m2 ion channel

8/9/2019 M2 Ion Channel

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J O U R N A L O F V I R O L O G Y , M a r . 1 9 9 4 , p . 1 5 5 1 - 1 5 6 30 0 2 2 - 5 3 8 X / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t C o 1 9 9 4 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

I n f l u e n z a A V i r u s M2 I o n C h a n n e l P r o t e i n :a S t r u c t u r e - F u n c t i o n A n a l y s i s

LESLIE J . HOLSINGER,' DEEPALI NICHANI,' LAWRENCE H. PINTO,2 AND ROBERT A. LAMB3*D e p a r t n m e n t o f B i o c h l e m i s t r y , M o l e c u x l a r B i o l o g y a n d C e l l B i o l o g y , ' D e p a r t m e n t o f N e u r o b i o l o g y a n d P h y s i o l o g y , 2a n d Howard H u i g h e s M e d i c a l I n s t i t u t t e , 3 N o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y , E v a n s t o n , I l l i n o i s 6 0 2 0 8 - 3 5 0 0R e c e i v e d I I O c t o b e r 1 9 9 3 / A c c e p t e d 3 t ) November 1 9 9 3

A s t r u c t u r e - f u n c t i o n a na l y s i s o f t h e i n f l u e n z a A v i r u s M2 i o n c h a n n e l p r o t e i n was p e r f o r m e d . T h e M2 p r o t e i no f human i n f l u e n z a v i r u s A / U d o r n / 7 2 and mutants c o n t a i n i n g c h a n g e s on one f a c e o f t he p u t a t i v e a h e l i x o ft h e M2 t r a n s m e m b r a n e ( T M ) d o m a i n , s e v e r a l o f w h i c h l e a d t o a m a n t a d i n e r e s i s t a n c e when f o u n d i n v i r u s , weree x p r e s s e d i n o o c y t e s o f X e n o p u s l a e v i s . T h e membrane c u r r e n t s o f o o c y t e s e x p r e s s i n g mutant M2 i o n c h a n n e l sw e r e m e a s u r e d a t b o t h n o r m a l a n d l o w p H , a n d t h e a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t mutant c o n t a i n i n g t h e c h a n g e o fa l a n i n e a t r e s i d u e 3 0 t o t h r e o n i n e was f o u n d t o h a v e a s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d l o w pH a c t i v a t i o n r e spon s e . Thes p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e c h a n n e l c u r r e n t o f t h e a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t mutants was i n v e s t i g a t e d b y m e a s u r i n g t h emembrane c u r r e n t o f i n d i v i d u a l o o c y t e s f o l l o w e d b y q u a n t i f i c a t i o n o f t h e amount o f M2 p r o t e i n e x p r e s s e d i nt h e s e s i n g l e o o c y t e s b y i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i s . Th e d a t a i n di c at e t h a t c h a n g i n g r e s i d u e s on t h i s f a c e o f t h ep u t a t i v e a h e l i x o f t h e M2 TM d o m a i n a l t e r s p r o p e r t i e s o f t h e M2 i o n c h a n n e l . Some o f t h e M2 p r o t e i n sc o n t a i n i n g c h a n g e s i n t h e TM d o m a i n w e r e f o u n d t o b e m o di f i ed b y a d d i t i o n o f an N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i na t an a s p a r a g i n e r e s i d u e t h a t i s membrane p r o x i m a l a n d w h i c h i s n o t m o d i f i e d i n t h e w i l d - t y p e M2 p r o t e i n .T h e s e N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i n s were f u r t h e r m o d i f i ed b y a d d i t i o n o f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n . A g l y c o s y -l a t e d M2 mutant p r o t e i n (M2+V, A 3 0 T ) e x h i b i t e d an i o n c h a n n e l a c t i v i t y w i t h a v o l t ag e -a ct i v at e d, t i m e -d e p e n d e n t k i n e t i c c o m p o n e n t . P r e v e nt i o n o f c a r b o h y d r a t e a d d i t i o n d i d n o t a f f e c t t h e a l t e r e d c h a n n e l a c t i v i t y .T h e a b i l i t y o f t h e M2 p r o t e i n t o t o l e r a t e d e l e t i o n s i n t h e TM d o m a i n was e x a m i n e d b y e x p r e s s i n g t h r e e mutants( d e l 2 9 - 3 1 , d e l 2 8 . . 3 1 , a n d d e l 2 7 . 3 1 ) c o n t a i n i n g d e l e t i o n s o f t h r e e , f o u r , a n d f i v e r e s i d u e s i n t h e TM d o m a i n . No i o nc h a n n e l a c t i v i t y was d e t e c t e d from e x p r e s s i o n o f M2 d e l 2 9 . 3 1 and del27-31, whereas expression ofM2d e 2 8 _ 3 ,r e s u l t e d i n an i o n c h a n n e l a c t i v i t y t h a t was a c t i v a t e d b y h y p e r p o l a r i z a t i o n ( a n d n o t l o w p H ) a n d was r e s i s t a n tt o a m a n t a d i n e b l o c k . E x a m i n a t i o n o f t h e o l i g o m e r i c f o r m o f M2 d e l 2 8 . 3 1 i n d i c a t e d t h a t t h e o l i g o m e r i s d i f f e r e n tf r o m w i l d - t y p e M 2 , a n d t h e d a t a w e r e c o ns i s t e nt w i t h M2 d e l 2 8 3 , f o r m i n g a p e n t a m e r .

The influenza Avirus M2 p r o t e i n i s a s m a l l ( 9 7 - a m i n o - a c i dr e s i d u e ) t r a n s m e m b r a n e (TM) p r o t e i n w h i c h i s e n c o d e d b y as p l i c e d mRNA d e r i v e d f r o m g e n o m i c RNA segment 7 ( 2 0 , 2 3 ) .W h i l e t h e M, p r o t e i n i s a b u n d a n t l y e x p r e s s e d a t t h e p l a s m amembrane o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s , i t i s a c o m p a r a t i v e l y m i n o rcomponent o f v i r i o n s ( 2 4 , 4 4 ) . T h e M2 p r o t e i n c o n t a i n s t h r e ed o m a i n s : a 2 4 - r e s i d u e N - t e r m i n a l e x t r a c e l l u l a r d o m a i n , a1 9 - r e s i d u e s i g n a l a n c h o r TM d o m a i n , a n d a 5 4 - r e s i d u e c y t o -p l a s m i c t a i l ( 1 6 , 2 4 ) . M i n i m a l l y , t h e M2 p r o t e i n f o r m s ah o m o t e t r a m e r c o m p o s e d o f a p a i r o f d i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s o ra d i s u l f i d e - l i n k e d t e t r a m e r , w i t h t h e d i s u l f i d e b o n d s a c t i n g t os t a b i l i z e t h e o l i g o m e r ( 1 5 , 3 8 ) .The M2 p r o t e i n h a s b e e n p r o p o s e d t o f u n c t i o n as an i o nc h a n n e l t h a t p e r m i t s i o n s t o e n t e r e n d o c y t o s e d v i r i o n s a n d t of u n c t i o n as a m o d u l a t o r o f pH i n i n t r a c e l l u l a r compartments( 1 1 , 3 8 ) . D i r e c t e v i d e n c e t h a t t h e M2 p r o t e i n h a s i o n c h a n n e la c t i v i t y was o b t a i n e d b y e x p r e s s i n g t h e M2 p r o t e i n i n o o c y t e s o fX e n o p u s l a e v i s a n d m e a s u r i n g membrane c u r r e n t s ( 3 2 ) . T h eM, i o n c h a n n e l a c t i v i t y was f o u n d t o b e b l o c k e d b y t h ea n t i - i n f l u e n z a v i r u s d r u g a m a n t a d i n e h y d r o c h l o r i d e , t h e r e b yp r o v i d i n g d i r e c t e v i d e n c e f o r t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r t h ed r u g ( 3 2 ) . I n f l u e n z a v i r u s mutants r e s i s t a n t t o a m a n t a d i n ec o n t a i n a m i n o a c i d c h a n g e s i n t h e M, p r o t e i n TM d o m a i n( 1 2 ) , a n d when t h e a l t e r e d M2 proteins were e x p r e s s e d ino o c y t e s , t h e y e x h i b i t e d i o n c h a n n e l a c t i v i t i e s t h a t were n o t

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . M a i l i n g a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m -i s t r y , M o l e c u l a r B i o l o g y a n d C e l l B i o l o g y , N o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y ,2 1 5 3 N . Campus D r . , E v a n s t o n , I L 6 0 2 0 8 - 3 5 0 0 . P h o n e : ( 7 0 8 ) 4 9 1 - 5 4 3 3 .F a x : ( 7 0 8 ) 4 9 1 - 2 4 6 7 . E l e c t r o n i c m a i l a d d r e s s : r a l a m b ( a n w u . e d u

a f f e c t e d b y t h e d r u g ( 3 2 ) . The M, i o n c h a n n e l was f o u n d t o b ep e r m e a b l e t o Na + i o n s , a n d i t i s l i k e l y t h a t t h i s m o n o v a l e n tc a t i o n c o n d u c t a n c e a l s o e x t e n d s t o p r o t o n s ( 3 2 ) . S p e c i f i cc h a n g e s i n t h e M, p r o t e i n TM domain a l t e r e d t h e k i n e t i c s a n di o n s e l e c t i v i t y o f t h e c h an n el , p r o v i di n g s t r o n g e v i d e n c e t h a tt h e M, TM domain c on s t i tu t es t h e pore o f t h e c h a n n e l ( 3 2 ) .T h i s n o t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a t when a p e p t i d ec o r r e s p o n d i n g t o t h e M2 p r o t e i n TM domain was i n c o r p o r a t e di n t o p l a n a r m e m b r a n e s , a p r o t o n t r a n s l o c a t i o n s u s c e p t i b l e t ob l o c k b y a m a n t a d i n e c o u l d b e d e t e c t e d ( 5 ) . The M, i o nc h a n n e l a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e r e g u l a t e d b y c h a n g e s i n pH( 3 2 , 4 1 ) , w i t h t h e c h a n n e l b e i n g a c t i v a t e d a t t h e l o w e r e d pHf o u n d i n t r a l u m e n a l l y i n endosomes a n d t h e t r a n s G o l g i n e t -w o r k .

I n t h e l i f e c y c l e o f i n f l u e n z a v i r u s , t h e M2 p r o t e i n i o nc h a n n e l a c t i v i t y i s t h o u g h t t o f u n c t i o n a t an e a r l y s t a g e b e t w e e nt h e s t e p s o f v i r u s p e n e t r a t i o n a n d u n c o a t i n g . I t i s g e n e r a l l yb e l i e v e d t h a t o n c e t h e v i r i o n p a r t i c l e h a s b e e n e n d o c y t o s e d ,t h e v i r i o n - a s s o c i a t e d i o n c h a n n e l p e r m i t s t h e f l o w o f i o n s f r o mt h e endosome i n t o t h e v i r i o n i n t e r i o r t o d i s r u p t p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a n d r e l e a s e t h e r i b o n u c l e o p r o t e i n s t r u c -t u r e f r o m t h e membrane ( m a t r i x ) ( M I ) p r o t e i n ( r e v i e w e d i nr e f e r e n c e 1 4 ) . In a d d i t i o n , f o r some s t r a i n s o f i n f l u e n z a v i r u sw h i c h h a v e a h e m a g g l u t i n i n (HA) t h a t i s c l e a v e d i n t r a c e l l u l a r l ya n d a h i g h pH optimum o f f u s i o n ( e . g . , f o w l p l a g u e v i r u s [ F P V ]R o s t o c k ) , t h e M, i o n c h a n n e l i s t h o u g h t t o f u n c t i o n i n t h e t r a n sG o l g i n e t w o r k t o m o d u l a t e pH s u c h t h a t i t r e m a i n s a b o v e t h et h r e s h o l d n e e d e d t o i n d u c e t h e a c i d pH t r a n s i t i o n o f HA ( 2 , 3 ,9 , 1 0 , 2 8 , 3 7 , 3 9 ) .The M. p r o t e i n s equence d o e s n o t i n d i c a t e any o b v i o u s

1 5 5 1

V o l . 6 8 , N o . 3


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1 5 5 2 HOLSINGER ET A L .h o m o l o g y w i t h o t h e r p r o t e i n s f o u n d i n t h e d a t a b a s e o f p ro t ei nsequences. I n a d d i t i o n , t h e M2 p r o t e i n i s a m i ni m al i s t i c i o nc h a n n e l , a s i t c o nt a i ns o n l y a s i n g l e TM d o m a i n , i n c o m p a r i s o nw i t h t h e m a j o r i t y o f i o n c h an n el s ( re v i ew e d i n r e f e r e n c e 2 6 ) .T h u s , we w e r e i n t e r e s t e d i n p e r f o r m i n g a d e t a i l e d s t r u c t u r e -f u n c t i o n a n a l y s i s o f t h e M2 p r o t e i n . We d e s c r i b e h e r e proper-t i e s o f a l t e r e d M2 m o l e c u l e s e x p e c t e d t o b e r e s i s t a n t t oa m a n t a d i n e , p r o p e r t i e s o f a l t e r e d M2 m o l e c u l e s t h a t ar eg l y c o s y l a t e d , a n d p r o p e r t i e s o f a l t e r e d M2 m o l e c u l e s c o n t a i n -i n g d e l e t i o n s i n t h e TM d o m a i n . The p r o p e r t i e s o f t h e s ea l t e r e d M2 m o l e c u l e s ar e d i s c u s s e d i n t e r m s o f p o s s i b l e i o nc h a n n e l m o l e c u l a r a r c h i t e c t u r e .

MATERIALS AND METHODSS i t e - s p e c i f i c m u t a g e n e s i s , c o n s t r u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s -m i d s , a n d i n v i t r o RNA s y n t h e s i s . The cDNA t o i n f l u e n z a v i r u sA / U d o r n / 7 2 mRNA ( 1 6 , 4 5 ) w a s c l o n e d e i t h e r i n t o t h e BamHIs i t e o f t h e r e p l i c a t i v e f o r m o f M13mpl9 a n d u s e d as a t e m p l a t eDNA f o r s i t e - s p e c i f i c m u t a g e n e s i s ( 1 5 ) o r i n t o t h e BamHI s i t e

o f pGEM3Zf(+) a n d u s e d a s a t e m p l a t e f o r p h a g e m i d - b a s e dm u t a g e n e s i s ( 3 1 ) . O l i g o n u c l e o t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d b y t h eN o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y B i o t e c h n o l o g y F a c i l i t y o n a DNAs y n t h e s i z e r ( m o d e l 3 8 0 B ; A p p l i e d B i o s y s t e m s , I n c . , F o s t e rC i t y , C a l i f . ) . M u t a n t cDNAs e n c o d i n g t h e a l t er ed M2 genesw e r e e x c i s e d f r o m t h e r e p l i c a t i v e f o r m o f M13 b y BamHId i g e s t i o n a n d s u b c l o n ed i n t o t h e BamHI s i t e o f a pGEM3v e c t o r s u c h t h a t mRNA sense t r a n s c r i p t s c o u l d b e g e n e r a t e db y u s i n g t h e b a c t e r i o p h a g e T7 RNA p o l y m e r a s e p r o m o t e r a n dT 7 p o l y m e r a s e . The n u c l e o t i d e sequences o f t he a l te r e dcDNAs i n b o t h t h e pGEM3 v e c t o r a n d pGEM3Zf(+) p h a g e -m i d v e c t o r w e r e c o n f i r m e d b y d i d e o x y n u c l e o t i d e c h a i n - t e r m i -n a t i n g s e q u e n c i n g ( 3 4 ) . F o r i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n , p l a s m i dDNAs w e r e l i n e a r i z e d d o w n s t r e a m o f t he T7 p r o m o t e r a n d t h eM2 cDNA w i t h X b a I . I n v i t r o s y n t h e s i s a n d q u a n t i t a t i o n o f7 m G ( 5 ' ) p p p ( 5 ' ) G - c a p p e d mRNA was c a r r i e d o u t as d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 3 2 ) .M i c r o i n j e c t i o n a n d c u l t u r e o f o o c y t e s . O v a r i a n l o b u l e s f r o mX l a e v i s f e m a l e s ( N a s c o , F o r t A t k i n s o n , W i s . ) w e r e s u r g i c a l l yr e m o v e d a n d t r e a t e d w i t h c o l l a g e n a s e B ( 2 m g / m l ; B o e h r i n g e rMannheim B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I n d . ) ( 3 2 ) . S e l e c t e do o c y t e s ( s t a g e s V a n d V I ) w e r e i n j e c t e d w i t h 5 0 n l o f RNA ( 1 . 0j i g / p l A ) b y u s i n g a 2 0 - j i m - d i a m e t e r g l a s s p i p e t t e , a n d o o c y t e sw e r e m a i n t a i n e d i n ND96 ( 3 2 ) a t 1 7 C .M e t a b o l i c l a b e l i n g o f i n j e c t e d o o c y t e s , i m m u n o b l o t t i n ga n a l y s i s , i m m u n o p r e c i p i t a t i o n , a n d SDS-PAGE. F o r immuno-p r e c i p i t a t i o n s , o o c y t e s were i n c u b a t e d i n ND96 s u p p l e m e n t e dw i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e ( 2 5 0 , i C i / m l ; Amersham C o r p . , A r l i n g -t o n H e i g h t s , I l l . ) f r o m 2 4 t o 4 8 h p o s t i n j e c t i o n . L a b e l e d o o c y t e swere h o m o g e n i z e d i n , pe r o o c y t e , 7 5 j i l o f r a d i o i m m u n o p r e -c i p i t a t i o n assay ( R I P A ) b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 mM i o d o a c e t -a m i d e a n d a c o c k t a i l o f p r o t e a s e i n h i b i t o r s ( p h e n y l m e t h y l s u l -f o n y l f l u o r i d e , a p r o t i n i n , a n t i p a i n , p e p s t a t i n A , l e u p e p t i n , andc h y m o s t a t i n ) ( 3 0 ) , a n d e x t r a c t s were i m m u n o p r e c i p i t a t e d ( 2 1 )w i t h M 2 - s p e c i f i c 1 4 C 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d y a s c i t e s f l u i d ( 4 4 ) .S a m p l e s were a n a l y z e d b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) -p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s (PAGE) on 1 7 . 5 % p o l y -a c r y l a m i d e - 4 M ur ea g e l s a n d p r o c e s s e d f o r f l u o r o g r a p h y a n da u t o r a d i o g r a p h y as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 9 ) . F o r immuno-b l o t t i n g o f s i n g l e o o c y t e l y s a t e s , i n d i v i d u a l u n l a b e l e d o o c y t e sw e r e l y s e d i n 1 0 0 j il o f RIPA b u f f e r a n d e x t r a c t e d o n c e w i t h1 , 1 , 2 - t r i c h l o r o t r i f l u o r o e t h a n e t o remove y o l k a n d p i g m e n tp r o t e i n s . F i v e t o 1 0 j il o f l y s a t e s was a n a l y z e d on 1 7 . 5 %p o l y a c r y l a m i d e - 4 Mu r e a g e l s a n d e l e c t r o t r a n s f e r r e d t o p o l y -v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e membranes ( M i l l i p o r e , B e df o r d, M a s s .)b y u s i n g a T r a n s - B l o t s e m i d r y t r a n s f e r c e l l ( B i o - R a d , R i c h -

m o n d , C a l i f . ) . F i l t e r s w e r e i n c u b a t e d w i t h 5% p o w d e r e dm i l k - 0 . 3 % Tween 2 0 - p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) f o r 6 0m i n t o b l o c k n o n s p e c i f i c s i t e s a n d t h e n i n c u b a t e d f o r 6 0 m i nw i t h a 1 : 3 , 0 0 0 d i l u t i o n o f M 2 - s p e c i f i c 1 4 C 2 a s c i t e s f l u i d ( 4 4 ) .F i l t e r s w e r e w a s h e d i n P B S - 0 . 3 % Tween 2 0 a n d i n c u b a t e d f o r6 0 m i n w i t h a 1 : 1 , 0 0 0 d i l u t i o n o f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e -c o n j u g a t e d g o a t a n t i - m o u s e i m m u n o g l o b u l i n G s e c o n d a r ya n t i b o d y ( C a p p e l , O r g a n o n T e k n i k a , M a l v e r n , P a . ) . B l o t s weree x t e n s i v e l y w a s h e d i n PBS w i t h 0 . 3 % Tween 2 0 , a n d t h e M2p r o t e i n immune c o m p l e x w a s d e t e c t e d w i t h t h e ECL ( e n -h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ) s y s t e m ( A m e r s h a m I n t e r n a t i o n a l ,A r l i n g t o n H e i g h t s , I l l . ) . A u t o r a d i o g r a p h y was p e r f o r m e d b yu s i n g p r e f l a s h e d X - r a y f i l m ( 2 5 ) a n d q u a n t i t a t e d b y l a s e rs c a n n i n g d e n s i t o m e t r y on a n LKB U l t r o s c a n XL d e n s i t o m e t e r( P h a r m a c i a - L K B , P i s c a t a w a y , N . J . ) . F o r q u a n t i f i c a t i o n o fb l o t s , 5 0 t o 4 0 0 p g o f p u r i f i e d M2 p r o t e i n , t h e p r e c i s e amountd e p e n d i n g on t h e M2 m u t a n t u n d e r a n a l y s i s , was r u n w i t h a l ls a m p l e s i n o r d e r t o g e n e r a t e a s t a n d a r d c u r v e . M2 p r o t e i n wasp u r i f i e d f r o m d e t e r g e n t l y s a t e s o f i n f l u e n z a v i r u s A / U d o r n / 7 2 -i n f e c t e d C V - 1 c e l l s b y i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n gM 2 - s p e c i f i c p u r i f i e d 1 4 C 2 i m m u n o g l o b u l i n G c o u p l e d t oC N B r - a c t i v a t e d S e p h a r o s e 4B ( 1 5 ) .

E n d o - , - g a l a c t o s i d a s e d i g e s t i o n s a n d t u n i c a m y c i n t r e a t -m e n t . P r o t e i n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d , a n d p r o t e i n A -S e p h a r o s e a n t i b o d y - a n t i g e n c o m p l e x e s were b o i l e d i n 2 0 [ L o f1 0 mM T r i s ( p H 7 . 4 ) - 0 . 2 % SDS f o r 4 m i n , d i l u t e d w i t h a ne q u a l v o l u m e o f a s s a y b u f f e r ( 0 . 1 M s o d i u m a c e t a t e [ p H 5 . 5 1 ,7 0 mM N a C l ) , a n d i n c u b a t e d w i t h 2 0 mU o f e n d o - p - g a l a c t o -s i d a s e ( I C N I m m u n o B i o l o g i c a l s , C o s t a M e s a , C a l i f . ) s u s -p e n d e d i n 2 0 [ l o f a s s a y b u f f e r f o r 1 6 h a t 3 7 C . F o rt u n i c a m y c i n t r e a t m e n t o f o o c y t e s , mRNAs were m i x e d w i t ht u n i c a m y c i n ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 , u g / m l , made f r o m a1 - m g / m l s t o c k i n d i m e t h y l s u l f o x i d e ; C a l b i o c h e m - B e h r i n gC o r p . , L a J o l l a , C a l i f . ) p r i o r t o i n j e c t i o n , a n d i n j e c t e d o o c y t e sw e r e i n c u b a t e d i n ND96 c o n t a i n 2 j i g o f t u n i c a m y c i n p e r m ld u r i n g m e t a b o l i c l a b e l i n g . O o c y t e s were t h e n h o m o g e n i z e d ,a n d e x t r a c t s were i m m u n o p r e c i p i t a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e .C h e m i c a l c r o s s - l i n k i n g . F o r a n a l y s i s o f t h e o l i g o m e r i c f o r mo f w i l d - t y p e ( w t ) M2 a n d M2 d e 2 8 - 3 1 p r o t e i n s , h o m o b i f u n c -t i o n a l c r o s s - l i n k i n g r e a g e n t s were u s e d . T h e p r o t e i n s w e r ee x p r e s s e d i n C V - 1 c e l l s b y u s i n g s i m i a n v i r u s 4 0 ( S V 4 0 )r e c o m b i n a n t s . B o t h t h e w t a n d mutant M2 cDNAs weres u b c l o n e d i n t o t h e BamHI s i t e o f t h e S V 4 0 VP1 r e p l a c e m e n tv e c t o r p S V 7 3 E / K ( 4 5 ) s u c h t h a t t h e M2 cDNA was u n d e r t h ec o n t r o l o f t h e S V 4 0 l a t e - r e g i o n p r o m o t e r , s p l i c i n g , a n d p o l y -a d e n y l a t i o n s i t e s . S V 4 0 r e c o m b i n a n t v i r u s s t o c k s were p r o -d u c e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 2 ) . S V 4 0 r e c o m b i -n a n t v i r u s - i n f e c t e d C V - 1 c e l l s were l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] c y s t e i n e( 1 0 0 p L C i / m l ) i n D u l b e c c o m o d i f i e d E a g l e medium d e f i c i e n t i nc y s t e i n e f r o m 4 5 t o 4 8 h p o s t i n f e c t i o n . C e l l s were l y s e d i n 1%N o n i d e t P - 4 0 - 5 0 mM T r i s - H C I ( p H 8 . 0 ) - 1 0 0 mM N a C l - 5 0mM i o d o a c e t a m i d e a n d i n c u b a t e d w i t h a n d w i t h o u t d i t h i o - b i s( s u c c i n i m i d y l p r o p i o n a t e ) ( D S P ; f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 m g /m l , f r o m a 5 0 - m g / m l s t o c k i n d i m e t h y l s u l f o x i d e ; P i e r c eC h e m i c a l C o . , R o c k f o r d , I l l . ) f o r 3 0 m i n a t 4 C . R e a c t i o n sw e r e s t o p p e d b y a d d i t i o n o f g l y c i n e ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 6 0m M ) . L y s a t e s w e r e c l a r i f i e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g a n d i m m u n o p r e -c i p i t a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . I n a d d i t i o n , c r o s s - l i n k i n g w asp e r f o r m e d on i n t a c t c e l l s . M o n o l a y e r s o f r a d i o a c t i v e l y l a b e l e dv i r u s - i n f e c t e d c e l l s w e r e w a s h e d w i t h c o l d PBS a n d i n c u b a t e dw i t h e t h y l e n e g l y c o l - b i s ( s u c c i n i m i d l y s u c c i n a t e ) ( E G S ; f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 1 m g / m l , f r o m a 5 0 m g / m l s t o c k i n d i m e t h y ls u l f o x i d e ; P i e r c e ) a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 4 C . E x c e s sc r o s s - l i n k e r was n e u t r a l i z e d w i t h 6 0 mM g l y c i n e ; m o n o l a y e r sw e r e w a s h e d i n P B S , l y s e d i n 1% N o n i d e t P - 4 0 - 5 0 mMT r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) - 1 0 0 mM N a C l - 5 0 mM i o d o a c e t a m i d e ,

J . V I R O L .


3/13

INFLUENZA VIRUS M. PROTEIN ION CHANNEL ACTIVITYc l a r i f i e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g , a n d i m m u n o p r e c i p i t a t e d a s d e s c r i b e da b o v e .S u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t s e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s . S e d i m e n -t a t i o n a n a l y s i s o f t h e o l i g o m e r i c f o r m s o f M, w a s p e r f o r m e de s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 5 , 2 7 ) , w i t h t h e f o l l o w i n gm o d i f i c a t i o n s . R e c o m b i n a n t S V 4 0 - i n f e c t e d C V - 1 c e l l s w e r el a b e l e d w i t h [ 1 3 5 S ] c y s t e i n e a t 4 8 h p o s t i n f e c t i o n f o r 2 h a n dl y s e d i n MNT b u f f e r ( 2 0 mM m o r p h o l i n e e t h a n e s u l f o n i c a c i d[ M E S ] , 3 0 mM T r i s - H C l , 1 0 0 mM N a C l [ p H 7 . 0 ] , 1% T r i t o nX - 1 0 0 , 5 0 mM i o d o a c e t a m i d e , p r o t e a s e i n h i b i t o r s ) . L y s a t e sw e r e c r o s s - l i n k e d w i t h DSP ( 1 m g / m l ) a s d e s c r i b e d a b o v e , a n dn u c l e i a n d c e l l d e b r i s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 5 5 , 0 0 0r p m , 1 0 m i n , 4 C ) i n a T LA 1 0 0. 2 r o t o r ( B e c k m a n I n s t r u m e n t sI n c . , P a l o A l t o , C a l i f . ) . L y s a t e s w e r e l a y e r e d o n t o a n 1 1 - m lc o n t i n u o u s 5 t o 15% ( w t / v o l ) s u c r o s e g r a d i e n t i n MNT b u f f e r -0 . 1 % T r i t o n X - 1 0 0 t h a t o v e r l a i d a 0 . 7 5 - m l 60 % s u c r o s ec u s h i o n . S e d i m e n t a t i o n w a s d o n e i n a n SW41 r o t o r ( B e c k m a n )a t 3 8 , 0 0 0 rpm a t 2 0 C f o r 2 4 h . T w e n t y - f o u r 0 . 5 - m l f r a c t i o n sw e r e c o l l e c t e d d r o p w i s e f r o m t h e b o t t o m o f t h e t u b e , d i l u t e di n RIPA b u f f e r , a n d i m m u n o p r e c i p i t a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e .I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . O o c y t e s w e r e i n -j e c t e d w i t h M2 mRNAs a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 t o 7 2 h a t 1 7 C a sd e s c r i b e d a b o v e . O o c y t e s w e r e f r o z e n b y p l u n g i n g i n t o i s o p e n -t a n e c o o l e d t o - 1 7 0 C o v e r l i q u i d n i t r o g e n a n d t h e n e m b e d -d e d , a n d 1 0 - p . m s e c t i o n s w e r e c u t o n a c r y o s t a t ( B r i g h tI n s t r u m e n t C o . , H u n t i n g d o n , E n g l a n d ) a t - 2 2 C . S e c t i o n sw e r e c o l l e c t e d o n g e l a t i n - c o a t e d s l i d e s a n d a i r d r i e d . D r i e ds e c t i o n s w e r e f i x e d i n 1 % f o r m a l d e h y d e a n d s t a i n e d w i t ha n t i b o d y ( 4 4 ) . F i x e d s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h M 2 - s p e c i f i c1 4 C 2 a s c i t e s f l u i d ( d i l u t e d 1 : 3 0 0 i n P B S - 1 % b o v i n e s e r u ma l b u m i n ) a n d i n c u b a t e d w i t h f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e( F I T C ) - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - m o u s e s e c o n d a r y a n t i b o d y . P h o -t o m i c r o s c o p y w a s p e r f o r m e d b y u s i n g a N i k o n M i c r o p h o t -FXA m i c r o s c o p e ( N i k o n , I n c . , M e l v i l l e , N . Y . ) . A l l p h o t o -g r a p h i c e x p o s u r e t i m e s w e r e e q u i v a l e n t .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s . W h o l e - c e l l c u r r e n t s w e r er e c o r d e d f r o m o o c y t e s 4 9 t o 7 2 h a f t e r mRNA i n j e c t i o n w i t h at w o - e l e c t r o d e v o l t a g e c l a m p a p p a r a t u s ( 3 2 ) . A m a n t a d i n e h y -d r o c h l o r i d e (1 0 mM s t o c k i n w a t e r ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t .L o u i s , M o . ) w a s d i l u t e d a s i n d i c a t e d .

RESULTSE x p r e s s i o n i n o o c y t e s o f m u t a n t M2 p r o t e i n s w i t h c h a n g e so n o n e f a c e o f t h e p u t a t i v e a - h e l i c a l TM d o m a i n . I f t h e M2p r o t e i n TM d o m a i n i s m o d e l e d a s a n o x h e l i x , M2 p r o t e i nr e s i d u e s V - 2 7 , A - 3 0 , S - 3 1 , G - 3 4 , L - 3 8 , a n d W - 4 1 l i e o n t h es a m e f a c e o f t h e o x h e l i x , a n d m u t a t i o n s a t r e si du e s V - 2 7 , A - 3 0 ,S - 3 1 , G - 3 4 , a n d L - 3 8 l e a d t o i o n c h a n n e l s w i t h a l t e r e d a c t i v i t ya n d a l t e r e d s u s c e p t i b i l i t y t o a m a n t a d i n e ( 9 , 3 2 , 4 1 ) . To b e g i n as t r u c t u r e f u n c t i o n a n a l y s i s o f t h e r e s i d u e s i n t h e humani n f l u e n z a v i r u s ( A / U d o r n / 7 2 ) M , p r o t e i n TM d o m a i n , t h e pHa c t i v a t i o n r e s p o n s e o f t h e a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t m u t a n t sV 2 7 A , V 2 7 S , A 3 0 T , S 3 1 N ( 3 2 ) w a s t e s t e d , a n d t h e a m a n t a d i n es e n s i t i v i t y a n d pH a c t i v a t i o n o f a d d i t i o n a l m u t a t i o n s i n t h eU d o r n M2 p r o t e i n c o n t a i n i n g t h e c h a n g e s V 2 7 T , A 3 0 P , a n dG 3 4 E , a n d W 4 1 A ( F i g . I A) w e r e e x a m i n e d . T h e c h a n g e s 1 2 7 S ,1 2 7 T , 1 2 7 A , V 2 7 A , V 2 7 D , A 3 0 E , A 3 0 P , S 3 1 N , a n d G34E h a v eb e e n f o u n d t o a r i s e n a t u r a l l y i n a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t v i r u s e s o fa v i a n i n f l u e n z a v i r u s e s , FPV s t r a i n s R o s t o c k ( A / c h i c k e n / G e r -m a n y / 3 4 ) a n d W e y b r i d g e ( A / c h i c k e n / G e r m a n y / 2 7 ) ( 9 , 1 2 ) . T h ec h a n g e s V27T a n d V 2 7 S i n Udorn M2 p r o t e i n a r e a r t i f i c i a l , b u ta s t h e c h a n g e s 1 2 7 T , 1 2 7 S , a n d V27A a r e f o u n d n a t u r a l l y ( s e ea b o v e ) , i t w a s o f i n t e r e s t t o b e g i n t o e x a m i n e t h e p l a s t i c i t y o ft h e c h a n n e l s t r u c t u r e a t t h i s r e s i d u e . W e a l s o c h a n g e d t h et y r o s i n e 4 1 r e s i d u e ( m u t a n t W41A) o n t h i s f a c e o f t h e p u t a t i v e

x h e l i x o f t h e M, p r o t e i n TM d o m a i n b e c a u s e a r o m a t i cr e s i d u e s i n t h e c h a n n e l p o r e a r e t h o u g h t t o p l a y a n i m p o r t a n tr o l e i n K+ c h a n n e l c o n d u c t a n c e s ( 1 3 , 1 8 ) .To e x a m i n e t h e s y n t h e s i s o f t h e M2 p r o t e i n p o i n t m u t a n t s ,o o c y t e s were i n j e c t e d w i t h s y n t h e t i c mRNA t r a n s c r i p t s a n dm e t a b o l i c a l l y l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e f o r 2 4 h . M, p r o -t e i n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d , a n d t h e p o l y p e p t i d e s w e r ea n a l y z e d b y SDS-PAGE ( F i g . l B a n d C ) . U n d e r r e d u c i n gc o n d i t i o n s ( i n t h e p r e s e n c e o f d i t h i o t h r e i t o l [ D T T ] ; F i g . 1 B ) ,s p e c i e s o f Mr - 1 5 , 0 0 0 c o u l d b e d e t e c t e d f o r e a c h o f t h e p o i n tm u t a n t s ( d a t a f o r W 4 1 A n o t s h o w n ) . F o r M, A30P a n d G 3 4 E ,a n a d d i t i o n a l b a n d o f Mr - 1 8 , 0 0 0 c o u l d b e r e a d i l y i d e n t i f i e d ,a n d f o r m u t a n t s A30P a n d G 3 4 E , s l o w l y m i g r a t i n g h e t e r o g e -n e o u s p o p u l a t i o n s o f m o l e c u l e s ( - 3 0 t o 5 0 k D a ) c o u l d b eo b s e r v e d . As d i s c u s s e d b e l o w , t h e s e a d d i t i o n a l M 2 - s p e c i f i cs p e c i e s a r e d u e t o a m o d i f i c a t i o n o f M, m o l e c u l e s b y t h ea d d i t i o n o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i n s a n d t h e i r s u b s e q u e n tm o d i f i c a t i o n w i t h p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n . U n d e r n o n r e d u c i n gc o n d i t i o n s , t h e m u t a n t s w e r e f o u n d t o f o r m a m i x t u r e o fd i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s ( - 3 0 k D a ) a n d d i s u l f i d e - l i n k e d t e t r a -m e r s ( - 6 0 k D a ) ( F i g . I C ) .From e x t e n s i v e s t u d i e s , p a r t i c u l a r l y o f v i r a l i n t e g r a l mem-b r a n e p r o t e i n s , t h e c o n c e p t h a s e m e r g e d t h a t c o r r e c t f o l d i n ga n d o l i g o me r i z at i o n o f membrane p r o t e i n s i s a p r e r e q u i s i t e f o rt r a n s p o r t t h r o u g h t h e e x o c y t o t i c p a t h w a y . M o l e c u l e s w h i c h a r em a l f o l d e d a r e b l o c k e d i n t r a n s p o r t i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u -l u m ( r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 4 ) . T h e r e f o r e , i t w a s n e c e s s a r y t oe s t a b l i s h w h e t h e r t h e a l t e r e d M2 p r o t e i n s w e r e e x p r e s s e d a tt h e p l a s m a membrane o f o o c y t e s , a s f a i l u r e o f a c h a n n e lp o l y p e p t i d e t o b e t r a n s p o r t e d t o t h e p l a s m a membrane w o u l dy i e l d a p h e n o t y p e i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h a t o f a m o l e c u l ee x p r e s s e d a t t h e c e l l s u r f a c e t h a t l a c k e d i o n c h a n n e l a c t i v i t y .F r o z e n s e c t i o n s o f o o c y te s e x pr es s in g M2 V 2 7 T , A 3 0 P , a n dG34E w e r e s t a i n e d w i t h a n M2 e c t o d o m a i n - s p e c i f i c m o n o c l o -n a l a n t i b o d y a n d F I T C - l a b e l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y , a n d ac h a r a c t e r i s t i c s u r f a c e s t a i n i n g p a t t e r n w a s o b s e r v e d ( F i g . 2 ) ,i n d i c a t i n g p r o p e r t r a n s p o r t t o t h e o o c y t e p l a s m a m e m b r a n e .The s u r f a c e e x p r e s s i o n o f t h e w t M2 p r o t e i n a n d t h e o t h e rm u t a n t s i n d i c a t e d i n F i g . 1 h a s b e e n s h o w n p r e v i o u s l y ( 3 2 ) .A m a n t a d i n e b l o c k a n d pH a c t i v a t i o n o f M2 p r o t e i n i o nc h a n n e l a c t i v i t y . To d e t e r m i n e t h e a m a n t a d i n e s e n s i t i v i t y a n dpH a c t i v a t i o n o f a l t e r e d M2 p r o t e i n s e x p r e s s e d i n o o c y t e s o f X .l a e v i s , a t w o - e l e c t r o d e v o l t a g e c l a m p p r o c e d u r e w a s u s e d , a n dt o t a l membrane c u r r e n t s w e r e m e a s u r e d . T h e c u r r e n t s w e r es t u d i e d b y h o l di ng t h e membrane v o l t a g e a t -40 mV a n dh y p e r p o l a r i z i n g t h e membrane w i t h s t e p v o l t a g e c l a m p p u l s e sf r o m - 1 3 0 t o -60 mV. T h e p e a k a m p l i t u d e s o f i n w a r dc u rr en t f o l l o w i ng a n a c t i v a t i n g v o l t a g e o f - 1 3 0 mV i n n o r m a lB a r t h ' s s o l u t i o n a t pH 7 . 5 a n d 6 . 2 a r e s h o w n i n T a b l e 1 . F o r a l lm e a s u r e m e n t s d e s c r i b e d h e r e i n , t h e s m a l l e n d o g e n o u s c u r r e n te x h i b i t e d b y c o n t r o l o o c y t e s i n j e c t e d w i t h a n t i s e n s e RNA w a ss u b t r a c t e d f r o m t h e m e a s u r e d c u r r e n t t o y i e l d t h e c u r r e n tr e p o r t e d . A l t h o u g h o o c y t e s e x p r e s s i n g b o t h t h e w t a n d m u t a n tM , p r o t e i n s h a d o n l y s m a l l m e m b r a n e c u r r e n t s a t n e u t r a l p H ,t h e c u r r e n t a m p l i t u d e i n c r e a s e d a n a v e r a g e o f e i g h t f o l d whent h e c u r r e n t w a s m e a s u r e d a t pH 6 . 2 . W e n o t e d t h a t o o c y t e se x p r e s s i n g o n e m u t a n t p o l y p e p t i d e , M2 A 3 0 P , h a d e s s e n t i a l l yn o c u r r e n t a t e i t h e r pH 7 . 5 o r pH 6 . 2 , s u g g e s t i n g t h i s p r o t e i nd o e s n o t h a v e f u n c t i o n a l i o n c h a n n e l a c t i v i t y . When o o c y t e sw e r e b a t h e d i n B a r t h ' s s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 0 0 , u M a m a n t a -d i n e a t pH 7 . 5 , t h e c u r r e n t o f o o c y t e s e x p r e s s i n g t h e w t M2p r o t e i n w a s a t t e n u a t e d , w h e r e a s t h e c u r r e n t s o f o o c y t e s e x -p r e s s i n g M2 V 2 7 A , V 2 7 S , A 3 0 T , S 3 1 N , a n d G34E w e r er e s i s t a n t t o t h e d r u g ( d a t a n o t s h o w n ) . S i m i l a r l y , f o l l o w i n ga c t i v a t i o n a t pH 6 . 2 , t h e c u r r e n t o f o o c y t e s e x p r e s s i n g t h e w tM2 p r o t e i n w a s s t i l l s e n s i t i v e t o a m a n t a d i n e , w h e r e a s t h e

V O L . . 6 8 , 1 9 9 4 1 5 5 3


4/13

1 5 5 4 HOLSINGER ET A L .A NH2

FTM2 5 4 3

P L V V A

COOH

A S I I G I L H L I L WIL2 7 3 0 3 1 3 4 4 1M2 V 2 7 A A

M 2 V 2 7 S LM2 V 2 7 T [M2 A 3 0 T [M2 A 3 0 P [M2 S 3 1 N [M2 3 4 E [

ST

Tp

NE

M2 W41AL A

C O A . A , 0 _0~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0(O~~~~~~~oC Cc ; Z . 4u Xc I- CL,-aeR tS~- m

fm - m 4

- 60kd

' 3 0 k c

- ' l 5 k d

::

1

1:

W-Eg: _L' 4 , < S , 0 i S ,S X''dy _____--___

; s_t a 0 0 i ' a; '_ _

. i ' t % , .:, Z : . , E : . . . :fDTT -DTT

F I G . 1 . C o n s t r u c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f i n f l u e n z a v i r u s wt M2 a n d mutant M2 p o l y p e p t i d e s i n o o c y t e s . ( A ) S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e i n f l u e n z av i r u s M2 p r o t e i n a n d i t s h y d r o p h o b i c TM domain r es i du e s 2 5 t o 4 3 . The amino a c i d sequence o f t h e TM domain i s shown i n t h e e x p a n d e d s e c t i o no f t h e d i a g r a m , u s i n g t h e s i n g l e - l e t t e r c o d e . The mutants M2 V27A, V 2 7 S , V 2 7 T , A 3 0 T , A 3 0 P , S 3 1 N, G 3 4 E , an d W41A were c o n s t r u c t e d asd e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . ( B and C ) E x p r e s s i o n o f w t M2 and mutant M2 p o l y p e p t i d e s i n o o c y t e s o f X . l a e v i s . S y n t h e t i c mRNAs w e r et r a n s c r i b e d f r o m e i t h e r pGEM3 o r pGEM3Zf(+) e n c o d i n g t h e wt M2 o r mutant M2 p r o t e i n s an d w e r e m i c ro i n j e ct e d ( 5 0 n l o f RNA o f I p g / p . l )i n t o o o c y t e s o f X . l a e v i s . At 2 4 h p o s t i n j e c t i o n , o o c y t e s were l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e and h o m o g e n i z e d , and d e t e r g e n t l y s a t e s w e r e p r e p a r e di n t h e presence o f 5 0 mM i o d o a c e t a m i d e . P r o t e i n s were i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h an M 2 - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( 1 4 C 2 ) an d a n a l y z e d b ySDS-PAGE u n d e r r e d u c i n g ( B ) an d n o n r e d u c i n g ( C ) c o n d i t i o n s . M, i n f l u e n z a v i r u s - i n f e c t e d CV-1 c e l l l y s a t e used as molecular s i z e m a r k e r s ; HA=7 7 k D a , NP =5 6 k D a , M , =2 8 k D a , and M2 =1 5 k D a . P o s i t i o n s o f t h e M2 m o n o m e r , d i m e r , and t e t r a m e r b a n d s ( 1 5 , 3 0 , and 6 0 k D a ,r e s p e c t i v e l y ) ar e shown on t h e r i g h t .

c u r r e n t a s s o c i a t e d w i t h e x p r e s s i o n o f M2 V 2 7 A , V 2 7 S , A 3 0 T ,S 3 1 N , a n d G34E r e m a i n e d r e s i s t a n t t o t h e d r u g ( T a b l e 1 ) . F o rt h e Udorn M2 p r o t e i n , t h e c h a n g e V27S l e a d s t o a m a n t a d i n er e s i s t a n c e , w h e r e a s t h e mutant c o n t a i n i n g t h e c h a n g e V27Twas s e n s i t i v e t o a m a n t a d i n e a t b o t h pH 7 . 5 a n d pH 6 . 2 ( T a b l e1 ) . W h e n t h e pH s e n s i t i v i t i e s o f t h e membrane c u r r e n t s o fo o c y t e s e x p r e s s i n g t h e w t and mutant M2 p r o t e i n s werec o m p a r e d o ver t h e pH range f r o m 7 . 5 t o 5 . 4 , i t was f o u n d t h a tmutants M2 V 2 7 A , V 2 7 S , V 2 7 T , a n d S31N h a d s i m i l a r s l o p e s

o f pH a c t i v a t i o n ( F i g . 3 ) . Mutant A30T was o n l y w e a k l y pHa c t i v a t e d i n c o m p a r i s o n w i t h w t M2 p r o t e i n i o n c h a n n e l a c t i v i t yo ver t h e e n t i r e pH range, a n d as d i s c u s s e d a b o v e , no s i g n i f i c a n ti o n c h a n n e l a c t i v i t y c o u l d b e m e a s u r e d f o r mutant A 3 0 P . As t a t i s t i c a l a n a l y s i s u s i n g a t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i an c e(ANOVA) i n d i c a t e d t h a t t h e pH a c t i v a t i o n s o f M2 A30P a n dA30T were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r a n d f r o mt h o s e o f a l l o t h e r p r o t e i n s (ANOVA: F =1 2 . 4 9 ; P < 0 . 0 0 0 1 ) .S p e c i f i c a c t i v i t y o f wt and mutant M2 p r o t e i n c h a n n e lc u r r e n t s i n o o c y t e s . O o c y t e s e x p r e s s i n g v a r i o u s M2 mutants

J . V I R O L .

B A .M

HANP

I

I


5/13

INFLUENZA VIRUS M2 PROTEIN ION CHANNEL ACTIVITY 1 5 5 5

F I G . 2 . C e l l s u r f a c e e x p r e s s i o n o f m u t a n t M2 p r o t e i n s e x p r e s s e d i n o o c y t e s o f X l a e v i s . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y o f s e c t i o n so f o o c y t e s w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e M2 p r o t e i n w a s s t a i n e d w i t h t h e M 2 - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y 1 4 C 2f o l l o w e d b y F I T C - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - m o u s e s e c o n d a r y a n t i b o d y . (A ) M2 V 2 7 T ; ( B ) M2 A 3 0 P ; ( C ) M2 G 3 4 E ; ( D ) i n j e c t i o n o f a n t i s e n s e RNA.P h o t o g r a p h i c e x p o s u r e t i m e s w e r e e q u i v a l e n t . B a r , 1 0 0 p L m .

e x h i b i t e d d i f f e r e n t l e v e l s o f w h o l e - c e l l c u r r e n t s . T h i s c o u l dr e f l e c t a n i n t r i n s i c p r o p e r t y o f t h e c h an n e l p e r s e o r a v a r i a t i o ni n e x p r e s s i o n l e v e l s b e t w e e n o o c y t e s . To d i s t i n g u i s h b e t w e e nt h e s e p o s s i b i l i t i e s , t h e p e a k a m p l i t u d e o f i n w a r d c u r r e n t o fi n d i v i d u a l o o c y t e s w a s m e a s u r e d f o l l o w i n g a n a c t i v a t i n g v o l t -a g e o f - 1 3 0 mV i n B a r t h ' s s o l u t i o n ( p H 6 . 2 ) . T h e o o c y t e w a st h e n l y s e d , a n d t h e a m o u n t o f M2 p r o t e i n t h a t h a d a c c u m u -TABLE 1 . A m p l i t u d e s o f i n w a r d c u r r e n t s

I n w a r d c u r r e n t ( p L A ) ( m e a n S E M ) "M2 p r o t e i ng e n o t y p e pH pH pH 6 . 2 + 1 0 0 n7 . 5 6 . 2 , u M a m a n t a d i n eWT 0 . 1 3 0 . 0 4 0 . 7 3 0 . 1 3 0 . 0 6 0 . 0 3 b 5V27A 0 . 2 7 0 . 0 4 1 . 0 9 0 . 1 2 0 . 8 7 0 . 1 0 6V27S 0 . 2 3 0 . 0 6 0 . 7 1 0 . 0 8 0 . 7 0 0 . 0 9 6V27T 0 . 0 6 0 . 0 1 0 . 6 0 0 . 0 8 0 . 0 2 0 . 0 1 b 1 0A30T 0 . 0 9 0 . 0 1 0 . 2 3 0 . 0 2 0 . 2 5 0 . 0 2 5A30P 0 . 0 3 0 . 0 1 0 . 0 4 0 . 0 1 0 . 0 5 0 . 0 1 9S 3 1 N 0 . 0 8 0 . 0 1 0 . 7 8 0 . 0 6 0 . 5 5 0 . 0 4 6G34E 0 . 0 6 0 . 0 1 0 . 6 1 0 . 0 8 0 . 7 5 0 . 0 8 1 0W 4 1 A 0 . 0 3 0 . 0 1 0 . 0 5 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 1 5" C u r r e n t o f c o n t r o l o o c y t e s i n j e c t e d w i t h a n t i s e n s e RNA ( e n d o g e n o u sc u r r e n t ) w a s s u b t r a c t e d f r o m t o t a l c u r r e n t m e a s u r e d t o y i e l d c u r r e n t r e p o r t e d .C u r r e n t s w e r e m e a s u r e d a t - 1 3 0 mV.b R e d u c e d b y a m a nt a d in e , P < 0 . 0 1 .

4 -2A

5 7 8pHF I G . 3 . M o d u l a t i o n o f membrane c u r r e n t s o f o o c y t e s e x p r e s s i n gt h e w t M2 a n d m u t a n t M2 p r o t e i n s b y p H . O o c y t e s w e r e m i c r o i n j e c t e dw i t h s y n t h e t i c RNA t r a n s c r i p t s e n c o d i n g t h e m u t a n t M2 p r o t e i n s .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 4 0 t o 5 0 hp o s t i n j e c t i o n . T h e p e a k a m p l i t u d e o f i n w a r d c u r r e n t s f o l l o w i n g ah y p e r p o l a r i z i n g p u l s e o f - 1 3 0 mV f o r t h e i n d i c a t e d M2 p r o t e i n i sp l o t t e d a g a i n s t e x t r a c e l l u l a r p H . I n t h i s a n d s u b s e q u e n t f i g u r e s ,b a c kg r o u n d e n do g e n o u s c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m o o c y t e s i n j e c t e d w i t ha n t i s e n s e RNA w e r e s u b t r a c t e d f r o m e a c h d a t u m p o i n t , a s d e s c r i b e di n T a b l e 1 , f o o t n o t e a . T w o - w a y ANOVA was d o n e a s d e s c r i b e d i nM a t e r i a l s a n d M e t h o d s .

V O L . 6 8 , 1 9 9 4


6/13

1 5 5 6 HOLSINGER ET A L .5 s t d s

M2 W T

8 o o c y t e s n g M2 p e r o o c y t e W A l n g M 23 . 6 5 0 . 3 4 0 . 1 6 0 . 0 1

WESIIIU s

2 'V 2 7 S m e_1 . 6 3 + 0 . 2 0 0 . 4 2 + 0 . 0 32 . 4 0 + 0 . 4 8 0 . 4 2 + 0 . 0 7WW1w~_-__r_ 3 . 6 3 + 0 . 6 0 0 . 4 1 + 0 . 0 5- S -!- M m - * 3 . 3 1 + 0 . 3 9 0 . 0 6 0 . 0 1;>-lyii.0777

M2 A 3 0 P = __7----_7M2 S 3 1 N

3 . 7 1 + 0 . 8 2 0 .0 2 + 0 . 0 1

3 . 7 9 0 . 5 0 0 . 1 4 + 0 . 0 11 1 N ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ R I_;M E T B s i - i t e 1 . 9 8 + 0 . 1 7 0 . 4 7 0 . 0 4

F I G . 4 . N o r m a l i z a t i o n o f wt M2 a n d mutant M2 e x p r e s s i o n l e v e l s w i t h i o n c h a n n e l c u r r e n t s i n d i c a t e s t h a t d i f f e r e n t c h a n n e l s h a v e d i s t i n c tp r o p e r t i e s . T h e p e a k a m p l i t u d e o f c u r r e n t f o l l o w i n g a - 3 0 - m V a c t i v a t i n g v o l t a g e a t pH 6 . 2 was m e a s u r e d f o r e i g h t i n d i v i d u a l o o c y t e s f o r e a c hmutant M2 p r o t e i n . E a c h o o c y t e w a s t h e n h o m o g e n i z e d , l y s a t e s w e r e r un on SDS-PAGE, a n d p o l y p e p t i d e s w e r e t r a n s f e r r e d t o p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e m e m b r a n e s . F i v e known c o n c e n t r a t i o n s o f p u r i f i e d M2 p r o t e i n w e r e c o e l e c t r o p h o r e s e d w i t h mutant M2 p r o t e i n s o t h a t t h e a c c u m u l a t e dM2 p r o t e i n i n o o c y t e s c o u l d b e q u a n t i f i e d . Th e amount o f t h e s t a n d a r d p u r i f i e d M2 p r o te i n v a r ie d f o r e a c h mutant M2 p r o t e i n . B l o t s were p r o b e dw i t h M 2 - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y 1 4 C 2 a n d h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y , a n d immune c o m p l e x e s w e r e d e t e c t e dw i t h t h e ECL s y s t e m . Q u a n t i t a t i o n o f M2 p r o t e i n i n i n d i v i d u a l o o c y t e s was d o n e b y l a s e r s c a n n i n g d e n s i t o m e t r y o f t h e X - r a y f i l m s , u s i n g t h e k n o w nc o n c e n t r a t i o n s o f p u r i f i e d M2 t o g e n e r a t e a s t a n d a r d curve. T h e c u r r e n t ( m e a n s t a n d a r d er r o r o f t h e m e a n ) a t pH 6 . 2 i n m i c r o a m p s was d i v i d e db y t h e t o t a l amount ( n a n o g r a m s ) o f p r o t e i n f o r e a c h o o c y t e , a n d t h e average M2 p r o t e i n s p e c i f i c a c t i v i t y f o r s i x o o c y t e s i s r e p o r t e d .

l a t e d i n e a c h o o c y t e w as q u a n t i f i e d b y an i m m u n o b l o t t i n gp r o c e d u r e u s i n g 5 0 t o 4 0 0 pg o f i m m u n o a f f i n i t y - p u r i f i e d M2p r o t e i n as a s t a n d a r d i n o r d e r t o n o r m a l i z e t h e w h o l e - c e l lc u r r e n t s t o t h e amount o f a c c u m u l a t e d p r o t e i n , w h i c h h e r e i sd e f i n e d as t h e s p e c i f i c a c t i v i t y . The p r e c i s e amounts o f s t a n -d a r d M2 p r o t e i n u s e d v a r i e d d e p e n d i n g on t h e mutant u n d e ra n a l y s i s . The i m m u n o b l o t a n a l y s i s o f e i g h t i n d i v i d u a l o o c y t e sa n d t h e average s p e c i f i c a c t i v i t y o f e a c h m u t a n t , e x p r e s s e d asm i c r o a m p s o f c u r r e n t a t pH 6 . 2 pe r nanogra m o f M2 p r o t e i ne x p r e s s e d , i s s h o w n i n F i g . 4 . M u t a n t s V 2 7 A , V 2 7 S , V 2 7 T , a n dG34E h a d an i n c r e a s e d s p e c i f i c a c t i v i t y ( 0 . 4 1 t o 0 . 4 7 , u A / n g o fM2 p r o t e i n ) c o m p a r e d w i t h wt M2 ( 0 . 1 6 j x A / n g ) . S31N wass i m i l a r t o wt M2 ( 0 . 1 4 , u A / n g ) , A3OT h a d a g r e a t l y r e d u c e d b u td e t e c t a b l e a c t i v i t y ( 0 . 0 6 , u A / n g ) , a n d A30P h a d v i r t u a l l y noa c t i v i t y ( 0 . 0 2 , u A / n g ) .A n a l y s i s o f a l t e r e d M2 p r o t e i n s t h a t ar e m o d i f i e d b y a d d i -t i o n o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e . When an a l t e r e d p r o t e i n ,M2+V, A 3 0 T , t h a t c o n t a i n s an a dd i t i o n o f a v a l i n e r e s i d u eb e t w e e n M2 r e s i d u e s 2 6 a n d 2 9 i n a d d i t i o n t o t h e c h a n g eA 3 0 T , was e x p r e s s e d i n o o c y t e s , i t was f o u n d on SDS-PAGEa n a l y s i s t h a t i n a d d i t i o n t o t h e M2 ( - 1 5 - k D a ) b a n d , ana d d i t i o n a l b a n d ( M 2 g ; -18 k D a ) a n d h e t e r o g e n e o u s l y m i g r a t -i n g s p e c i e s ( M 2 p ; -30 t o 5 0 k D a ) c o u l d b e d e t e c t e d ( 3 2 ) ( F i g .S B ) . When t h e io n c h a n n e l a c t i v i t y o f M2+V , A 30 T wase x a m i n e d , i t was f o u n d t o h a v e a l t e r e d k i n e t i c a n d v o l t a g e -d e p e n d e n t a c t i v a t i o n p r o p e r t i e s ( 3 2 ) . We w e r e i n t e r e s t e d i ni n v e s t i g a t i n g w h e t h e r t h e a l t e r e d m o b i l i t i e s o f t h e a d d i t i o n a ls p e c i e s on SDS-PAGE were d u e t o t h e a d d i t i o n o f N - l i n k e dc a r b o h y d r a t e a n d a l s o t h e p o s s i b l e r o l e o f c a r b o h y d r a t e a d d i -t i o n i n t h e a l t e r e d i o n c h a n n e l a c t i v i t y o f M2+V, A 3 0 T .O o c y t e s w e r e c o i n j e c t e d w i t h RNA e n c o d i n g M2+V, A30T

a n d t u n i c a m y c i n , t h e i n h i b i t o r o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e a d d i -t i o n , a n d when p o l y p e p t i d e s w e r e e x a m i n e d on SDS-PAGE,o n l y t h e 1 5 - k D a u n g l y c o s y l a t e d b a n d was d e t e c t e d ( F i g . S B ) .The h e t e r o g e n e o u s l y m i g r a t i n g M 2 p s p e c i e s was r e m i n i s c e n t o ft h e p a t t e r n o b s e r v e d f o r m o d i f i c a t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t ec h a i n s o f t h e NB g l y c o p r o t e i n o f i n f l u e n z a B v i r u s b y a d d i t i o no f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n ( 4 2 , 4 3 ) . T h u s , o o c y t e l y s a t e s e x -p r e s s i n g M2+V, A30T were d i g e s t e d w i t h e n d o - f - g a l a c t o s i -d a s e , w h i c h s p e c i f i c a l l y d i g e s t s p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n . A ss h o w n i n F i g . S B , t h e h e t e r o g e n e o u s l y m i g r a t i n g m a t e r i a l w asno l o n g e r o b s er v ed , a n d c o nc o mi t a nt l y , t h e re w as an i n c r e a s ei n t h e amount o f t h e M 2 g s p e c i e s . I n a d d i t i o n , some s p e c i e sm i g r a t i n g s l i g h t l y more s l o w l y t h a n M2g were o b s e r v e d w h i c hp r o b a b l y r e p r e s e n t t r i a n t e r n a r y a n d t e t r a - a n t e n a r y cores w i t hl a c t o s a m i n y l c h a i n s n o t c o m p l e t e l y d i g e s t e d b y e n d o - , B - g a l a c -t o s i d a s e . T h u s , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t some o f t h e M2+V,A30T m o l e c u l e s ar e m o d i f i e d b y a dd it i o n o f N - l i n k e d c a r b o -h y d r a t e c h a i n s ( s p e c i e s M 2 g ) , a n d t h e s e c h a i n s ar e f u r t h e rm o d i f i e d b y a dd i t i o n o f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n ( s p e c i e s M 2 p ) .

W i l d - t y p e M2 p r o t e i n c o n t a i n s a p o t e n t i a l s i t e f o r t h ea dd i t i o n o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e ( N D S ; r e s i d u e s 2 0 t o 2 2 )w h i c h i s n o t u s e d i n w t M2 p r o t e i n ( 2 4 , 4 5 ) . To p r o v i d ee v i d e n c e t h a t t h i s c onsensus s equence s i t e i s u s e d f o r c a r b o -h y d r a t e a d d i t i o n i n M2+V, A 3 O T , two i n d e p e n d e n t m u t a t i o n s ,N20S a n d S 2 2 A , were i n t r o d u c e d i n t o t h e M2+V, A30Tm o l e c u l e , e a c h o f w h i c h w o u l d b e e x p e c t e d t o a b o l i s h N - l i n k e dc a r b o h y d r a t e a d d i t i o n . As s h o w n i n F i g . S B , when t h e m o l e -c u l e s M2+V, A 3 0 T - N 2 0 S a n d M2+V, A 3 0 T - S 2 2 A w e r e ex -p r e s s e d i n o o c y t e s , o n l y t h e u n g l y c o s y l a t e d M2 s p e c i e s ( - 1 5k D a ) w as d e t e c t e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e a s p a r a g i n e a t M2r e s i d u e 2 0 can b e m o d i f i e d b y a d d i t i o n o f c a r b o h y d r a t e .

M2 V 2 7 A

M2 A30T

M2 G 3 4 E

J . V I R O L .

-IFt-


7/13

INFLUENZA VIRUS M2 PROTEIN ION CHANNEL ACTIVITY 1 5 5 7A

M 2 + V , A 3 0 TM2 + V , A 3 0 T , N 2 0 SM2 + V , A 3 0 T , S 2 2 AM2 I N S - V

M 2 A 3 0 P

NH2 Y V 2 I T , COOH B

,UD8So P L V V A A S I I G I L H L I L W I L O s2 0 2 2 2 5 3 0 3 5 4 0

+V TS + V T

A V TI V I

P I-

I M 2 p

M2 + V , A 3 P + V PF I G . 5 . C o n s t r u c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f m u t a n t M2 p r o t e i n s t o i n v e s t i g a t e t h e s i t e o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e a d d i t i o n t o M2+V, A 3 0 T . ( A )S c h em a t ic d i a g r am o f t h e i n f l u e n z a v i r u s M2 p r o t e i n a n d i t s h y d r o p h o b i c TM d o m a i n r e s i d u e s 2 5 t o 4 3 . T h e a m i n o a c i d s e q u e nc e o f t h e r e g i o n sf l a n k i n g t h e TM d o m a i n a nd t h e TM d o m a i n a r e s h o w n i n t h e e x p a n d e d s e c t i o n o f t h e d i a g r a m , u s i n g t h e s i n g l e - l e t t e r c o d e . T h e m u t a n t s M2+V,A 3 0 T ; M2+ V , A 3 0 T - N 2 0 S ; M2+V, A 3 0 T - S 2 2 A ; M 2 - I N S - V ; M2 A 3 0 P , a n d M2+ V , A30P w e r e c o n s t r u c t e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s .R e s i d u e s 2 0 t o 2 2 ( N D S ) f o r m a c o n s e n s u s s e q u e n c e f o r a d d i t i o n o f N - li n k ed c a r b o h y d r a t e a n d a r e i n d i c a t e d o n t h e s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e M2p r o t e i n b y t h e t r e e s y m b o l . A l l m u t a nt s w i th t h e d e s i g n a t i o n +V c o n t a i n a n i n s e r t i o n o f a v a l i n e r e s i d u e b e t w e e n r e s i d u e s 2 6 a n d 2 9 . ( B ) E x p r e s s i o no f m u t a n t M2 p r o t e i n s i n o o c y t e s o f X l a e v i s . S y n t h e t i c RNAs e n c o d i n g m u t a n t M2 p r o t e i n s w e r e m i c r o i n j e c t e d ( 5 0 n l o f RNA o f 1 , u g / p , l ) i n t oo o c y t e s o f X l a e v i s . A t 2 4 h p o s t i n j e c t i o n , o o c y t e s w e r e l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e a n d h o m o g e n i z e d i n d e t e r g e n t b u f f e r . P r o t e i n s w e r ei m m u n o p r e c i p i t a t e d w i th a n M 2 - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( 1 4 C 2 ) a n d a n a l y z e d b y SDS-PAGE i n t h e p r e s e n c e o f t h e r e d u c i n g a g e n t DTI.L a n e s : M , m a r k e r l a n e o f i n f l u e n z a v i r u s - i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 ; + t u n i c , o o c y t e s c o i n j e c t e d w i t h M2+V, A30TRNA a n d t u n i c a m y c i n ; + e n d o 1 3 , M2+V, A30T p r o t e i n d i g e s t e d w i t h e n d o - , B - g a l a c t o s i d a s e ; a n t i s e n s e , o o c y t e i n j e c t e d w i t h a n t i s e n s e M2 RNA. M 2 pd e n o t e s M2 c o n t a i n i n g h e t e r o g e n e o u s g l y c a n a d d i t i o n s ( p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n ) . T h e s m a l l b r a c k e t i n d i c a t e s t h e a l t e r e d f o r m o f M 2 p a f t e re n d o - 1 - g a l a c t o s i d a s e d i g e s t i o n . M 2 g d e n o t e s M2 c o n t a i n i n g o n e h i g h - m a n n o s e c a r b o h y d r a t e c h a i n .To i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e a d d i t i o n o f a v a l i n e r e s i d u e a l o n ep r o m o t e d t h e a d d i t i o n o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e , t h e m u t a n tM 2 - I N S - V ( v a l i n e a d d e d b e t w e e n r e s i d u e s 2 6 a n d 2 9 ) w a se x p r e s s e d i n o o c y t e s . As s h o w n i n F i g . 5 B , n o e v i d e n c e o f ag l y c o s y l a t e d M 2 - I N S - V s p e c i e s w a s f o u n d . When M2 A30P w a se x p r e s s e d , a m ix t u r e o f u n g l y c o s y l a t e d M 2 , M 2 g , a n d M 2 p w a so b s e r v e d ( F i g . 1 B a n d 5 B ) . A d d i t i o n o f a v a l i n e r e s i d u eb e t w e e n r e s i d u e s 2 6 a n d 2 9 i n t o A30P i n c r e a s e d t h e r a t i o o fg l y c o s y l a t e d t o u n g l y c o s y l a t e d s p e c i e s ( F i g . 5 B ) . T a k e n t o -g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t p e r t u r b a t i o n s t o t h e M2 TMd o m a i n m a k e t h e s i t e a c c e s s i b l e t o o l i g o s a c c h a r y l t r a n s f e r a s ef o r N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e a d d i t i o n .I o n c h a n n e l a c t i v i t y o f g l y c o s y l a t e d a n d u n g l y c o s y l a t e d M2p r o t e i n s . O o c y t e s e x p r e s s i n g t h e g l y c o s y l a t e d M2+ V, A 30 Tp r o t e i n e x h i b i t e d a n i o n c h a n n e l a c t i v i t y t h a t i s r e s i s t a n t t ob l o c k b y a m an t ad i ne , i s v o l t a g e a c t i v a t e d , a n d h a s t w o k i n e t i cc o m p o n e n t s : o n e w h i c h a p p e a r s i m m e d i a t e l y a f t e r t h e a p p l i -c a t i o n o f t h e h y p e r p o l a r i z i n g v o l t a g e a n d a s e c o n d w h i c hi n c r e a s e s w i t h t i m e ( 3 2 ) ( F i g . 6 ) . T h u s , i t w a s p o s s i b l e t o t e s tw h e t h e r g l y c o s y l a t i o n p r o v i d e d a n e x p l a n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n t

p r o p e r t i e s o f M2+V, A3OT c h a n n e l a c t i v i t y f r o m w t M 2 .O o c y t e s e x p r e s s i n g t h e m u t a n t s M2+V, A 3 0 T ; M2+V, A 3 0 T -N 2 0 S ; M2+V, A 3 0 T - S 2 2 A ; M 2 - I N S - V ; M 2 - A 3 0 P ; a n d M2+V,A 3 0 P , when e x a m i n e d b y i m m u n o c h e m i s t r y , e x h i b i t e d b r i g h tp l a s m a membrane s t a i n i n g f o r M2 p r o t e i n ( d a t a n o t s h o w n ) ,i n d i c a t i n g t r a n s p o r t o f t h e p r o t e i n s t o t h e p l a s m a m e m b r a n e .When t h e i o n c h a n n e l a c t i v i t i e s o f g l y c o s y l a t e d M2+V, A30Ta n d u n g l y c o s y l a t e d M2+V, A 3 0 T - N 2 0 S a n d M2+V, A 3 0 T -S 2 2 A w e r e t e s t e d b y u s i n g a n a c t i v a t i o n v o l t a g e o f e i t h e r - 1 3 0o r - 1 4 0 mV, a l l t h r e e p r o t e i n s e x h i b i t e d s i m i l a r t i m e - d e p e n -d e n t v o l t a g e - a c t i v a t e d c u r r e n t s t h a t h a d t w o k i n e t i c c o m p o -n e n t s ( F i g . 6 ; o n l y t h e p r o f i l e o f M2+V, A30T i s s h o w n ) . T h ep e a k a m p l i t u d e s o f t h e i n w a r d c u r r e n t s f r o m a l l t h r e e p r o t e i n s

w e r e s i m i l a r f o l l o w i n g a n a c t i v a t i o n v o l t a g e p u l s e o f - 1 3 0 mV( F i g . 6 ) . T h u s , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e a d d i t i o n o f N - l i n k e dc a r b o h y d r a t e t o M2+V, A30T d o e s n o t p l a y a r o l e i n t h ef o r m a t i o n o f t h e a l t e r e d i o n c h a n n e l a c t i v i t y . I n t e r e s t i n g l y ,M 2 - I N S - V w h e n e x p r e s s e d i n o o c y t e s d i d n o t e x h i b i t v o l t a g e -a c t i v a t e d i o n c h a n n e l a c t i v i t y b u t r a t h e r e x h i b i t e d a t i m e -i n d e p e n d e n t , a m a n t a d i n e - s e n s i t i v e ( d a t a n o t s h o w n ) , p H - a c t i -v a t e d c u r r e n t ( F i g . 6 ) - t h e h a l l ma rk s o f w t M 2 . N e i t h e r M2A30P n o r M2+V, A30P e x h i b i t e d d e t e c t a b l e i o n c h a n n e la c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) . T h u s , t a k e n t o g e t h e r , t h e d a t as u g g e s t t h a t i t i s t h e p r e s e n c e o f t h e A30T c h a n g e , i n c o n j u n c -t i o n w i t h t h e a d d i t i o n o f t h e e x t r a v a l i n e r e s i d u e , t h a t l e a d s t ot h e a l t e r e d i o n c h a n n e l p r o p e r t i e s .I o n c h a n n e l a c t i v i t i e s a n d o l i g o m e r i c s t r u c t u r e s o f M2p r o t e i n s c o n t a i n i n g d e l e t i o n s i n t h e TM d o m a i n . An a m a n t a -d i n e - r e s i s t a n t m u t a n t o f FP V W e y b r i d g e w a s f o u n d t o c o n t a i na d e l e t i o n o f f o u r r e s i d u e s ( r e s i d u e s 2 8 t o 3 1 ) i n t h e M2 p r o t e i nTM d o m a i n ( 1 2 ) . We i n t r o d u c e d t h i s d e l e t i o n i n t o t h e U d o r nM2 p r o t e i n ( M 2 d e l 2 , 3 1 ) , a n d w h e n M2 d e l 2 - 3 1 w a s e x p r e s s e di n o o c y t e s , a n a m a n t a d i n e - r e s i s t a n t , v o l t a g e - a c t i v a t e d i n w a r dc u r r e n t w a s o b s e rv e d ( 3 2 ) . We w e r e i n t e r e s t e d i n e x a m i n i n gw h e t h e r o t h e r d e l e t i o n s i n t h e M2 p r o t e i n TM d o m a i n c o u l dy i e l d a v i a b l e M2 c h a n n e l a c t i v i t y . Tw o m u t a n t s i n w h i c h t h r e eo r f i v e r e s i d u e s w e r e d e l e t e d f r o m t h e TM d o m a i n werec o n s t r u c t e d a n d e x p r e s s e d i n o o c y t e s ; t h e s e m u t a n t s wered e s i g n a t e d M2 d e 1 2 9 - 3 1 a n d d e 1 2 7 - 3 1 , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 7 ) .W h e r e a s o o c y t e s e x p r e s s i n g M2 d e l 2 , 3 , e x h i b i t e d a l a r g ei n w a r d c u r r e n t i n d e p e n d e n t o f e x t r a c e l l u l a r p H , o o c y t e s e x -p r e s s i n g e i t h e r M2 d e 1 2 9 _ 3 1 o r M2 d e 1 2 7 - 3 1 e x h i b i t e d c u r r e n t st h a t w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y l a r g e r t h a n t h o s e o f c o n t r o l o o c y t e si n j e c t e d w i t h a n t i s e n s e RNA ( F i g . 7 ) . To d e t e r m i n e w h e t h e rt h e l a c k o f i o n c h a n n e l a c t i v i t y was d u e t o a f a i l u r e o f M2d e 1 2 9 _ 3 1 o r d e 1 2 7 _ 3 1 t o b e e x p r e s s e d a t t h e o o c y t e p l a s m a

am %a1 Y- . : .. . . - : . 7 . . " ? . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F w:.

V O L . 6 8 , 1 9 9 4

- M 2 g

C o+ V , A 3 o Tr e *S C


8/13

1 5 5 8 HOLSINGER ET A L .

a .

1 V 'M 2 + V , A 3 0 T

I n w a r d C u r r e n t ( p A )( M e a n SEM)e n o t y p eM2 + V , A 3 0 T , S 2 2 A ...M2 + V , A 3 0 T , N 2 0 S _ - -M 2 + V , A 3 0 T -------

1 . 8 7 0 . 6 3

2 . 7 6 0 . 9 1

2 . 5 1 0 . 7 7

n

7

7

7

b . + , pH 7 . 5 M 2 I N S - V pH 7.5_____ 0 . 0 4 0 . 0 1 8ItZzzIIzzzl M 2 I N S - V p H 5.8_ _-_ 0 . 3 4 0 . 0 4 8" I p H 5 . aC .

- 1 3 0 m V

1 , A1 s e c

F I G . 6 . A n a l y s i s o f t h e a m p l i t u d e a n d t i m e c o u r s e o f c u r r e n t s a s s o c i a t e d w i t h g l y c o s y l a t e d a n d u n g l y c o s y l a t e d mutant M2 p r o t e i n s . ( a ) L e f t ,t i m e d e p e n d e n c e o f t h e c u r r e n t s a s s o c i a t e d w i t h M2+V, A 3 0 T ; M2+V, A 3 0 T - S 2 2 A ; a n d M 2 + V , A 3 0 T - N 2 0 S on a h y p e r p o l a r i z i n g v o l t a g e s t e pt o - 1 3 0 mV ( t i m e c o u r s e i n p a n e l c ) . O n l y t h e c u r r e n t p r o f i l e o f M2+V, A30T i s s h o w n a s an e x a m p l e o f t h e t h r e e v o l t a g e - a c t i v a t e d c u r r e n t s .R i g h t , p e a k c u r r e n t a m p l i t u d e s d u r i n g a n a c t i v a t i n g v o l t a g e t o - 1 3 0 mV f o r o o c y t e s e x p r e s s i n g t h e m u t a n t s s h o w n . ( b ) L e f t , t i m e i n d e p e n d e n c eo f t h e c u r r e n t s a s s o c i a t e d w i t h M 2 - I N S - V a t pH 7 . 5 a n d 5 . 8 ; r i g h t , p e a k c u r r e n t a m p l i t u d e s d u r i n g an a c t i v a t i n g v o l t a g e t o - 1 3 0 mV f o r o o c y t e se x p r e s s i n g M 2 - I N S - V . ( c ) T i m e c o u r s e o f h y p e r p o l a r i z a t i o n , c u r r e n t s c a l e , a n d t i m e s c a l e f o r p a n e l s a a n d b .

m e m b r a n e , i m m u n o c h e m i s t r y f o r M2 w a s p e r f o r m e d . Ass h o w n i n F i g . 8 , a b r i g h t M 2 - s p e c i f i c p l a s m a m e m b r a n e s t a i n i n gw a s o b s e r v e d w i t h M2 d e 1 2 9 _ 3 1 a n d d e l 2 8 - 3 1 . H o w e v e r , o o c y t e se x p r e s s i n g M2 d e 1 2 7 _ 3 1 s h o w e d o n l y v e r y l o w l e v e l s o f M 2 -s p e c i f i c p l a s m a membrane s t a i n i n g , w h i c h s u g g e s t s t h a t t h i sm u t a n t w a s p o o r l y t r a n s p o r t e d t o t h e c e l l s u r f a c e o r d i d n o ta c c u m u l a t e a t t h e c e l l s u r f a c e .T h e l a c k o f M 2 - s p e c i f i c s u r f a c e f l u o r e s c e n t s t a i n i n g f o r M2d e 1 2 7 - 3 1 c o u l d b e d u e t o a f a i l u r e o f t h e p r o t e i n t o o l i g o m e r i z e ,t h u s p r e v e n t i n g i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f t h e m o l e c u l e ( r e -v i e w e d i n r e f e r e n c e 4 ) . T h e r e f o r e , t h e M2 TM d o m a i n d e l e t i o nA N H 2 COOH2 5 4 3

m u t a n t p o l y p e p t i d e s w e r e a n a l y z e d b y SDS-PAGE u n d e rr e d u c i n g ( i n t h e p r e s e n c e o f DYF) a n d n o n r e d u c i n g ( i n t h ea b s e n c e o f DTT) c o n d i t i o n s . As s h o w n i n F i g . 9 A , u n d e rr e d u c i n g c o n d i t i o n s , a - 1 4 - k D a p o l y p e p t i d e s p e c i e s w a s o b -s e r v e d f o r M2 d e l 2 7 - 3 1 , d e l 2 8 - 3 1 , a n d d e l 2 9 - 3 1 * U n d e r n o n r e d u c -i n g c o n d i t i o n s , b o t h M2 d e l 2 7 - 3 1 a n d M2 d e l 2 9 - 3 1 f o r m e d a na p p r o x i m a t e l y e q u a l m i x t u r e o f d i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s ( - 2 8k D a ) a n d d i s u l f i d e - l i n k e d t e t r a m e r s ( - 5 6 k D a ) ( F i g . 9 A ) ,w h i c h i s t h e p a t t e r n o b s e r v e d f o r w t M2 p r o t e i n ( 1 5 , 3 8 ) . T h u s ,t h e i n a b i l i t y t o d e t e c t M2 d e l 2 7 _ 3 1 d o e s n o t a p p e a r t o b e d u e t oa f a i l u r e o f t h e p r o t e i n t o o l i g o m e r i z e .B I n w a r d C u r r e n t ( p A ) ( M e a n S E M )

p H 7 . 5 p H 5 . 8 NPLVVAASIIGILHLILWIL I

M2 d e l 2 7 - 3 1

M 2 d e l 2 8 - 3 1 L IGIM2 d e l 2 9 - 3 1 PLVV IG

0 . 0 4 .0 1

2 . 2 4 . 3 5

0 . 0 6 . 0 1

0 . 0 4 + 0 . 0 1 8

2 . 0 0 0 . 0 3 5

0 . 0 5 . 0 1 6F I G . 7 . A n a l y s i s o f t h e c u r r e n t a s so c i at e d w i t h M2 p r o t e i n s c o n t a i n i n g d e l e t i o n s i n t h e TM d o m a i n . ( A ) S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e M2 TMdomain i n d i c a t i n g t h e l o c at i o ns o f t h e d e l e t i o n s i n t h e mutants M2 d e l 2 9 _ 3 1 , d e l 2 8 . 3 1 , a n d d e l 2 7 31. T h e s e mutants were c o n s t r u c t e d , a n d RNA wass y n t h e s i z e d a n d e x p r e s s e d i n o o c y t e s , as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( B ) P e a k c u r r e n t a m p l i t u de s d u ri n g an a c t i v a t i n g v o l t a g e t o -1 3 0mV m e a s u r e d a t pH 7 . 5 and 5 .8 f o r e a c h m u t a n t .

l I

M2 WT 0 . 1 4 + 0 . 0 3 0 . 9 4 0 . 0 2 4

041

J . V I R O L .


9/13

INFLUENZA VIRUS M, PROTEIN ION CHANNEL ACTIVITY 1 5 5 9

- -_F I G . 8 . C e l l s u r f a c e e x p r e s s i o n o f M 2 p r o t e i n s c o n t a i n i n g m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n d e l e t i o n s e x p r e s s e d i n o o cy t e s o f X l a e v i s . I n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y w a s d o n e o n s e c t i o n s o f o o c yt e s s t a i n e d w i t h M . - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y 1 4 C 2 f o l l ow e d b y F I T C - c o n j u g a t e dr a b b i t a n t i - m o u s e s e c o n da r y a n t i b o d y a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( A ) M, d e l 2 8 , 3 1 ; ( B ) M, d e l . 2 1 3 1 ; (C ) M, d e 1 1 7 _ 3 1 ; ( D ) o o c y t e i n j e c t e dw i t h a n t i s e n s e RNA. P h o t o g r a p h i c e x p o s u r e t i m e s w e r e e q u i v a l e n t . B a r , 1 0 0 , u m .

M o s t i n t e r e s t i n g l y , M2 d e l 8 _ 3 , , w h e n a n a l y z e d b y S D S -PAGE u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s , f o r m e d , i n a d d i t i o n t od i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s a n d t e t r a m e r s , t w o p r o m i n e n t a d d i -t i o n a l s p e c i e s o f -42 a n d 7 0 k D a , w h i c h a r e m o l e c u l a r m a s s e st h a t w o u l d b e p r e d i c t e d f o r t r i m e r i c a n d p e n t a m e r i c M2s p e c i e s . To e x a m i n e f u r t h e r t h e o l i g o m e r i c f o r m o f M2 d e l 2 8 _3 1 , w e p e r f o r m e d a n a n a l y s i s o f M 2 - d e 1 2 8 , 3 e x p r e s s e d i n C V - 1c e l l s , u s i n g h o m o b i f u n c t i o n a l c r o s s - l i n k i n g r e a g e n t s a n d a nS V 4 0 r e c o m b i n a n t v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m . T h e M2d e 1 2 8 _ 3 1 p o l y p e p t i d e s p e c i e s f o u nd u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i -t i o n s w e r e t h e same w i t h e i t h e r t h e o o c y t e o r m a m m a l i a n c e l le x p r e s s i o n s y s t e m ( F i g . 9 ) , b u t c r o s s - l i n k i n g i s t e c h n i c a l l ys i m p l e r w i t h m a m m a l i a n c e l l s . C V - 1 c e l l s e x p r e s s i n g e i t h e r w tM2 o r M2 d e l 2 8 _ 3 w e r e l y s e d , a n d c r o s s - l i n k i n g w a s p e r f o r m e do n t h e w h o l e - c e l l l y s a t e b y u s i n g D S P ; a l t e r n a t i v e l y , c r o s s -l i n k i n g w a s p e r f o r m e d o n i n t a c t c e l l s e x p r e s s i n g t h e M2 p r o t e i nb y u s i n g EG S ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . As s h o w n i n F i g .9 B , when w t M2 w a s a n a l y z e d b y SDS-PAGE u n d e r n o n re d u c-i n g c o n d i t i o n s , i t w a s f o u n d t o b e c r o s s - l i n k e d p r e d o m i n a n t l yt o a - 6 0 - k D a s p e c i e s , a s f o u n d p r e v i o u s l y ( 1 5 ) . I n c o n t r a s t , M2d e l 2 8 , 3 1 w a s f o u n d t o b e c r o s s - l i n k e d t o a s p e c i e s s i m i l a r i nm o b i l i t y t o t h e l a r g e s t d i s u l f i d e - l i n k e d s p e c i e s ( - 7 0 k D a ) . Tof u r t h e r e x a m i n e t h e c h a n g e i n f o r m o f t h e o l i g o m e r o f M2d e 1 2 8 _ 3 1 c o m p a r e d w i t h w t M 2 , D S P - c r o s s - l i n k e d M2 d e 9 8 _ 3 1a n d w t M2 w e r e s u b j e c t e d t o s u c r o s e v e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n .As s h o w n i n F i g . 1 0 , t h e m a j o r M2 d e l 2 l 3 1 o l i g o m e r i c s p e c i e ss e d i m e n t e d more r a p i d l y t h a n t h e m a j o r w t M2 o l i g o m e r i cs p e c i e s , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h M) d e l ^ 8 _ 3 , h a v i n g a l a r g e rm a s s . T h u s , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e o l i g o m e r i c f o r m o f M2d e l 2 8 l 3 i s d i f f e r e n t f r o m t h e t e t r a m e r i c w t M2 p r o t e i n , a n d t h e

d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h M2 d e 1 2 8 - 3 f o r m i n g a p e n t a m e r w i t hv a r i o u s d i s u l f i d e b o n d a r r a n g e m e n t s b e t w e e n s u b u n i t s . T h ea l t e r e d o l i g o m e r i c s t r u c t u r e o f M2 d e 1 2 8 , 3 m a y b e t h e b a s i s f o rt h e d i f f e r e n t i o n c h a n n e l p r o p e r t i e s o f M2 d e 1 2 8 - 3 1 c o m p a r e dw i t h w t M2 p r o t e i n .

DISCUSSIONI n a d d i t i o n t o t h e i n f l u e n z a v i r u s M2 i o n c h a n n e l p r o t e i n , t h eo n l y o t h e r known i o n c h a n n e l t h a t h a s a s i n g l e TM d o m a i n i st h e 1 3 0 - r e s i d u e I S K ( m i n K ) K+ c h a n n e l ( 7 , 8 , 3 3 , 3 6 , 4 0 ) , a n di n t e r e s t i n g l y , ' S K I l i k e t h e M2 p r o t e i n , i s t h o u g h t t o b e a t y p eI I I i n t e g r a l membrane p r o t e i n . T h u s , i n c o m p a r i s o n w i t hc l o n e d i o n c h a n n e l s h a v i n g a m u l t i p l e m e m b r a n e - s p a n n i n gd o m a i n a r c h i t e c t u r e a n d p o r e s f o r m e d b y l a r g e r o l i g o m e r i cc o m p l e x e s w h i c h s h a r e s i m i l a r s t r u c t u r a l e l e m e n t s ( r e v i e w e d i nr e f e r e n c e s 1 7 a n d 2 6 ) , t h e i n f l u e n z a v i r u s M2 p r o t e i n i s am i n i m a l i s t i c o r p r i m a t i v e i o n c h a n n e l . T h e s m a l l s i z e o f t h e M2p r o t e i n m a k e s f e a s i b l e a s t r u c t u r e - f u n c t i o n a n a l y s i s b y s e l e c -t i v e l y c h a n g i n g r e s i d u e s i n t h e p o r e r e g i o n .I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e M, p r o t e i n TM d o m a i na d o p t s a n o x - h e l i c a l s e c o n d a r y s t r u c t u r e ( 6 , 3 5 , 3 8 ) . When t h eTM d o m a i n i s m o d e l e d a s a n c x h e l i x ( F i g . 1 1 ) , r e s i d u e s 2 7 , 3 0 ,3 1 , 3 4 , 3 7 , 3 8 , a n d 4 1 a r e f o u n d t o b e l o c a t e d on t h e same f a c eo f t h e c x h e l i x , a n d s p e c i f i c c h a n g e s a t r e s i d u e s 2 7 , 3 0 , 3 1 , a n d3 4 l e a d t o a n i o n c h a n n e l t h a t i s r e s i s t a n t t o b l o c k b ya m a n t a d i n e ( 9 , 1 2 , 3 2 , 4 1 ) . I n a d d i t i o n , w e h a v e s h o w np r e v i o u s l y t h a t t h e c h a n g e H37A r e s u l t s i n c h a n n e l a c t i v i t y t h a ti s n o t pH a c t i v a t e d , a n d t h e c h a n g e L38F i n t h e FP V R o s t o c kM2 p r o t e i n r e s u l t s i n a c h a n n e l a c t i v i t y t h a t i s a c t i v a t e d b y pH

V O L . 6 8 , 1 9 9 4


10/13

1 5 6 0 HOLSINGER ET A L .A B*f~~~~~*Ietl o i , ; , : . 44 v * c ' t0u - . J . p oHA

NP

+ DTT -DTT

WT de l 2 8 - 3 1- DSP EGS - DSP EGS

0-0 i l i f I , k

6 0 k d

' 3 0 k d60kd,

- g 1 5 k d30kd-

-DTTF I G . 9 . A n a l y s i s o f t h e o l i g o m e r i c f o r m s o f M2 p r o t e i n s c o n t a i n i n g d e l e t i o n s i n t h e m e mb r a ne - s p an n i ng d o m a i n b y c h e m i c a l c r o s s - l i n k i n g a n dSDS-PAGE. (A ) O o c y t e s w e r e i n j e c t e d w i t h t h e RNAs e n c o d i n g M2 d e l 2 7 - 3 1 , d e l 2 8 - 3 , , a n d d e l 2 9 - 3 1 , l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e , a n d h o m o g e n i z edi n d e t e r g e n t b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 mM i o d o a c e t a m i d e . P r o t e i n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w it h a n M 2 - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( 1 4 C 2 ) a n da n a l y z e d u n d e r r e d u c i n g ( + D T J ) a n d n o n r e d u c i n g ( - D T T ) c o n d i t i o n s o n a 1 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e - 4 M u r e a g e l . M , m a r k e r l a n e o f i n f l u e n z av i r u s i n f e c t e d - c e l l p r o t e i n s a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 . P o s i t i o n s o f t h e w t M2 m o n o m e r , d i m e r , a n d t e t r a m e r ( 1 5 , 3 0 , a n d 6 0 k D a ,r e s p e c t i v e l y ) a r e s h o w n a t t h e r i g h t . (B ) C V - 1 c e l l s i n f e c t e d w i t h S V 4 0 r e c o m b i n a n t s e x p r e s s i n g w t M2 a n d M2 d e l 2 , 3 1 w e r e l a b e l e d w i t h[ 3 5 S ] c y s t e i n e f r o m 4 5 t o 4 8 h p o s t i n f e c t i o n . C e l l s w e r e t h e n l y s e d a n d p r o t e i n s w e r e c r o s s - l i n k e d w i t h DSP ( l a n e D S P ) , o r c e l l m o n o l a y e r s w e r ei n c u b a t e d w i t h t h e c r o s s - l i n k e r EGS ( l a n e E G S ) p r i o r t o c e l l l y s i s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . P r o t e i n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t hM 2 - s p e c i f i c a n t i b o d y 1 4 C 2 a n d a n a l y z e d o n a 10% p o l y a c r y l a m i d e g e l u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s . T h e p r e d o m i n a n t c r o s s - l i n k e d f o r m o f M2d e l 2 8 _ 3 1 i s d e n o t e d b y a n a s t e r i s k . 1 4 C - l a b e l e d m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s w e r e u s e d a s m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( n o t s h o w n ) .

b u t i s l a r g e l y r e s i s t a n t t o a m a n t a d i n e b l o c k ( 3 2 , 4 1 ) . T a k e nt o g e t h e r , t h e d a t a d e s c r i b e d i n t h i s r e p o r t a n d t h o s e d e s c r i b e dp r e v i o u s l y i n d i c a t e t h a t c h a n g i n g a n y r e s i d u e o n t h i s f a c e o ft h e p u t a t i v e o t h e l i x o f t h e M2 TM d o m a i n a l t e r s p r o p e r t i e s o ft h e M2 i o n c h a n n e l .F o r t h e U d o r n M2 p r o t e i n , t h e c h a n g e s V 2 7 A , V 2 7 S , V 2 7 T ,S 3 1 N , a n d G34E y i e l d e d c h a n n e l a c t i v i t i e s w i t h pH a c t i v a t i o nc u r v e s t h a t c o u l d n o t b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h a t o f w t M 2 , a n da l l s h o w e d a q u a s i - l i n e a r s l o p e o f a c t i v a t i o n t o pH 5 . 4 , t h el o w e s t pH t h a t t h e o o c y t e s c o u l d t o l e r a t e a n d g i v e l o w c u r r e n t su p o n r e t u r n t o pH 7 . 5 . M u t a t i o n s i n M2 p r o t e i n s A30P a n dW 4 1 A e f f e c t i v e l y a b o l i s h e d m e a n i n g f u l c h a n n e l a c t i v i t y a t b o t hpH 7 . 5 a n d pH 6 . 2 . T h u s , a l th o u g h M2 A30P a n d W 4 1 A f o r mt e t r a m e r s t h a t a r e e x p r e s s e d a t t h e o o c y t e p l a s m a m e m b r a n e ,t h e p o i n t m u t a t i o n s r e s u l t e d i n a l o s s o f i o n f l u x . I n t e r e s t i n g l y ,o n e n a t u r a l l y o c c u r r i n g m u t a n t , A 3 0 T , w h i c h e x h i b i t e d a s m a l lpH a c t i v a t i o n r e s p o n s e t h a t w a s d i s t i n c t f r o m t h o s e o f a l l t h eo t h e r m u t a n t s t e s t e d w a s f o u n d ( F i g . 3 a n d T a b l e 1 ) . When t h eA30T m u t a t i o n w a s f o u n d i n FPV R o s t o c k , v i r u s g r o w t h w a si m p a i r e d , a n d w h e n t h e v i r u s w a s p a s s a g e d i n t h e a b s e n c e o fa m a n t a d i n e , t h e A30T m u t a t i o n r e a d i l y r e v e r t e d t o w t ( 9 ) .T h u s , t h e s e i n v i v o o b s e r v a t i o n s s u g g e s t pH a c t i v a t i o n i s o fg r e a t i m p o r t a n c e t o t he i on c h a n n e l f u n c t i o n i n t h e i n f l u e n z av i r u s l i f e c y c l e .We o b s e r v e d t h a t o o c y t e s e x p r e s s i n g t h e m u t a n t M2 i o nc h a n n e l s h a d d i f f e r e n t m e m b r a n e c u r r e n t s . I n a d d i t i o n t o av a r y i n g pH a c t i v a t i o n r e s p o n s e , a d i f f e r e n c e i n t h e t o t a l c e l ls u r f a c e c u r r e n t s o f o o c y t e s e x p r e s s i n g t h e M2 p r o t e i n s c o u l d b ed u e t o d i f f e r e n t l e v e l s o f e x p r e s s i o n . As a l l o f t h e p o i n t m u t a n t st e s t e d c o u l d b e r e a d i l y d e t e c t e d a t t h e o o c y t e p l a s m a mem-b r a n e , t h e a s s u m p t i o n w a s made t h a t t h e t o t a l M2 p r o t e i na c c u m u l a t i o n i n o o c y t e s , a s d e t e r m i n e d b y a q u a n t i t a t i v ei m m u n o b l o t t i n g , d i r e c t l y r e f l e c t e d t h e s u r f a c e e x p r e s s i o n l e v -

e l s . C a l c u l a t i o n o f t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e s e M2 i o n c h a n n e la c t i v i t i e s ( m i c r o a m p s p e r n a n o g r a m o f M 2 ) i n d i c a t e d t h a t i nc o m p a r i s o n w i t h w t M 2 , t h e M2 S31N m u t a t i o n h a d a n e u t r a le f f e c t , w h e r e a s M2 m o l e c u l e s c o n t a i n i n g t h e c h a n g e s V 2 7 A ,V 2 7 S , V 2 7 T , a n d G34E h a d a 2 . 5 - f o l d i n c r e a s e i n a c t i v i t y o v e rw t M 2 . I n c o n t r a s t M2 A 3 O T , w h i c h i s o n l y w e a k l y pHa c t i v a t e d , h a d a s p e c i f i c a c t i v i t y 2 . 5 - f o l d l o w e r t h an t h a t o f w tM 2 . T h e c a l c u l a t i o n o f t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e M2 i o nc h a n n e l s i s a u s e f u l m e a s u r e m e n t ; h o w e v e r , u n t i l s i n g l e -c h a n n e l r e c o r d i n g s a r e m a d e , we c a n n o t d i s t i n g u i s h w h e t h e rt h e c h a n n e l c u r r e n t s v a r y i n a c t i v i t y d u e t o c h a n g e s i n i o n f l u x ,d u e t o c h a n g e s i n t h e f r a c t i o n o f t i m e t h a t e a c h i n d i v i d u a lc h a n n e l s p e n d s i n t h e o p e n s t a t e , o r d u e t o t h e f r a c t i o n o fm o l e c u l e s t h a t d o n o t e n t e r i n t o a n a c t i v e i o n c h a n n e l c o m p l e x .T h e M 2 - m e d i a t e d a l t e r a t i o n i n t h e c o n f o r m a t i o n a l f o r m o fHA ( e i t h e r l o w - p H o r n a t i v e f o r m ) w a s u s e d a s a n a s s a y o f t h ea c t i v i t i e s o f t h e FPV R o s t o c k , FPV W e y b r i d g e , a n d U d o r n M2p r o t e i n s i n m a m m a l i a n c e l l s ( 9 , 1 0 , 3 9 ) . The d a t a o b t a i n e di n d i c a t e t h a t t h e i o n c h a n n e l a c t i v i t y o f FPV R o s t o c k M2 i smore a c t i v e t h a n t h a t o f e i t h e r t h e FP V W e y b r i d g e o r U d o r nM2 p r o t e i n . I n a d d i t i o n , b y u s i n g FP V R o s t o c k a n d FP VW e y b r i d g e p o i n t m u t a t i o n s c o n f e r r i n g a m a n t a d i n e r e s i s t a n c e ,i t w a s f o u n d t h a t t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e w h o l e M2 TMd o m a i n i n f l u e n c e d t h e c o n s e q u e n c e o f s p e c i f i c r e s i d u ec h a n g e s . F o r e x a m p l e , t h e c h a n g e G34E i n FP V R o s t o c k M2p r o t e i n w a s f o u n d t o d i m i n i s h M2 p r o t e i n a c t i v i t y , w h e r e a s t h eG34E c h a n g e i n FP V W e y b r i d g e M2 p r o t e i n w a s f o u n d t oi n c r e a s e t h e M2 p r o t e i n a c t i v i t y ( 9 ) . Our e s t i m a t e s o f i o nc h a n n e l s p e c i f i c a c t i v i t y , b y m e a s u r i n g t h e w h o l e - c e l l c u r r e n t so f o o c y t e s e x p r e s s i n g M2 p r o t e i n s w i t h c h a n g e s i n t h e TMd o m a i n a s a f u n c t i o n o f M2 p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s , l e n df u r t h e r s u p p o r t t o t h e n o t i o n t h a t t h e r e i s a c o m p l e x r e l a t i o n -s h i p b e t w e e n t h e r o l e o f a s p e c i f i c r e s i d u e a t a p a r t i c u l a r

J . V I R O L .


11/13

INFLUENZA V IRU S M2 PROTEIN ION CHANNEL ACTIVITY 1 5 6 1b o t t o m t o p7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9

d el 2 8 - 3 1

-60 kd

- 3 0 k d

-60kd

-30k d

X | 0 v ; D - - s ww X4 * r D E ; - ;04SF**t0 0 0 ' t l E ' i ' - 0 ' ' t t -' Lf :: - f ! w 0 r d ww_-_wl; : . . . - . ; . . . s m w : w w -

. f : P w .F. v m S t ;: . : E D : . - A : S : . w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .f .t ' : 5 ' 000, 0, 000 00 l" ''t

F I G . 1 0 . S u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t a n a l y s i s o f t h e o l i g o m e r i c f o r m so f t h e wt M2 a n d M2 d e l 2 8 _ 3 1 p r o t e i n s . C V - 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t hS V 4 0 r e c o m b i n a n t s e x p r e s s i n g wt M2 or M2 d e l 2 , 3 1 , l a b e l e d w i t h[ 3 5 S ] c y s t e i n e f r o m 4 5 t o 4 8 h p o s t i n f e c t i o n , a n d l y s e d i n T r i t o nX-100-MNT b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 mM i o d o a c e t a m i d e . P r o t e i n s w e r ec r o s s - l i n k e d w i t h DSP as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , a n dl y s a t e s w e r e s u b j e c t e d t o sucrose v e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n on 5 t o 15%suc r o se g r a di e n ts ( 3 8 , 0 0 0 rpm, 2 4 h , 2 0 C i n an SW41 r o t o r ) . T w e n t y -f o u r 0 . 5 - m i f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e b o t t o m o f e a c h g r a d i e n t ,t h e i nd i ca te d f r a c t i o n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h M 2 - s p e c i f i cm o n o c l o n a l a n t i b o d y 1 4 C 2 , a n d p o l y p e p t i d e s were a n a l y z e d on a1 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e - 4 M urea g e l u n d er n o n re d u c i n g c o n d i t i o n s .' 4 C - l a b e l e d m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s were u s e d as m o l e c u l a r w e i g h ts t a n d a r d s ( n o t s h o w n ) .

p o s i t i o n i n t h e M2 i o n c h a n n e l a n d t h e o v e r a l l m o l e c u l a ra r c h i t e c t u r e o f t h e M2 i o n c h a n n e l . F o r e x a m p l e , i n b o t h F P VR o s t o c k a n d FPV W e y b r i d g e , t h e c h a n g e S31N l o w e r s M2p r o t e i n a c t i v i t y , b u t w i t h Udorn M2 p r o t e i n , i t l e a d s t oa m a n t a d i n e r e s i s t a n c e w i t h l i t t l e c h a n g e i n i o n c h a n n e l s p e c i f i ca c t i v i t y . I n c o n t r a s t , t h e c h a n g e A30P i n FP V W e y b r i d g e l e a d st o a v i a b l e v i r u s ( 1 2 ) , w h e r e a s t h e c h a n g e A30P i n Udorn M2p r o t e i n e f f e c t i v e l y a b o l i s h e s i o n c h a n n e l a c t i v i t y . I n a d d i t i o n ,when M2 r e s i d u e 2 7 i n FP V R o s t o c k i s t h r e o n i n e , i t l e a d s t oa m a n t a d i n e r e s i s t a n c e , w h e r e a s t h e presence o f t h r e o n i n e i nt h e e q u i v a l e n t p o s i t i o n i n Udorn M2 p r o t e i n l e a d s t o c h a n n e la c t i v i t y t h a t i s a m a n t a d i n e s e n s i t i v e .I t h a d b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t h a t o o c y t e s e x p r e s s i n g t h emutant M2+V, A 3 0 T , w h i c h c o n t a i n s an a d d i t i o n a l v a l i n er e si d u e i n se rt e d b e t w e e n r e s i d u e s 2 6 a n d 2 9 a n d t h e c h a n g eA 3 0 T , e x h i b i t e d a v o l t a g e - a c t i v a t e d i o n c h a n n e l a c t i v i t y t h a tc o n s i s t e d o f tw o k i n e t i c c o m p o n e n t s : one i m m e d i a t e l y uponh y p e r p o l a r i z a t i o n a n d t h e s e c o n d i n cr e as i n g s l o w ly w i t h t i m e .I n a d d i t i o n , i t was f o u n d t h a t M2+V, A30T was s u s c e p t i b l e t om o d i f i c a t i o n b y a d d i t i o n o f c a r b o h y d r a t e ( 3 2 ) . Our a n a l y s i sd e s c r i b e d h e r e i n d i c a t e s t h a t M2 a s p a r a g i n e r e s i d u e 2 0 i s t h es i t e o f a dd i t i o n o f an N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e c h a i n a n d t h a t t h i sc h a i n i s f u r t h e r m o d i f i e d b y a d d i t i o n o f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n .H o w e v e r , n e i t h e r a d d i t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t e no r a d d i t i o n o ft h e e x t r a v a l i n e r e s i d u e t o t h e TM domain p r o v i d e s ane x p l a n a t i o n f o r t h e a l te re d c u r r e n t t i m e course, w h i c h appearst o b e d e p e n d e n t on b o t h t h e c h a n g e o f A30T a n d t h e a d d i t i o n

LL

LI

I -

AVL pF I G . 1 1 . H e l i c a l n e t p r o j e c t i o n o f t h e p o s t u l a t e d o t h e l i x o f t h e M2p r o t e i n m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n . Amino a c i d r e s i d u e s 2 5 t o 4 3 a r es h o w n b e g i n n i n g a t t h e b o t t o m o f t h e h e l i x a n d w i nd in g u p w ar d.R e s i d u e s w h i c h l i e o n o n e f a c e o f t h e a h e l i x a n d w h i c h a f f e c t b o t h i o nc h a n n e l a c t i v i t y a n d a m a n t a d i n e s e n s i t i v i t y a r e d a r k l y s h a d e d . T h eh i s t i d i n e r e s i d u e i n v o l v e d d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y i n m o d u l a t i o n o f

c h a n n e l a c t i v i t y b y pH i s s h o w n l i g h t l y s h a d e d .

o f t h e v a l i n e r e s i d u e . T h e s i m p l e s t e x p l a n a t i o n f o r t h e a d d i t i o no f a c a r b o h y d r a t e t o t h e m u t a n t s M2+V, A 3 0 T ; M2 A 3 0 P ; a n dM2+V, A30P a t a s p a r a g i n e r e s i d u e 2 0 , w h i c h i s n o t m o d i f i e di n w t M 2 , i s t h a t t h e m u t a t i o n s c a u s e a p e r t u r b a t i o n i n t h es t r u c t u r e o f t h e TM d o m a i n s u c h t h a t a s p a r a g i n e a t r e s i d u e 2 0b e c o m e s a c c e s s i b l e t o t h e o l i g o s a c c h a r y l t r a n s f e r a s e . D i g e s t i o no f t h e h e t e r o g e n e o u s l y m i g r a t i n g M2 s p e c i e s w i t h e n d o - , B -g a l a c t o s i d a s e i s a c h a r a c t e r i s t i c o f p o l y l a c t o s a m i n o g l y c a n m o d -i f i c a t i o n , a n d i n t h r e e v i r a l g l y c o p r o t e i n s i n w h i c h t h i s m o d i f i -c a t i o n h a s b e e n o b s e r v e d ( M 2 p r o t e i n d e s c r i b e d h e r e , NB o fi n f l u e n z a B v i r u s [ 4 2 , 4 3 ] , a n d 1A o f r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s[ 1 , 2 9 ] ) , t h e g l y c o s y l a t i o n s i t e s a r e membrane p r o x i m a l .W e w e r e i n t r i g u e d t h a t a n a t u r a l l y s e l e c t e d a m a n t a d i n e -r e s i s t a n t m u t a n t o f FP V W e y b r i d g e c o n t a i n e d a d e l e t i o n o ff o u r r e s i d u e s i n t h e TM d o m a i n . When t h i s d e l e t i o n w a s madei n t h e U d o r n M2 p r o t e i n ( M 2 d e 1 2 8 _ 3 1 ) a n d e x p r e s s e d i n

o o c y t e s , i t e x h i b i t e d a v o l t a g e - a c t i v a t e d ( a n d p H - i n d e p e n d e n t )i o n c h a n n e l a c t i v i t y ( 3 2 ) . On h y p e r p o l a r i z a t i o n o f o o c y t em e m b r a n e s t o - 1 3 0 mV, t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f M2 d e l 2 , 3 ,( 1 . 2 0 0 . 3 0 [ m e a n s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n s ] , u A / n g o fM2 p r o t e i n , d a t a n o t s h o w n ) w a s much g r e a t e r t h a n t h a t o fU d o r n w t M 2 . H o w e v e r , i n t h e i n v i v o a s s a y m e a s u r i n g t h eM 2 - m e d i a t e d a l t e r a t i o n i n t h e c o n f o r m a t i o n a l f o r m o f HA, t h ed a t a i n d i c a t e d t h a t M2 d e

m2 ion channel

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