei risultati è quello di utilizzare la regione diPRF più vicina al coagulo di G.R.

L-PRF in Chirurgia

La fibrina è un utile substrato perscopi di bioingegneria ed è uno degli idrogelpiù popolari nel campo dell’ingegneria tissutale

e della medicina rigenerativa. Le cellule trapian-tate richiedono segnali specifici dalla matriceextracellulare per sopravvivere. Anoikis è un ter-mine usato per descrivere la morte prematuradelle cellule che non ricevono questi segnalimeccanici e chimici dalla matrice, e questofenomeno è considerato una delle cause princi-pali di fallimento del trapianto cellulare.La fibrina ricca di piastrine pura (P-PRF) e laleucociti-fibrina ricca di piastrine (L-PRF) sonobiomateriali solidi di fibrina contenenti o noleucociti. In queste tecniche l’attivazione pia-strinica è parte del processo di produzionee può essere naturale (L-PRF) o artificiale (P-PRF), ma si verifica sempre durante la centrifu-gazione e porta ad una forte architettura finaledi fibrina.Il L-PRF è un preparato contenente leucociti econ un’alta densità della rete di fibrina. Questiprodotti esistono sotto forma di gel attivato enon possono essere iniettati o utilizzati come lacolla di fibrina tradizionale. Tuttavia, a causadella loro forte matrice di fibrina possono esse-re trattati come materiale solido per le applica-zioni che sono state proposte, con interessantirisultati in chirurgia ricostruttiva, ma questeapplicazioni rimangono ancora in fase speri-mentale in quanto richiedono di trovare unmodo per utilizzare i coaguli in ogni specificaprocedura chirurgica.La fibrina crea una matrice provvisoria nel lettodel trapianto, ma le sue fibre non hanno dire-zionalità e tensione, essa ha infatti pochi fattoridi crescita associati contenuti. I gel di fibrinainvece presentano una disposizione regolare ereticolare dei pori con fibre corte e sottili e nondel tutto acellulate e al SEM sono state osserva-te piastrine e leucociti (Figura 7). In studi eseguiti nel cavallo i gel di fibrina con-tenenti piastrine (PRFG) presentano grandifibre dense e disposte in modo casuale (con dia-metro medio di 117,7 ± 10,53 nm). Le fibre digel di fibrina sono più piccole (56,8 ± 5,11nm). L’incorporazione delle piastrine nel gel difibrina quindi risulta in alterazioni strutturali ein un aumento della concentrazione dei fattoridi crescita e può, in definitiva migliorare le pre-stazioni delle cellule innestate nello scaffolddopo il trapianto.Il PDGF e TGF-β1 sono i più abbondanti fattoridi crescita contenuti all’interno degli α-granulidelle piastrine e vengono rilasciati nello spazioextracellulare dopo l’attivazione piastrinica.Questi fattori cellulari dirigono la proliferazione,

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Figura 6.A) Al confine tra la zona rossa e coagulo giallo al SEM. Il gruppo diglobuli rossi e di leucociti appare come strutture sferiche con unasuperficie irregolare (cerchi bianchi). La maggior parte di loro sembrava piuttosto piccola (tra 6 e 8 µm di diametro) e, quindi,potrebbero essere principalmente linfociti. B) Le piastrine erano spesso mischiate nella rete di fibrina, ma a volte, appaiono comeaggregati (cerchi bianchi) che sono stati facilmente identificati (Ingr. A1500 x, B 3500 x) (modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2010).

Figura 7.a e b. Coagulo di PRF visto al microscopio elettronico. La freccia indica i trombocitia barra =10 µm b barra = 1 µm

A B



La famiglia L-PRF si adatta alle esigenze degliinterventi chirurgici. Come coaguli e membranela L-PRF presenta una forma e un volume faci-le da combinare con la maggior parte delle tec-niche chirurgiche, come riempimento ed inter-posizione di biomateriali di guarigione o comemembrane di protezione per la guarigione delleferite. Queste membrane sono anche forti ed offronoun lento rilascio di molti fattori di crescita(Tabella 1) per periodi lunghi. Infine, è facile dapreparare i gran quantità e poco costoso, ciò lorende particolarmente adatto per la quotidianapratica clinica. È utilizzabile in particolare neltrattamento delle ulcere cutanee.

la differenziazione cellulare, la produzione dellamatrice, l’angiogenesi e la contrazione della feri-ta, la supplementazione di fattori di crescitainfatti, migliora la sopravvivenza e la differenzia-zione delle cellule trapiantate in un numero dimateriali e tessuti trattati (Figure 8, 9).L’aggiunta di piastrine al gel di fibrina (PRFG)comporta un aumento del diametro delle fibre ela diminuzione delle aree porose aumentando larigidità del gel di fibrina. Il diametro misuratodelle fibre è stato associato alla concentrazionepiù bassa di piastrine (100 x 103 piastrine/μl)che si approssima alla concentrazione di piastri-ne sistemica in cavalli normali. La spiegazionepuò essere che meno tensione viene applicataalle fibre dal minor numero di piastrine.Le aree porose e la percentuale di porosità sonoimportanti indici strutturali di qualsiasi scaffoldbiologico. I pori più grandi favoriscono la cre-scita interna e la proliferazione cellulare mentrei pori più piccoli favoriscono l’adesione cellula-re a causa di una maggiore superficie. La con-centrazione di leucociti presente nel PRP e nelPRFG è controversa. Però l’effetto specifico della concentrazione dileucociti sulla formazione del coagulo, sulla for-mazione di gel di fibrina o sulla rigidità del coa-gulo è ancora da studiare. Il PRP utilizzato perla produzione di PRFG ha una concentrazionedi WBC intermedia (media: 9,34 x 103 leucoci-ti/ml) (range: 3,2 x 103 - 16,0 x 103 di leucoci-ti/ml) (Textor et al. 2014).Da un punto di vista clinico, L-PRF presentaeccellenti proprietà di manipolazione: i singolicoaguli di L-PRF vengono trasformati in mem-brane di opportune dimensioni e spessore gra-zie al nuovo “L-PRF Wound Box®”; più membra-ne unite tra loro serviranno a creare una mem-brana bioattiva di maggiori dimensioni per rico-prire e costituire ampi innesti. La membrana diL-PRF può essere tagliata su misura. Essendoabbastanza flessibile si adatta bene a differentiaree anatomiche. Da un punto di vista legale un medico essendoautorizzato alle punture endovena è autorizzatoanche al prelievo. Inoltre, da regolamentocomunitario, quindi con legge valida in tuttaEuropa il L-PRF non avendo aggiunta di sostan-ze non è un emoderivato ma rientra nel caso delreinnesto di cellule autologhe.Poiché la guarigione che si verifica con questatecnica non è né per prima, né per secondaintenzione, essa viene definita “guarigione perseconda intenzione modificata” (Desai et al. 2013).

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A. Crisci

Figura 8.Livelli TGF-β1 nel cavallo (modificata da McLellan, Plevin, 2014i).

Figura 9.Livelli PDGF-BB nel cavallo (modificata da McLellan, Plevin, 2014).



L-PRF in vitro

In vitro i comportamenti di una mem-brana di L-PRF e gel P-PRP (PRFG-endorest)sono stati confrontati attraverso la valutazionedel lento rilascio di fattori di crescita e di mole-cole della matrice.Queste due famiglie di gel sono state poste inun terreno di coltura per 7 giorni, e le versionilente di 3 fattori di crescita chiave (TGF-β1,PDGF-AB, VEGF) e 3 proteine della coagulazio-ne e della matrice (TSP-1 [Trombospondina 1])

(Fn) (Vitronectina) sono state quantificate spe-rimentalmente sette volte (a 20’, 1h, 4h, 24h,72h, 120h, 168h) (Figure 10-14) (DohanEhrenfest et al. 2014) Questi studi hanno rivelato che i prodotti pre-sentano due profili molto differenti: la membra-na L-PRF è rimasta solida e intatta dopo 7 gg erilascia continuamente una grande quantità difattori di crescita e una parte significativa di essiè prodotta dalle cellule all’interno della mem-brana. Al contrario il gel P-PRP chiarificato rila-scia la maggior parte dei fattori di crescita nelleprime ore ed è completamente sciolta dopo 3giorni (Figure 11-14).I leucociti presenti nella L-PRF non sono solocellule infiammatorie, in quanto essi presentanoanche effetti anti-nocicettivi attraverso diversechemiochine, citochine antinfiammatorie (IL-4,IL-10, IL-13) e peptici oppioidi (β-endorfine,dimorfina-A ecc.) e quindi possono promuove-re una inibizione clinicamente rilevante deldolore patologico (il processo di centrifugazio-ne può attivare dolcemente, stimolare patologi-camente lo stato infiammatorio o distruggere ileucociti). Molti tipi di cellule sono presenti inqueste preparazioni. La formula leucocitaria èun parametro importante: le popolazioni dilinfociti sono molto diverse e non hanno affattolo stesso impatto dei monociti e dei granulociti.Inoltre, molte altre cellule circolanti, come lestaminali possono essere trovate in un concen-trato piastrinico e non essere trascurate. È stata osservata una certa quantità di GF nelsiero rilasciato da PRF (PRFR) e nel siero super-natante (SS) subito dopo la formazione del PRF.È stato trovato un rilascio aggiuntivo dalla PRF diGF fino a 300’ (5h). Il contenuto di GF nel SSè ≅ 7 ng/ml (PDGF-AB), 9,5 ng/ml (TGF-β1),0,1 ng/ml (VEGF) e costituisce una buona indi-cazione del livello basale dei GF nel PRFR intrap-polata nel coagulo. La concentrazione di GF rila-sciati dal PRF è significativamente inferiorerispetto a quella presente nei lisati piastrinici edè la concentrazione inferiore presente nel sangueintero utilizzato per produrre PRF. Il PRF ed il SScontengono grandi quantità di GF e non devonoessere scartate in quanto possono essere utili neltrattamento del paziente (Su, 2010). L’essudato iniziale del PRF (ricco di fattori dicrescita e proteine del siero) viene raccolto nelcontenitore e le membrane PRF vengono con-servate in un ambiente umido di siero. Questoè un metodo efficace da un punto di vista bio-logico.

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Figura 10.Livelli dei fattori di crescita nel tempo.

Figura 11.Variazioni di TSP-1 e fibronectina nel tempo. Confronto tra L-PRF ePRGF (modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2012).



o il contenuto cellulare. Inoltre è importanteevidenziare l’influenza chiave dei leucociti el’architettura della fibrina nei potenziali effetticlinici o sperimentali di questi prodotti e checiascun prodotto si riferisce ad un’improntabiologica specifica.Le piastrine, la fibrina e i leucociti agiscononaturalmente in sinergia per promuovere la

Il coagulo L-PRF contiene quasi tutte le piastri-ne e più del 50% dei globuli bianchi del sangueinizialmente raccolto, presenta inoltre una fortearchitettura di fibrina e una speciale distribu-zione tridimensionale delle piastrine e dei leu-cociti. Una soluzione è mantenere i coaguli inun contenitore di metallo sterile e premerli inmembrane con una placca sterile in metalloquando è necessario.Questo dispositivo permette la conservazione delcoagulo in un ambiente umido e sterile per 1 h epermette un aumento del rilascio dei fattori dicrescita totale. Il L-PRF Wound Box® è uno stru-mento polivalente in cui coaguli PRF (A) posso-no essere trasformati in membrane. Le quantitàmedie prodotte di PDGF-AB sono significativa-mente più alte in ogni momento sperimentale(Figura 12, Tabella 1) e la TGF-β1 (Figura 12,Tabella 1) e VEGF (Figura 13, Tabella 1) sonosignificativamente più alte durante le prime 4h(Figura 14). La spiegazione di questo risultato èabbastanza semplice: utilizzando il PRF Box, laprocedura di compressione dei coaguli in mem-brana viene eseguita attraverso una leggera com-pressione, lenta ed omogenea e la membranafinale rimane sempre omogeneamente bagnataed intrisa di siero. Questo metodo delicato evital’estrazione e la perdita di una quantità significa-tiva di fattori di crescita, ed è particolarmenteevidente con PDGF-AB, perché questo fattore dicrescita viene rilasciato solo dalle piastrine.Questo metodo, non influenza altri fattori di cre-scita intrinseci che vengono rilasciati lentamentein quantità elevate per diversi giorni. Le quantitàrilasciate di VEGF e TGF-β1 sono prodotte daileucociti massicciamente. Un procedimento di raccolta di sangue ed unapreparazione non standardizzata, lenta ed ina-deguata, porta ad una piccola massa di fibrinaPRF-like, con polimerizzazione di fibrina insta-bile (con conseguente deboli proprietà mecca-niche) e fattori di crescita sconosciuti e irripro-ducibili. Inoltre è molto difficile separare questepiccole masse di fibrina alla base dei G.R. risul-tante in un pesante carico di globuli rossi nelprodotto (Dohan Ehrenfest et al. 2012).

Limitazioni del PRF

Secondo la classificazione POSEIDOtutti i prodotti di questa categoria sono rag-gruppati sotto il termine generale di concentra-ti piastrinici (HPC), qualunque sia la loro forma

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A. Crisci

Figura 12.Variazioni di TGF-β1/PDGF-AB e Vitronectina nel tempo. Confronto traL-PRF e PRGF (modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2012).

Figura 13.Variazioni di VEGF nel tempo. Confronto tra L-PRF e PRGF(modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2012).



guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tes-suti e il concetto di concentrati piastrinici peruso chirurgico è di moltiplicare questo effetto dicoagulazione/rigenerazione su un sito chirurgi-co o una ferita.

Le limitazioni nell’uso di PRF sono:1) A causa del fatto che la PRF èun prodotto autologo, la disponi-bilità di questo biomateriale inquantità maggiore è difficoltoso.Quindi, il suo utilizzo in proce-dure chirurgiche deve essere benprogrammato.2) Il PRF possiede cellule immu-nitarie circolanti e molecole anti-geniche che impediscono il suouso come materiale allogenico evi è inoltre un aumentato rischiodi trasmissione di agenti infettivi.

A questo punto della nostra cono-scenza, tra i parametri tenuti al difuori dalle nostre considerazioniabbiamo: la concentrazione dipiastrine, la concentrazione deileucociti e la proporzione tra ivari tipi di leucociti. Il problemadella concentrazione delle piastri-ne non esiste nel PRF, in quantotutte le piastrine del campione disangue prelevato sono attivate eintegrate nella matrice di fibrinanel coagulo. Per quanto riguardala concentrazione dei leucociti ela loro formula, la loro influenzadeve ancora essere studiata conattenzione, in quanto la loro pre-senza o meno può spiegare irisultati contraddittori che sisono osservati (Tabelle 2, 3). Nel L-PRF non sono state eviden-ziate differenze statisticamentesignificative tra le concentrazionibasali di WBC (7,4 x 103/ml) e dipiastrine (166 x 103/ml). Non cisono correlazioni tra valori emati-ci basali e concentrazione di FG.È stata rilevata una correlazionesignificativa tra numero di pia-strine e rilascio di TGF-β1(p = 0,005) e di PDGF-BB(P = 0,04). Il TGF-β1 è quantita-tivamente maggiore nel gruppoPRF a lento rilascio rispetto a

quello a pronto rilascio (Figura 8). È stato riportato che WBC intrappolati nellamatrice PRF rappresentano la fonte principaledi questo rilascio supplementare di TGF-β1, eche WBC continuano a secernere questo FG

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Tabella 1.Variazioni di vari fattori di crescita nel tempo. Confronto tra L-PRF, PRGF e PPGF (modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2012).

Tabella 2.Numero di leucociti, G.R. e piastrine nel sangue intero (gruppo di controllo) e nel residuo coagulo rosso dopo la raccolta della membrana PRF (gruppi testati) (modificata da Dohan Ehnrenfest et al. 2010).

Leucociti/µl RBC/µl Piastrine/µl

Media Range Media Range Media Range

Controllo 6.900 6.100-7.800 5.19 (106) 5.01-5.52 (106) 2.66 (105) 2.18-3.09 (105)

Serie 1 3.500 3.000-3.800 5.89 (106) 5.75-6.08 (106) 6.000 4.000-8000

Serie 2 3.600 3.300-4.000 5.84 (106) 5.78-5.91 (106) 7.000 6.000-9000

Tabella 3.Formula leucocitaria stabilizzata nel sangue intero (gruppo di controllo) e nel residuo coagulo rosso dopo la raccolta della membrana PRF (gruppi testati) modificata da Dohan Ehnrenfest et al. 2010).

Sangue Intero(%) Serie 1(%) Serie 2(%)

Tipo di cellula Media Range Media Range Media Range

Leucociti Neutrofili 51.8 49.7-53.2 72.1 66.1-77.1 66.4 60.9-71.4

Leucociti Eosinofili 2.9 2.3-3.1 6.1 3.4-8.8 5.1 3.9-6.1

Leucociti Basofili 0.5 0.3-0.8 0.1 0.0-0.3 0.4 0.1-0.9

Linfociti 37.7 35.1-39.2 17.5 15.0-20.4 24.8 21.4-28.0

Monociti 71.1 6.8-7.6 4.2 1.1-7.6 3.3 2.5-5.0

Totale (Media) per µl 6.900(100%) 3.500(100%) 3.600(100%)



A. Crisci

Figura 14.Variazioni di vari fattori di crescita nel tempo. Confronto tra L-PRF e PRGF+PPGF.I valori sono riportati come somme dei dosaggi consecutivi (modificata da Dohan Ehrenfest et al. 2012).

all’interno del coagulo PRF per parecchi giorni.Il PDGF-BB è quasi completamente contenutonegli α-granuli delle piastrine e viene rilasciatoal momento dell’attivazione, questo spiega per-ché la sua produzione è massima nel PRP e PRFattivati e si riduce nelle forme lente (Figura 9).È possibile che i valori ematologici rilevati nelsangue prelevato non possono essere utilizzatiper prevedere il rilascio immediato o lento deifattori di crescita nel PRF (McLellan et al. 2014).Nello studio di Dohan Ehrenfest et al. 2010, si èvoluto determinare la composizione cellulare el’organizzazione tridimensionale di questo bio-materiale autologo e l’utilità di provette diverse(vetro asciutto, vetro rivestito, plastica) ma tutte

senza gel. Circa il 97% delle piastrine e più del50% dei leucociti sono concentrati nel coagulodi PRF che ha mostrato una specifica distribu-zione tridimensionale. Le piastrine e la fibrinasono presenti in grosse quantità nei primi mil-limetri della membrana oltre il limite dei globu-li rossi. Non vi è differenza nell’architettura diPRF usando vari tipi di provette.

Analisi delle piastrine e dei leucociti

Quasi tutte le piastrine (> 97%) eranoassenti dalle provette dei gruppi testati dopo l’e-



strazione della membrana PRF. Nei gruppi testa-ti il livello di leucociti è sceso significativamen-te rispetto al gruppo di controllo (p < 0,01) epiù della metà dei leucociti sembrava essere

scomparso (Tabella 2). Le piastrine e i leucocitimancanti rimangono intrappolati nella matricedi PRF quando si usa il metodo di raccolta conle forbici. L’assenza di una differenza tra i duegruppi testati (p > 0,05) sembra indicare che labrutale compressione del coagulo non influen-za il possibile rilascio di corpi cellulari intrap-polati all’interno della matrice di fibrina. Nei gruppi testati la concentrazione di linfocitiè significativamente inferiore, mentre quella deigranulociti neutrofili è significativamente su -periore (p < 0,01) al gruppo di controllo (Ta -bella 3). Questo indicherebbe che i linfociti sonostati più degli altri leucociti intrappolati nellamatrice di PRF. Infine il volume medio delle pia-strine (MPV) è notevolmente ridotto nei gruppitestati rispetto ai gruppi di controllo (p < 0,01)ed è sceso da 9 μm3 (range: 8-11 μm3) nel san-gue intero a 4,7 μm3 (range: 4,5-5,8 μm3) neigruppi testati. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto all’au-mento dell’osmolarità plasmatica nelle provettedopo l'attivazione della cascata coagulativa.

Studio alla microscopia ottica

L’analisi istomorfometrica è stata effet-tuata utilizzando un microscopio ottico con uningrandimento totale di 100 ×. Un oculare da 10mm con un reticolo con 100 divisioni è stato uti-lizzato per misurare la percentuale di coperturadella lunghezza totale con almeno uno strato dicellule in ogni sezione. Con la colorazione hemalaun-eosina la matrice difibrina appare omogenea in colore rosa, mentregli aggregati piastrinici sono blu scuro/viola(Figura 15A-B). I GR e il citoplasma dei leucociti sono rosa scuroe non facilmente individuabili. Il nucleo dei leu-cociti sono colorati in blu con la hemalaun e nonsono facilmente distinguibili dagli aggregati pia-strinici. Con la tricromia di Masson (modificata daGodman) gli aggregati piastrinici sono ancora bluscuro, ma i GR sono facilmente identificabili per-ché colorati in rosso. I leucociti sono ancora diffi-cili da evidenziare dentro gli aggregati piastrinici,tuttavia la linea di demarcazione tra GR e aggre-gati piastrinici/leucociti è molto chiara (Figura15C-D). La linea di distinzione tra GR, leucociti e aggrega-ti piastrinici non è evidente.

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Figura 15.Analisi al microscopio ottico di coaguli di PRF. A e B) La colorazione hemalaun-eosina non è sufficiente per distin-guere i vari tipi di cellule intrappolate nella matrice di fibrina. C e D)Usando la colorazione tricromica di Masson è possibile facilmentedistinguere gli aggregati piastrinici separatamente dai leucociti (bluscuro) dai Globuli rossi (rosso). Ingrandimenti (G) (modificata daDohan Ehnrenfest et al. 2010).

Figura 16.A e B) La zona rossa del coagulo PRF (SEM) contiene molti G.R.intrappolati all’interno di un’immatura e molto sciolta matrice di fibrina (Ingr. A x 750, B x 2000) (modificata da Dohan Ehnrenfest etal. 2010).

A

A B

B

C D



spesse e dense. In essa è impossibile distingue-re gli elementi cellulari contenuti.

Analisi della distribuzione degli elementi corpuscolati

La più alta densità di piastrine e leu-cociti è stata trovata nel primo millimetro delcoagulo giallo a limite con quello rosso. La distribuzione di piastrine e leucociti diventapiù bassa man mano che ci si sposta alla fine delcoagulo e non sono state trovate più piastrine eleucociti oltre la prima metà del coagulo giallo.Nei primi 2 mm al di là del limite tra il coagulorosso e quello giallo la distribuzione delle pia-strine e di leucociti è abbastanza omogenea sututta la lunghezza del coagulo. Oltre questolimite, quanto più ci si sposta dal bordo gial-lo/rosso, più piastrine (e leucociti) sono rag-gruppate in vene di concentrazioni piastrinichecentrali o centrifughe. Queste vene presentanoun’alta densità di piastrine/leucociti all’internodi una matrice priva di cellule.Questa architettura è simile in tutti i coaguli,indipendentemente dai pazienti, dal tipo diprovette e dal metodo di compressione. Laconta piastrinica ha mostrato chiaramente chenon ci sono quasi piastrine lasciate nello stratodi GR, nel PPP e nell’essudato dopo la com-pressione del coagulo PRF. Così la maggior parte delle piastrine provenien-ti dal campione di sangue intero sono raccoltenella membrana PRF. La conta leucocitaria haconfermato che oltre la metà dei leucociti è

Valutazione al SEM

L’osservazione del coagulo PRF al SEMa piccolo ingrandimento (15×) ha dimostrato cheil coagulo presenta una concavità centrale che èun artefatto da fissazione. Nella parte rossa delcoagulo PRF, i coaguli presentano GR nella rete difibrina (Figura 16). I GR sono normali ma la rete di fibrina appareimmatura. Al limite tra la parte rossa e quellagialla del coagulo (area buffy coat), l’esame alSEM ha mostrato leucociti che appaiono comestrutture sferiche con superficie irregolare(Figura 16A). La maggioranza di questi è piccola (6-8 μm didiametro) e quindi potrebbe trattarsi principal-mente di linfociti. Aggregati piastrinici appaionolungo i filamenti di fibrina (Figura 6B). Al di là dell’area buffy coat si distinguono duediverse aree: la prima costituita da filamenti difibrina spessi e pochi GR sparsi, probabilmenteda contaminazione; la fibrina sembra esserematura (Figura 17); la seconda costituita da quel-la vena di piastrine addensata osservata al micro-scopio ottico, caratterizzata da piastrine e fibrinain ammassi densi e grandi dovuti ad ampiaaggregazione e coagulazione (Figura 18). Questo aggregato è costituito da una rete spessae solida e le piastrine sembrano altamente attiva-te durante il protocollo di preparazione di PRF. A un maggiore ingrandimento la fibrina è chia-ramente organizzata in fibre parallele molto

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A. Crisci

Figura 17.Esame al SEM del coagulo giallo di fibrinaha rivelato una fitta matrice di fibrina ma -tura con una bassissima quantità di corpiidentificabili (RBC, leucociti, aggregatipiastrinici) intrappolati. (Ingr. 2000) (modi-ficata da Dohan Ehnrenfest et al. 2010).

Figura 18.A e B) SEM Nelle vene biancastre all’interno del coagulo giallo, gliaggregati piastrinici erano strettamente uniti in una matrice di fibrina densa e matura. (Ingr. A x 1000; B x 1500) (modificata daDohan Ehnrenfest et al. 2010).

A B



intrappolata nella membrana PRF (Tabelle 2, 3)e i piccoli linfociti sembrano attratti in modoselezionato come confermato al SEM. Questileucociti non sembrano essere danneggiatidurante la preparazione di PRF. Questo risulta-to ha un forte impatto clinico poiché la quantitàdi leucociti impiantati all’interno della membra-na è considerevole e i piccoli linfociti sono par-ticolarmente efficienti nella regolazione dellereazioni infiammatorie. Inoltre, la composizio-ne cellulare dell’L-PRF implica che questo bio-materiale deve essere maneggiato con attenzio-ne per fare in modo che il contenuto cellulare simantenga vivo e stabile. Il microscopio fotonicoha dimostrato che la distribuzione piastrinica edei leucociti all’interno del coagulo non èuniforme. Le piastrine e i leucociti sono con-centrati nello strato che si trova tra il coagulorosso e il coagulo di fibrina e si dispongono for-mando un rivestimento macroscopico sullasuperficie del coagulo di PRF. Pertanto la partepiù utile da un punto di vista chirurgico è lostrato biancastro intermedio. Quindi è necessa-rio preservare un piccolo strato di GR all’estre-mità del coagulo di PRF che contiene la mag-gior parte di leucociti e piastrine. La proceduradeve essere eseguita con le forbici ed è operato-re-dipendente e ciò richiede una conoscenzaaccurata dell’architettura del PRF. La compres-sione leggera della matrice di fibrina determinache i filamenti di fibrina sono condensati eattaccati a vicenda. Quando le membrane PRFsono utilizzate in chirurgia il loro riassorbimen-to è lento e facilita il rimodellamento dellamatrice di fibrina in un tessuto cicatriziale.Per la standardizzazione della preparazione PRFcome materiale di innesto per la rigenerazionetissutale, proponiamo l’utilizzo della regionedelle membrane di PRF con il massimo arric-chimento piastrinico e, inoltre, non spremeretutto il plasma contenuto nel coagulo di PRF.Quindi è consigliabile comprimere il coagulocon un dispositivo di compressione (L-PRFWound Box). È difficile quindi controllare accuratamente la

qualità dei materiali di derivazione umana,come i preparati PRF, ma è molto importanteeffettuare il massimo livello di controllo di qua-lità sul PRF preparato prima della loro applica-zione clinica. Ulteriori studi clinici, istologici estatistici sono richiesti per comprendere i van-taggi di questa nuova concentrazione piastrini-ca. Tuttavia, non si può ignorare che, quandoottenuto da un campione di sangue autologo, ilPRF prodotto è scarso e solo un volume limita-to può essere utilizzato. Questo fatto limita l’u-tilizzazione sistematica di PRF in ChirurgiaGenerale. Anche se le potenziali applicazioni diPRF sono ampie, è necessaria un’accurata cono-scenza del funzionamento del biomateriale, lasua biologia, l’efficienza e i limiti, per ottimizza-re il suo utilizzo nella pratica clinica quotidiana(Chatterjee et al. 2014).

AbbreviazioniC-PRF Compressione di PRF con sistema di

compressioneEGF Fattore di crescita epidermicoFGF Fattore di crescita dei fibroblastiFPRP Preparato fresco di plasma ricco di

piastrineG-PRF Compressione di PRF con garzaHGF Fattore di crescita degli epatocitiHPC Concentrato di piastrine umanoIGF Insulin-like growth factorL-PRF Fibrina ricca di piastrine con leucocitiLPRP Plasma ricco di piastrine liofilizzatoMMP Matrice delle petalloproteasiPDGF Fattore di crescita derivato dalle pia-

strinePDWHF Fattori cicatrizzanti derivati da pia-

strine umane autologhe PRF Fibrina ricca di piastrinePPP Plasma privo di piastrinePPGF Plasma povero di fattori di crescitaP-PRF Fibrina ricca di piastrine puraP-PRP Plasma ricco di piastrine puroPRGF Plasma ricco di fattori ci crescita

= P PRPTGF Fattore di crescita trasformante

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N.B. L’Autore è responsabile di figure, tabelle e grafici presenti in questo articolo.



VEGF Fattore di crescita vascolare endoteliale.

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A. Crisci

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