prenatal tanıda yeni ufuklar non İnvaziv prenatal...
TRANSCRIPT
Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar
Non İnvaziv Prenatal Test
Dr İsrael Aruh,
Kent hastanesi IVF Ünitesi
Direktörü
PRENATAL TEST: NIPT TEKNOLOJİSİNE
BAKIŞ
Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from
population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012.
53
13
5
8
5
16
Percent of Reported Chromosome Abnormalities
T21
T18
T13
45,X
Sex trisomy
Other rare
Kromozom Anomalilerinin Prenatal Görülme Sıklığı
Major fetal
aneuploidies
PRENATAL TARAMA SEÇENEKLERİ – RISK SCORE
ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007
Integrated
Screen
1st Trimester
1st Trimester
2nd Trimester
2nd Trimester
Serum
Integrated
64-70
82-87
69
81
94-96
85-88
Detection Rate
(%) Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate
.
GÜNÜMÜZDEKİ TANI SEÇENEKLERİ
KARYOTYPE
Kesin cevap, ancak girişimsel olup anne ve fetus için risk taşır.
Tarama testlerindeki yüksek yanlış pozitif oranlarından dolayı, çoğu
zaman gereksiz yere uygulanır.
1. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and
non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20.
2. Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6.
Trimester - Test Sensitivity Specificity
1st – CVS 99.25%1 98.65%1
2nd - Amniocentesis 99.4%2 99.5%2
.
PRENATAL TEST SPEKTRUMU
Serum
Screening
Amnio NIPT Combined Serum
Screens, NT, Ultra-
sound
SCREENING DIAGNOSTIC
TARAMA
Risk skorları biyokimyasal analiz
ve populasyon istatistikleri
kullanılarak elde edilir.
TANI
Sonuçlar tamamen genetik
faktörlere bağlıdır.
CVS
NIPT’NİN HEDEFLERİ NELERDİR?
Fetal,
maternal
riski
azaltmak
Yalancı
pozitifleri
azaltmak
Tüm
gebelere
kolay
uygulanır
olması
Yüksek
tespit
oranı
sağlama
MATERNAL KANDA FETAL DNA’NIN
İKİ KAYNAĞI:
• Fetal hücreler
• Tüm hücre popülasyonunun
milyarda biri
• İzolasyonu için mekanik ve
biyokimyasal yöntemler gerekir
• Cell-free DNA (cfDNA)
• Anne kanında maternal ve fetal
cfDNA birarada mevcuttur
• Total cfDNA’nın %2–20’si fetus’a
aittir
.
MATERNAL KANDA FETAL cfDNA
• Apoptosis sonucu salınır
• Fetal cfDNA plasentanın cytotrophoblastic
hücrelerinden salınır
• Kan dolaşımına küçük DNA
fragmentleri(150-200bp) olarak karışır
• 7+ gebelik haftasında güvenle tespit edilir
• Postpartum saatler içinde dolaşımdan
kaybolur
Gebelikte güvenli analiz edilebilen bir komponenttir
.
NIPT Metodları
MPSS
Targeted Sequencing
Massively Parallel
Shotgun Sequencing
Digital Analysis of Selected Regions+
Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation
COUNTING SNPs
DANS+FORTE
NIPT Metodları
Massively Parallel Shotgun
Sequencing
Targeted Sequencing
Sequenom MaterniT21
Verinata Verifi
Ariosa Harmony
Targeted Sequencing
Natera Panorama
COUNTING SNPs
Chrom 3 Chrom 21 Sayarak
Chrom 3 Chrom 21
Expected Amount: 20% 80%
Sayarak
Observed Amount: 25% 75%
Confidential and Privileged
Sayma Metodu
Collect (MPSS, Targeted)
Sequence
Assign/Map with Reference
Calculate ratio
Observed:Expected
Create result
Cell free DNA ve Fetal Fraksiyon
cfDNA comes from
apoptytic cells derived
from:
•Maternal
• Adipocytes
• Hematopoetic
system
•Fetal
• Placenta
(trophoblasts)
Fetal Fraction = Fetal DNA
Fetal DNA + Maternal DNA
Cell free DNA (cfDNA)
At 10% fetal DNA:
[1.5% x (90% maternal)]
+
[1.5 + 0.75 =2.25%] x (10%
fetal)]
= 1.575%
Chromosome 21 is 1.5%
of genome equivalents
(0.75 per chromo)
At 5% fetal DNA:
[1.5% x (95% maternal)]
+
[1.5 + 0.75 =2.25%] x (5%
fetal)]
= 1.530%
Difference of 0.03%
Kromozoma bağlı amplifikasyon değişimleri
Adapted from: Fan, Quake et al. 2008 PNAS
Average Counting
Sensitivity1,2,3,4
SNP Sensitivity5
Trisomy 21 99.67% >99%
Trisomy 18 98.5% >99%
Trisomy 13 86.4% >99%
1 Palomaki 2011
2 Bianchi 2012
3 Ashoor 2212
-“Özellikle G ve C’nin çok düşük veya fazla olduğu kromozomlarda,
amplifikasyon aşaması daha geniş varyasyonlara yol açar.”6
Sayma metodu DNA’daki bilgilerden ziyade DNA miktarına dayanır ve bu
nedenle bu varyasyonlardan daha çok etkilenir.
- SNP metodu ile kromozomdan kromozoma amplifikasyon değişimi elimine
edilerek, trizomi 13 ve seks kromozomlarındaki azalmış sensitivite ve
spesifisite sorunu önlenir.”6
4 Ashoor 2012
5 Nicolaides, 2013
6 Boon & Faas 2013
SNP’ler:
Genomdaki herhangi bir nükleotidin A,T,G ve C’nin DNA
sekanslarındaki dizilimindeki varyasyonlarından dolayı
değişimine SNP adı verilir. SNP’ler toplumlardaki doğal
genetik varyasyonların bir parçasıdır.
SNP-Bazlı Yaklaşım
Maternal
blood
Buffy coat =
Maternal
DNA
Plasma =
Maternal + Fetal
DNA
SNP
Sequencing
SNP
Sequencing Maternal
Genotype
Maternal +
Fetal Genotype
Fetal
Genotype
19,488 SNP simultane hedeflenir
SNP (NATUS) Algoritması kullanılarak Next-generation Anöploidi Testi
Genotypic Data
from Mom +/-
Dad
Sub-hypotheses with
different crossover
points
Data from Human
Genome Project
(HapMap)
+
Multiple hypotheses for
each chromosome
Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma
Compare
Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma
Compare
Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler
Sequencing
Measurements
from Maternal plasma Compare
Her koşul için
kişiselleştirilmiş risk
skoru
SNP profilinin çözülümü
Mother AA, Fetus AA
Mother AA, Fetus AB
Mother AB, Fetus AA
Mother AB, Fetus AB
Mother AB, Fetus BB
Mother BB, Fetus AB
Mother BB, Fetus BB
Mother AA, Fetus AAA
Mother AA, Fetus AAB
Mother AB, Fetus AAB
Mother AB, Fetus ABB
Mother BB, Fetus ABB
Mother BB, Fetus BBB
Disomy Trisomy
Mother AB, Fetus BBB
Mother AB, Fetus AAA
NATUS Algoritma Özeti
• Anne ve babadan fetüse geçen, ilgili kromozomlardaki (21,18,13,X,Y) tüm cross-over’lar dahil milyonlarca olası sonuç hipotezleri bilgisayar tarafından oluşturulur.
• Olası tüm sonuçlar fetüsün fragmente SNP profilleri ile karşılaştırılır
• Sonucu verebilmek için tüm eşleşmeler toplanıp maksimum olasılık bayesian analizi kullanılır
• Özelleştirilmiş risk skoru elde etmek için, SNP sayıları,, fetal fraksiyon,maternal yaş ve diğer örneğe bağlı faktörler kullanılır.
SNP-bazlı Yaklaşımın Avantajları
• Tüm otozomlarda daha tutarlı tespit oranı – Düşük veya yüksek GC içeriğinden
kaynaklanan kromozom amplifikasyonu önyargısından bağımsız
• Referans kromozoma ihtiyaç yok
• Düşük hata oranı
• Triploidiyi tespit edebilme
• Düşük fetal fraksiyonlarda daha hassas performans
Taken from http://wdic.net/word/snp
Neden Sayma Metodu Triploidiyi Tespit Edemez?
No difference
Triploidi Tespiti
• Sayma metodu triploidiyi tespit edememektedir – Sayma metodu uygulanan 8 olgu ‘’etkilenmemiş olarak”
raporlanmıştır (Bianchi 2012, Futch 2013)
– 2 kör çalışmada, 5 paternal triploidi olgusunun tamamı SNP metoduyla tespit edilmiştir.
Triploidi Tipleri
DIGYNIC DIANDRIC
Extra haplotypes
Maternal Paternal
Placenta Small, normal Large, cystic
Fetus Growth-restricted, often abnormal
Less affected
Biochemistry Very low free β-hCG and PAPP-A
free β-hCG 10X higher than normal
Other findings Partial Molar - Maternal complications
Vanishing Twin/Triploidi Sonucunu Alındığında Takip
• Vanishing twin/ Triploidi
– Eğer ikinci sak yok ve/veya anormal plasenta bulgusu mevcut ise, girişimsel tanı testi önerilir
Düşük Fetal cfDNA Fraksiyonu Tespit Oranını Düşürür
0
5
10
15
20
25
30
35
40
8 10 12 14 16 18 20 22 24
Feta
l Fra
ctio
n (
%)
Gestational Age (weeks)
9-14. gebelik haftasında anne
adaylarının %25’inde fetal fraksiyon oranı
%4-8 arasında saptanmıştır. (2,3)
% Fetal DNA
Fraction
Counting Down
Syndrome Sensitivity1
Panorama Down
Syndrome Sensitivity2
>8% >99% >99%
4-8% 75% >99%
1.Palomaki GE et al DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an interntional clinical validation
study. Genet Med 2011 Nov; 13(11):913-2
2. Natera Internal Data
3. Norton ME et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation(NICE) Study: results of a multicenter prospectgive cohort
study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. AJOB 2012;1.e1-1.e8
Fetal Fraksiyonun Önemi
“Son 1.5 yıl içerisinde, anöploidi tespiti için Dünya’da 100,000’den fazla DNA testi uygulanmış olup, test performansını etkileyen faktörler daha belirginleşmiştir. cffDNA’nın relatif oranı yani fetal fraksiyonun önemi kriktir.”
-- Lyn Chitty and Diana Bianchi Prenatal Diagnosis 2013, 33, 511–513
Fetal Fraksiyon Aralıkları
Fetal Fraction too
low to report
Intermediate fetal
fraction – decreased
sensitivity with
counting methodology
Fetal fraction adequate to
achieve best performance
Confidential and Privileged 63
What is this a picture of?Edges are minimum ff – so no call is made by anyone
<4% fetal fraction
Fetal fraksiyonun %4’ten düşük olduğu durumda puzzle’daki resim
aşağıdaki gibi gözükür. Sonuç alınamaz.
Confidential and Privileged 64
Missing moderate amount of pieces, but still making callPhoto of car and highway
4-8% fetal fraction, single rejection test
4-8% fetal fraksiyonda sayma metoduyla, puzzle’da halen eksik parçalar
bulunmasına rağmen, resim daha belirginleşti.
Confidential and Privileged 66
4-8% fetal fraction with metrics
Still have same amount of pieces, but now they are the right pieces -BUFFALO walking in the street
SNP metoduyla 4-8% fetal fraksiyonda puzzle parçaları daha
doğru yerleşerek resim daha nettir.
Confidential and Privileged
Reporting
SequenomMaterniT21
Plus
VerinataVerifi
AriosaHarmony
NateraPanorama
Reporting Method
PositiveNegative
DetectedNot Detected
Suspected
Risk score(mat age, fetal
fraction,1 metric)
Risk Score(mat age, fetal
fraction, multiple metrics)
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Confidential and Privileged
Low Risk Report
Confidential and Privileged
High Risk Report for Trisomy 21
53
FETAL FRACTION: 9.2%
Unable to Report – Low Fetal Fraction
FETAL FRACTION: 3.2%
Unable to Report – Redraw Recommended
• Spesifik bir örnekteki DNA fragmentlerine bağlı bir durum olduğu düşünülüp, yeni bir örneğin daha hassas bir sonuç verebileceği ihtimalinde tekrar bir kan örneği alınması istenebilir.
• Böyle bir sonucun gelmesi, gebelikte herhangi bir sorun olduğunu göstermez.
• Redraw önerilmesinin amacı daha hassas ve güvenilir bir sonuç alınabilmesini hedefler.
• Redraw önerildiğinde, 2. bir örneğin alınmasıyla %90 ihtimalle sonuç alınır.
• DÜŞÜK FETAL FRAKSİYON – <3.5% fetal fraksiyon
– Algoritmayla yüksek güvenirlikte sonuç alınamaz.
– Not:Diğer NIPT metodlarında fetal fraksiyon cutoff değeri %4’tür.
• DOES NOT PASS QUALITY METRICS -- – DNA daha az bilgi verici ise
("noisy" data)
– Algoritmanın yüksek güvenirlikte sonuç vermesinde güçlük olduğunda.
– Bunlar, total DNA miktarı (kombine maternal ve fetal DNA), okuma sayısı ve de hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için iyi kalitede veri sağlıyan diğer kontrol ölçümlerini içerir.
Unable to report – Redraw NOT recommended
• Uninformative DNA Pattern
– Vakaların <1%
– DNA yorumlanamıyorsa
– Bu hasta için klinik öykü tekrar dikkate alınıp takip ve/veya daha ileri tetkik seçenekleri önerilebilinir
• Fetal mozaisizm
• Maternal kromozom anomalileri veya mozaisizm
• Beklenenden fazla seviyedeki homozigosite (Haploblock)
• Egg donor or surrogate
NIPT IS A
INVASIVE PROCEDURE UPDATE BY MONTH (7/2010 THROUGH 3/2013)
NIPT’yi öneren kurumlar
Nisan 2013, TJOD İstanbul Şubesi
• Maternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffDNA) ile Non-Invasive Prenatal Test (NIPT)
• Uzman Görüşü
• Raporu onaylayanlar (soyadı sırasına göre); BAKSU Başak, BAŞARAN Seher,
BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GEDİKBAŞI Ali, GÜL Ahmet, HAS
Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, POLAT İbrahim, ŞAHİNOĞLU Zeki,
ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan,
YÜKSEL Atıl)
• cffDNA ile NIPT'nin olası kullanım alanları:
* Maternal yaşın 35 ve üstünde olması.
* Trizomi tarama testlerinin pozitif olması durumunda.
* Trizomi 21 ve 18 için spesifik ultrason belirteçlerinin varlığında.
* Trizomi 21 ve 18’li fetus / bebek öyküsünde.
* Parental dengeli robertsonian Trizomi 21 ve Trizomi 13 translokasyonu.
Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.
The performance of screening for trisomy 21 and trisomy 18 by NIPT using
chromosome-selective sequencing in a routine population is as effective as
previously reported in high-risk groups with DR 99% and FPR 1%.
Daha önce bildirilen yüksek risk gruplarındaki %99 tespit oranı ile %1’lik
yalancı pozitif oranı, trizomi 21 ve trizomi 18’in taramasında kromozom-selektif
sekanslama kullanılarak uygulanan NIPT performansı, rutin popülasyonlarda
da eşit derecededir.
Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.
On the basis of existing data, NIPT can potentially be used in universal
screening for trisomies 21 and 18 in all singleton pregnancies and the main
limiting factor for such widespread application of the test at present is the
associated cost.
Mevcut verilere göre, NIPT potansiyel olarak , tüm tekil gebeliklerin
trizomi 21 ve trizomi 18 açısından taramasında üniversal
kullanılabilinir. Günümüzde, yaygın uygulamayı sınırlayıcı esas
faktör testin maliyetidir.
Validation of targeted sequencing of single-nucleotide
polymorphisms for non-invasive prenatal detection of
chromosomes 13, 18, 21, X, and Y K.H. Nicolaides, A. Syngelaki, M. Gil, V. Atanasova and D. Markova
This blinded validation study has demonstrated that cfDNA testing
in maternal blood using targeted sequencing of SNPs at
chromosomes 13, 18, 21, X and Y and use of the NATUS algorithm
holds promise as an accurate method for detecting fetal
autosomal aneuplodies, sex chromosome aneuploidies and
triploidy in the first trimester of pregnancy.
Bu kör doğrulama çalışması, gebeliğin birinci trimestrinde
maternal kanda cfDNA testiyle, 13,18,21,X ve Y kromozomlarındaki
SNP’lere yönelik hedeflenmiş sekanslama ve NATUS algoritması
kullanımının fetal otozomal anöploidileri, seks kromozom
anöploidileri ve triplodiyi tespitte, gelecek vaad eden kesin bir
metod olduğunu göstermiştir.
Prenatal Diagnosis 2013 June, 33(6): 575-579
NIPT
DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI
1. NIPT kadınlar için mevcut prenatal test opsiyonları
spektrumunu genişletmiştir
2. Tarama sonucunun pozitif olduğu durumda, invaziv tanı
testi yerine, NIPT, kadınlar için bir alternatiftir.
• T18 and T21 için yüksek sensitivite ve spesifisite. (T13
performansı nispeten daha düşük)
NIPT
DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI
3. İnvaziv tanı testlerini kabule yanaşmayan kadınlar için, NIPT
güven verici ve rahatlatıcı bir seçenektir.
4. NIPT, girişime bağlı riski ortadan kaldırarak kadınların bu tip
testleri reddetme ihtimalini düşürür.
GELECEK UFUKLAR
• Düşük risk popülasyonlarda geniş kapsamlı çalışmalar
• Çoğul gebeliklerde çalışmalar
• Sub-kromozomal anomalilerin tespiti
• cfDNA ve gebelik komplikasyonları
• Tek örnekte NIPT + Maternal taşıyıcılık taraması
• Genetik sendromların tedavisi (Down v.s)
Teşekkürler!
Dr İsrael Aruh,
Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü