RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1716258

(13) T3

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

15.04.2005 05731459.3

(51) Int. Cl. C12R1/01 A23L1/03 A23B4/12 A23L1/314

(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:

31.03.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/13

EP 1716258 B1

(54) Tytuł wynalazku:

Sposób zmniejszenia zawartości organizmów patogennych obecnych w materiałach żywnościowych

(30)

Pierwszeństwo:

DK20040000596

15.04.2004

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

02.11.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/44

(45)

O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.09.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 09/2010

(73) Uprawniony z patentu:

Chr. Hansen A/S, Horsholm, DK

PL/

EP

1716

258

T3

(72) Twórca (y) wynalazku:

HELLER STAHNKE Marie Louise, Virum, DK

(74) Pełnomocnik:

Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Kossowska Janina 02-770 Warszawa 130 skr. poczt. 37

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP1 716 258B1

1

Dziedzina wynalazku

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny poprawiania bezpieczeństwa mikrobiologicznego w wytwarza-

niu produktów żywnościowych. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy szczepów mikroorganizmów

użytecznych dla zmniejszenia ilości organizmów patogennych np. – Listeria, gdy dodane są do fermentowa-

nych produktów żywnościowych, takich jak fermentowany produkt mięsny.

Stan techniki

[0002] Podczas wytwarzania fermentowanych produktów żywnościowych, takich jak np. produkty kiełbasia-

ne, kultury starterowe są najczęściej stosowane w celu kontrolowania procesu fermentacji, zamiast polega-

nia na naturalnie rozwijającej się florze. Zwykle, kultura starterowa zawiera kombinację jednej lub więcej

bakterii kwasu mlekowego (LAB) i jednego lub więcej rodzaju z rodzin Micrococcaceae i Staphylococcaceae.

Podczas procesu fermentacji bakterie kwasu mlekowego początkowo wytwarzają kwas mlekowy, dzięki któ-

remu pH spada do żądanej wartości pH, zależnie od kultury i warunków obróbki (temperatura, rodzaj

/zawartość cukru etc.) i produkowanego produktu żywnościowego.

[0003] Podczas gdy bakterie kwasu mlekowego są głównie odpowiedzialne za tworzenie się kwasu, Micro-

coccaceae spp. i Staphylococcaceae spp. są odpowiedzialne za zwiększenie tworzenia się zapachu przez

wytworzenie nielotnych i lotnych związków w różnych etapach reakcji biochemicznych. Dodatkowo, Micro-

coccaceae spp. i Streptococcaceae spp. są odpowiedzialne za szybkość i intensywność tworzenia się bar-

wy, w szczególności w fermentowanych rodzajach kiełbas.

[0004] Micrococcaceae spp. i Streptococcoceae spp. są bardzo wrażliwe na niskie pH, ponieważ ich wzrost

jest drastycznie spowolniony, gdy pH jest obniżone do pH poniżej 5,0. W np. wytwarzaniu suchych kiełbas

istotne jest dla tworzenia się zapachu i barwy produktów mięsnych, żeby profil zakwaszenia był dobrze kon-

trolowany i nie zmieniał się w zależności od partii. W szczególności, szybkie obniżenie pH może pogorszyć

jakość i w rezultacie dawać mniejszą dojrzałość i mniej złożony profil zapachowy, co zmusi producentów

produktów żywnościowych do wydłużenia dojrzewania produktów żywnościowych przez dłuższy czas w celu

osiągnięcia tej samej intensywności zapachu (Tjener i in., 2003).

[0005] Podczas wytwarzania fermentowanych produktów żywnościowych obecność organizmów patogen-

nych, takich jak Listeria monocytogenes, może stanowić problem, jeśli surowce są zanieczyszczone. Pod-

czas wytwarzania np. fermentowanych kiełbas ilość Listeria monocytogenes zwykle będzie zmniejszała się

podczas okresu fermentacji i dojrzewania, początkowo z powodu wytwarzania kwasu mlekowego, prowa-

dząc do spadku pH i z powodu zmniejszania się aktywności wody wywołanej późniejszym procesem susze-

nia. Jednakże, całkiem często znacząca ilość Listeria monocytogenes przeżywa. Może to powodować po-

ważny problem z bezpieczeństwem, ponieważ spożycie zainfekowanej żywności może powodować wzrost

śmiertelnych zakażeń (listerioz).

[0006] W celu zmniejszenia obecności mikroorganizmów patogennych w produkcie żywnościowym pewne

bakterie kwasu mlekowego produkujące bakteriocynę, w tym szczepy Pediococcus i pewne szczepy Lacto-

bacillus, dodaje się do kultury starterowej, aby produkowały bakteriocyny, z których niektóre zabijają i/lub

inaktywują patogenne organizmy i odpowiednio zmniejszają ich stężenie w produkcie.

[0007] Foegeding i in. (1992) ujawniają efektywność pediocyny wytwarzanej in situ przez Pediococcus acidi-

EP1 716 258B1

2

lactici jako składnika antylisteryjnego. Jednakże, fermentację kiełbas przeprowadzono w 38˚C, co powodo-

wało duże wytwarzanie kwasu i stąd bardzo szybki spadek pH. Jak wspomniano powyżej gwałtowne obniża-

nie pH pogarsza ogólną jakość produktu i powoduje obniżenie dojrzałości i mniej złożony profil zapachowy.

Zatem, niekorzystny wpływ Pediococcus acidilactici na ogólną jakość uzyskanego produktu, czyni ten spo-

sób nieodpowiednim dla fermentacji żywności, gdy zastosowano wyżej wspomniane warunki i charakterysty-

ki.

[0008] We wzorze użytkowym BA 1994 00266 ujawniono kulturę starterową bakterii kwasu mlekowego za-

wierającą wybrany Pediococcus spp wytwarzający bakteriocynę i wybrany Lactococcus wytwarzający bawa-

rycynę przydatny do hamowania patogennych organizmów np. Listeria, w produktach mięsnych, w tym, fer-

mentowanych produktach mięsnych.

[0009] W sposób oczywisty, Pediococcus spp. są często niedobrze sklasyfikowane, jako kultury starterowe

w wytwarzaniu produktów żywnościowych, chociaż te gatunki są znane z ich potencjału do zmniejszania

ilości organizmów patogennych np. Listeria.

[0010] Zatem, w przemyśle istnieje stała konieczność, aby móc zmniejszać ilość organizmów patogennych i

jednocześnie otrzymać optymalne właściwości fermentowanych produktów żywnościowych np. profil zakwa-

szenia, powstanie zapachu i barwy.

Streszczenie wynalazku

[0011] Zatem, w interesujących aspektach, dostarczone są sposoby do A) wytwarzania fermentowanego

produktu żywnościowego i B) zmniejszania stężenia Listeria spp (konkretnie Listeria monocytogenes) w

fermentowanych produktach żywnościowych.

Wymienione sposoby obejmują etapy:

(i) dostarczenia surowca żywnościowego,

(ii) zmieszania materiału żywnościowego z kulturą starterową dostarczając żądanej zmiany we właści-

wościach matrycy żywnościowej podczas fermentacji (np. żądanego zakwaszenia),

(iii) wymieszania materiału żywnościowego z co najmniej jedną kulturą wspomagającą w postaci Pedio-

coccus acidilactici wytwarzającego bakteriocynę,

(iv) poddania mieszaniny otrzymanej w etapie (iii) procesowi fermentacji przeprowadzanemu w temperatu-

rze, która jest równa 30˚C lub poniżej i ponadto charakteryzującego się tym, że dodatkowe zakwaszenie

wywołane kulturą wspomagającą wynosi 0,5 jednostki pH lub mniej, umożliwiając wytarzanie bakteriocyny w

ilości wystarczająco wysokiej do doprowadzenia do zmniejszenia liczby Listeria wyrażonej jako log cfu/g

produktu fermentowanego, która wynosi 2 lub więcej na końcu dojrzewania i otrzymania fermentowanego

produktu żywnościowego.

Szczegółowe ujawnienie

[0012] Przed omówieniem szczegółowych aspektów i wykonań wynalazku dostarczono definicję konkretnych

stosowanych tu pojęć.

[0013] Jak tu użyto, określenie „fermentacja” lub „fermentacja żywności” odnosi się do procesu zmian bio-

chemicznych, np. zakwaszenia, w zwierzęcym i/lub roślinnym materiale (tj. matrycy żywnościowej ), obejmu-

jąc aktywność żywych mikrobiologicznych komórek w tlenowych i/lub beztlenowych warunkach, w celu

otrzymania produktu żywnościowego o wymaganej jakości.

EP1 716 258B1

3

[0014] Określenie „kultura wspomagająca” powinno być rozumiane jako kultura mikrobiologiczna, która mo-

że być dodana do matrycy żywnościowej i która wytwarza bakteriostatyczny i/lub bakteriokrytyczny produkt

(np. bakteriocyny i antybiotyki) bez niekorzystnego działania na żądany profil fermentacji matrycy żywno-

ściowej. Korzystnie, kultura wspomagająca nie działa niekorzystnie na profil zakwaszenia podczas wytwa-

rzania produktu żywnościowego.

[0015] Wynika z tego, że „warunki sub-optymalne dla wzrostu” powinny być rozumiane jako warunki wzrostu

umożliwiające działanie kultury wspomagającej, gdy jest dodana do matrycy żywnościowej, jak opisano po-

wyżej.

[0016] Określenie „kultura starterowa”, dotyczy preparatu zawierającego komórki mikrobiologiczne, który jest

przeznaczony do inokulacji matrycy żywnościowej poddawanej fermentacji. Kultura starterowa przeznaczona

jest do dostarczania żądanej zmiany we właściwościach matrycy żywnościowej podczas fermentacji (np.

żądanego zakwaszenia). Typowo, kultura starterowa będzie mnożyć się podczas procesu fermentacji.

[0017 ] „Bioochronny czynnik” będzie rozumiany jako żywy organizm, który wywiera bioochronny skutek, gdy

jest dodany do matrycy żywnościowej, bez niekorzystnego oddziaływania na matrycę żywnościową.

[0018] Bioochronny efekt jest zdefiniowany jako efekt uzyskany przez wytwarzanie bakteriostatycznego i/lub

bakteriokrytycznego produktu, dzięki któremu obecność i/lub działanie niepożądanych organizmów np. Liste-

ria monocytogenes są zahamowane i/lub zmniejszone.

[0019] W obecnym kontekście, określenie „mikroorganizm” jest użyte w jego normalnym znaczeniu. Zatem,

w jego najszerszym znaczeniu określenie „mikroorganizm” jest przeznaczone do objęcia alg, pierwotniaków ,

wirusów, bakterii i grzybów. Korzystnymi mikroorganizmami są bakterie i grzyby, w szczególności bakterie,

takie jak bakterie kwasu mlekowego.

[0020] Wyrażenie „bakterie kwasu mlekowego” (LAB) oznacza grupę gram-dodatnich, katalazo-ujemnych,

nieruchliwych mikroaerofilowych lub anaerobowych bakterii, które fermentują cukier z wytworzeniem kwa-

sów, w tym kwasu mlekowego, jako głównie wytwarzanego kwasu, kwasu octowego, kwasu mrówkowego i

kwasu propionowego. Bakterie kwasu mlekowego, najbardziej przydatne pod względem przemysłowym,

znaleziono pośród gatunku Lactococcus, gatunku Streptococcus, gatunku Enterococcus, gatunku Lactoba-

cillus, gatunku Leuconostoc, gatunku Pediococcus i gatunku Bifidobacterium.

[0021] Zwykle, stosowane szczepy kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego na ogół dzieli się na orga-

nizmy mezofilne o optymalnej temperaturze wzrostu około 30˚C i organizmy termofilne mające optymalne

temperatury wzrostu w zakresie od około 40 do około 45˚C. Typowe organizmy należące do grupy mezofilnej

obejmują Lactococcus lactis, Lactococcus lactis podgat. cremoris, Leuconostoc mesenteroides podgat. cre-

moris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis podgat. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei

podgat. casei i Lactobacillus paracasei podgat. paracasei. Gatunki termofilne bakterii kwasu mlekowego

obejmują jako przykład Streptococcus thermophilus, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Lacto-

bacillus delbrueckii podgat. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbruecki podgat. bulgaricus i Lac-

tobacillus acidophilus.

[0022] Także ściśle anaerobowe bakterie należące do rodzaju Bifidobacterium, w tym, Bifidobactrium bifi-

dum i Bifidobacterium longum, są zwykle stosowane jako mleczarskie kultury starterowe i zasadniczo zali-

czane są do grupy bakterii kwasu mlekowego. Dodatkowo, gatunki Propionibacterium stosuje się jako mle-

czarskie kultury starterowe, szczególnie w wytwarzaniu sera. Dodatkowo, jako żywnościowe kultury starte-

rowe są zwykle stosowane organizmy należące do rodzaju Brevibacterium.

EP1 716 258B1

4

[0023] Inną grupą mikrobiologicznych kultur starterowych są kultury grzybowe, w tym kultury drożdży i grzy-

bów nitkowatych, które są stosowane zwłaszcza w wytwarzaniu pewnych rodzajów serów i napojów. Przy-

kłady obecnie stosowanych kultur grzybowych obejmują Penicillum roqueforti, Penicillum candidum, Geotri-

chum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir i Saccharomyces cerevisiae.

[0024] W wytwarzaniu i przechowywaniu fermentowanych produktów żywnościowych, stałym problemem

jest potencjalne zanieczyszczenie materiału żywnościowego przez patogenne organizmy, takie jak Listeria

spp. W celu przezwyciężenia tego problemu twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że

przez zastosowanie co najmniej jednej kultury wspomagającej w postaci Pediococcus acidilactici wytwarza-

jącej bakteriocynę w materiale żywnościowym, możliwe jest zmniejszenie ilości organizmów patogennych

bez wpływania na profil fermentacji i skutkiem tego żądanej sensorycznej jakości produktu żywnościowego.

Efekt ten uzyskuje się przez poddanie Pediococcus acidilactici wytwarzającej bakteriocynę warunkom fer-

mentacji, które są sub-optymalne dla wzrostu Pediococcus acidilactici. Typowo, takie warunki będą optymal-

ne dla wzrostu kultury starterowej i co najbardziej zaskakujące, stwierdzono, że takie warunki umożliwią

wysoką produkcję bakteriocyny przez Pediococcus acidilactici . Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek umożli-

wia wytwórcom żywności wybór i zastosowanie receptur i warunków obróbki zapewniających optymalny

rozwój, np. zakwaszenie kultury starterowej i w tym samym czasie optymalne zapewnienie bezpieczeństwa

żywności, przez dodanie kultury wspomagającej według niniejszego wynalazku w dowolnym odpowiednim

punkcie czasowym podczas procesu fermentacji.

[0025] Jak wspomniano powyżej, kulturę starterową i kulturę wspomagającą można dodać do materiału

żywnościowego w dowolnej kolejności. Czas upływający między dodaniem pierwszej kultury starterowej i

kultury wspomagającej i dodaniem drugiej wynosi 0 sekund, np. co najwyżej 10 sekund, tak jak co najwyżej

30 sekund, np. co najwyżej 1 minuta, tak jak co najwyżej 5 minut, np. co najwyżej 10 minut, tak jak co naj-

wyżej 60 minut, np. co najwyżej 300 minut, tak jak co najwyżej 600 minut, np. co najwyżej 1 dzień, tak jak co

najwyżej 2 dni, np. co najwyżej 3 dni, tak jak co najwyżej 4 dni, np. co najwyżej 6 dni.

[0026] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, kulturę starterową dodaje się do materiału żywno-

ściowego w tym samym czasie lub przed kulturą wspomagającą.

[0027] Wynalazek pomyślnie obniża i/lub hamuje ilość i/lub aktywność dowolnych organizmów patogennych

wrażliwych na bakteriocyny wytwarzane przez Pediococcus spp., takie jak pediocyna, konkretnie z Listeria

spp, takiej jak Listeria monocytogenes.

[0028] Wykazano, że zmniejszenie organizmów patogennych może być spowodowane przez wymieszanie

materiału żywnościowego zawierającego patogenne organizmy z wytwarzającym bakteriocynę Pediococcus

acidilactici. Korzystny jest szczep Pediococcus acidilactici B-LC-20 (DSM 10313), sprzedawany przez Chr.

Hansen A/S pod znakiem towarowym SafePro™. Jednakże, rozważa się również, że inne szczepy Pedio-

coccus acidilactici wytwarzające bakteriocyny mogą dostarczać takich samych korzystnych właściwości i

działania.

[0029] Działanie Pediococcus acidilactici wytwarzającej bakteriocynę jest najbardziej prawdopodobne z po-

wodu tendencji gatunku Pediococcus do wytwarzania bakteriocyn zdolnych do zabijania, inaktywacji i/lub

hamowania organizmów patogennych. Do chwili obecnej nie zdawano sobie sprawy, że zdolności Pediococ-

cus acidilactici do hamowania organizmów patogennych, np. Listeria, niekoniecznie wywołują ogólny wzrost

zakwaszenia, gdy dodaje się je jako kulturę wspomagającą. Optymalna temperatura wzrostu dla gatunku

Pediococcus, takiego jak Pediococcus acidilactici, wynosi około 40˚C lub nawet więcej. Jednakże większość

EP1 716 258B1

5

kultur starterowych, stosowanych w fermentowaniu żywności, rozwija się optymalnie, tj. daje w rezultacie

wymaganą jakość sensoryczną produktu, w temperaturze poniżej 30˚ C. Zatem, poprzednio nie zawsze było

odpowiednie włączanie Pediococcus acidilactici w celu kontroli np. Listeria, ponieważ nie można było ustalić

rozsądnego kompromisu między optymalnymi warunkami dla startera, a optymalnymi warunkami dla szcze-

pu Pediococcus. Niniejszy wynalazek pozwoli wytwórcom żywności na wolny wybór żądanego organizmu

kultury starterowej i przeprowadzenie fermentacji żywności w warunkach optymalnych dla żądanego opra-

cowania produktu żywnościowego. Jednocześnie, można zapewnić bezpieczeństwo żywności przez dodanie

kultury wspomagającej według niniejszego wynalazku bez niekorzystnego oddziaływania na profil fermenta-

cji.

[0030] Oczywiście, gdy specjalista w dziedzinie zdaje sobie sprawę, że wytwarzanie bakteriocyny przez

Pediococcus acidilactici nie jest połączone ze wzrostem aktywności zakwaszenia, będzie możliwe testowa-

nie warunków, które sprzyjają wytwarzaniu bakteriocyny bez jakiegokolwiek znacznego wytwarzania kwasu.

Takie warunki, sprzyjające wzrostowi organizmów mikrobiologicznych są dobrze znane specjalistom w dzie-

dzinie. Obejmują one, ale nie wyłącznie, aktywność wody, warunki atmosferyczne, Wilgotność Względną

(RH), składniki odżywcze, takie jak źródło węgla, źródło azotu itp. i inne dodatki, takie jak sole mineralne,

witaminy itp.

[0031] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu zmniejszenia stężenia Listeria spp. w

fermentowanym produkcie żywnościowym.

[0032] W niniejszym kontekście określenie „zmniejszenie stężenia” odnosi się do zmniejszenia ilości organi-

zmu patogennego. Zmniejszenie może być możliwe przez zabicie, inaktywację lub hamowanie aktywności

organizmu patogennego. W wykonaniu niniejszego wynalazku zabitych, inaktywowanych lub zahamowanych

zostaje 100% patogennych organizmów, tak jak co najmniej 90%, np. co najmniej 75%, tak jak co najmniej

jak 50%, np. co najmniej 40%, tak jak co najmniej 30%, np. co najmniej 25%, tak jak co najmniej 20%, np. co

najmniej 10, tak jak co najmniej jak 5%, np. co najmniej 1%.

[0033] W pewnych zastosowaniach „stabilizacja” organizmów patogennych, które mogą być obecne w ma-

trycy żywnościowej, będzie wystarczająca do sprawienia, że żywność będzie bezpieczna. Zatem, kultura

wspomagająca zapewnia, że ilość organizmów patogennych, które są obecne w matrycy żywnościowej, nie

zwiększa się.

[0034] Wymienione sposoby obejmują następujące etapy:

(i) dostarczenie materiału żywnościowego,

(ii) mieszanie materiału żywnościowego z kulturą starterową powodujące żądaną zmianę we właściwościach

matrycy żywnościowej podczas fermentacji (np. żądane zakwaszenie),

(iii) mieszanie materiału żywnościowego z co najmniej jedną kulturą wspomagającą w postaci Pediococcus

acidilactici wytwarzającej bakteriocynę,

(iv) poddanie mieszaniny otrzymanej w etapie (iii) procesowi fermentacji, przeprowadzanemu w tempe-

raturze, która jest równa lub poniżej 30̊̊˚C i dalej charakteryzującego się tym, że dodatkowe zakwaszenie

spowodowane przez kulturę wspomagającą wynosi 0,5 jednostki pH lub mniej, co umożliwia wytwarzanie

bakteriocyny w ilości wystarczająco dużej do uzyskania zmniejszenia liczby Listeria wyrażonej jako log cfu/g

fermentowanego produktu, która wynosi 2 lub więcej na końcu dojrzewania, i otrzymanie fermentowanego

produktu żywnościowego.

[0035] Fermentowany produkt żywnościowy może być poddany procesowi suszenia jednocześnie z proce-

EP1 716 258B1

6

sem fermentacji w etapie (iv) i/lub później w stosunku do procesu fermentacji w etapie (iv) w celu otrzymania

suchego fermentowanego produktu żywnościowego.

[0036] Kilka fermentowanych produktów może być wytwarzanych sposobem według niniejszego wynalazku

pod warunkiem, że materiał żywnościowy jest fermentowany. Przykłady fermentowanych produktów żywno-

ściowych obejmują, ale nie wyłącznie, produkty mleczarskie, takie jak różne produkty serowe, fermentowane

produkty mięsne, takie jak kiełbasy, np. do smarowania i suche kiełbasy oraz szynka, fermentowane ryby i

fermentowane warzywa.

[0037 ] Fermentowany produkt żywnościowy wytwarza się przez dostarczenie surowca żywnościowego,

który jest poddawany procesowi fermentacji i ewentualnie fermentowany produkt żywnościowy jest podda-

wany procesowi suszenia w celu dostarczenia suchego fermentowanego produktu żywnościowego.

[0038] Aby zmniejszyć stężenie organizmów patogennych, celowe jest zapewnienie tego zmniejszenia bez

istotnej zmiany jakości końcowego produktu żywnościowego, tj. producent żywności może zastosować kultu-

rę do swojej obecnej lub korzystnej receptury, bez jakiejkolwiek zmiany receptury lub warunków obróbki. Aby

uzyskać żądany wynik, do materiału żywnościowego, jako kulturę wspomagającą, która jest oddzielona od

kultury starterowej, zastosowano kulturę Pediococcus acidilactici wytwarzającą bakteriocynę. W obecnym

kontekście „kultura wspomagająca" jest kulturą, która jest dodana do materiału żywnościowego lub połączo-

na z kulturą starterową, lecz która nie tworzy części kultury starterowej, tj. kultura wspomagająca jest dodat-

kową kulturą, nie próbującą „wytwarzać" fermentowanego produktu żywnościowego, lecz dostarczającą do-

datkową technologiczną korzyść, w tym przypadku efekt zabijania, inaktywacji lub hamowania w odniesieniu

do organizmów patogennych. W obecnym kontekście „kultura wspomagająca" i „gatunek Pediococcus spe-

cies wytwarzający bakteriocynę” stosuje się zamiennie, a kultura wspomagająca jest stosowana do dalszego

zilustrowania specyficznych właściwości Pediococcus acidilactici wytwarzającego bakteriocynę.

[0039] Wytwarzanie fermentowanego produktu żywnościowego kontroluje się i przeprowadza wyłącznie

przez kulturę starterową. Kultura starterowa odpowiada za opracowanie nieograniczającej grupy parametrów

jakościowych, takich jak zakwaszenie, zmniejszenie wiązania wody i aktywność wody, wygląd ogólny, bar-

wa, tekstura, woń, aromat, smak. zapach i inne parametry sensoryczne i technologiczne. Zatem, kultura

wspomagająca ma minimalny lub korzystnie żaden wpływ na parametry jakościowe .

[0040] W celu ograniczenia lub wyeliminowania wpływu Pediococcus acidilactici wytwarzającego bakteriocy-

nę na parametry jakościowe, proces fermentacyjny przeprowadza się w sub-optymalnych warunkach dla

wzrostu Pediococcus acidilactici wytwarzającego bakteriocynę, jak tu opisano poprzednio.

[0041] W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, ewentualny proces suszenia jest przeprowadzany

w warunkach, które są sub-optymalne dla wzrostu Pediococcus acidilactici wytwarzającego bakteriocynę, w

celu zapewnienia efektu ograniczonego zakwaszenia i umożliwienia wysokiego wytwarzania bakteriocyny.

[0042] W obecnym kontekście, określenie „ograniczone zakwaszenie" odnosi się do wpływu co najmniej

jednej kultury wspomagającej na zakwaszenie. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, ograni-

czone zakwaszenie zapewnia różnicę w wartości pH spowodowaną przez kulturę wspomagającą o 0,5 jed-

nostki pH lub mniej, tak jak 0,25 jednostki pH lub mniej, np. 0,1 jednostki pH lub mniej, tak jak 0,25 jednostki

pH lub mniej, np. 0,075 jednostki pH lub mniej, tak jak 0,06 jednostki pH lub mniej, np. 0,05 jednostki pH lub

mniej, tak jak 0,04 jednostki pH lub mniej, np. 0,03 jednostki pH lub mniej , tak jak 0,02 jednostki pH lub

mniej, np. 0,01 jednostki pH lub mniej.

[0043] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku sub-optymalne warunki wzrostu są zapewnione

EP1 716 258B1

7

przez zmienianie temperatury.

[0044] W celu zapewnienia optymalnych warunków wzrostu w odniesieniu do kultury wspomagającej pod-

czas procesu fermentacji, temperatura w procesie fermentacji jest równa lub poniżej 30˚ C, taka jak równa

lub poniżej 28˚ C, np. równa lub poniżej 26˚ C, równa lub poniżej 24˚ C.

[0045] W celu zapewnienia sub-optymalnych warunków wzrostu podczas procesu suszenia w odniesieniu do

kultury wspomagającej, temperatura w procesie suszenia jest równa lub poniżej 30˚ C, taka jak równa lub

poniżej 25 ˚C, np. równa lub poniżej 20˚ C, taka jak równa lub poniżej 15˚C, taka jak równa lub poniżej 10˚ C,

np. równa lub poniżej 5˚C.

[0046] Podczas mieszania kultury wspomagającej z materiałem żywnościowym, który albo zawiera kulturę

starterową, albo który jest następnie mieszany z kulturą startową, stężenie co najmniej jednej kultury wspo-

magającej zwiększa poziom inokulacji ogółem bakterii kwasu mlekowego najwyżej 1000-krotnie, np. najwy-

żej 500-krotnie, tak jak najwyżej 100-krotnie , np. najwyżej 50-krotnie,tak jak najwyżej 10-krotnie, np. najwy-

żej 8-krotnie, tak jak najwyżej 5-krotnie, np. najwyżej 4-krotnie, tak jak najwyżej 3-krotnie, np. najwyżej 2-

krotnie.

[0047] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku co najmniej jedną kulturę starterową dodaje się w

stężeniu w zakresie 102-1010 CFU/g produktu, np. w zakresie 102-109 CFU/g produktu, w zakresie takim jak

103-109 CFU/g produktu, np. w zakresie 104-109 CFU/g produktu, tak jak w zakresie 102-108 CFU/g produk-

tu, np. w zakresie 102-107 CFU/g produktu, tak jak w zakresie 103-107 CFU/g produktu, np. w zakresie 104-

107 CFU/g produktu, tak jak w zakresie 105-107 CFU/g produktu, np. w zakresie 108-107 CFU/g produktu, tak

jak w zakresie 103-106 CFU/g produktu, np. w zakresie 103-105 CFU/g produktu, tak jak w zakresie 102-104

CFU/g produktu .

[0048] W najbardziej korzystnym wykonaniu według wynalazku, kulturę wspomagającą dodaje się w zakre-

sie 5 x 106 – 9 x 107 CFU/g produktu.

[0049] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku materiał żywnościowy i/lub suchy fermentowany

produkt żywnościowy jest analizowany na zawartość organizmów patogennych. Jeśli zawartość organizmów

przekracza wcześniej określony dopuszczalny poziom, kulturę wspomagającą można dodać do materiału

żywnościowego w celu zabicia, inaktywowania lub zahamowania organizmów patogennych.

[0050] W przypadku, gdy analizuje się materiał żywnościowy na zawartość organizmów patogennych i wy-

kazuje się, że zawartość przekracza wcześniej określony dopuszczalny poziom, można dodać kulturę

wspomagającą bezpośrednio do materiału żywnościowego w celu zabicia inaktywowania lub zahamowania

organizmów patogennych.

[0051] W przypadku, gdy suchy fermentowany produkt analizuje się na zawartość organizmów patogennych

i wykazuje, że zawartość przekracza wcześniej określony dopuszczalny poziom, wytwarzane następnie

partie materiału żywnościowego miesza się z kulturą wspomagającą w celu zabicia, inaktywowania lub za-

hamowania organizmów patogennych.

[0052] W warunkach sposobu według wynalazku, Pediococcus accidilactici, wytwarzający bakteriocynę,

można dodać do fermentacji żywności bez szkodliwego działania na profil fermentacji. Zatem, gatunek może

być zastosowany jako kultura wspomagająca dla zapewnienia bezpieczeństwa mikrobiologicznego fermen-

towanego produktu żywnościowego.

[0053] Naturalnie, cechy użyte do opisania sposobu według wynalazku odnoszą się również do przypadku,

gdy szczep jest użyty jako kultura wspomagająca, jak opisano powyżej.

EP1 716 258B1

8

[0054] W konkretnych wykonaniach kulturę wspomagającą jest dostarcza się w odpowiednich opakowa-

niach. Takimi opakowaniami mogą być np. worek, tetra-pak, puszka i inne odpowiednie środki, opisane w

dziedzinie do umieszczenia w nich gatunków mikrobiologicznych.

[0055] Korzystnie, opakowanie lub odpowiedni materiał handlowy jest dostarczany z instrukcją wskazującą

warunki fermentacji, które są sub-optymalne dla wzrostu Pediococcus acidilactici, wytwarzającego bakterio-

cynę.

[0056] Ponadto, kulturę wspomagającą można dostarczyć w dowolnej odpowiedniej postaci np. w postaci

zamrożonej lub liofilizowanej (odparowanej ze stanu zamrożenia).

[0057] W korzystnym wykonaniu kultura wspomagająca jest preparatem liofilizowanymB-LC-20 (DSM

10313) dostarczanym przez Chr. Hansen A/S pod znakiem towarowym SafeProTM.

[0058] Wyizolowany szczep jest przydatny dla celów wynalazku tu opisanego. Ponadto, rozważa się, zasto-

sowanie Pediococcus accidilactici, wytwarzającego bakteriocynę jako bioochronnego środka dla poprawy

bezpieczeństwa wszystkich produktów żywnościowych.

[0059] Chociaż wynalazek skupia się na zastosowaniu kultury wspomagającej podczas procesu fermentacji,

w zakresie niniejszego wynalazku jest możliwe dodanie kultury wspomagającej do matryc żywnościowych,

które nie są poddawane procesowi fermentacji.

[0060] Próbka szczepu została zdeponowana zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim o Międzynarodowym

Uznawaniu Depozytów Mikroorganizmów dla celów procedur patentowych. Depozyt złożono 24 października

1995 pod numerem dostępu DSM 10313.

[0061] Wynalazek jest dalej zilustrowany w następujących, nieograniczonych przykładach i na figurach,

gdzie

Fig. 1. A i B ilustrują zmianę pH podczas dojrzewania kiełbas, z zastosowaniem lub bez B-LC-20 razem z

szybko fermentującą kulturą starterową od Chr. Hansen Bactoferm™. Kiełbasy fermentowano w 24-20˚C

przez 3 dni, z późniejszym dojrzewaniem w 18 do 16˚C przez 11 dni, a

Fig 2. A i B ilustrują zmianę pH podczas dojrzewania kiełbas z zastosowaniem lub bez B-LC-20 razem z

tradycyjnie fermentującą kulturą starterową od Chr. Hansen Bactoferm™. Kiełbasy fermentowano w 24-20˚C

przez 4 dni, z późniejszym dojrzewaniem w 18 do 14˚C przez 17 dni.

PRZYKŁADY

PRZYKŁAD 1

Wpływ B-LC-20 na zmianę pH w siekanym mięsie kiełbasianym

[0062] Przedstawiono wpływ kultury wspomagającej na zakwaszenie i podsumowanie profili pH/czas, mają-

ce miejsce, gdy do siekanego mięsa kiełbasianego stosowano B-LC-20. W Tabeli 1 przedstawiono zmiany

pH podczas okresu fermentacji, jak określono co drugi dzień, a w Tabeli 2 przedstawiono zmiany pH, jak

określono w sposób ciągły od 0 do 68 godzin.

Tabela 1: zmiana pH w siekanym mięsie kiełbasianym określana co drugi dzień

Kod Dzień 0 Dzień 2 Dzień 4 Dzień 6Kontrola (kultura starterowa) 5,79 ± 0,04 4,81 ± 0,03 4,80 ± 0,04 4,79 ± 0,01Kontrola + B-LC-20 5,79 ± 0,01 4,77 ± 0,01 4,77 ± 0,01 4,80 ± 0,04

EP1 716 258B1

9

Tabela 2: zmiana pH w siekanym mięsie kiełbasianym określana przez stały pomiar

Kod/Godziny 0 10 20 30 40 50 60 68Kontrola (kul-tura startero-wa)

5,62 5,71 5,58 5,16 4,97 4,86 4,79 4,77

Kontrola + B-LC-20

5,62 5,70 5,55 5,12 4,91 4,80 4,76 4,76

[0063] Wyniki pokazują, że dodanie kultury wspomagającej w postaci B-LC-20 razem z kulturą kontrolną nie

ma znaczącego wpływu na końcowe pH w porównaniu z dodaniem samej kultury kontrolnej. B-LC-20 doda-

no w stężeniu 1,1 x 107 CFU/g siekanego mięsa. Kulturę kontrolną dodano w ogólnym stężeniu bakterii kwa-

su mlekowego wynoszącym 3,3 x 106 CFU/g.

[0064] Wykazano, że istnieje niewielki wpływ B-LC-20 podczas pierwszych 20-60 godzin, ale maksymalna

różnica między dwiema krzywymi wynosi 0,06 jednostki pH, co jest dobre w prawidłowej zmienności partii,

napotkanej przy rzeczywistej produkcji kiełbas.

[0065] Kontrolna kultura starterowa składa się z mieszaniny laktobacillusów, pediokokków, mikrokokków i

gronkowców.

PRZYKŁAD 2

Wpływ B-CL-20 na zmniejszenie Listeria

PODSUMOWANIE PRÓB

[0066] Przeprowadzono dwie niezależne próby w celu oceny zachowania się Listeria w kiełbasie podczas

przeprowadzania procesu dojrzewania. W każdej próbie wytworzono trzy partie. Jedną z kontrolną kulturą

starterową nieaktywną przeciw Listerii i dwie partie z kontrolną kulturą starterową razem z antylisteryjną kul-

turą starterową, dodaną w dwóch różnych stężeniach (BL-C-20, Chr. Hansen A/S). Każdą partię w czasie

wytwarzania zaszczepiono koktailem pięciu szczepów Listeria monocytogenes (około 103 CFU/g). .

[0067] Dojrzewanie przeprowadzono w zaadaptowanym uniwersalnym środowisku komory testowej Sanyo

Model MLR-350H, z okresem fermentacji 72 godziny w 14˚ C z 80% RH.

[0068] W wybranych czasach z każdej partii pobierano jako próbki trzy kiełbasy, dla określenia liczby bakterii

Listeria i kwasu mlekowego, pH i ubytku wagi.

[0069] Zachowanie Listeria w obu próbach było podobne , wykazując znaczne różnice między partią kontrol-

ną (A) i partią z dodanymi kulturami antylisteryjnymi (B i C), gdzie Listeria zmniejszono 2 log cfu/g (próba 1) i

3 log cfu/g w próbie 2. Nie obserwowano istotnej różnicy w liczbie Listeria między partiami B i C.

W podsumowaniu, powyższe wyniki wskazują, że kultura bakteryjna B-LC-20 okazała się być odpowiednią

kulturą dla kiełbas wytwarzanych zgodnie z niniejszą formulacją, wykazując dodatkowe zmniejszenie Listeria

po okresie fermentacji i do końca dojrzewania w porównaniu z samą kontrolną kulturą starterową.

METODOLOGIA

[0070] Test prowokacji Listeria w suchych kiełbasach razem z procesem dojrzewania został zaprojektowany

EP1 716 258B1

10

według następującego protokołu. Przeprowadzono dwie niezależne próby (próba 1 i 2 ) w Institut de Recerca

I Tecnologia Agroalimentáries (IRTA), Monells, Hiszpania. Badano działanie przeciwko Listeria kultury bakte-

rii kwasu mlekowego B-LC-20 w dwóch różnych stężeniach.

Kultury bakteryjne

[0071] Kulturę antylisteryjną B-LC-20 Chr. Hansen i kontrolną kulturę starterową przechowywano zamrożoną

(-20˚ C ), aż do użycia.

[0072] Listeria monocytogenes: Dwa szczepy pochodziły z kolekcji szczepów IRTA, tj. szczep CTC1011 i

CTC1034; a trzy szczepy zostały dostarczone przez Chr. Hansen (P01, P05, P15). Każdy szczep hodowano

oddzielnie w standardowej pożywce IRTA "TSBYE" i przechowywano zamrożony (-20˚ C). Liczbę żywotnych

bakterii określano przed każdą próbą w celu obliczenia właściwego rozcieńczenia do osiągnięcia oczekiwa-

nej inokulacji w mieszaninie mięsnej (około 103 CFU/g).

Wytwarzanie

[0073] Wytwarzano trzy partie (12 kg każda) .

Partia kontrolna A (kultura starterowa) + koktail Listeria monocytogenes

Partia kontrolna B (kultura starterowa) + niskie stężenie B-LC-20

Partia kontrolna C (kultura starterowa) + wysokie stężenie B-LC-20

[0074] Kultury bakteryjne dodano oddzielnie w czasie mieszania. Najpierw dodano koktajl

L. monocytogenes (w 20 ml roztworu soli fizjologicznej), a następnie kulturę starterową i kulturę wspomaga-

jącą.

Warunki dojrzewania

[0075] Fermentację i suszenie kiełbas przeprowadzono w dostosowanym, uniwersalnym środowisku testo-

wej komory Sanyo Model MLR-350H.

Fermentację prowadzono przez 72 godziny w 24˚ C z RH >90%.

Po okresie fermentacji, warunki dostosowano do suszenia aż do 29 dnia w 14˚ C z 80% RH.

Analizy

[0076] Podczas fermentacji i suszenia, mierzono pH i utratę wagi w 3 oznaczonych kiełbasach na partię,

codziennie podczas pierwszego tygodnia i z przerwami 3-4 dni podczas ostatnich 3 tygodni.

Analizy mikrobiologiczne

[0077] Trzy różne kiełbasy z każdej partii (A, B, C) przeanalizowano w każdym czasie próbkowania (dni:

zero (po 4 godzinach), 2, 7, 14 i 29). Każda próbka zawierała 25 gramów poprzednio zhomogenizowanej

kiełbasy.

EP1 716 258B1

11

[0078] Określenie Listeria przeprowadzano w każdym czasie próbkowania, z wyjątkiem dnia 0, techniką

najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) w bulionowej pożywce podstawowej Fraser Broth Base (Oxoid) +

Half Fraser selective suplement (Oxoid) (48 godzin, 37˚ C), z późniejszym potwierdzeniem dodatnich pro-

bówek na selektywnej pożywce agarowej Palcam Listeria Selective Agar Base (Merck) + Selective Suple-

ment att. Van Netten i in. (48 godzin, 37˚ C).

[0079] Liczbę Listeriae zliczono w czasie zero przez wysianie odpowiedniego rozcieńczenia na wzbogacone

płytki agarowe Palcam i inkubowanie w 37° C przez 72 godziny. Liczenie bakterii kwasu mlekowego prze-

prowadzono w każdym czasie próbkowania na agarze MRS (72 godziny w 30° C w warunkach beztleno-

wych).

Tabela 1. Liczba bakterii Listeria spp. i kwasu mlekowego podczas dojrzewania suchych kiełbas w próbie 1

Partia Czas (dni) Listeria spp. Bakterie kwasu mlekowegoAAAAA

BBBBB

CCCCC

0271429

0271429

0271429

3,31±0,022,69±0,333,15±0,192,45±0,182,34±0,35

3,25±0,042,24±0,121,77±0,351,18±0,390,89±0,69

3,22±0,102,05±0,411,48±0,261,43±0,510,54±0,16

6,47±0,118,85±0,058,93±0,078,73±0,068,60±0,01

7,50±0,068,73±0,088,78±0,178,61±0,038,51±0,02

7,77±0,058,68±0,078,75±0,208,52±0,048,41±0,09

Wartości są średnią z trzech powtórzeń próbek wyrażoną jako log cfu/g, odchylenie standardowe.

[0080] Partie zaszczepiono następująco:

Partia A (kontrolna kultura starterowa, 3.0 x 106 CFU/g), Partia B (kontrolna kultura starterowa + niskie stę-

żenie B-LC-20 (2,9 x 107 CFU/g siekanego mięsa), Partia C (kontrolna kultura starterowa + wysokie stężenie

B-LC-20 (5,6 x 107 CFU/g siekanego mięsa)). Wszystkie partie zaszczepiono koktajlem 5 różnych szczepów

Listeria monocytogenes (CTC1011, CTC1034, P01, P05, P15)

Tabela 2. pH i ubytek wagi podczas dojrzewania suchych kiełbas w próbie 1

Partia Czas (dni) pH % Ubytku wagi %AAAAAAAAAA

01234711141824

5,82±0,015,57±0,044,90±0,094,67±0,044,60±0,014,69±0,014,75±0,014,71±0,014,86±0,024,75±0,01

NA1,54±0,732,96±1,495,79±1,1310,36±0,7917,04±0,6021,66±0,5424,31±0,3427,04±0,3830,23±0,33

EP1 716 258B1

12

A

BBBBBBBBBBB

CCCCCCCCCCC

29

0123471114182429

0123471114182429

4,99±0,13

5,79±0,035,50±0,054,92±0,014,61±0,034,49±0,014,55±0,024,58±0,014,49±0,174,69±0,014,63±0,014,75±0,01

5,83±0,015,37±0,014,89±0,034,59±0,024,49±0,014,55±0,014,61±0,014,57±0,024,69±0,014,62±0,014,74±0,03

31,89±0,36

NA1,22±0,642,46±0,764,24±0,748,71±1,1515,92±0,7121,71±0,3325,02±0,6528,36±0,3931,27±0,5832,89±0,61

NA1,32±0,492,67±0,535104,89±0,039,66±0,3316,69±0,2622,57±0,3025,57±0,2828,60±0,0731,56±0,2533,15±0,26

Na = nie dotyczyWartości są średnią z trzech powtórzeń próbek ± odchylenie standardowe

Tabela 3. Liczba bakterii Listeria spp i kwasu mlekowego podczas dojrzewania suchych kiełbas w próbie 2

Partia Czas (dni) pH

AAAAA

BBBBB

CCCCC

0271429

0271429

0271429

3,40±0,012,56±0,542,68±0,361,86±0,191,56±0,35

3,39±0,032,04±0,121,13±0,261,16±0,200,33±0,17

3,67±0,051,87±0,191,56±0,350,84±0,200,23±0,23

6,41±0,158,83±0,048,75±0,048,76±0,038,39±0,14

7,25±0,078,56±0,108,58±0,118,35±0,088,33±0,08

7,79±0,028,50±0,088,47±0,078,52±0,128,34±0,04

Wartości są średnimi z trzech próbek wyrażonych jako log cfu/g, odchylenie standardowe.

[0081] Porcje zaszczepiono następująco:

Partia A (kontrolna kultura starterowa, 2,6 x 106 CFU/g), Partia B (kontrolna kultura starterowa + niskie stę-

żenie B-LC-20 (1,5 x 107 CFU/g), Partia C (kontrolna kultura starterowa + wysokie stężenie B-LC-20 (5,9 x

107 CFU/g).

[0082] Wszystkie partie zaszczepiono koktajlem 5 różnych szczepów Listeria monocytogenes (CTC1011,

EP1 716 258B1

13

CTC1034, P01, P05, P15).

Tabela 4. pH i ubytek wagi podczas dojrzewania suchych kiełbas w próbie 2

Partia Czas (dni) pH Ubytek wagi %AAAAAAAAAAA

BBBBBBBBBBB

CCCCCCCCCCC

0123471114182429

0123471114182429

0123471114182429

6,10±0,075,83±0,025,04±0,034,86±0,034,90±0,014,91±0,014,95±0,014,94±0,014,98±0,015,04±0,015,04±0,01

5,97±0,025,52±0,074,98±0,024,72±0,034,72±0,014,71±0,034,74±0,014,75±0,014,80±0,024,84±0,024,89±0,02

5,99±0,015,49±0,044,93±0,014,68±0,014,70±0,014,68±0,024,70±0,014,74±0,014,79±0,024,84±0,024,83±0,02

NA3,09±1,274,73±1,137,30±1,3910,03±0,8914,81±0,7619,19±0,5321,14±0,4824,08±0,6627,41±0,4429,92±0,43

NA3,79±1,485,17±1,037,90±1,7011,31±1,06 16,53±0,9521,84±0,3823,96±0,3927,24±0,4030,90±0,2033,26±0,13

NA2,77±0,594,16±1,166,33±0,759,985±0,4815,84±0,6021,29±0,6123,52±0,5126,65±0,6230,37±0,5832,69±0,67

Na = nie dotyczyWartości są średnimi z trzech powtórzeń próbek ± odchylenie standardowe

Dyskusja

[0083] Przeprowadzono dwie niezależne próby dla oceny zachowania Listeria w kiełbasach po procesie

dojrzewania. Wytwarzano trzy partie w każdej próbie. Jedną kontrolną z kulturą starterową nieaktywną w

stosunku do Listeria i dwie partie z tą samą kulturą starterową plus antylisteryjną kulturą wspomagającą

dodaną w dwóch różnych stężeniach (B=LC-20) w każdej porcji. Każdą porcję zaszczepiono koktajlem pię-

ciu szczepów Listeria monocytogenes (około 1 03 cfu/g) w czasie wytwarzania.

[0084] W obydwóch próbach, po dwóch dniach fermentacji Listeria zmniejszyła się. Liczba bakterii w par-

tiach B i C była niższa niż w partii A. Te różnice między partią kontrolną A i partiami zaszczepionymi antyli-

steryjnymi kulturami zwiększyły się do końca dojrzewania. W próbie 1, do końca dojrzewania, Listeria

zmniejszyła się o 1 log cfu/g w partii A, podczas gdy w partii B i C, Listeria zmniejszała się więcej niż 2 log

EP1 716 258B1

14

cfu/g. W próbie 2 do końca dojrzewania Listeria zmniejszyła się 1,8 (log cfu/g) w partii A więcej niż 3 log w

partii B i C.

[0085] Liczba bakterii kwasu mlekowego osiągnęła maksimum po 2 dniach fermentacji z podobnymi warto-

ściami przy końcu procesu w każdej partii (około 108 cfu/g) w obu próbach . Krzywa pH była podobna dla

różnych partii w obu próbach. Minimalne pH odnotowano po 4 dniach w próbie 1 i po 3 dniach w próbie 2,

pomimo że pH w czasie 0 było wyższe w próbie 2. Spadek pH w partiach kontrolnych był w obu próbach

podobny do spadku pH w partii z dodatkiem kultury wspomagającej. Δ pH wynosiło 1,22 – 1,24 w partii A po

3-4 dniach fermentacji, a 1,26 – 1,34 w partiach B i C. Małe różnice były prawdopodobnie spowodowane

przez dodanie dodatkowej glukozy z torebeczką kultury wspomagającej. Ubytek wagi wykazał podobny profil

w obu próbach bez różnic między seriami.

Wniosek

[0086] Kultura B-LC-20 okazała się odpowiednią ochronną kulturą wspomagającą dla fermentowanych kieł-

bas wytwarzanych zgodnie z niniejszą formulacją wykazując dodatkowe zmniejszenie Listeria po okresie

fermentacji i do końca dojrzewania, w porównaniu z samą kontrolną kulturą starterową.

[0087] Na ogół, dodanie dodatkowego inokulum bakterii kwasu mlekowego zmniejsza czas rozpoczęcia

fermentacji (faza logarytmiczna), a tym samym przyśpiesza całkowitą szybkość zakwaszenia. Gdy zwięk-

szano inokulum 10–krotnie (od 5⋅105 do 5⋅106 CFU/g), faza logarytmiczna zakwaszenia dla typowego Pół-

nocnoeuropejskiego rodzaju fermentowanej kiełbasy była zmniejszona do połowy, a czas do osiągnięcia pH

5,3 i 4,9 zmniejszył się log cfu/g o 25 i 30%, odpowiednio.

[0088] Dodatek B-LC-20 do receptury kiełbasy w Przykładzie 2, próba 1,dał w wyniku zwiększony poziom

inokulacji ogólną liczbą bakterii kwasu mlekowego około 15-krotnie, od 3⋅106 do między 3⋅107 - 6⋅107 . Ocze-

kiwano, że faza logarytmiczna mogłaby zostać znacząco zmniejszona, a czas do osiągnięcia pH 4,9 zmniej-

szony o co najmniej 30%. To oczekiwane zmniejszenie nie miało miejsca, pH osiągnęło 4,9 po 2 dniach we

wszystkich trzech partiach, tj. dodanie kultury wspomagającej, takiej jak B-LC-20 do istniejącej receptury nie

przyspieszyło, jak oczekiwano, czasu zakwaszenia. W Przykładzie 1, tabela 1 i 2, szybkość zakwaszenia

również nie wzrosła znacząco.

[0089] Dlatego też, twórcy niniejszego wynalazku, nieoczekiwanie stwierdzili, że zastosowanie kultury

wspomagającej, takiej jak B-LC-20, zapewni unikalne antylisteryjne zmniejszenie w fermentowanych kiełba-

sach, ponieważ stwierdzono, że Pediococcus acidilactici jest silnym producentem pediocyny (która niszczy

Listeria monocytogenes) w europejskiej temperaturze fermentacji (<26°C), chociaż nie jest silnym zakwa-

szaczem w tej temperaturze.

[0090] Zmniejszenie Listeria jest przede wszystkim powodowane przez pediocynę wytwarzaną przez kulturę

wspomagającą, taką jak B-LC-20, w materiale żywnościowym podczas fermentacji i procesu suszenia. Dzia-

łanie pediocyny jest dobrze znanym w literaturze fenomenem. Jednak, wyjątkowość kultury wspomagającej

(B-LC-20) i sposób tu ujawniony są takie, że producent żywności może użyć kultury wspomagającej razem

ze zwykłymi kulturami zakwaszającymi, ponieważ nie zmienia ona istotnie ogólnego profilu zakwaszenia i

jakości produktu. Jak wspomniano powyżej, profil zakwaszenia jest najbardziej ważny dla jakości sensorycz-

nej. Zatem, producenci nie potrzebują zmieniać swoich obecnych receptur lub warunków obróbki, lecz będą

mieli korzyść z obniżenia liczebności Listeria.

EP1 716 258B1

15

Przykład 3

Wpływ kultury wspomagającej na profil zakwaszenia różnych fermentowanych kiełbas

[0091] Wpływ kultury wspomagającej B-LC-20 na profil zakwaszenia czterech rodzajów kiełbas fermentowa-

nych z różnymi kulturami starterowymi przedstawiono na figurach 1 i 2. We wszystkich przypadkach, doda-

tek kultury wspomagającej w siekanym mięsie razem z kulturą starterową nie wpływał istotnie na profil za-

kwaszenia kiełbas. Ponadto, wewnętrzne sensoryczne oceny wykazały, że jakość sensoryczna kiełbas nie

uległa zmianie przez dodanie B-LC-20.

Organizmy inokulacja, ogółem LABF-1 Pediococcus pentosaceus Staphylococcus xylosus 5 x 106 CFU/g siekanego mięsaF-SC-11 Lactobacillus sakei Staphylococcus carnosus 1 x 107 CFU/g siekanego mięsaT-SPX Pediococcus pentosaceus Staphylococcus xylosus 5,5 x 106 CFU/g siekanego mięsaT-SC-150 Lactobacillus sakei Staphylococcus carnosus 1 x 107 CFU/g siekanego mięsa

Literatura

[0092]

Foegeding, P.M.; Thomas, A.B.; A.B. Pilkington, D.H.; Klaenhammer, T.R. 1992. “Enhanced control of Liste-

ria monocytogenes by in situ-produced pediocin during dry fermented sausage production”, Applied and

Environmental Microbiology, Vol.58(3), strona 884-890.

Tjener, K., Stahnke, L.H., Andersen, L. Martinussen, J. 2003. “A fermented meat model system for studies of

microbial aroma formation”. Meat Science, 66(1), 211-218.

Wzór użytkowy BA 1994 00266

Zastrzeżenia

1. Sposób poprawy tłumienia wzrostu patogenów, takich jak Listeria spp. w fermentowanym produkcie

żywnościowym, który obejmuje etapy:

(i) dostarczania materiału żywnościowego,

(ii) zmieszania materiału żywnościowego z kulturą starterową zapewniającą żądaną zmianę w cechach

matrycy żywnościowej podczas fermentacji,

(iii) mieszania materiału żywnościowego z co najmniej jedną kulturą wspomagającą w postaci Pediococ-

cus acidilactici, wytwarzającą bakteriocynę.

(iv) poddania mieszaniny otrzymanej w etapie (iii) procesowi fermentacji, przy czym proces fermentacji

przeprowadzany jest w temperaturze, która jest równa 30°C lub poniżej i ponadto jest znamienny tym, że dodatkowe zakwaszanie wywołane przez kulturę wspomagającą wynosi 0,5 jednostki pH lub poniżej,

EP1 716 258B1

16

tym samym umożliwiając wytwarzanie bakteriocyny w ilości wystarczająco wysokiej do uzyskania

zmniejszenia liczby Listeria, wyrażonej jako log cfu/g fermentowanego produktu, która wynosi 2 lub wię-

cej na końcu dojrzewania, i uzyskanie fermentowanego produktu żywnościowego.

2. Sposób, według zastrzeżenia 1, w którym proces fermentacji przeprowadza się w temperaturze rów-

nej lub poniżej 25 o C.

3. Sposób, według zastrzeżenia 1 lub 2, w którym fermentowany produkt żywnościowy poddaje się

procesowi suszenia jednocześnie z procesem fermentacji w etapie (iv) i/lub po procesie fermentacji

w etapie (iv) w celu otrzymania suchego fermentowanego produktu żywnościowego.

4. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym maksymalna różnica w wartości

pH, wywołana przez dodanie przynajmniej jednej kultury wspomagającej wynosi 0,25 jednostki pH

lub poniżej.

5. Sposób, według zastrzeżenia 4, w którym temperatura w procesie fermentacji jest równa lub poniżej

28°C.

6. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym dodanie co najmniej jednej kul-

tury pomocniczej zwiększa poziom inokulacji ogólną liczbą bakterii kwasu mlekowego co najmniej

1000- krotnie.

7. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym co najmniej jedna kultura

wspomagająca jest dodawana w stężeniu w zakresie 102 – 1010 cfu/g produktu.

8. Sposób według zastrzeżenia 7, w którym co najmniej jedna kultura wspomagająca jest dodawana w

stężeniu 2 x 107 cfu/g produktu.

9. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym fermentowany produkt spożyw-

czy jest wybrany z grupy składającej się z fermentowanych produktów mleczarskich.

10. Zastosowanie szczepu Pediococcus acidilactici wytwarzającego bakteriocynę jako kulturę wspoma-

gającą dla tłumienia Listeria spp. w fermentowanym produkcie żywnościowym, przy czym kultura,

gdy jest dodana do procesu fermentacji żywności jest poddana temperaturze równej 30oC lub poni-

żej, w następstwie czego wytwarza bakteriocynę, tym samym oddziałując na profil zakwaszenia fer-

mentacji o 0,5 jednostki pH lub mniej.

11. Zastosowanie według zastrzeżenia 10, w którym szczepem wytwarzającym bakteriocynę jest szczep

Pediococcus acidilactici DSM 10313.

12. Zastosowanie według zastrzeżenia 10 lub 11, w którym warunkiem sub-optymalnym dla wzrostu jest

temperatura równa 26°C lub poniżej.

13. Zastosowanie według dowolnego z zastrzeżeń 10 do 13, w którym kulturą wspomagającą jest liofili-

zowany preparat DSM 10313 dostarczony przez Chr. Hansen A/S pod nazwą produktu SafePro.

EP1 716 258B1

17

Dni

doj

rzew

ania

EP1 716 258B1

18

Dni

doj

rzew

ania

EP1 716 258B1

19

Dni

doj

rzew

ania

EP1 716 258B1

20

Dni

doj

rzew

ania