Oppsummering av immunologikurs

Bjarte G. Solheim

Dag 1

• Presipitasjon, dobbeldiffusjon i agarose

• Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA)

• Hemolyse

• Agglutinasjon

Dobbeldiffusjon i agarose

ELISA

• Bestemmelse mengden av anti-HBsAg i blod

AF substrat tilsettes Gulfarge avlesesjo mer As jo mer

gulfarge!

p-nitrofenylfosfat

Vask

3 6 12 24

OD

IE antistoff mot HBsAg / liter

Hemolyse

C1q binder ikke Anti-A i serum

binding tilantigen

C4

A A A A

C4bC4a+

videre komplement-aktivering, cellelyse

spalting av C4

A A

aggregering av IgG

A A A A

Skrift kunne leses gjennom det hemolyserte blodet, men ikke gjennom blodlegemer i løsning.

Agglutinasjon

Erytrocytter Agglutinater

ABO-systemet A antigen

A-transferase

Karbohydrat- H-substans B-transferase B antigen antigen Manglende transferase

(Stumt gen) H substans ( O antigen )

GalFuc

GalFuc

NAcGal

GalFuc

Gal

A-transferase B-transferase

Aantigenet HsubstansOantigenet

Bantigenet

ABO-systemet• Det klinisk viktigste blodtypesystem

Mange antigener på blodlegemene Antistoffer rettet mot A- og B-egenskaper aktiverer komplement effektivt

Antistoffer av IgM-type dannes mot de antigener man mangler uten forutgående transfusjon el. svangerskap

Uforlikelige blodlegemer hemolyseres oftest av komplement straks de kommer i sirkulasjonen

• ABO-uforlikelige transfusjoner har > 10% dødelighet

• Forbytninger er viktigste årsak til ABO-uforlikelige transfusjoner

ABO-systemet

Individets Antistoffer mot

blodtype A-antigen B-antigen

O + +

A – +

B + –

AB – –

Transfusjon i ABO-systemet

For røde bllg. O

A B

AB

For plasma AB

A B

O

Irregulære reaksjoner ved ABO-typing

• ABO-typen bestemmes av blodlegemenes reaksjon med typereagens

• Reaksjonen mellom plasma og kontrollblodlegemer– tjener som kontroll på at det foreligger antistoffer mot de antigener pasienten

mangler i ABO-systemet

– ved irregulære reaksjoner ser vi uventede reaksjoner mellom plasma og kontrollblodlegemer

• Årsak til irregulære reaksjoner– alloantistoffer etter transfusjon eller svangerskap, reagerer med A1c el. Bc men

ikke med egne blodlegemer

– kuldeagglutininer, reagerer med både A1c, Bc og egne blodlegemer, agglutinatet løses opp ved 370 C, agglutinasjonen kommer tilbake etter avkjøling

– pengeruller, reaksjonen sees med alle celler, men blir borte etter 1x vask med saltvann

Alloantistoff Pengeruller

Rh-systemet• To nært koblete genloci: D og CE• Vanlige genotyper i norsk befolkning:

– DCe (R1), dce (r) og DcE (R2)

• Seks alleler: D og d, det siste er stumt CE, Ce, cE og ce Antigene er proteinmolekyler på erytrocyttoverflaten

Antall RhD-antigener: 10.000 - 20.000 pr. erytrocytt

Antistoff mot Rh-antigener aktiverer ikke komplement, men fører til Fc-reseptorbinding og fagocytose.

• Antistoffer dannes først etter transfusjon eller svangerskap. IgG dominerer antistoffsvaret.

Stimulering av lymfocytter med mitogen

Antigener og mitogener stimulerer lymfocytter til å gjennomgå en

blastoid transformasjon

Blastoid transformasjon

• Bare lymfocytter med en spesifikk reseptor for et antigen stimuleres av antigen– i praksis vil det være langt under 1 promille av

cellene

• Mitogener stimulerer imidlertid alle cellene i en gruppe lymfocytter– for eksempel B-lymfocytter eller T-lymfocytter

Zeta potensialet

-

-

-

-

-

--

-

-- -

-

-

-

-

-- -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

- --

-

-

--

---

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+ +

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

++

Positivt ladede poler på magneter frastøter hverandre

-

-

-

-

-

--

-

- --

-

-

-

-

---

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

--

-

--

-

-

--

---

-

-

-

-

--

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

+

++

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

Positivt ladede ioneskyer rundt erytrocytter frastøter hverandre

zeta-potensial

-

-

-

-

-

--

-

-- -

-

-

--

---

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

- --

-

--

----

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+ +

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

-

-

-

-

-

--

-

---

-

-

--

---

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

--

-

--

-

-

--

----

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

++

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

mindrefrastøtende

krefter

35 nm

IgM

-

-

-

-

-

--

-

-- -

-

-

-

-

-- -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

- --

-

-

--

---

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+ +

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

-

-

-

-

-

--

-

- --

-

-

-

-

---

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

--

-

--

-

-

--

---

-

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

++

+

+

+

++

+

+.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

Større frastøtendekrefter

14 nm

IgG

Direkte anti-globulin reaksjon• Et kanin-antistoff rettet mot humant immunglobulin

kan påvise humant immunglobulin som har seg festet til blodlegemer in vivo. Kanin-antistoffet bygger da bro over zetapotensialet.

• Problem:– blodlegemene er omgitt av plasma som inneholder store

mengder med immunglobulin

– for å kunne påvise humant antistoff på blodlegemene, må immunglobulinet i plasma vaskes bort. Ellers vil det løselige immunglobulinet nøytralisere kanin antistoffet

– skyldes en negativ reaksjon dårlig vask?

Direkte anti-globulin reaksjon

NaClsentrifugering

NaClSupernatant kastes

X3

Etter vask

Frie antistofferer vasket bort

Direkte anti-globulin reaksjonHumant antistoff Kanin anti-humant

IgG antistoff

+

“sekundær antistoff”“anti-globulin reagens”

HumantIgG

antistoffKanin anti-humant

IgG antistoff

+

“sekundær antistoff”antiglobulinreagensCoombs’ reagens

agglutinasjon

Kontroll av anti-globulin reaksjoner

• Alle negative prøver tilsettes 1 dråpe ”antistoffdekkete kontrollceller” som er RhD positive vaskete blodlegemer dekket med anti-RhD

• Ved riktig vask av negative prøver, vil de tilsatte antistoffdekkete kontrollcellene agglutinere

Direkte anti-globulin reaksjon

• Antistoffer mot egne blodlegemer finnes– hos nyfødte/fostre der mor har allo-antistoffer

rettet mot barnets blodtypeantigener. Bare antistoffer av IgG-type passerer placenta

– ved autoantistoffer mot erytrocytter– etter uforlikelige transfusjoner

Hemolyttisk sykdom hos foster eller nyfødte

• Anti-RhD fra mor kan føre til alvorlig anemi og høy bilirubin (dvs. hemolyttisk sykdom el. erytroblastose) hos nyfødte som er RhD-positive.

• Hos fostere vil bilirubin fjernes via placenta, og sykdommen gir seg uttrykk ved anemi. Etter fødselen utvikles også icterus.

• Behandling av alvorlig hemolyttisk sykdom er:– Etter fødselen: IVIg; evt. utskiftningstransfusjon der barnet tilføres RhD-

negative blodlegemer i AB-plasma. Man skifter vanligvis ut 2x barnets blodvolum.

– I svangerskapet: intrauterin transfusjon av konsentrerte erytrocytter. • Ved utskiftningstransfusjon:

– Blodlegemer må være forlikelige med morens plasma– Plasma må være forlikelig med barnets blodlegemer

Indirekte anti-globulin reaksjon

NaClsentrifugering

NaClSupernatantkastes

3x

Etter vask

Frie antistofferer vasketbort

Humant antistoff Kanin anti-humantIgG antistoff

+

“sekundær antistoff”“anti-globulin reagens”

HumantIgG

antistoffKanin anti-humant

IgG antistoff

+

“sekundær antistoff”antiglobulinreagensCoombs’ reagens

agglutinasjon

Donor eller screening blodlegemerinkuberes med pasientens plasmaved 370C i minst 30 minutter

Antistoffscreening

• Ved antistoffscreening undersøkes om en pasient har irregulære blodtypeantistoffer

• Pasientens plasma inkuberes med 2-4 nøye utvalgte blodlegemer av blodtype O. Disse uttrykker til sammen alle viktige blodtypeegenskaper i vår befolkning

• IgM antistoffer gir direkte agglutinasjon• IgG antistoffer påvises oftest med anti-globulin

reaksjonen

Type and Screen

• Blodtyping for ABO og RhD og samtidig antistoffscreening kalles ”type and screen”

• Alle større sykehus utfører i dag ”type and screen” av pasienter som kan bli transfu-sjonstrengende

• Dermed kan pasienter med irregulære antistoffer oppdages og disse antistoffers spesifisitet bestemmes.

Forlikelighetsprøver• Forlikelighetsprøver ved transfusjon

– Enkelt forlik påviser IgM antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved romtemperatur

• De vanligst påviste antistoffer er anti-A og anti-B pga. ABO-uforlik og forbytting. De utløser umiddelbar komplementbetinget hemolyse av erytrocytter

– Utvidet forlik med indirekte anti-globulinreaksjon påviser IgG antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved 370 C

• De påviste antistoffer skyldes immunisering etter transfusjon eller svangerskap. De fører sjelden til komplementbetinget hemolyse av erytrocyttene, derimot utløser de fagocytose gjennom Fc-reseptor-binding

Praksis ved sykehus

• Forliksprøveoppsett er avhengig av ”type and screen” resultat– Dersom ingen irregulære antistoffer er påvist

• utføres det bare enkelt forlik før transfusjon (kontroll på ABO-forlikelighet)

– Dersom irregulære antistoffer er identifisert• velges blod som antistoffene ikke reagerer med (forlikelig blod),

men det settes likevel opp både enkelt og utvidet forlik

– Resultatet av antistoff screeningen er gyldig i 4 døgn; deretter må det tas ny prøve av pasienten

Valg av blodprodukter• Erytrocytter skal være forlikelige med

pasientens plasma– Vi velger i utgangspunktet ABO og Rh(D)

forlikelige blodlegemer

• Dersom pasienten har fått påvist et irregulært alloantistoff, vil vi velge blodlegemer som ikke har det aktuelle antigen

• Ved transfusjon av plasma, skal plasmaet være forlikelig med pasientens blodlegemer

Før transfusjon utføres

• Enkelt forlik (siste ABO-kontroll!)• Utvidet forlik, dersom antistoffscreening er positiv

eller ikke er utført/er for gammel– Ved antistoffscreening undersøkes pasientens plasma på

alloantistoffer av IgG type mot alle vanlig forkommende blodtypeantigener. Man foretar da såkalt ”type and screen”.

– Dersom det ikke foreligger antistoffer mot disse antigener i en nylig gjennomført screening kan man gi blod uten å utføre utvidet forlik.

• I akuttsituasjoner prioriteres enkelt forlik

ANTISTOFFSCREENING OG FORLIKELIGHETSPRØVER

Enkelt forlik settes opp med alle aktuelle givere. Utvidet forlik settes bare opp på pasienter som har irregulært antistoff, dvs. positivt resultat med screening celle I og/el. II.Vurder resultatene av screening, enkelt og utvidet forlik og trekk konklusjonen om undersøkelsen viser at blodet fra de oppgitte giverne er forlikelig eller uforlikelig.Det skal være mulig å finne minst en giver for hver av pasientene.Resultatene av dagens oppsett blir gjennomgått i smågrupper etter hvert som studentene er ferdige.

Pasient plasma Screening celle I

(+ el. -)

Kontroll celle

(+ el. -)

Screening celle II

(+ el. -)

Kontroll celle

(+ el. -)

Ris - +/- - +/-

Aas + - +/-

Pasient Giver(plasma) (celler)

Enkelt forlik

( + eller - )

UtvidetForlik

( + el. - )

KontrollCeller

( + el. - )

Konklusjon(forlikelig eller

uforlikelig)

Ris 1 - ja

Ris 2 + nei

Aas 3 - - +/- ja

Aas 4 - - +/- ja

ANTISTOFFSCREENING

FORLIKELIGHETSPRØVER

Problemer ved forlik

• Enkelt forlik– Kuldeagglutininer– Pengeruller

• Se om også pasientens blodlegemer er agglutinert. I så fall undersøk om agglutinat i forlik og pasientblodlegemer løses opp ved oppvarming (kuldeagglutininer) eller vask (pengeruller)

• Utvidet forlik– Negativ reaksjon på grunn av dårlig vask

Blod er forlikelig

• Når enkelt forlik er negativt– Positivt enkelt forlik pga. kuldeagglutininer

eller pengeruller godkjennes som negativt, men transfusjon må evt. gis med oppvarmede blodlegemer ved kuldeagglutininer

• Når utvidet forlik er negativt og tilsetting av antistoffdekkede kontrollblodlegemer gir partiell agglutinasjon

Hva gjør man på blodbanker i dag?

• Type and screen– Pasienten blodtypes og undersøkes samtidig på

irregulære blodtypeantistoffer. Antistoffundersøkelsen gjentas hvert 4. døgn under sykehusoppholdet.

• Enkelt forlik

• Utvidet forlik bare hos pasienter med irregulære blodtypeantistoffer

• Elektronisk forlik kan erstatte enkelt forlik

Hvilke metoder benyttes på blodbanker i dag?

• Enkelt og utvidet forlik settes ofte opp slik som dere har gjort– Anvendes spesialløsninger kan inkuberingstider

kortes ned

• Blodtyping og antistoffscreening utføres i Norge oftest med gelkort teknik

Gelkort teknikk• Reaksjonen foregår enten

– I væskefasen over en gel og synliggjøres ved sentrifugering. Agglutinater blir liggende på geloverflaten, mens frie blodlegemer sentrifugeres ned i gelen.

• eller– Ved at gelen er tilsatt antistoffer. Disse reagerer med aktuelle

antigener og holder blodlegemene tilbake i de øvre lag av gelen.

• Ved anti-globulinreaksjon– Gelen er tilsatt anti-globulinreagens. Antistoffer i plasma

”vaskes” vekk når blodlegmene sentrifugeres ned i gelen. Når blodlegemer med antistoffer på overflaten kommer ned i gelen agglutineres de derfor av anti-globulinreagenset.

Gel-kort teknikk for påvisning av agglutinasjon

Positiv Negativ

Agglutinater er forstore til å passeremellom gelkulene

1. Tilsetting av røde blodlegemer til gel-brønnen

2. Inkubering (reaksjon med antistoff)

3. Sentrifugering

4. Avlesning

O RhDpos B RhDneg

PartiellPositiv Negativ

Anvendelse av gel-kort teknikken

Gel-kort teknikken kan benyttes til påvisning av agglutinasjon

ved ulike problemstillinger og trenger ingen vasking:• Blodtyping (som vist med ABO/RhD typingen nedenfor)• Antisoffpåvisning (antistoff-screening og utvidet forlik)• Direkte anti-globulin test

Partiell agglutinasjon er lett å påvise i gel-kort teknikk

4+ 2+ 1+3+ ABO/RhD typing

Antistoffscreening

Anti-globulinreagens i gelenScreeningcelle I+II

Anti-globulinreagens i gelen Screeningcelle III+IV