На правах рукописи

СТРЕЛЬЧЕНКО

Дарья Андреевна

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РАЗВИТИЯ И ОСОБЕННОСТЕЙ

КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ГИПЕРСТИМУЛЯЦИИ

ЯИЧНИКОВ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО

ОПЛОДОТВОРЕНИЯ НА ОСНОВАНИИ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-

ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

14.01.01 – Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2017

2

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика

В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Перминова Светлана Григорьевна

кандидат медицинских наук Донников Андрей Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Назаренко Татьяна Алексеевна - доктор медицинский наук, профессор,

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт

акушерства и гинекологии», отделение репродуктологии, главный научный

сотрудник

Рудакова Елена Борисовна – доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО

«Московский областной перинатальный центр», отделение вспомогательных

репродуктивных технологий, заведующая

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский

медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения

Российской Федерации

Защита состоится «16» мая 2017 года в 13.00 на заседании диссертационного

совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного бюджетного

учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени

академика В.И. Кулакова» по адресу: 117997, Москва, ул. Академика Опарина,

д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального

государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства,

гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства

здравоохранения Российской Федерации

http://science.ncagp.ru/upfiles/pdf/StrelchenkoDA_diss.pdf.

Автореферат разослан «___» ____________2017 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

доцент Калинина Елена Анатольевна

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Основной целью программ вспомогательных репродуктивных технологий

(ВРТ) является получение оптимального количества ооцитов и эмбрионов

хорошего качества при минимизации рисков осложнений, наиболее серьезным из

которых является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). Частота развития

клинически значимых форм СГЯ в программе экстракорпорального

оплодотворения (ЭКО) зависит от особенностей овариального ответа на

стимуляцию суперовуляции, при этом частота средних форм может достигать 6%,

тяжелых форм – 3% (А. Delvigne, 2009; P. Humaidan, 2016).

На сегодняшний день не представляется возможным точное своевременное

прогнозирование и абсолютное предотвращение развития СГЯ. Крайне важно

своевременно выявлять пациенток группы риска на этапе планирования программ

ВРТ. В клинической практике широко используется ряд клинико-лабораторных

маркеров, служащих предикторами развития СГЯ, к которым относятся возраст,

индекс массы тела (ИМТ), базальный уровень фолликулостимулирующего

гормона (ФСГ), уровень антимюллерового гормона (АМГ), ингибина В, число

антральных фолликулов (E. Papanikolaou, Р. Humaidan, 2010). Данные маркеры

позволяют вовремя применить клинически значимые меры профилактики,

которые заключаются в выборе «мягких» протоколов стимуляции, замене

триггера овуляции на агонист гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ),

использовании препаратов агонистов допаминовых рецепторов 2 типа, отмене

переноса эмбрионов и их криоконсервации для переноса в следующих циклах

(C. Nastri, D. Teixeira, 2015). Однако, несмотря на использование клинико-

лабораторных предикторов, а также проведение вышеуказанных мер

профилактики, у части пациенток СГЯ все же развивается, что предполагает

участие в его развитии других факторов, в том числе и генетических (А. Marzal,

2012; S. Santos-Ribeirо, 2015).

4

С выявлением генетической природы развития спонтанных форм СГЯ было

положено начало углубленному изучению полиморфизма ряда генов-кандидатов,

ответственных за развитие данного осложнения, так как стало ясно, что до

внедрения в практику информативных молекулярно-генетических маркеров все

имеющиеся на сегодняшний день клинико-лабораторные предикторы не

способны в полной мере прогнозировать развитие СГЯ. Обладая высокой

чувствительностью, вышеперечисленные параметры могут использоваться в

качестве скрининга на выявление группы риска развития СГЯ, однако

специфичность этих маркеров невысока (K. Fiedler, D. Ezcurra, 2012).

Общепризнанным фактом является существование индивидуальной

генетической вариабельности овариального ответа на применение лекарственных

препаратов (S. Mutsatsa, T. Currid, 2013). В настоящее время все больше внимания

уделяется фармакогенетике - науке о взаимосвязи эффектов лекарственных

веществ с индивидуальным генотипом пациента, а также изучению

полиморфизма генов (single nucleotide polymorphism, SNP). На сегодняшний день

в геноме человека выявлено более 19 миллионов SNP (J. Wang, G. Pang, 2012),

некоторые из которых обоснованно связывают с лекарственными эффектами.

Полагают, что, несмотря на то, что на индивидуальную реакцию на

лекарственный препарат могут влиять сотни генов, даже небольшое количество

ключевых SNPs могут надежно прогнозировать безопасность и эффективность

применения данного препарата у конкретного пациента.

Тем не менее, роль молекулярно-генетических предикторов в развитии СГЯ

мало изучена, не разработаны принципы выявления пациенток с риском СГЯ в

зависимости от индивидуальной генетической предрасположенности. В связи с

вышеизложенным, перспективным и актуальным направлением репродуктивный

медицины представляется комплексная оценка клинико-лабораторных и

молекулярно-генетических предикторов развития и особенностей клинического

течения СГЯ с целью выявления наиболее значимых из них.

5

Цель исследования

оптимизация проведения программы ЭКО у женщин с риском развития синдрома

гиперстимуляции яичников на основании комплексной оценки клинико-

лабораторных и молекулярно-генетических предикторов его развития и течения.

Задачи исследования:

1. Провести оценку клинико-анамнестических данных и анатомо-

функционального состояния репродуктивной системы у женщин с бесплодием,

обратившихся для проведения программы ЭКО.

2. В группе женщин с риском развития СГЯ и у пациенток группы сравнения

провести анализ параметров стимулированного цикла, фолликулогенеза, оогенеза

и эмбриогенеза.

3. Провести анализ клинико-лабораторных предикторов развития СГЯ

(возраст, ИМТ, уровень ФСГ, уровень АМГ, число антральных и растущих

фолликулов, число полученных ооцитов) в программах ЭКО и выявить их

прогностическую ценность.

4. Изучить молекулярно-генетические предикторы СГЯ и оценить

особенности течения СГЯ (начало манифестации, степень тяжести, длительность

течения, клинические проявления) в зависимости от выявленных молекулярно-

генетических маркеров.

5. Разработать прогностическую модель развития и течения СГЯ в программе

ЭКО с учетом значимых клинико-лабораторных и выявленных молекулярно-

генетических предикторов.

Научная новизна

На основании проведенного исследования представлены и научно

обоснованы новые данные об особенностях развития и клинического течения СГЯ

с учетом клинико-лабораторных и молекулярно-генетических предикторов.

Проведен многофакторный прогностический анализ предиктивной

значимости полиморфизма генов гормонов и их рецепторов, а также генов,

6

участвующих в ключевых звеньях патогенеза СГЯ, в сравнении с общепринятыми

клинико-лабораторными маркерами риска СГЯ и созданы бинарные

логистические регрессионные модели с проведением ROC-анализа, согласно

которым выявлены независимые наиболее значимые генотипы полиморфизма

исследованных генов, позволяющие достоверно прогнозировать риск развития

клинически значимого СГЯ и особенности его течения в программах ВРТ.

Практическая значимость

В результате проведенного исследования определена и обоснована

целесообразность генотипирования пациенток перед началом проведения

программы ЭКО наряду с клинико-лабораторным обследованием.

Выявлены независимые генетические маркеры, связанные с временем

манифестации и степенью тяжести СГЯ. Разработан алгоритм

персонализированного подхода к проведению мер профилактики развития

раннего и позднего СГЯ в программе ЭКО с учетом молекулярно-генетических

предикторов.

Положения, выносимые на защиту

1. Клинико-лабораторные маркеры СГЯ имеют ограниченную предиктивную

способность. Наибольшую значимость в прогнозировании риска развития СГЯ

имеют уровень АМГ > 3,7 нг/мл (чувствительность 82%, специфичность 54%) и

число антральных фолликулов > 14 (чувствительность 84%, специфичность 47%).

Несмотря на проводимые меры профилактики, частота развития СГЯ в группе

риска достигает 30,8%; у пациенток без риска СГЯ - 8,0%. Клинико-лабораторные

предикторы прогнозируют только раннюю форму СГЯ, их прогностическая

значимость при позднем СГЯ не оптимальна.

2. Генотип C/С гена TSHR 2181 является независимым генетическим маркером

развития СГЯ, что обусловлено его структурной гомологией с рецептором ХГч.

Степень тяжести течения СГЯ генетически детерминирована. Для носителей

7

аллеля G полиморфного локуса гена TSHR 2181 C>G и аллеля 936T VEGFA

характерно более тяжелое течение СГЯ.

3. Ранний и поздний СГЯ различаются по молекулярным механизмам

развития, что обусловливает дифференцированный подход к выбору мер

профилактики СГЯ. Ключевыми генами при развитии раннего СГЯ являются

VEGFA, LHCGR и аллель А полиморфного локуса ESR1; при развитии позднего

СГЯ – ACE и носительство аллеля G полиморфного локуса ESR1. Вклад

генетической предрасположенности в развитие ранней и поздней форм СГЯ

составляет около 25%.

Личный вклад автора

Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления

исследования, разработке цели и задач исследования, анализе и статистической

обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении

пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом ЭКО, в сборе материала, в

анализе и научной интерпретации результатов исследования.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности

14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования

соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5

паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы

Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников 1 – го

гинекологического отделения (27.10.2016г.) и заседании апробационной комиссии

ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (14.11.2016г., протокол № 11).

8

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанная на основании результатов исследования тактика

персонализированного подхода к прогнозированию развития СГЯ с учетом

молекулярно-генетических маркеров внедрена в практическую деятельность 1–го

гинекологического отделения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава

России.

По теме диссертации опубликовано 5 научных статей в ведущих

рецензируемых научных изданиях, определенных перечнем ВАК.

Поданы 2 заявки на изобретение «Способ прогнозирования синдрома

гиперстимуляции яичников в программе ЭКО на основании определения

полиморфизма генов VEGFA и TSHR» № 2016100089 и «Способ прогнозирования

ранней и поздней форм синдрома гиперстимуляции яичников в программе ЭКО

на основании определения полиморфизма генов TSHR 2181 C>G (Asp727Glu),

ESR1-351G [Xbal], АCE 287bp Ins/Ins, VEGFA 936 C>T, VEGFA -2578(-2595) A/C и

LHCGR 935G (Asn312Ser)» № 2017101973.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах, состоит из введения и 4 глав (обзор

литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных

исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических

рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 11

рисунками. Использованная литература включает 10 работ отечественных и 159

зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В соответствии с целью и задачами исследования в 1 гинекологическом

отделении (заведующий – к.м.н. Абубакиров А.Н.) ФГБУ «НЦАГиП имени

академика В.И. Кулакова» Минздрава России в период с ноября 2013 по апрель

2016 года было обследовано 287 женщин. Основную группу (группу 1) составили

9

163 пациентки с высоким риском развития СГЯ («гиперответом» на стимуляцию

суперовуляции), группу сравнения (группу 2) - 124 пациентки с низким риском

развития СГЯ (с «нормальным» овариальным ответом). Исходя из того, что у

части пациенток обеих групп СГЯ развился, было выделено по 2 подгруппы в

каждой из двух групп (1б и 2б): пациентки с манифестировавшим СГЯ. В данные

подгруппы вошло 63 пациентки с клинически значимым СГЯ (средней и тяжелой

степени), госпитализированные в стационар в период с 2013 по 2016 годы, в том

числе 16 пациенток, которым программа ЭКО была проведена в НЦАГиП им.

В.И. Кулакова и 47 женщин, которым программа проводилась в других клиниках

ВРТ. Из исследования были исключены 4 пациентки группы риска с

манифестировавшим СГЯ, которым не было проведено мер профилактики.

Всем пациенткам проведено клинико-лабораторное обследование в

соответствии с приказом № 107н Минздрава России от 30 августа 2012 года “О

порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий,

противопоказаниях и ограничениях к их применению”.

Пациенткам проводили программу ЭКО по стандартному протоколу c

антГнРГ. Стимуляция яичников проводилась препаратами рФСГ. Подбор

стартовой дозы индуктора осуществляли исходя из параметров овариального

резерва пациенток (возраст, уровень ФСГ, АМГ, количество антральных

фолликулов и ответ на предыдущую стимуляцию). Для пациенток с высоким

риском СГЯ (> 14 антральных фолликулов, уровень АМГ >3 нг/мл), стартовая

доза рФСГ не превышала 200 МЕ. Дозу индуктора увеличивали или снижали в

зависимости от ответа яичников на проводимую стимуляцию. Пациенткам,

исходно составлявшим группу риска СГЯ по ряду клинико-лабораторных

параметров (АМГ, число антральных и растущих фолликулов), проводились

профилактические мероприятия, направленные на предотвращение СГЯ: замена

триггера овуляции на аГнРГ, назначение препаратов агонистов допаминовых

рецепторов 2 типа после трансвагинальной пункции (ТВП), отмена переноса

эмбрионов, введение 0,75 мг антГнРГ в день ТВП с целью блокирования

10

гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы у ряда пациенток с планируемой

отменой переноса эмбрионов.

При манифестации клинически значимого СГЯ проводили комплексную

терапию, направленную на купирование симптомов СГЯ. Тяжесть СГЯ оценивали

по модифицированной классификации (Российская ассоциация репродукции

человека (РАРЧ), 2011).

Всем пациенткам проведено исследование широкой панели генетических

маркеров, потенциально участвующих в развитии и клинических проявлениях

СГЯ: IL18: -137 G>C, ICAM1 721 G>A (Gly241Arg), IL18 -656 C>A, VEGFA -2578(-

2595) A>C, BSG: 3800 C>T, AMH 146 G>T (Ile49Ser), VEGFA 936 C>T, IL2 166

G>T (Leu38Leu), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), EDN1 G>T (Lys198Asn), VEGFA -

634 G>C, IL6 174 C>G, AMHR2 (-482 A>G), EDNRA C>T (H323H), FSHR 2039

G>A (Ser680Asn), IL1R1 1970 C>T [Pst1], INHA -16 C>T, ESR1–351 A>G [XBaI],

LHCGR 872 A>G (Asn291Ser), TNF -308 G>A, SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G),

IL1B -598(-1552) T>C, ESR1 –397 T>C [PvuII], IL2 -330 T>G, TNF -238 G>A, IL1B -

31 T>C, ESR2 G>A, IL18 -607 G>T, TSHR 2181 C>G (Asp727Glu), IL8 -251 A>T,

ACE 287bp Ins>Del. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для проведения

генотипирования выделяли из образцов периферической крови. Определение

замен однонуклеотидных последовательностей проводили методом полимеразной

цепной реакции (ПЦР) с анализом кривых плавления.

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы

IPM SРSS Statistics, версия 21. Статистически значимыми считали отличия при

р<0,05 (95% уровень значимости).

Для создания математической модели использовался метод бинарной

логистической регрессии методом обратной селекции. Оценка качества

полученных моделей проводилась с помощью ROC-анализа.

11

Результаты собственных исследований и их обсуждение

На первом этапе исследования были изучены клинико-анамнестические

особенности пациенток с высоким и низким риском СГЯ (по клинико-

лабораторным маркерам), проанализированы основные параметры

стимулированного цикла и эмбриогенеза. Результаты сравнительного анализа

клинико – анамнестических и лабораторных данных пациенток двух групп

показали, что исследуемые пациентки были соматически здоровы. Отмечено

уменьшение среднего возраста пациенток группы риска развития СГЯ (медиана -

31 год (интерквартильный интервал 28–33 лет)) по сравнению со средним

возрастом пациенток без риска развития СГЯ (32 года (интерквартильный

интервал 28,2–35,0 лет)), что коррелирует с данными зарубежной литературы, где

более молодой возраст пациентки является одним из факторов риска развития

СГЯ (С. Boothroyd, 2015). Также у пациенток основной группы отмечено

значимое удлинение менструального цикла: средняя продолжительность

менструального цикла составила 31,4±0,6 дней, против 28,8±0,1 дней в группе

сравнения. На момент вступления в программу ЭКО все пациентки имели

регулярный ритм менструаций, однако у 7,5% женщин группы риска развития

СГЯ в анамнезе отмечены нарушения менструального цикла по типу

олигоменореи. Указанные нарушения менструального цикла рассматривают как

признак мультифолликулярных яичников и фактор риска развития СГЯ (R. Briggs,

2015).

Также обращало на себя внимание уменьшение количества пациенток с

вторичным бесплодием в группе риска СГЯ и, как следствие, значимо более

низкий показатель количества беременностей и искусственных абортов в

анамнезе. Данные различия можно объяснить более молодым возрастом женщин с

риском СГЯ. При оценке гормонального профиля пациенток исследуемых групп

отмечено статистически значимое повышение уровня АМГ в группе риска

развития СГЯ (Ме 6,2 нг/мл) по сравнению с группой «нормоответа» (Ме 2,3

нг/мл), что обусловлено критериями отбора групп. По другим гормональным

12

показателям пациентки обеих групп были сопоставимы. Принципиальные

различия были выявлены при сравнении параметров стимулированного цикла и

эмбриологических показателей у пациенток обеих групп. Так, в основной группе

отмечено увеличение числа антральных фолликулов, количества фолликулов

диаметром >11 мм на день введения триггера овуляции, и, как следствие,

количества полученных ооцитов, зрелых ооцитов, зигот и частоты дробления по

сравнению с пациентками без риска СГЯ, что также обусловлено критериями

отбора групп. Также в группе риска развития СГЯ отмечалось снижение

показателей стартовой и суммарной доз гонадотропинов, что является важной

мерой профилактики развития СГЯ на этапе стимуляции суперовуляции в

программе ЭКО (C. Nastri, 2015; V. Smith, 2015). Выявленные различия в дозах

гонадотропинов можно объяснить их тщательным выбором для пациенток группы

риска развития СГЯ, однако, несмотря на подбор адекватных доз препаратов

рФСГ и применение «мягких» протоколов стимуляции, у части пациенток данной

группы СГЯ развился. Также было выявлено статистически значимое уменьшение

переносов эмбрионов в группе риска развития СГЯ (р=0,0001), что объясняется

применением мероприятий, направленных на профилактику развития СГЯ у

пациенток группы риска. Тем же можно объяснить большее количество

эмбрионов, подвергнутых криоконсервации, в основной группе, превышавшее в

три раза данный показатель среди пациенток группы сравнения (р=0,0001).

Несмотря на проведение профилактических мероприятий у 159 пациенток

группы риска, СГЯ развился у 49 (30,8%) женщин, что согласуется с данными M.

Banker (2015), S. Santos-Ribeirо (2015) и A. Gurbuz (2016) о манифестации СГЯ

вне зависимости от проведенных мер профилактики.

С целью изучения прогностической значимости клинико-лабораторных

маркеров (возраст, ИМТ, базальный уровень ФСГ, уровень АМГ, число

антральных фолликулов, фолликулов диаметром >11 мм в день назначения

триггера овуляции и количество полученных ооцитов) в развитии СГЯ на

различных этапах проведения программы ЭКО проведен ROC-анализ, результаты

которого показали, что наиболее значимыми клинико-

13

лабораторными предикторами являются АМГ и число антральных фолликулов.

Для остальных маркеров площадь под кривой составила < 0,6, что говорит о

неудовлетворительной модели. Было установлено, что пороговое значение АМГ

в 3,7 нг/мл (чувствительность 82%, специфичность 54%) и число антральных

фолликулов ≥ 14 (чувствительность 84%, специфичность 47%) прогнозируют

развитие СГЯ. Оценка вышеуказанных параметров имеет важное значение в

группе риска развития СГЯ, однако важно отметить, что прогноз нормального

овариального ответа на стимуляцию суперовуляции, основанный на клинико-

лабораторных параметрах, исходно ожидаемый у 124 пациенток, не оправдался,

поскольку у 10 (8,0%) из них развился клинически значимый СГЯ. Полученные

данные согласуются с данными зарубежных исследований, также

демонстрирующих, что, несмотря на то, что возраст, АМГ, число антральных и

растущих фолликулов являются важными маркерами, бесспорно имеющими

прикладное значение в аспекте прогнозирования СГЯ, их прогностическая

ценность не оптимальна, и принципиально новым подходом является

формирование группы риска СГЯ исходя из особенностей генотипа пациенток

(M. Dieterich, 2010; А. Marzal, 2012).

В связи с тем, что клинически значимый СГЯ развился не только среди

пациенток с «гиперответом», но и с «нормальным» ответом яичников на

стимуляцию суперовуляции, пациентки с манифестировавшим СГЯ были

разделены на две группы - пациентки с развившимся СГЯ из группы риска (1b) и

пациентки с развившимся СГЯ, не имевшие риска развития СГЯ (2b). Несмотря

на малочисленную выборку группы 2b (10 человек), были выявлены значимые

различия, представляющие определенный интерес и требующие более подробных

исследований на больших выборках. Так, при проведении сравнительного анализа

пациенток с манифестировавшим СГЯ, не было выявлено различий в клинико-

анамнестических данных пациенток, однако, обращало на себя внимание

увеличение частоты аллергических реакций у пациенток без исходного риска

развития СГЯ (50% и 10,2%; р=0,002), что согласуется с результатами A. Enskog

(1999) и K. Fiedler (2012), и свидетельствует о повышенной иммунологической

14

реактивности организма как предикторе развития СГЯ. Вышеуказанное

подтверждает вклад аллергической предрасположенности в развитие синдрома

воспалительного ответа как важного компонента патофизиологии СГЯ (A.

Delvigne, 2002).

При анализе начала манифестации СГЯ также были получены значимые

различия, заключавшиеся в более частом развитии раннего СГЯ в группе

пациентокc риском развития СГЯ по клинико-лабораторным параметрам (77,5% и

30%), и, напротив, большее количество позднего СГЯ у женщин без риска

развития СГЯ (70% и 22,4%); р=0,003.

Полученные данные наводят на мысль о различиях в механизмах развития

СГЯ в двух группах. В группе пациенток с исходным риском СГЯ проведенные

профилактические мероприятия (применение «мягких» протоколов стимуляции,

замена триггера овуляции на аГнРГ, использование препаратов агонистов

допаминовых рецепторов 2 типа) были направлены, в первую очередь, на

предотвращение раннего СГЯ, который манифестировал, несмотря на

примененные меры профилактики. Очевидно, что в группе пациенток, где

исходного риска СГЯ не было, развитие позднего СГЯ связано с повышением

эндогенного ХГч в ответ на имплантацию эмбрионов. Развитие раннего СГЯ в

группе с исходным «нормоответом» связано, по-видимому, с генетическими

особенностями овариального ответа на стимуляцию суперовуляции. Многие

авторы отмечают тот факт, что все профилактические мероприятия, применяемые

на этапе начала стимуляции (низкие дозы гонадотропинов) и по ее окончании

(использование аГнРГ в качестве триггера овуляции, назначение препаратов

агонистов допаминовых рецепторов 2-го типа), оказывают свое действие лишь на

ранние формы СГЯ, не предотвращая поздний СГЯ, а в ряде случаев вовсе не

оказывая необходимого эффекта (S. Santos-Ribeirо, 2015; E. Borges, 2016).

При анализе особенностей клинического течения СГЯ не было выявлено

различий в степени его тяжести. Так, у большинства пациентов обеих групп

развился СГЯ средней степени тяжести (77,6% в группе 1b и 80% в группе 2b).

15

Учитывая выявленные различия во времени начала манифестации СГЯ, с

целью прогнозирования развития ранней и поздней форм СГЯ был проведен

ROC-анализ ассоциации раннего и позднего СГЯ с общепринятыми клинико-

лабораторными маркерами (возраст, ИМТ, базальный уровень ФСГ, уровень

АМГ, число антральных фолликулов, фолликулов диаметром >11 мм в день

назначения триггера овуляции и количество полученных ооцитов), из которых

значимыми предикторами развития раннего СГЯ оказались лишь АМГ (AUC -

0,677 (95% 0,602-0,751)) и число антральных фолликулов (AUC - 0,664 (95%

0,585-0,742)) (рис.1). При проведении ROC-анализа зависимости развития

поздней формы СГЯ от клинико-лабораторных маркеров не было выявлено

значимых предикторов (AUC < 0,6).

Рисунок 1. ROC-анализ зависимости развития ранней и поздней форм СГЯ от

АМГ и числа антральных фолликулов.

Результаты проведенного анализа свидетельствуют о недостаточной

прогностической значимости клинико-лабораторных маркеров при

прогнозировании поздней формы СГЯ.

Учитывая полученные данные о невысокой прогностической ценности

клинико-лабораторных маркеров, проведен поиск генетических предикторов

16

развития СГЯ. При анализе распределения генотипов исследуемых генов

выявлена ассоциация генотипа С/С гена TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) с развитием

СГЯ (рис.2).

Рисунок 2. Распределение аллелей гена TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) в

зависимости от факта развития СГЯ.

С целью создания комплексного многофакторного прогностического

алгоритма проведено математическое моделирование, подтвердившее тот факт,

что ген TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) является независимым маркером развития

как ранней, так и поздней форм СГЯ, что может объясняться структурной

гомологией ТТГ-рецептора с рецептором ХГч. Проведен поиск генетических

маркеров, ассоциированных с СГЯ средней и тяжелой степени. При анализе

распределения частоты генотипов исследуемых генов в зависимости от степени

тяжести СГЯ выявлена статистически значимая ассоциация полиморфизма

гена TSHR 2181 и гена VEGFA: 936 с развитием СГЯ тяжелой степени (рис.3).

83,1%

16,9%

0,0%

70,9%

25,9%

2,2%

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

С/С С/G G/G

СГЯ развился

СГЯ не развился

р=0,042

17

TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) VEGFA 936 C>T

Рисунок 3. Распределение аллелей генов TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) и VEGFA

936 C>T в зависимости от степени тяжести течения СГЯ.

Далее был проведен поиск генетических маркеров, ассоциированных со

временем начала манифестации СГЯ, по результатам которого была выявлена

статистически значимая ассоциация двух полиморфных

локусов гена VEGFA (VEGFA -2578(-2595) A>C [rs699947] (р=0,047; ОШ=0,62

(95% ДИ 0,39-1,00) и VEGFA 936 C>T [rs3025039] (р=0,017; ОШ= 2,03 (95% ДИ

1,12-3,65)) и пограничная значимость третьего локуса (VEGFA -634 G>C

[rs2010963] (р=0,069; ОШ= 1,85 (95% ДИ 0,94-3,62)) с развитием ранней формы

СГЯ. Также была выявлена статистически значимая ассоциация полиморфизма

генов AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] (р=0,025; ОШ=1,85 (95% (1,07-3,19)) и

FSHR 2039 G>A (Asn680Ser) [rs6166] (р=0,045; ОШ=0,62 (95% (0,39-0,99)) с

ранним СГЯ.

В предикцию позднего СГЯ существенный вклад внесли полиморфизм генов

TSHR:2181С>G (Asp727Glu) [rs1991517] (р=0,048; ОШ=5,95 (95% (0,80-44,07)),

ESR1 -351 A>G [Xbal] [rs9340799] (р=0,008; ОШ= 2,45 (95% ДИ 1,24-4,84)), а

также отмечена пограничная ассоциация гена VEGFA-634 G>C [rs 2010963]

(р=0,059; ОШ= 3,77 (95% ДИ 0,87-16,41), АCE 287bp Ins>Del ((ALU)/-) [rs4340]

(р=0,061; ОШ=1,98 (95% (0,96-4,11)) и EDN1 G>T (Lys198Asn) [rs5370] (р=0,070;

ОШ=0,52 (95% (0,25-1,07) (рис.4).

96% 77%

4% 23%

0%

50%

100%

150%

Средняя степень

Тяжелая степень

G

С 84% 65%

16% 35%

0%

50%

100%

Средняя степень

Тяжелая степень

T

C

18

Рисунок 4. Различия в распределении аллелей при ранней и поздней формах

СГЯ.

С целью создания комплексного многофакторного прогностического

алгоритма проведено математическое моделирование с построением бинарной

логистической регрессионной модели. Проведенный анализ позволил выявить

факт развития раннего СГЯ на основании генотипа пациентки. На завершающей

стадии анализа остались пять переменных: VEGFA -2578(-2595) A>C [rs699947],

VEGFA 936 C>T [rs3025039], LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs 2293275], ESR1 -

351 A>G [Xbal] [rs9340799] и TSHR 2181 C>G (Asp727Glu) [rs1991517]. Часть

дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных пяти генотипов,

составляет 25,7%. Такой же анализ был проведен с целью выявления значимых

генетических предикторов поздней формы СГЯ. На завершающей стадии анализа

остались три переменные, а именно: ESR1 -351 A>G [Xbal] [rs9340799], TSHR

2181 C>G (Asp727Glu) [rs1991517] и АCE 287bp Ins>Del ((ALU)/-)[rs4340]. Часть

дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных трех генотипов,

составляет 24,4%.

- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

- Lo

g(p

)

Ранний СГЯ

Поздний СГЯ

порог статистической значимости

19

В настоящем исследовании впервые выявлена ассоциация особенностей

клинического течения СГЯ с генотипом пациентки, что может свидетельствовать

о принципиальных различиях в молекулярных механизмах развития ранней и

поздней форм данного осложнения, что позволяет рассматривать их как две

независимые нозологические формы.

Таким образом, несмотря на многообразие функциональных клинико-

лабораторных параметров, наиболее объективными могут считаться лишь

некоторые из них. Исследование молекулярно-генетических маркеров открывает

новые перспективы для развития стратегий прогнозирования риска данного

осложнения и персонализации программ ВРТ. Учитывая высокую специфичность

генетического тестирования, перспективным представляется разработка

алгоритма двухэтапного скрининга, включающего генотипирование пациенток

при выявлении клинико-лабораторных предикторов СГЯ.

На основании полученных результатов разработан алгоритм

персонализированного проведения программ ВРТ с учетом клинико-

лабораторных и молекулярно-генетических маркеров (рис.5), в соответствии с

которым пациенткам с предполагаемым «нормальным» и «чрезмерным» ответом

на стимуляцию суперовуляции, на этапе подготовки к программе ЭКО с целью

оценки риска СГЯ показано определение АМГ и числа антральных фолликулов, а

также определение генотипа по гену TSHR 2181 C>G. Пациенткам, не имеющим

исходного риска развития СГЯ (АМГ<3,7 нг/мл, <14 антральных фолликулов) без

генотипа риска (TSHR 2181 С/С), проведение профилактических мер не требуется.

При выявлении генотипа TSHR 2181 С/С как при наличии риска развития СГЯ по

клинико-лабораторным предикторам, так и без риска, рекомендуется проведение

генотипирования для выявление генотипов, связанных с развитием раннего и

позднего СГЯ. При выявлении генотипа VEGFA -2578(-2595) A/C, носительства

аллеля Т гена VEGFA 936 C>T, а также носительства аллеля LHCGR 935G

(Asn312Ser) и аллеля ESR1-351 A [Xbal], ассоциированных с развитием раннего

СГЯ, следует провести профилактику раннего СГЯ на начальных этапах

программы ЭКО («мягкие» схемы гонадотропной стимуляции, замена триггера

20

овуляции и применение препаратов агонистов допаминовых рецепторов 2 типа

после ТВП). При выявлении носительства аллеля ESR1-351G [Xbal], а также

генотипа АCE 287bp Ins/Ins, в связи с повышенным риском развития позднего

СГЯ, следует рекомендовать введение 0,75 мг антГнРГ п/к в день ТВП и

«сегментацию» цикла (отмена переноса эмбрионов в лечебном цикле, их

криоконсервация с целью переноса в следующих циклах).

TSHR 2181 C>G

(Asp727Glu)C/C */G

«Мягкие» схемы стимуляции, замена

триггера овуляции, применение

препаратов агонистов допаминовых

АCE 287bp Ins>Del ESR1 -351 A>G

Риск

позднего

Отмена ПЭ в

лечебном цикле +

введение 0,75 мг

Риск

раннего

VEGFA 936 T LHCGR 935G VEGFA -2578 A/C

Клинико-лабораторные предикторы

Риск СГЯ Нет риска

Проведение профилактических мер обязательно Проведение

профилактических

мер

нецелесообразно

АМГ>3,7 нг/мл; >14

антральных фолликулов

АМГ<3,7 нг/мл; <14

антральных фолликулов

Молекулярно-генетические предикторы

21

Рисунок 5. Алгоритм персонифицированного проведения программ ВРТ с учетом

клинико-лабораторных и молекулярно–генетических маркеров

ВЫВОДЫ

1. Пациентки группы риска развития СГЯ характеризуются более молодым

возрастом (средний возраст - 31 год; р=0,022), большей длительностью

менструального цикла (средняя продолжительность - 31,4 дня; р=0,0001),

меньшим количеством беременностей в анамнезе (р=0,0001), а также более

высоким значением АМГ (средний показатель – 6,2 нг/мл; р=0,0001) по

сравнению с пациентками без риска развития СГЯ.

2. Параметры стимулированного цикла пациенток группы риска СГЯ по

сравнению с пациентками без риска СГЯ характеризуют большее число

антральных фолликулов (21,9±0,5 и 10,4±0,2; р=0,0001), растущих фолликулов >

11 мм на день введения триггера овуляции (19,1±0,5 и 9,8±0,2; р=0,0001) при

более низких стартовых (175,0±2,6 МЕ и 222,1±3,7 МЕ; р=0,0001) и суммарных

(1621,2±37,2 МЕ и 1910,7±31,4; р=0,0001) дозах гонадотропинов, а также большее

количество ооцитов (17,6±0,5 и 9,3±0,2; р=0,0001), в том числе зрелых (13,5±0,5 и

7,4±0,2; р=0,0001), зигот (11,1±0,4 и 6,0±0,2; р=0,0001) и эмбрионов на стадии

дробления (10,5±0,4 и 5,6±0,2; р=0,0001), при переносах меньшего количества

эмбрионов (0,9±0,7 и 1,7±0,1; р=0,0001).

3. Наиболее значимыми клинико-лабораторными предикторами СГЯ являются

уровень АМГ (пороговое значение - 3,7 нг/мл, с чувствительностью 82% и

специфичностью 54%) и число антральных фолликулов (пороговое значение - 14

антральных фолликулов, с чувствительностью 84% и специфичностью 47%).

4. Универсальным генетическим предиктором развития СГЯ, независимо от

наличия клинико-лабораторных маркеров риска, является генотип TSHR 2181 C/С

(Asp727Asp). Развитие СГЯ тяжелой степени ассоциировано с носительством

аллеля G полиморфного локуса гена TSHR 2181 C>G и аллеля 936T VEGFA.

5. Наиболее значимыми в прогнозировании раннего СГЯ являются АМГ (AUC -

0,677 (95% 0,602-0,751)) и число антральных фолликулов (AUC - 0,664 (95%

22

0,585-0,742)). Основными молекулярно-генетическими предикторами развития

ранних форм СГЯ являются представители маркеров сосудистой проницаемости:

генотип VEGFA -2578(-2595) A/C, носительство аллеля Т гена VEGFA 936 C>T, а

также носительство аллеля LHCGR 935G (Asn312Ser) и аллеля ESR1-351A [Xbal].

6. Клинико-лабораторные маркеры прогнозируют только ранний СГЯ, их

прогностическая значимость при прогнозировании позднего СГЯ не оптимальна.

Ключевыми генетическими маркерами в развитии позднего СГЯ являются

носительство аллеля ESR1-351G [Xbal], а также генотипа АCE 287bp Ins/Ins.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При прогнозировании риска СГЯ нецелесообразно ориентироваться только

на ряд клинико-лабораторных маркеров, используемых до начала стимуляции

суперовуляции, таких как возраст, ИМТ и базальный уровень ФСГ, а также на

предикторы, используемые в процессе стимуляции суперовуляции (количество

фолликулов диаметром >11 мм на день введения триггера овуляции и количество

полученных ооцитов), ввиду их невысокой прогностической ценности.

2. Пациенткам, обратившимся для лечения бесплодия в программе ЭКО, на

этапе подготовки к программе с целью оценки риска СГЯ показано определение

клинико-лабораторных параметров (АМГ и числа антральных фолликулов), а

также определение генотипа TSHR 2181 C>G.

3. При выявлении носительства генотипа TSHR 2181 С/С как при наличии риска

развития СГЯ по клинико-лабораторным предикторам, так и без риска,

рекомендуется определение генотипа по генам ESR1-351G [Xbal], АCE 287bp

Ins/Ins, VEGFA 936 C>T, VEGFA -2578(-2595) A/C и LHCGR 935G (Asn312Ser).

4. При носительстве аллеля G гена TSHR 2181 C>G и/или аллеля 936T VEGFA,

ассоциированных с СГЯ тяжелой степени, пациенткам с исходным риском

развития СГЯ, необходимо проведение «двойных» мер профилактики:

использование «мягких» схем стимуляции, замена триггера овуляции, введение

0,75 мг антГнРГ подкожно в день ТВП, а также проведение «сегментации» цикла

(отмена переноса эмбрионов в лечебном цикле и их криоконсервация).

23

5. При выявлении генотипа VEGFA -2578(-2595) A/C, носительства аллеля Т

гена VEGFA 936 C>T, а также носительства аллеля LHCGR 935G (Asn312Ser) и

аллеля ESR1-351 A [Xbal], ассоциированных с развитием раннего СГЯ, следует

провести профилактику развития ранней формы СГЯ на начальных этапах

программы ЭКО («мягкие» схемы гонадотропной стимуляции, замена триггера

овуляции и применение препаратов агонистов допаминовых рецепторов 2 типа

после ТВП).

6. При выявлении носительства аллеля ESR1-351G [Xbal], а также генотипа

АCE 287bp Ins/Ins, в связи с повышенным риском развития позднего СГЯ, следует

рекомендовать отмену переноса эмбрионов в лечебном цикле, а также подкожное

введение 0,75 мг антГнРГ в день трансвагинальной пункции.

7. Пациенткам без исходного риска развития СГЯ (АМГ<3,7 нг/мл, <14

антральных фолликулов), не имеющих генотипа риска TSHR 2181 С/С,

проведение профилактических мер не требуется.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние поддержки лютеиновой фазы цикла агонистом гонадотропин –

рилизинг гормона на исходы программ ЭКО / Е.М. Галлямова, С.Г. Перминова,

Е.В. Митюрина, Д.А. Стрельченко // Акушерство и гинекология. – 2015. - №7.

– С. 48-55.

2. Предикторы синдрома гиперстимуляции яичников в программе ЭКО / Д.А.

Стрельченко, А.Е. Донников, С.Г. Перминова // Акушерство и гинекология. –

2015. - №10. – С. 19-26.

3. Молекулярно-генетические предикторы развития синдрома

гиперстимуляции яичников в программе экстракорпорального оплодотворения /

Д.А. Стрельченко, А.Е. Донников, С.Г. Перминова, В.В. Кадочникова, Д.Д.

Абрамов, И.Е. Корнеева, Т.Т. Сароян, А.Н. Абубакиров. // Акушерство и

гинекология. – 2016. - №4. – С. 56-63.

4. Влияние поддержки лютеиновой фазы агонистом гонадотропин – рилизинг

гормона на рецептивность эндометрия и исходы программы ЭКО / Е.М.

24

Савельева, С.Г. Перминова, Т.А. Демура, Д.А. Стрельченко // Гинекология. –

2016. - №3. – С. 80-87.

5. Генетическая предрасположенность к развитию синдрома гиперстимуляции

яичников тяжелой степени в программе экстракорпорального оплодотворения у

пациентки с нормальным овариальным ответом: клиническое наблюдение / Д.А.

Стрельченко, А.Е. Донников, С.Г. Перминова, Е.М. Савельева // Акушерство и

гинекология. – 2016. - №5. – С. 149-153.