m2 ion channel

Post on 29-May-2018

218 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • 8/9/2019 M2 Ion Channel

    1/13

    J O U R N A L O F V I R O L O G Y , M a r . 1 9 9 4 , p . 1 5 5 1 - 1 5 6 30 0 2 2 - 5 3 8 X / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t C o 1 9 9 4 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

    I n f l u e n z a A V i r u s M2 I o n C h a n n e l P r o t e i n :a S t r u c t u r e - F u n c t i o n A n a l y s i s

    LESLIE J . HOLSINGER,' DEEPALI NICHANI,' LAWRENCE H. PINTO,2 AND ROBERT A. LAMB3*D e p a r t n m e n t o f B i o c h l e m i s t r y , M o l e c u x l a r B i o l o g y a n d C e l l B i o l o g y , ' D e p a r t m e n t o f N e u r o b i o l o g y a n d P h y s i o l o g y , 2a n d Howard H u i g h e s M e d i c a l I n s t i t u t t e , 3 N o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y , E v a n s t o n , I l l i n o i s 6 0 2 0 8 - 3 5 0 0R e c e i v e d I I O c t o b e r 1 9 9 3 / A c c e p t e d 3 t ) November 1 9 9 3

    A s t r u c t u r e - f u n c t i o n a na l y s i s o f t h e i n f l u e n z a A v i r u s M2 i o n c h a n n e l p r o t e i n was p e r f o r m e d . T h e M2 p r o t e i no f human i n f l u e n z a v i r u s A / U d o r n / 7 2 and mutants c o n t a i n i n g c h a n g e s on one f a c e o f t he p u t a t i v e a h e l i x o ft h e M2 t r a n s m e m b r a n e ( T M ) d o m a i n , s e v e r a l o f w h i c h l e a d t o a m a n t a d i n e r e s i s t a n c e when f o u n d i n v i r u s , weree x p r e s s e d i n o o c y t e s o f X e n o p u s l a e v i s . T h e membrane c u r r e n t s o f o o c y t e s e x p r e s s i n g mutant M2 i o n c h a n n e l sw e r e m e a s u r e d a t b o t h n o r m a l a n d l o w p H , a n d t h e a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t mutant c o n t a i n i n g t h e c h a n g e o fa l a n i n e a t r e s i d u e 3 0 t o t h r e o n i n e was f o u n d t o h a v e a s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d l o w pH a c t i v a t i o n r e spon s e . Thes p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e c h a n n e l c u r r e n t o f t h e a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t mutants was i n v e s t i g a t e d b y m e a s u r i n g t h emembrane c u r r e n t o f i n d i v i d u a l o o c y t e s f o l l o w e d b y q u a n t i f i c a t i o n o f t h e amount o f M2 p r o t e i n e x p r e s s e d i nt h e s e s i n g l e o o c y t e s b y i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i s . Th e d a t a i n di c at e t h a t c h a n g i n g r e s i d u e s on t h i s f a c e o f t h ep u t a t i v e a h e l i x o f t h e M2 TM d o m a i n a l t e r s p r o p e r t i e s o f t h e M2 i o n c h a n n e l . Some o f t h e M2 p r o t e i n sc o n t a i n i n g c h a n g e s i n t h e TM d o m a i n w e r e f o u n d t o b e m o di f i ed b y a d d i t i o n o f an N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i na t an a s p a r a g i n e r e s i d u e t h a t i s membrane p r o x i m a l a n d w h i c h i s n o t m o d i f i e d i n t h e w i l d - t y p e M2 p r o t e i n .T h e s e N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i n s were f u r t h e r m o d i f i ed b y a d d i t i o n o f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n . A g l y c o s y -l a t e d M2 mutant p r o t e i n (M2+V, A 3 0 T ) e x h i b i t e d an i o n c h a n n e l a c t i v i t y w i t h a v o l t ag e -a ct i v at e d, t i m e -d e p e n d e n t k i n e t i c c o m p o n e n t . P r e v e nt i o n o f c a r b o h y d r a t e a d d i t i o n d i d n o t a f f e c t t h e a l t e r e d c h a n n e l a c t i v i t y .T h e a b i l i t y o f t h e M2 p r o t e i n t o t o l e r a t e d e l e t i o n s i n t h e TM d o m a i n was e x a m i n e d b y e x p r e s s i n g t h r e e mutants( d e l 2 9 - 3 1 , d e l 2 8 . . 3 1 , a n d d e l 2 7 . 3 1 ) c o n t a i n i n g d e l e t i o n s o f t h r e e , f o u r , a n d f i v e r e s i d u e s i n t h e TM d o m a i n . No i o nc h a n n e l a c t i v i t y was d e t e c t e d from e x p r e s s i o n o f M2 d e l 2 9 . 3 1 and del27-31, whereas expression ofM2d e 2 8 _ 3 ,r e s u l t e d i n an i o n c h a n n e l a c t i v i t y t h a t was a c t i v a t e d b y h y p e r p o l a r i z a t i o n ( a n d n o t l o w p H ) a n d was r e s i s t a n tt o a m a n t a d i n e b l o c k . E x a m i n a t i o n o f t h e o l i g o m e r i c f o r m o f M2 d e l 2 8 . 3 1 i n d i c a t e d t h a t t h e o l i g o m e r i s d i f f e r e n tf r o m w i l d - t y p e M 2 , a n d t h e d a t a w e r e c o ns i s t e nt w i t h M2 d e l 2 8 3 , f o r m i n g a p e n t a m e r .

    The influenza Avirus M2 p r o t e i n i s a s m a l l ( 9 7 - a m i n o - a c i dr e s i d u e ) t r a n s m e m b r a n e (TM) p r o t e i n w h i c h i s e n c o d e d b y as p l i c e d mRNA d e r i v e d f r o m g e n o m i c RNA segment 7 ( 2 0 , 2 3 ) .W h i l e t h e M, p r o t e i n i s a b u n d a n t l y e x p r e s s e d a t t h e p l a s m amembrane o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s , i t i s a c o m p a r a t i v e l y m i n o rcomponent o f v i r i o n s ( 2 4 , 4 4 ) . T h e M2 p r o t e i n c o n t a i n s t h r e ed o m a i n s : a 2 4 - r e s i d u e N - t e r m i n a l e x t r a c e l l u l a r d o m a i n , a1 9 - r e s i d u e s i g n a l a n c h o r TM d o m a i n , a n d a 5 4 - r e s i d u e c y t o -p l a s m i c t a i l ( 1 6 , 2 4 ) . M i n i m a l l y , t h e M2 p r o t e i n f o r m s ah o m o t e t r a m e r c o m p o s e d o f a p a i r o f d i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s o ra d i s u l f i d e - l i n k e d t e t r a m e r , w i t h t h e d i s u l f i d e b o n d s a c t i n g t os t a b i l i z e t h e o l i g o m e r ( 1 5 , 3 8 ) .The M2 p r o t e i n h a s b e e n p r o p o s e d t o f u n c t i o n as an i o nc h a n n e l t h a t p e r m i t s i o n s t o e n t e r e n d o c y t o s e d v i r i o n s a n d t of u n c t i o n as a m o d u l a t o r o f pH i n i n t r a c e l l u l a r compartments( 1 1 , 3 8 ) . D i r e c t e v i d e n c e t h a t t h e M2 p r o t e i n h a s i o n c h a n n e la c t i v i t y was o b t a i n e d b y e x p r e s s i n g t h e M2 p r o t e i n i n o o c y t e s o fX e n o p u s l a e v i s a n d m e a s u r i n g membrane c u r r e n t s ( 3 2 ) . T h eM, i o n c h a n n e l a c t i v i t y was f o u n d t o b e b l o c k e d b y t h ea n t i - i n f l u e n z a v i r u s d r u g a m a n t a d i n e h y d r o c h l o r i d e , t h e r e b yp r o v i d i n g d i r e c t e v i d e n c e f o r t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r t h ed r u g ( 3 2 ) . I n f l u e n z a v i r u s mutants r e s i s t a n t t o a m a n t a d i n ec o n t a i n a m i n o a c i d c h a n g e s i n t h e M, p r o t e i n TM d o m a i n( 1 2 ) , a n d when t h e a l t e r e d M2 proteins were e x p r e s s e d ino o c y t e s , t h e y e x h i b i t e d i o n c h a n n e l a c t i v i t i e s t h a t were n o t

    * C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . M a i l i n g a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m -i s t r y , M o l e c u l a r B i o l o g y a n d C e l l B i o l o g y , N o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y ,2 1 5 3 N . Campus D r . , E v a n s t o n , I L 6 0 2 0 8 - 3 5 0 0 . P h o n e : ( 7 0 8 ) 4 9 1 - 5 4 3 3 .F a x : ( 7 0 8 ) 4 9 1 - 2 4 6 7 . E l e c t r o n i c m a i l a d d r e s s : r a l a m b ( a n w u . e d u

    a f f e c t e d b y t h e d r u g ( 3 2 ) . The M, i o n c h a n n e l was f o u n d t o b ep e r m e a b l e t o Na + i o n s , a n d i t i s l i k e l y t h a t t h i s m o n o v a l e n tc a t i o n c o n d u c t a n c e a l s o e x t e n d s t o p r o t o n s ( 3 2 ) . S p e c i f i cc h a n g e s i n t h e M, p r o t e i n TM domain a l t e r e d t h e k i n e t i c s a n di o n s e l e c t i v i t y o f t h e c h an n el , p r o v i di n g s t r o n g e v i d e n c e t h a tt h e M, TM domain c on s t i tu t es t h e pore o f t h e c h a n n e l ( 3 2 ) .T h i s n o t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a t when a p e p t i d ec o r r e s p o n d i n g t o t h e M2 p r o t e i n TM domain was i n c o r p o r a t e di n t o p l a n a r m e m b r a n e s , a p r o t o n t r a n s l o c a t i o n s u s c e p t i b l e t ob l o c k b y a m a n t a d i n e c o u l d b e d e t e c t e d ( 5 ) . The M, i o nc h a n n e l a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e r e g u l a t e d b y c h a n g e s i n pH( 3 2 , 4 1 ) , w i t h t h e c h a n n e l b e i n g a c t i v a t e d a t t h e l o w e r e d pHf o u n d i n t r a l u m e n a l l y i n endosomes a n d t h e t r a n s G o l g i n e t -w o r k .

    I n t h e l i f e c y c l e o f i n f l u e n z a v i r u s , t h e M2 p r o t e i n i o nc h a n n e l a c t i v i t y i s t h o u g h t t o f u n c t i o n a t an e a r l y s t a g e b e t w e e nt h e s t e p s o f v i r u s p e n e t r a t i o n a n d u n c o a t i n g . I t i s g e n e r a l l yb e l i e v e d t h a t o n c e t h e v i r i o n p a r t i c l e h a s b e e n e n d o c y t o s e d ,t h e v i r i o n - a s s o c i a t e d i o n c h a n n e l p e r m i t s t h e f l o w o f i o n s f r o mt h e endosome i n t o t h e v i r i o n i n t e r i o r t o d i s r u p t p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a n d r e l e a s e t h e r i b o n u c l e o p r o t e i n s t r u c -t u r e f r o m t h e membrane ( m a t r i x ) ( M I ) p r o t e i n ( r e v i e w e d i nr e f e r e n c e 1 4 ) . In a d d i t i o n , f o r some s t r a i n s o f i n f l u e n z a v i r u sw h i c h h a v e a h e m a g g l u t i n i n (HA) t h a t i s c l e a v e d i n t r a c e l l u l a r l ya n d a h i g h pH optimum o f f u s i o n ( e . g . , f o w l p l a g u e v i r u s [ F P V ]R o s t o c k ) , t h e M, i o n c h a n n e l i s t h o u g h t t o f u n c t i o n i n t h e t r a n sG o l g i n e t w o r k t o m o d u l a t e pH s u c h t h a t i t r e m a i n s a b o v e t h et h r e s h o l d n e e d e d t o i n d u c e t h e a c i d pH t r a n s i t i o n o f HA ( 2 , 3 ,9 , 1 0 , 2 8 , 3 7 , 3 9 ) .The M. p r o t

View more