Modelli cellulari Modulo B

Dal semplice

Al complesso

La cellula rappresenta il modello sperimentale di elezione del biotecnologo per lo studio di: Struttura e funzione della cellula Meccanismi genetici di base:

replicazione e divisione cellulareespressione genica

Sviluppo e differenziamento cellulare:fisiologicopatologico

Modelli animali

Cell division

Cytocalasin & actin

Cell divisionFireworks

Epidermoblast division

Cell divisionFireworks sequel

Walking on the dark side

Gnam gnam

Cell highways

Cell truks

Tissue culture methods

Tissue culture of animal cells

Tissue culture media

Tissue culture plastic ware

Tecniche di analisi

Proteine•Elettroforesi•Immunologiche•Proteomiche

Acidi nucleici•Ibridazione•Amplificazione•Sequenziamento

Funzioni cellulari•Trasfezione•Interferenza

Tecniche di base per l’analisi degli Acidi Nucleici

Tecniche di Ibridazione:

in vitro (Southern & Northern Blot)

in vivo (FISH)

Tecniche di Amplificazione:

PCR

RT-PCR & qRT-PCR

Lo scopo di queste tecniche è di caratterizzare il genotipo e/o il profilo di espressione genica

Tecniche di sequenziamento:

Manuale (Sanger)

Automatizzato (ABI)

Microarray

Tecniche di base per l’analisi delle Proteine

Apparato base2DElettroforetiche:

Isoelectric Focusing (IEF)•SDS-PAGE•2D

Immunologiche:•Immuno-blot•Immunofluorescenza

Proteomiche:•MS

Tecniche di base per l’analisi di alcune funzioni cellulari

Separazione cellulare:•Disgregazione tissutale con collagenasi•Ficoll•Affinità

Crescita e migrazione:•Colorazione vitale•Incorporazione H3-dT•FACS

Tecniche di base per l’analisi di alcune funzioni cellulari

Trasfezione:•Transiente•Stabile

Interferenza:•RNAi

TRASFEZIONE TRANSIENTETRASFEZIONE TRANSIENTE

No No selezioneselezione

neo

TRASFEZIONE STABILETRASFEZIONE STABILE

Sì selezioneSì selezione

I VETTORI RETROVIRALII VETTORI RETROVIRALI

RetrovirusRetrovirus: : virus a RNA a doppio filamento virus a RNA a doppio filamento

5’-LTR5’-LTR 3’-LTR3’-LTRpsipsigeni per la replicazionegeni per la replicazione

• LTR (long terminal repeat) (ESSENZIALI);LTR (long terminal repeat) (ESSENZIALI);• geni per la replicazione (geni per la replicazione (gaggag, , polpol e e envenv) (NON ESSENZIALI);) (NON ESSENZIALI);• psi (per l’assemblaggio delle particelle virali) (ESSENZIALI).psi (per l’assemblaggio delle particelle virali) (ESSENZIALI).

• I vettori retrovirali vengono costruiti MANTENENDO le I vettori retrovirali vengono costruiti MANTENENDO le SEQUENZE ESSENZIALI, LTR e psi, del genoma retrovirale. SEQUENZE ESSENZIALI, LTR e psi, del genoma retrovirale.

• Sono vettori ‘SHUTTLE’.Sono vettori ‘SHUTTLE’.

INFEZIONE VIRALE: l’RNA è COPIATO in DNA dalla trascriptasi INFEZIONE VIRALE: l’RNA è COPIATO in DNA dalla trascriptasi inversa (contenuta nel virione) inversa (contenuta nel virione) il DNA il DNA

CIRCOLARIZZA e si INTEGRA nel DNA della CIRCOLARIZZA e si INTEGRA nel DNA della cellula ospite per azione dell’integrasi cellula ospite per azione dell’integrasi

(contenuta nel virione).(contenuta nel virione).

1. Il costrutto è utilizzato per TRASFETTARE 1. Il costrutto è utilizzato per TRASFETTARE una specifica linea cellulare (cellule helper) una specifica linea cellulare (cellule helper) che contiene, integrati nel genoma i geni che contiene, integrati nel genoma i geni gaggag, , polpol e e envenv richiesti per la produzione richiesti per la produzione del virus. Le cellule trasfettate SONO IN del virus. Le cellule trasfettate SONO IN

GRADO di produrre particelle virali contenenti GRADO di produrre particelle virali contenenti UNA COPIA AD RNA DEL COSTRUTTO. UNA COPIA AD RNA DEL COSTRUTTO.

2. Queste particelle virali sono in grado di 2. Queste particelle virali sono in grado di INFETTARE altre cellule (cellule target) che INFETTARE altre cellule (cellule target) che NON contengono i GENI gag, pol e env. Dal NON contengono i GENI gag, pol e env. Dal

momento che le particelle virali CONTENGONO momento che le particelle virali CONTENGONO la TRASCRITTASI INVERSA e l’INTEGRASIla TRASCRITTASI INVERSA e l’INTEGRASI

preformate, in queste cellule l’RNA viene preformate, in queste cellule l’RNA viene copiato in DNA a doppio filamento che poi si copiato in DNA a doppio filamento che poi si INTEGRA nel genoma della cellula infettata. INTEGRA nel genoma della cellula infettata.

Dal momento che queste cellule NON Dal momento che queste cellule NON POSSIEDONO I GENI essenziali PER LA POSSIEDONO I GENI essenziali PER LA

REPLICAZIONE VIRALE, NON si REPLICAZIONE VIRALE, NON si VERIFICHERA’ ulteriore PRODUZIONE di VERIFICHERA’ ulteriore PRODUZIONE di

particelle virali.particelle virali.

Come funziona la RNAi

HUVECHuman Umbelical Vein Endothelial Cells

NHLFNormal Human Lung Fibroblasts

Human Hepatocytes Normal Human Epidermal Keratinocytes

Linee cellulari tumorali

http://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/all/allIndex.cfm

Tumor lines

MODELLI ANIMALI IN BIOLOGIA

Invertebrati Vertebrati

Caenorabditiselegans

Drosophila melanogaster

Daniorerio

(zebrafish)

Ratto TopoXenopus

CARATTERISTICHE GENERALI DI ZEBRAFISH

Piccolo pesce osseo d’ acqua dolce originario del fiume Gange Si nutre di piccoli invertebrati ed è predato da pesci, anfibi, uccelli e mammiferi

Ciclo vitale molto rapido (da uovo ad adulto fertile in 7 giorni) La femmina depone un centinaio di uova alla volta con una frequenza

settimanale Fecondazione e sviluppo avvengono esternamente

Genoma di 1,8 x 109 bp organizzato in 25 cromosomi

ZEBRAFISH COME MODELLO ANIMALE

Vantaggi economici

Facili da reperire Basso costo Poco esigenti Allevabili in piccoli acquari Facili da riprodurre in cattività

Vantaggi biologici

Filogeneticamente più vicini all’uomo rispetto ai modelli invertebrati Facili da ibridare Grande quantità di embrioni a disposizione Sviluppo molto rapido Embrioni trasparenti durante tutto lo sviluppo Deposizione delle uova controllabile con l’esposizione alla luce Facili da manipolare

Possibilità di clonare individui da cellule somatiche

Svantaggi

Filogeneticamente meno vicini all’uomo rispetto a topi e ratti Genoma meno conosciuto rispetto ad altri modelli

In conclusione

OTTIMO MODELLO ANIMALEPER STUDI SULLA BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

SVILUPPO EMBRIONALE DI ZEBRAFISH

METODI DI STUDIO

1) Marcatura con sostanze fluorescenti

Per seguire, tramite osservazione al microscopio, la migrazione di singolecellule o di piccoli gruppi durante l’organogenesi

2) Delezione (o innesto) di singole cellule nelle prime fasi dello sviluppo

Consente di capire l’importanza relativa di una singola cellula nello sviluppodi un dato organo o tessuto

Normale sviluppo

Sviluppo alterato

3) Mutagenesi del maschio

Consente di selezionaremutanti per un determinatocarattere, come presupposto per studi a livello molecolare

4) Aploide ginecogenico

UV

uova

sperma

embrioniaploidi

5) Soppressione dell’espressione di una proteina con ‘antisense morpholino oligonucleotides ’ (M.O.)

A A A A A A -3’7mG5’-

M.O.

mRNA

A A A A A A -3’7mG5’-

dsRNA

(intraducibile)

(della proteina X)

Alcuni studi condotti su zebrafish

Studi sullo sviluppo dell’occhio e delle sue componenti (retina,coni, bastoncelli, cristallino, nervo ottico) es1: studio del mutante belladonna

Retina in zebrafish wild-type Retina nel mutante belladonna

es2: importanza del fattore trascrizionale Rx3 nello sviluppo dell’occhio attraverso lo studio di mutanti chk

Studio dell’ organogenesi (apparato digerente, cardiovascolare, ecc..) es:importanza del fattore trascrizionale Ptf1a-p48 nello sviluppo del pancreas

Studi sullo sviluppo del sistema nervoso es1: espressione di beta1 tubulina nel SN dell’embrione e nell’adulto es2: espressione dei geni drd3 per il recettore D3 per la dopamina, e drd2a, b e c per i recettori D2 per la dopamina

Studi sullo sviluppo embrionale delle gonadi es: importanza della chemochina SDF-1 nell’indurre la migrazione delle cellule progenitrici delle gonadi

Studi sull’importanza delle adesioni cellulari durante lo sviluppo embrionale es1: espressione di caderina E es2: espressione di connessina 48.5

Studi sulla teratogenicità di sostanze capaci di inquinare le acque es: pesticidi come il sodio metame