saccharomyces cerevisiae
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
CAPITULO l
1.1 INTRODUCCIÓN.
En los últimos años se ha especulado mucho con respecto al petróleo en
diferentes aspectos, tales como: el incremento de su precio, la disminución de
reservas y la falta de certeza en su suministro. Por otro lado, la necesidad de
conservar y buscar nuevas fuentes de energía se ha convertido en una necesidad
para las principales actividades de la humanidad. Entre las posibles opciones para
obtener fuentes alternas de energía, destaca la obtención de energía a partir de
biomasa (residuos agroindustriales o energía almacenada en forma de
carbohidratos en material vegetal) (Martínez et al., 2002). Siendo una opción que
ha recibido atención especial en varias partes del mundo. La biomasa es una
fuente de energía que tiene varias ventajas, no obstante su característica
renovable es el punto clave. Los equipos y sistemas diseñados por los humanos
para colectar y almacenar energía solar son costosos e ineficientes si se les
compara con el almacenamiento de energía en la biomasa mediante la
fotosíntesis. La biomasa también tiene una versatilidad única, la lista de especies
de plantas, sub-productos y materiales de desecho que pueden ser utilizados es
casi interminable. Con las tecnologías que actualmente se encuentran en
desarrollo, se podrán producir combustibles renovables, que sustituyan a los
combustibles fósiles en gran parte de sus roles actuales, (Martínez et al., 2002).
Los intentos para utilizar a la biomasa como fuente de energía no es nueva, los
combustibles tales como madera, carbón, rastrojos, entre otros; han sido
empleados como fuente de calor durante miles de años. De hecho en nuestros
días, en los países en vías de desarrollo, una gran parte de las personas usan
formas de energía relacionadas con la biomasa, siendo ésta la principal fuente de
energía que consumen.
Probablemente uno de los retos más difíciles de la presente búsqueda de
sustitutos de combustibles derivados del petróleo son los carburantes líquidos
alternos. La producción de etanol a partir de la biomasa es una de las pocas
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
opciones que es viable actualmente (Mielenz, 2001) Existen tecnologías que están
en proceso de maduración; se pueden utilizar una gran variedad de materias
primas; y el etanol producido es un compuesto valioso y versátil, ya que puede ser
utilizado como oxigenante, carburante, solvente o ser transformado, mediante
tecnologías ya establecidas para otros combustibles. (Bungay, 2004).
El programa más grande de producción de etanol por tecnologías biológicas
sustentables ha sido desarrollado por Brasil. La producción de etanol ha sido
promovida desde 1975, cuando el Programa Nacional de Alcohol (Pro-alcohol) fue
establecido con el fin de reducir el déficit generado por las compras de petróleo y
por las alzas del precio de éste durante la década de los setentas. En ese país en
1981 más de 450 000 automóviles funcionaban con etanol anhidro o etanol al 96%
((Vergara y Castello-Branco, 1981)
Hoy en día, Brasil produce más de 15 mil millones de litros de etanol al año y el
40% de los automóviles que circulan emplean mezclas de gasolina-etanol que
contienen 95% (v/v) de etanol (combustible conocido como E95), el resto utiliza
mezclas que contienen 22% (v/v) del mismo alcohol.
El etanol puede ser obtenido de materiales renovables como la sacarosa de caña,
de remolacha, melazas, suero de leche, almidones, cereales (maíz, trigo, sorgo o
cebada) en los cuales, previo tratamiento de la materia prima, la glucosa es la
fuente de carbono que las levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, pueden
utilizar a manera de sustrato para crecer, obtener energía y producir etanol. Otra
alternativa es la utilización de materiales lignocelulósicos que constituyen una
fuente barata y viable, en los que se incluyen, entre otros, rastrojo de maíz, paja
de arroz, papel, residuos de madera y bagazo de caña (Ingram et al., 1999).
En el caso de México, a diferencia de otros países como EUA, la obtención de
Etanol a partir de maíz u otros cereales no es una alternativa viable, debido a que
algunos son utilizados para el consumo humano y no se producen en cantidades
suficientes para cubrir las necesidades de alimentación del país. Tampoco la
sacarosa proveniente de la caña de azúcar, y que en Brasil es utilizada en el
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programa Pro Alcohol, constituye una materia prima alterna para nuestro país,
debido a que la demanda requerida de etanol carburante es elevada así como el
precio de la sacarosa (Martínez et al., 2002).
Se ha sugerido el uso de levaduras de deficientes respiratorias (petite) de S.
cerevisiae porque los rendimientos de alcohol son más altos debido a que este
tipo de células son insensibles al oxígeno y, por tanto, el sustrato no se desvía
hacia el crecimiento (Brown et al., 1994). Sin embargo, las deficientes respiratorias
crecen más lento que la competente que les dio origen.
Se propone como una opción viable el uso de la miel B como fuente de carbono
ya que es rica en azucares tales como sacarosa, glucosa, fructuosa y pequeñas
cantidades de manosa ya que son asimilables para la levadura S. cerevisiae
ITV01 DR en la producción de etanol; y como fuente de nitrógeno, la utilización de
urea, sulfato de amonio, fosfato de amonio. El nitrógeno puede ser utilizado por
las levaduras de diversas formas, ya sea como compuesto orgánico o inorgánico,
esto puede dar beneficios en la obtención de etanol.
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1.2 JUSTIFICACIÓN.
El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados
mayoritariamente en combustible no renovable. Al mismo tiempo el consumo de
energía aumenta a ritmo cada día más acelerado. En la actualidad no se satisface
la demanda de etanol a nivel nacional para la utilización en la industria.
Efectivamente el precio de la caña de azúcar en México es bastante elevado,
cerca de 38 U$/TM. Cifras que se comparan con países de Sudamérica
prácticamente, se triplica.
La posibilidad de usar otras fuentes de carbono, puede ayudar la obtención de
etanol más económico: el uso de la miel intermedia B, es presentado como una
alternativa viable para la producción de etanol, ya que la miel B solo es utilizada
para la producción de azúcar y no para etanol. Sin embargo por el alto contenido
de azucares fermentables que tiene, y la disponibilidad de nutrientes lo hace ser
un interesante sustrato renovable.
La utilización de fuente de nitrógeno como la de sulfato de amonio, fosfato de
amonio y urea que puede ayudar a la levadura en su biosíntesis de proteínas,
ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular, para una mayor obtención de
etanol.
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1.3 OBJETIVOS.
1.3.1 Objetivo general.
Evaluar el efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción
de etanol con S. cerevisiae ITV01 DR.
1.3.2 Objetivos específicos.
Seleccionar la mejor fuente de carbono para la producción de etanol con S.
cerevisiae ITV01 DR.
Evaluar el efecto del sulfato de amonio, urea y fosfato de amonio sobre el
crecimiento y actividad fermentativa de S. cerevisiae ITV01 DR empleando
la fuente de carbono previamente seleccionada.
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1.4 PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA.
La importancia que hoy en día tienen los temas de corte energético, no solo en
nuestro país, sino en el mundo en general, que es el agotamiento progresivo de
sus recursos energéticos no renovables, al mismo tiempo el consumo de energía
aumenta cada día más, y esto hace que generen enorme cantidades de gases
contaminantes que son liberados a la atmósfera, estos tipos de contaminantes han
causado cambios climáticos en el planeta. La única forma de encarar este
problema es mediante recursos energéticos renovables, para ello la biotecnología
ofrece múltiples alternativas como emplear diferentes fuentes de carbono y
nitrógeno para la obtención de etanol y satisfacer las necesidades de la
humanidad en materia energética. Es por ello, que se ha planteado el uso de S.
cerevisiae ITV01 DR como la cepa a emplear; sin embargo, se desconoce el
efecto de la fuente de carbono y nitrógeno industrial sobre la producción de etanol.
1.5 ALCANCES Y LIMITACIONES.
En los alcances que se lograron, fueron el aprendizaje del de los métodos de
fermentación, las técnicas de conteo de microorganismo, el manejo de equipos,
tales como: espectrofotometro UV-Vis y el cromatografo de líquidos de alta
resolución (HPLC, por sus siglas en inglés).
En nuestras limitaciones que encontramos que las técnicas de conteo y viabilidad
del microorganismo son difíciles de llevar a cabo, el tiempo de residencias que se
da para llevar a cabo el proyecto es demasiado corto, sin embargo fue posible
alcanzar el objetivo del estudio.
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1.6 FUNDAMENTO TEÓRICO.
1.6.1 ALCOHOL ETÍLICO.
Los alcoholes son aquellos compuestos cuyas moléculas se componen de
carbono, hidrógeno y uno o más hidroxilos (-OH). Los alcoholes ligeros son
líquidos miscibles con el agua, es decir, que pueden mezclarse fácilmente. Existen
otros alcoholes más densos o espesos, como las ceras.
El etanol, o también llamado alcohol etílico (CH3CH2-OH), es el más común de
los alcoholes y se caracteriza por ser un compuesto líquido, incoloro, volátil, con
un punto de ebullición de 78.4 C, inflamable y soluble en agua.
El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol) el cual puede
ser utilizado como oxigenante de la gasolina, elevando su contenido de O2 lo que
permite una mayor combustión de la misma disminuyendo las emisiones
contaminantes de hidrocarburos no oxidados completamente (Thomas y Kwong
2001).
El uso de etanol como oxigenante representa varias ventaja, mayor contenido de
02, mayor octanaje, no es toxico, reduce mas las emisiones de CO y no contamina
las fuentes de agua (thomas y kwong 2001).
En México, desde hace varios años, se produce etanol de caña de azúcar en los
diferentes ingenios del país que cuentan con destilerías, sólo que su uso es para
bebidas embriagantes e industriales, no para su uso como combustible. Se
produce, principalmente, de melazas de caña de azúcar y con una tecnología
tradicional.
No obstante de contar con capacidad instalada para producir mayor cantidad, los
ingenios del país no la utilizan, dado que la demanda es limitada y que el insumo
es cíclico. En promedio, la capacidad utilizada es de 44% respecto a la capacidad
instalada; además es relativamente fácil hacer adecuaciones para ampliar esa
capacidad.
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Aproximadamente, la mitad de los ingenios del país cuentan con destilerías, unas
más, otras menos modernas, pero pueden producir etanol (96° GL). Por ejemplo,
la oferta total en el ciclo agrícola 2002-2003 fue de 39.2 millones de litros,
producidos por los ingenios. Ahora bien, hay que decir que no todo el etanol que
se produce en México es anhidro.
Se estima que la capacidad instalada para etanol combustible sería de 33 millones
de litros por año, producidos fundamentalmente en los ingenios La Gloria y San
Nicolás, ambos ubicados en el Estado de Veracruz (Horta, 2005).
Según datos de la producción de etanol mundialmente en el 2004 fue cerca de
41,000 mil litros y en el 2007 fue de 55,700 millones de litros, y según estudios
realizados la demanda de etanol para el 2010 será de 101.000 millones de litros.
1.6.2 MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE ETANOL.
El etanol (alcohol etílico) se obtiene por dos métodos: por vía química, empleando
derivados del petróleo, pero no resulta una opción viable debido al agotamiento de
las reservas de petróleo; y por vía fermentativa, teniendo como ventaja el uso de
recursos renovables como: monosacáridos (glucosa), disacáridos (sacarosa) y
polisacáridos (almidones, celulosa, hemicelulosa) lo que permite un desarrollo
sustentable del proceso (Poy, 2005).
La eficiencia del proceso de producción de etanol se ve afectada por varios
factores, como:
El modo de operación del reactor, ya sea por lote, lote alimentado y cultivo
continuo.
Las condiciones ambientales, como el pH, la temperatura y la aireación.
Los requerimientos nutricionales, tales como la fuente de carbono, nitrógeno,
el uso de diferentes sales y la suplementación del medio de cultivo con
vitaminas.
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El microorganismo empleado, entre los que se encuentran bacterias y
levaduras.
Las levaduras presentan ventajas sobre las bacterias para este proceso, debido a
que no son susceptibles a la contaminación por bacteriófagos, es menos probable
la contaminación con bacterias ácido lácticas, además del tratamiento final que se
le debe dar a la biomasa bacteriana producida, mientras que la biomasa de
levadura producida puede ser empleada en diferentes industrias (Kuyper, 2006).
Es por ello que se han reportado varias características deseables en las levaduras
para la producción de etanol (Panchal, 1990 y Hutter y Oliver, 1998), entre las que
se encuentran:
Ser fácil de propagar.
Ser genéticamente estable.
Fermentar rápida y eficientemente.
Poseer la actividad Killer.
Ser capaz de utilizar una amplia vaiedad de sustratos.
No presentar represión en el consumo de sacáridos por glucosa.
Generar un mínimo de calor durante la fermentación.
Tener caracteristicas floculantes.
Ser osmotolerante.
Ser resistente a etanol.
Ser termotolerante.
Ser resistente a bajos pH.
Ser ácido tolerante.
Ser resistente a compuestos tóxicos.
Ser deficiente respiratoria.
Tomando como base estas características se han desarrollado varias tecnologías
para la producción de etanol con levaduras; de manera general se pueden
clasificar en procesos en lote, lote alimentado y continuo.
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Existen varios procesos en lote, entre los que se encuentran el proceso a partir de
la cuba madre y el proceso con recirculación de levaduras, teniendo semejanzas
entre ellos.
En el proceso a partir de la cuba madre, la levadura crece bajo condiciones
aeróbicas en concentraciones bajas de sustrato (70 g/L), después de
aproximadamente 10 horas se obtienen concentraciones de biomasa entre 60 y
80x106 cel/mL, y éstas son transferidas a la cuba de fermentación, ocupando
aproximadamente un 30% del volumen total y se alimenta el sustrato azucarado
concentrado (melazas de caña de azúcar o remolacha, por ejemplo) hasta obtener
una concentración de azúcar alrededor de 220 g/L. Este proceso se realiza sin
aireación, y en un tiempo de 36 a 48 horas se obtiene alrededor del 10 a 16 % v/v
de etanol, con productividades entre 2.2 y 3.6 g/Lh, dependiendo del sustrato
empleado (Gilis, 1999).
El proceso con recirculación de células se lleva a cabo de manera similar al
proceso a partir de la cuba madre, sólo que al terminar la fermentación se separan
las levaduras del medio. La crema de levadura obtenida puede ser llevada a una
cuba de regeneración durante un corto período de tiempo en presencia de aire,
transcurrido este tiempo se obtienen alrededor de 2x108 cel/mL que se alimentan a
la cuba de fermentación teniendo como resultado tiempos de fermentación de 36 a
48 horas, obteniendo productividades entre 3.2 y 4.8 g/Lh y concentraciones del
19 al 21% de etanol (Cot, 2007). Los procesos continuos tienen como ventaja
general un incremento en la productividad de cualquier proceso, entre los
procesos continuos se encuentran principalmente el multietapas y el continuo en
cuba única, también conocido como Proceso BIOSTIL (Gilis, 1999).
El cultivo continuo multietapa consiste en una serie de cinco a ocho fermentadores
colocados en serie, obteniendo concentraciones de etanol de 16.7 %v/v con
productividades de 12 a 18 g/Lh (Cot, 2007).
El cultivo continuo de cuba única (BIOSTIL) fue propuesto en los años 80 por la
Compañía Alfa-Laval. Este método consta de un fermentador único aireado donde
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se tienen dos alimentaciones: la primera proviene de la alimentación fresca de
medio y la segunda de la recirculación de levaduras y vinazas. En cuanto a la
forma de realizar la recirculación existen diferentes métodos, como la
centrifugación y la sedimentación; sin embargo, se destacan los procesos de
membrana que permiten altas densidades celulares y confieren menor daño a las
células; obteniendo concentraciones de alcohol del 12 %v/v con productividades
de 30 a 40 g/Lh a partir de un medio enriquecido en sólidos, disminuyendo el
volumen de vinazas obtenidas (Cot, 2007).
En modo de operación en lote alimentado deriva del cultivo por lote, donde el
sustrato es alimentado durante la fermentación con el fin de evitar la inhibición por
sustrato. La producción de etanol se divide en dos etapas: una fase de crecimiento
y una fase de producción de etanol (Cot, 2007). Con este método, se han
alcanzado concentraciones entre 19 y 21 %v/v y en tiempo entre 20 y 48 horas
con productividades de hasta 12 g/Lh, en los cuales se manejan estrategias de
alimentación de cofactores y de la fuente de carbono (Alfenore et al., 2002) .
De lo anterior, es posible inferir que la osmotolerancia y la resistencia a etanol son
factores cruciales para el éxito de un proceso de producción, puesto que hacen
posible la obtención de concentraciones elevadas de etanol en el medio, lo que
minimiza los costos de recuperación y el volumen de vinazas obtenidas. Es por
ello, que estudiar cada una de las variables del proceso (medio de cultivo, factores
fisicoquímicos) que afectan el comportamiento cinético y metabólico de las
levaduras resulta de interés, puesto que con el entendimiento de los procesos
celulares se podrá sugerir la estrategia que permita mejorar el proceso. A
continuación se presentan algunos aspectos teóricos sobre las levaduras.
1.6.3 LEVADURAS
Las levaduras tienen importancia económica, social y de salud en la cultura
humana. A menudo, las levaduras han sido referidas como los primeros
organismos “domesticados”, debido a que la fermentación para la producción de
vinos representa, probablemente, la primera biotecnología. En la actualidad, las
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levaduras han encontrado un amplio número de aplicaciones; además de su uso
en fermentaciones en el área de alimentos, las levaduras genéticamente
manipuladas pueden ser usadas para producir agentes biofarmaceúticos para
prevenir y tratar enfermedades humanas.
A futuro, el uso de las levaduras será más significante proporcionando fuentes de
energía renovables, biotecnología ambiental incluyendo el control biológico.
Horecker (1978) fue aun más lejos, sugiriendo que la fermentación alcohólica
representa una gran esperanza para la sobrevivencia de la civilización en el
planeta.
La fisiología de las levaduras es definida como el entendimiento de su crecimiento
y metabolismo. En términos generales explica cómo las levaduras interactúan con
su medio biótico y abiótico, específicamente explica cómo las levaduras se
alimentan, metabolizan, crecen, se reproducen y finalmente mueren. La
biotecnología de levaduras se define como el uso de la fisiología de levaduras
(Walker, 1998). A continuación se hará una revisión sobre los aspectos más
importantes sobre la nutrición y metabolismo de las levaduras.
1.6.3.1 NUTRICIÓN DE LEVADURAS.
El término nutrición de levaduras se refiere a cómo las levaduras se alimentan; de
forma específica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la
adquisición de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos nutricionales
y las estrategias de adquisición de nutrientes, junto con la regulación del
transporte de nutrientes es importante no sólo para el cultivo de las levaduras en
el laboratorio, sino también para la optimización del proceso de fermentación
industrial.
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
1.6.3.2 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES.
Los compuestos orgánicos e inorgánicos en un medio de cultivo desempeñan
funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento, su efecto dependerá de
su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. Cada levadura
presenta requerimientos nutricionales diferentes, sin embargo, es posible
generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono, hidrógeno,
oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, oligoelementos y factores de crecimiento.
1.6.3.2.1 CARBONO.
Las levaduras son organismos quimioorganotróficos porque obtienen la energía y
el carbono de compuestos orgánicos. Estos compuestos son generalmente
azúcares, de los cuales la glucosa es la más empleada en levaduras; sin embargo,
no es el azúcar más efectivamente metabolizable para todas ellas, debido a que
no se encuentra libre de forma natural en sus habitats. Además, la glucosa
generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represión en la asimilación de
otros azúcares. Las levaduras pueden asimilar azúcares (hexosas, pentosas,
disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos, polisacáridos), alcoholes, ácidos
orgánicos, ácidos grasos, hidrocarburos y compuestos aromáticos. Una pequeña
proporción (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser incorporados del
dióxido de carbono. Esta fijación es necesaria en reacciones anapleróticas para
reemplazar los ácidos dicarboxílicos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos
empleados para la síntesis de ácidos grasos, purinas y pirimidinas (Walker, 1998).
GLUCOSA.
La glucosa es un monosacáridos con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la
fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos –OH y O=. Es una
hexosa, es decir que contiene seis átomos de carbono y es una aldosa, esto es el
grupo carbonilo esta en el extremo de la moléculas, es una forma de azúcar que
se encuentra libres en las frutas y en la miel.
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
SACAROSA.
La sacarosa tiene la fórmula C12H22O11 que pertenece a un grupo de hidratos de
carbono llamados disacáridos. Es el azúcar normal de mesa, extraída de la
remolacha azucarera o de la caña de azúcar, es soluble en agua y ligeramente
soluble en alcohol y éter.
MIEL INTERMEDIA B
La miel intermedia B, un jarabe viscoso y oscuro, es un intermediario del proceso
de obtención del azúcar de caña (azúcares no cristalizables en las condiciones del
segundo tacho). Los componentes principales de la miel los constituye el agua,
que se encuentra en su mayor parte como agua libre y otra aparte retenida como
agua de hidratación, y los hidratos de carbono. El azúcar presente en la miel se
encuentra fundamentalmente como sacarosa, glucosa, fructosa y pequeñas
cantidades de manosas, en su composición están presentes los no azúcares
orgánicos e inorgánicos en los que se puede citar los compuestos nitrogenados,
ácidos, aminoácidos, albuminas, vitaminas, ceras, esteroles, lípidos, sales
minerales.
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
1.6.3.2.2 NITRÓGENO.
El nitrógeno puede ser utilizado por las levaduras de diversas formas, ya sea
como compuesto orgánico o inorgánico. Ciertos géneros de levaduras son
incapaces de consumir nitratos, como Saccharomyces, Kluyveromyces y Pichia;
por el contrario, Brettanomyces es capaz de consumirlos, lo cual ha sido
empleando como criterio taxonómico para la identificación de este género (Aguilar,
1998). Las levaduras son capaces de utilizar fuentes orgánicas e inorgánicas
para incorporarlas a los componentes estructurales y funcionales de la célula.
Los iones amonio son transportado activamente y pueden ser asimilados
directamente a pocos aminoácidos, dentro de los cuales existe: glumato y a la
glutamina, estos compuestos sirven como precursores para la biosíntesis de
otros aminoácidos. El glutamato y la glutamina son productos del amonio y por
tanto son compuestos claves para el metabolismo del nitrógeno y del carbono. El
principal producto formado después de la asimilación de ion amonio por levaduras
es el glutamato (figura 3) por la glutamato deshidrogenada dependiente de NADP.
NADPH + H+ NADP
α -cetoglutarato + NH4+ L-glutamato + H2O
FIGURA 3. Reacción alfa- cetoglutarato a L-glutamato (Walker, 1998)
La forma NAD dependiendo de esta enzima lleva acabo la desaminación
catabólica del glutamato de manera reversible. Sin embargo, si la disponibilidad
del ion amonio se encuentra reducida (1 Mm), las otras enzimas realizaran la
asimilación del amonio de manera significativa.
La glutamina sintetasa es una enzima de gran importancia ya que cataliza el
primer paso de varias rutas que conducen a la síntesis de muchas
macromoléculas importante para la celula. En levaduras que crecen en presencia
de sales de amonio, casi todas del nitrógeno es primero asimilado a glutamato y
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
glutamina, donde estos aminoácidos obtienen su nitrógeno α – amino requerido
para el crecimiento celular. Las rutas metabólicas de la glutamato deshidrogenada
y la glutamina sintetasa se encuentra altamente reguladas por iones de amonio
por residuos intracelulares de aminoácidos. Con respeto a la asimilación ion
nitrato aunque Saccharomyces cerevisiae no es capaz de asimilar esta forma
nitrogenada aunque otras levaduras (Candida, Hansenula spp.) pueden
transportarlo y asimilarlo como su única fuente nitrogenada ( Walker 1998).
La asimilación a nitrógeno orgánico es a través de la enzima nitrato reductasa y
la enzima nitrito reductasa (Figura 4)
NASPH+ H+ NADP+ NADPH+H+ NADP
NO-3 NO-
2 NO-2 NH-
4
FIGURA 4. Transporte electrónico de nitrato al ion amonio ( Walker, 1998).
Los iones de amonio formados de esta última reacción pueden ser asimilados
como se mencionaba anteriormente, de tal manera que la glutamato y la glutamina
pueden considerarse como los productos finales de la asimilación del nitrato
por levaduras.
El nitrato exógeno es generalmente toxico en levaduras, pero ciertas especies
(candida nitrapophila) pueden transportarlo si se presenta a bajas concentraciones
y sea reducida a amonio (Hipkin, 1989)
Algunas levaduras pueden presentar nitrificación de amonio a nitrato y a través
de la ruta ambiental de las levaduras con nitrificación heterotrófica se ha pensado
que es de poca significancia ambiental. Wainwright y Falinth (1996) encontraron
que Williposis californica puede ser importante en la nitrificación de suelos ricos en
carbono.
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UREA.
La urea es ampliamente utilizada como fuente de nitrógeno por levaduras, y
dependiendo de su concentración extracelular puede ingresar a la célula por
transporte activo o por difusión facilitada. Como se puede obeservar en la (Figura
5). En levaduras ureasas negativa Sacharomyces cerervisiae, urea
aminohidrolasa (urea carboxilasa + alofanato hidrolasa) hidroliza urea amonio:
3H2O
NH2CONH2 +ATP+HCO3 NH2CONHCOO- 2NH+4+ 2HCO3
UREA ALOFANATO
FIGURA 5. Metabolismo de la urea por levaduras (Walker, 1998).
La urea puede ser utilizada como una fuente económica de nitrógeno para
fermentaciones industriales en donde se emplean por ejemplo las melazas. Sin
embargo, no es recomendado como suplemento nutricional en fermentaciones de
producciones de bebidas alcoholicas, debido a que es posible la formación de
etilcarbomato (compuesto carcinogénico ) el cual es formado como producto de la
reacción química entre etanol y la urea residual dentro del proceso de destilación.
El etilcarbomato puede también presentarse como un intermediario del
metabolismo de la urea en fermentaciones para producción de vino por levaduras
(Hensck y Jiranek, 1993)
Algunas levaduras (Candida, Pichia ssp.) pueden también utilizar aminas
metiladas como única fuente de nitrógeno (Van Dijken, 1981). Las levaduras
transportan L-aminoácidos por procesos específicos de membranas dentro de la
célula donde pueden asimilar hacia proteínas como también descomponerlos a
través de varias rutas metabólica. En medios industriales, la concentración y los
tipos de aminoácidos presentan un papel importante en el curso de la
fermentación de las levaduras y en el espectro de metabolitos producidos.
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
SULFATO DE AMONIO.
El sulfato de amonio y sulfato diamónico son las sales más utilizadas como fuente
de nitrógeno, ya que aportan, al mismo tiempo, azufre y fósforo que la célula
necesita. El ión amonio es empleado por las levaduras para la formación del ácido
glutámico, que actúa como donador de un grupo amino para la síntesis de otros
aminoácidos para la célula (Aguilar, 1998). La asimilación y utilización de
nitrógeno amoniacal y nitrógeno amino pueden variar según la levadura utilizada,
ya que puede ser afectada por numerosos factores como la aireación y la
concentración de glucosa, entre otras. Por otro lado, el ion sulfato aporta el azufre
necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras.
FOSFATO DE AMONIO.
El fosforo es esencial para las células de levaduras para su incorporación en
moléculas estructurales, los ácidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados.
Levaduras también pueden almacenar fosforo en la vacuola, en forma de fosforo
ortofofato polimérico común mente disponible para la levadura en forma de
ortofosfato inorgánico. Que metabolizan muy rápidamente para el transporte
nucleótidos trifosfato, en la levadura se produce contra un transporte de con
centracion en contra de un gradiente de concentración y por lo tanto se activa.
También depende de la presencia en la de un sustrato fermentable exógeno
como la glucosa, pero sustratos respirables como acetato o etanol que no son
compatibles con la absorción de fosfato. En s. Cerevisiae, al menos tres sistema
se cree que translocan ortofosfato. En s. cerevisiae es concebible que los bajos y
los sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente dependiendo sobre
la disponibilidad de fosfato, de hecho la absorción de fosfato pueden ser
controlados por la concentración de ortofosfato intracelular. Por ejemplo, en
mitocondria levadura, que exhiben altas y bajas de transporte de afinidad, y en las
vacuolas en la formación de fosfato insolubles pueden contribuir a la forma en que
la levadura controles citológica los niveles de fosfato.
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Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
1.6.3.3 ADQUISICIÓN DE NUTRIENTES.
Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones, no solo es importante
que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios, sino que la
levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde un equilibrio
con el mismo.
El transporte de azúcares en levaduras ha sido estudiado por muchos años,
debido a la importancia biotecnológica de esto en fermentaciones industriales. Así,
se conoce que la velocidad de formación de etanol está limitada por la velocidad
de transferencia de azúcares al interior de la célula (Walker, 1998).
Las levaduras, generalmente, transportan preferentemente la glucosa; sin
embargo, las membranas celulares no son permeables a azúcares, por lo que
existen varios mecanismos para la translocación de la glucosa y otros sacáridos;
por ejemplo: en S. cerevisiae se conocen 20 transportadores de hexosas que
difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas (Kruckeberg, 1996).
Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades con
respecto al transporte de azucares:
a) La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones.
b) Los transportadores de glucosa son estéreo específicos para ciertas
hexosas, y pueden transportar glucosa, fructosa y manosa.
c) El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo.
d) Los transportadores de glucosa facilitan la difusión libre.
e) Durante el transporte no hay consumo de energía.
f) La fosforilación acompaña a la glucosa al entrar a la célula.
La sacarosa es un azúcar fácilmente fermentable por las levaduras y es muy
abundante en la naturaleza. Santos et al. (1982) reportaron que algunas cepas de
S. cerevisiae tienen un simport sacarosa-protón (transporte simultáneo de una
molécula no cargada y de un catión en la misma dirección, por un mismo
19
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
transportador). Pero de manera general, la sacarosa es primero convertida a
glucosa y fructosa, mediante la presencia de una invertasa periplásmica. El gen
SUC2 (gen de la invertasa) es reprimido en presencia de glucosa, y es expresado
cuando la concentración de glucosa es baja (Walker, 1998).
En lo concerniente al transporte de etanol, se ha demostrado que la difusión libre
es el medio de transporte del etanol en la célula. La salida del etanol es,
obviamente, importante para la industria de la fermentación, mientras que la
entrada del etanol es relevante en el crecimiento aeróbico de S. cerevisiae en
glucosa, debido a la presencia de un crecimiento diaúxico (Walker, 1998).
TRANSPORTE DE NITRÓGENO.
Las levaduras no pueden fijar el nitrógeno atmosférico, pero son capaces de
trasportar y utilizar compuesto de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno
generalmente tienen una función anabólica de proteínas estructurales y enzimas
funcionales. Algunas fuentes de nitrógeno pueden ser catabolizadas
inmediatamente a la entrada de la célula. Las fuentes favorables de nitrógeno
para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio, glutamato y
glutamina. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una fuente
de nitrógeno y sales de amonio. En S. cerevisiae se ha demostrado se lleva a
cabo por un transporte activo con las siguientes características:
Alta afinidad (KT 0.2 mM).
Requiere un sustrato fermentable.
Los aminoácidos causan una inhibición no competitiva.
20
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
1.6.3.4 EFECTOS DE REGULACIÓN.
En la actualidad se conocen cuatro mecanismos de regulación para la
fermentación y respiración en levaduras. Estos mecanismos son: Efecto Kluyver,
Efecto Custer, Efecto Pasteur y Efecto Crabtree (Pronk et al., 1996), para fines del
presente trabajo se describiran los últimos dos, que son los que presenta S.
cerevisiae.
1.6.3.4.1 EFECTO PASTEUR.
El efecto Pasteur relaciona al oxígeno con la cinética de consumo de azúcares y
bajo condiciones anaeróbicas. Es la inhibición de la vía de Embden-Meyerhof-
Parnas (EMP) en presencia de oxígeno, manifestado como una inhibición de la
fermentación alcohólica (Fiechter et al., 1981; Lagunas et al., 1982). La velocidad
de consumo de glucosa es menor en aerobiosis que en anaerobiosis. Este
mecanismo modifica el metabolismo básico a nivel enzimático como: regulación de
la actividad isocitrato deshidrogenasa, inhibición de la actividad de la
fosfofructoquinasa e inhibición alostérica sobre la actividad de la glucosa a través
de la membrana plasmática (Aguilar, 1998). Este efecto solo se presenta cuando
las concentraciones de glucosa son bajas (5mM en S. cerevisiae) o bajo ciertas
limitaciones de nutrientes (Lagunas, 1979), está asociado con una disminución de
la afinidad del transporte de azúcares en aerobiosis (Fiechter et al., 1981). Cuando
se realiza un cambio de aerobiosis a anaerobiosis (menor producción de ATP) las
células responden con un incremento en el flujo en la glucólisis. Nissen et al.
(1997) realizaron la determinación de los flujos metabólicos en anaerobiosis en
cultivo continuo limitando la fuente de carbono con S. cerevisiae.
Busturia y Lagunas (1986) observaron que al crecer a la levadura bajo limitación
de nitrógeno se induce la inactivación en el sistema de transporte de azúcares lo
cual reduce la velocidad de la fermentación, pero no altera la velocidad de
respiración. La razón por la cual la velocidad de fermentación disminuye puede ser
explicada por la teoría de competencia enzimática de Holzer (Holzer, 1961), es
21
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
decir, la piruvato deshidrogenasa tiene mucho mayor afinidad por el piruvato que
la piruvato decarboxilasa de la ruta fermentativa.
Otros factores intracelulares y extracelulares han sido implicados en el control de
flujo glucolítico sobre la expresión del efecto Pasteur, esto incluye: fosfato
inorgánico (Lagunas y Gancedo, 1983); iones amonio (Lloyd et al., 1983);
intermediarios de la vía glicolítica (Muller et al., 1995); AMP (Dombek e Ingram,
1988) y pH intracelular (Rowe et al., 1994). La regulación puede estar dada por la
enzima fosfofructoquinasa, la que es considerada la enzima regulatoria de la
glucólisis y del efecto Pasteur.
Sin embargo, el control fisiológico sobre la glucólisis, más correctamente involucra
una regulación a través de varias enzimas (Zimmerman, 1992) y no solo de la
fosfofructoquinasa. De hecho la sobre-expresión del gen de la fosfofructoquinasa
en S. cerevisiae no ocasiona cambios en el flujo glicolitico (Brindle, 1996). Pero lo
anterior es diferente para cultivos en crecimiento de S. cerevisiae donde la
respiración es sólo del 3 al 20% del azúcar catabolizado comparando con el 25 al
100% con las células que no se encuentran creciendo (Lagunas et al., 1982).
1.6.3.4.2 EFECTO CRABTREE.
Si la concentración de glucosa es alta el efecto Pasteur no opera, por lo que se
presenta el efecto Crabtree. Este fenómeno (también conocido como efecto
glucosa o contra efecto Pasteur) relaciona la concentración de glucosa con la ruta
catabólica particular adoptada por las levaduras sensibles a glucosa (por ejemplo,
S. cerevisiae) en presencia de oxígeno y establece que, aun bajo condiciones
aeróbicas, prevalece la fermentación sobre la respiración. Es decir, el NADH es
preferentemente oxidado durante la fermentación que durante la respiración; otra
forma de definir al efecto Crabtree es que la fermentación alcohólica se presenta
en condiciones de aerobiosis en exceso de glucosa (Aguilar, 1998). La glucosa es
convertida a etanol en aerobiosis. La glucosa tiene un efecto represivo en los
procesos de biosíntesis de enzimas respiratorias en Saccharomyces spp. (Moulin
et al., 1984). El mecanismo propuesto es la acumulación de piruvato, lo que
22
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
provoca una saturación en el metabolismo respiratorio (Figura 6), observándose lo
siguiente:
a) En limitación de glucosa no se observa la fermentación alcohólica y el
rendimiento de biomasa se incrementa hasta alcanzar un máximo.
b) En presencia de un exceso de glucosa se logra una acumulación de
piruvato en el citosol, lo que causa que éste al no ser metabolizado mediante
respiración, sea dirigido hacia la producción de etanol.
FIGURA 6. Saturación del metabolismo de piruvato ocasionado por el exceso de glucosa. a) No
hay saturación del metabolismo del piruvato debido a la baja concentración de glucosa en el medio.
b) Saturación del metabolismo de piruvato. Glucosa ( ), piruvato ( ), biomasa ( ) y etanol (
).
En la Figura 7 se puede observar el comportamiento cinético de las levaduras que
están sujetas a este mecanismo de regulación, destacándose que existe una
concentración de glucosa debajo de la cual no se presenta la fermentación
alcohólica y se obtiene el mayor rendimiento de biomasa, por arriba de esta
concentración se logra la producción de etanol.
El efecto Crabtree de corto término es observado cuando se agrega un exceso de
glucosa al medio de cultivo que no se encuentra fermentando, por lo que la
23
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
respuesta del cultivo es iniciar la fermentación en presencia del exceso de
glucosa. El efecto Crabtree de largo término es manifestado bajo condiciones de
fermentación aeróbicas en condiciones de estado estacionario en cultivos de
levaduras completamente adaptadas a dichas condiciones (Postma et al., 1989).
FIGURA 7. Comportamiento cinético de las levaduras que presentan el efecto Crabtree. Velocidad
específica de crecimiento (), rendimiento en biomasa (Yx/s), velocidad específica de formación de
etanol (vp) y concentración de sustrato (Cs).
El efecto Crabtree no es solo aplicable al crecimiento en glucosa debido a que S.
cerevisiae también fermenta aeróbicamente fructosa. En presencia de manosa o
galactosa, S. cerevisiae respira y fermenta simultáneamente (De Deken, 1966).
El efecto Crabtree no es aplicable para levaduras insensibles a glucosa (C. utilis,
Kluyveromyces marxianus, Trichosporon cutaneum). C. utilis, una levadura
Crabtree negativa, puede limitar su velocidad en la vía glicolitica por acumulación
intracelular de carbohidratos o bien, puede presentar una regulación diferente al
transporte de los mismos (Postma et al., 1989).
24
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
En S. cerevisiae, la supresión de la respiración por glucosa se considera debida a
la represión y/o inactivación de las enzimas respiratorias y a la actividad de los
transportadores (Lagunas, 1993).
La represión catabólica ocurre cuando la glucosa (o un producto inicial del
metabolismo de la glucosa) reprime la síntesis de varias enzimas respiratorias y
gluconeogénicas (Fiechter et al., 1981); dicha inactivación catabólica resulta en
una rápida desaparición de tales enzimas con la adición de glucosa. En la
represión catabólica, la actividad enzimática se pierde por dilución con el
crecimiento celular, esto es, aunque las enzimas continúan estando presentes, no
se sintetizan más debido a la represión de los genes por señales derivadas por la
glucosa u otros azúcares (Gancedo, 1992).
La contribución de la fermentación en el consumo global de glucosa es mayor para
las levaduras creciendo aeróbicamente en altas concentraciones de glucosa. Sin
embargo, cuando los niveles de glucosa disminuyen, las enzimas respiratorias son
desreprimidas lo que induce su síntesis, esto resulta en un consumo de etanol
cuando las células inician una segunda fase de crecimiento conocida como diauxia
(Walker, 1998).
Generalmente concentraciones cercanas a 5mM de glucosa afectan no sólo a las
enzimas respiratorias sino también a la expresión de muchos genes involucrados
en el transporte de azúcares y en su utilización (Carlson, 1987). Por ejemplo los
genes de SUC, MAL y GAL (genes para la utilización de la sacarosa, maltosa y
galactosa).
La inactivación catabólica es más rápida que la represión catabólica, se piensa
que es debido a que la glucosa induce la desactivación de un número limitado de
enzimas como la fructosa 1,6 bifosfatasa (Holzer, 1976). La inactivación de la
enzima ocurre primero por fosforilación de la enzima, seguido de una lenta
proteolisis vacuolar. François et al. (1984) demostraron que la inactivación
irreversible de la 1,6 bifosfatasa ocurre en S. cerevisiae por fosforilación mediada
por una proteína cinasa dependiente de adenosina monofosfato cíclico (AMPc).
25
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
El efecto Crabtree puede, además, ser debido a una saturación de la capacidad
respiratoria de las levaduras (Kappeli y Sonnleitner, 1986). Así, las levaduras que
presentan el efecto Crabtree (Crabtree positivas) poseen una capacidad oxidativa
limitada cuando crecen en glucosa, lo que ocasiona la acumulación de piruvato y
en consecuencia la producción de etanol.
La regulación entre respiración y fermentación es fundamental para el éxito de
muchos procesos industriales donde se aprovecha del metabolismo de las
levaduras. En S. cerevisiae, la optimización de la respiración es importante para la
producción de levadura (por ejemplo, para la industria de alimentos), mientras que
la optimización de la fermentación es importante para la producción de etanol
(Panchal, 1990). Así por ejemplo, para la producción de levadura en lote
alimentado se controla la concentración de azúcares con lo que se suprime la
formación de etanol, obteniéndose un mayor rendimiento en biomasa.
El metabolismo de levaduras, además de ser afectado por los efectos de
represión catabólica, es también afectado por efectos de inhibición en presencia
de un exceso de sustrato y producto.
1.6.3.5 LEVADURAS DEFICIENTES RESPIRATORIAS.
Una levadura deficiente respiratoria (DR) se caracteriza por presentar una
respiración alterada (Arneborg y Chi, 1999). Estas levaduras son de dos tipos:
mitocondriales y nucleares, dependiendo del lugar de la mutación (Nagai et al.,
1963). Las mutantes mitocondriales presentan una disminución del ADN
mitocondrial (O’Connor et al., 1976). Debido a su deficiencia en respiración
presentan incapacidad para crecer en sustratos no fermentables, tales como el
glicerol (Heslot et al., 1970).
Las levaduras DR son tres veces más resistentes al sulfato de cobalto, al cianuro,
a la antimicina A y a la adriamicina, por lo que pueden ser consideradas como
resistentes a compuestos tóxicos (Heslot et al., 1970; Daugherty et al., 1980 y
Poinsot, 1987).
26
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Nagai et al. (1963) resumen que la mutación deficiente respiratoria puede ser
obtenida por medio de agentes químicos, tales como: colorantes básicos
(acriflavina, ametista violeta, etc.), por sales de metales pesados (Co, Ni, Mn y
Cd), por inhibidores enzimáticos (azida de sodio, p-nitrofenol y 2,4 dinitrofenol) y
por otros agentes (como la cafeína, el TTC y etanol). También pueden ser
obtenidas por medios físicos, como radiación UV, y por tratamientos térmicos
subletales. Las mutantes obtenidas por medios químicos generalmente son
mutantes mitocondriales, por lo que el elemento de respuesta al stress (STRE)
puede ser afectado, mientras que las mutantes obtenidas por medios físicos
generalmente son nucleares, lo cual ayuda a mantener la integridad y
funcionalidad de la mitocondria.
Las condiciones de cultivo afectan directamente la mutación DR, por lo que ha
sido recomendado emplear condiciones de microaerobiosis o anaerobiosis para
inducir la mutación (Guiraud et al., 1987).
Hutter y Oliver (1998) obtuvieron una levadura deficiente respiratoria por medio de
la eliminación del gen PET191, en el cromosoma X de S. cerevisiae; se piensa
que este gen codifica para una proteína ensambladora del citocromo C, sin
embargo la función biológica del gen no ha sido totalmente entendida
(Saccharomyces genome database). El fenotipo de la levadura fue afectado en el
metabolismo de trehalosa, por lo que es posible que el elemento de respuesta al
estrés se vea afectado también.
Este tipo de mutación no es deseable durante la fermentación de la cerveza y,
aunque es frecuente de manera natural (mayor al 1%), produce efectos adversos,
tales como cambios en las propiedades de floculación, producción de compuestos
de aroma no deseados (diacetil) e incapacidad para utilizar azúcares no
fermentables. Guiraud et al. (1987) establecieron que las levaduras DR presentan
una disminución en la concentración de los citocromos a+a3 y b con respecto a la
levadura Silvestre (ver Figura 8), son incapaces de crecer en sustratos no
fermentables y no consumen etanol, por lo que no presentan un crecimiento
diaúxico.
27
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
FIGURA 8. Espectros de absorción de levaduras competentes y deficiente respiratoria. W,
Levadura Silvestre; M, Mutante deficiente Respiratoria (Guiraud et al., 1987).
Se ha sugerido el uso de mutantes deficientes respiratorias (petite) de S.
cerevisiae porque los rendimientos de alcohol son más altos debido a que este
tipo de células son insensibles al oxígeno y, por tanto, el sustrato no se desvía
hacia el crecimiento (Brown et al., 1994). Sin embargo, las deficientes respiratorias
crecen más lento que la competente que les dio origen.
Guiraud et al. (1987) Reportaron que las levaduras deficientes respiratorias
presentan una mayor velocidad de formación de etanol (en condiciones de
anaerobiosis para la levadura silvestre 1 g/gh y 2.5 g/gh para la DR) y un mayor
rendimiento específico de etanol (Yp/x) en condiciones de aerobiosis para la
levadura silvestre de 7.6 g/g y 28 g/g para la levadura DR. Además, las levaduras
deficientes respiratorias son ácidotolerantes y resistentes a los compuestos
tóxicos que alteran la cadena respiratoria y el proceso de fosforilación en
levaduras. Los resultados obtenidos por Giraud et al. (1987) son debidos a los
cambios realizados en la represión catabólica ejercida por el efecto Crabtree y
Pasteur dados por la mutación deficiente respiratoria.
28
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Tradicionalmente, se ha recomendado emplear condiciones de microaerobiosis
para la producción de etanol; sin embargo, Alfenore et al. (2004) encontraron que
bajo condiciones de aerobiosis es posible disminuir la producción de glicerol a
0.01 g/g contra 0.042 g/g obtenido en condiciones de anaerobiosis. Estos
resultados son importantes puesto que la presencia de glicerol en el medio de
cultivo dificulta el proceso de destilación del etanol.
Poinsot et al. (1987) Encontraron que la velocidad de producción de CO2 en
anaerobiosis aumenta de 130 a 250 L/hmg para la levadura silvestre y su
deficiente respiratoria y el valor del coeficiente respiratorio varía de 1.2 a 5,
respectivamente; tales resultados indican un aumento en la represión ejercida por
el efecto Crabtree y por tanto la imposición del metabolismo fermentativo sobre el
respiratorio. Además, se presenta una disminución del efecto Pasteur, dado por el
aumento del valor del indice del efecto Pasteur (PE) de 15% a un 85% para la
levadura silvestre y su deficiente respiratoria. El resultado de los cambios en la
represión catabólica causa un aumento en la velocidad de fermentación tanto en
aerobiosis como en anaerobiosis.
Gong et al. (1981) evaluaron la producción de etanol con S. cerevisiae y su
deficiente respiratoria, encontrando un aumento de un 3% en la eficiencia del
proceso. Öner et al. (2005) y Öner (2006) concluyen que las levaduras deficientes
respiratorias presentan mejores características que sus competentes respiratorias
para la producción de etanol.
29
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
1.6.3.6 S. cerevisiae ITV01 DR.
S. cerevisiae ITV01 DR, es un levadura resistente a bajos valores de pH, también
es osmotolerante debido que la velocidad específica de crecimiento permanece
sin alteración en un amplio intervalo de concentraciones iniciales de glucosa,
produce altas cantidades de etanol. Esta mutante fue obtenida mediante
exposición a bromuro de etidio y seleccionada por presentar mejores
características que la cepa parental. La deficiencia en su metabolismo oxidativo
está dada por la ausencia del citocromo c (ver Figura 9). Las mejores condiciones
para la producción de etanol son: pH 3.5, 30 C, 150 rpm (Ortiz-Muñiz, 2009). Sin
embargo, se desconoce el efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre el
crecimiento y la producción de etanol en S. cerevisiae ITV01 DR.
FIGURA 9. Espectros absolutos de () S. cerevisiae ITV01 y () S. cerevisiae ITV01 DR. Cit
a+a3, 610nm; Cit b, 560nm y Cit c, 549nm.
30
540 550 560 570 580 590 600 610 620
0.60
0.550.50
0.45
0.400.35
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
CAPITULO ll
2.1 MATERIALES Y METODOS.
2.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO.
La cepa que se empleo fue S. cerevisiae ITV01 DR obtenida mediante mutación
con bromuro de etidio por Ortiz-Muñiz (2009).
2.2 MEDIOS DE CULTIVOS.
2.2.1 MEDIO DE CONSERVACIÓN.
La cepa es conservada en refrigeración a 4C, resembrada cada mes en el medio
de conservación (Tabla 1).
TABLA 1. Composición del medio de conservación.
Componente g/L
Agar-agar 150
Glucosa 100
Extracto de levadura 10
31
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.2.2 MEDIO DE FERMENTACIÓN.
Las fermentaciones se realizan utilizando un medio de cultivo sintético mínimo
(Tabla 2), propuesto por Strehaiano (1984).
TABLA 2. Composición del medio de fermentación.
COMPONENTE g/L
Glucosa o Sacarosa 150
KH2PO4 5.0
(NH4)2SO4 2.0
MgSO47H2O 0.4
Extracto de levadura 1.0
Para las cinéticas realizadas empleando como fuente de carbono, miel intermedia
B, ajustando el contenido de azúcares a 200 g/L. Los medios de cultivo fueron
suplementados empleando tres fuentes de nitrógeno (urea, sulfato de amonio y
fosfato de amonio) y cinco niveles para cada una de ellas (1 a 5 g/L, incrementos
de 1 g/L), realizándose todas las fermentaciones por duplicado.
Los medios sintéticos fueron esterilizados en autoclave a 121C durante 15 min
(matraces Erlenmeyer). Los medios con miel intermedia B no fueron esterilizados.
2.3 CONDICIONES DE FERMENTACIÓN.
Para poder disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio de cultivo
de fermentación, la levadura fue previamente activada por medio de un precultivo.
Se toman tres asadas de la caja petri de la levadura en conservación y se incuba
en un matraz Erlenmeyer de 250 mL (100 mL de medio de cultivo e incubado a
150 rpm y 30 C). Después de transcurridas 12 horas de incubación, un número de
6x106 células viables/mL son tomadas del precultivo e inoculadas a un segundo
matraz, el cual es incubado a las mismas condiciones. Finalmente, se toman 6x106
células viables/mL como inóculo para las cinéticas a nivel matraz.
32
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.4 MÉTODOS ANALÍTICOS.
2.4.1 ANÁLISIS DE BIOMASA.
La densidad óptica (DO) es medida a 620 nm empleando un espectrofotómetro
Cintra 10, en celdas de metacrilato con una trayectoria óptica de 10 mm, se
realizan las diluciones adecuadas para tener valores de absorbencia menores a
0.8, correlacionando estos valores obtenidos con el peso seco (Figura 10).
2.4.2 CUENTA CELULAR.
La cuenta celular se realiza empleando una cámara de Thoma. Las muestras de
cultivo fueron diluidas con el fin de contar cada vez un número máximo de 500
células. Cada conteo es realizado a partir de cinco cuadros grandes de la cámara
de Thoma (Figura 11). El volumen de cada cuadro es de 4x10-6 mL.
FIGURA 10. Correlación Densidad óptica – Peso Seco obtenida.
33
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
FIGURA 11 .Distribución de la cuadrícula de la cámara de Thoma.
La concentración de células (X) por mililitro está dada por la ecuación:
cel /mL= Nd
4n10−6 (2.1)
Donde:
N: Número de células contadas
d: Dilución
n: Número de cuadros grandes
2.4.3 VIABILIDAD CELULAR.
El conteo de células viables de levadura es estimado por conteo al microscopio
después de la coloración de azul de metileno (Lange et al., 1993). La muestra se
mezcla volumen a volumen con el colorante, y después de 10 minutos de
contacto, se realiza la observación al microscopio, en donde las células viables no
34
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
presentan coloración y las células muertas presentan una coloración azul. Esto
puede ser debido a dos motivos:
a) La membrana de las levaduras muertas se debilita permitiendo que el
azul de metileno penetre a la célula, mientras que las células vivas
conservan la permeabilidad de la membrana;
b) El azul de metileno es un colorante de óxido-reducción, y es reducido por
una hidrogenasa y se vuelve incoloro (forma reducida) si la célula esta
viva.
Preparación del azul de metileno: el reactivo se prepara disolviendo 1g de azul de
metileno por litro de tricitrato de sodio trihidratado al 2%. Esta solución debe ser
conservada a 4ºC y en ausencia de luz.
Este método permite fijar con precisión la tasa de inoculación y el estado
fisiológico de las levaduras durante la fermentación. El porcentaje de viabilidad
(%V) está dado por la siguiente fórmula:
%V=NvNt
⋅100 (2.2)
Donde
Nv Número de células vivas
Nt Número de células vivas y muertas
2.4.4 ANÁLISIS DE GLUCOSA, GLICEROL, ÁCIDO ACÉTICO Y ETANOL.
Las muestras son centrifugadas a 10,000 rpm por 10 minutos a 4C y congeladas,
para posteriormente ser analizadas mediante cromatografíaa de líquidos de alta
resolución.
35
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Antes de de pasar las muestras al HPLC se realizó un pretratamiento de hidrolisis
a las muestras de miel congeladas. Se tomaron 0.8 mL de muestra y se mezcló
con 0.1 mL de Ba(OH)2 0.3 N y 0.1 mL de ZnSO4 5 %p/v, se dejaron reposar 5
minutos en el refrigerador, depués que transcurrido el tiempo, la muestras fueron
centrifugadas a 10,000 rpm por 10 minutos. Finalmente, se tomaron 0.5 mL de
sobrenadante y 0.5 mL de ácido sulfúrico 0.2 N y se colocaron en un baño maría
por 15 minutos a una temperatura de 65 ºC.
La concentración de glucosa, etanol, glicerol y ácido acético fue determinada
mediante HPLC, utilizando una columna Shodex SH1011P, específica para la
separación de azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes. Es una columna de
exclusión molecular e intercambio catiónico combinada.
La fase móvil empleada fue H2SO4 10 mM. El detector utilizado fue de índice de
Refracción. Las condiciones fueron: 0.6mL/min, 60C. A su vez, el volumen
inyectado fue de 10l utilizando un Alliance (Waters). El software que se utilizó fue
el Empower V2.0 calculando el área del pico y la concentración de la muestra
mediante una correlación con estándares previamente realizados. En la Tabla 3 se
muestran las correlaciones obtenidas.
TABLA 3. Correlaciones área-concentración obtenidas en HPLC para los diferentes compuestos
evaluados.
COMPONENTE R2 ECUACION.
GLUCOSA 0.999528 Y=7.83e+004 X-5.56+004
FRUCTOSA 0.999506 Y=1.46e+005 X-6.87e+004
GLICEROL 0.999486 Y=8.90e+004 X-1.80e+004
ACÉTICO 0.999498 Y=4.76e+004 X-9.51e+003
ETANOL 0.999487 Y=4.47e+004 X-4.95e+004
2.5 ANÁLISIS DE RESULTADOS.
36
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.5.1 CÁLCULO DE RENDIMIENTOS.
La ecuación de rendimiento Yx/s (g de biomasa / g de sustrato):
YXSX f X0S0 S f (2.3)
La ecuación de rendimiento Yp/s (g de producto/g de sustrato):
YPSPf P0S0 S f (2.4)
2.5.2 CÁLCULO DE PRODUCTIVIDADES.
La ecuación de productividad P (g de producto/Litro·hora):
P Pft f (2.5)
37
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.5.3 CÁLCULO DE VELOCIDADES GLOBALES.
El cálculo de las velocidades globales se realiza de acuerdo a las siguientes
fórmulas.
Producción de biomasa (rx):
rx (gl 1h 1)
dX
dt (2.6)
Consumo de sustrato (rs):
rs(gl 1h 1)
dS
dt (2.7)
Producción de producto (rp):
rp (gl 1h 1)
dP
dt (2.8)
2.5.4 CÁLCULO DE VELOCIDADES ESPECÍFICAS.
El cálculo de las velocidades específicas se realizó de acuerdo a las
siguientes formulas:
Crecimiento ():
(2.9)
38
(h 1)1
X
dX
dt
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Consumo (vs):
Vs( gg−1h−1 )=- 1XdSdt (2.10)
Producción (vp):
(2.11)
39
v p (gg 1h 1)
1
X
dP
dt
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.6 RESULTADOS
2.6.1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO.
Al evaluar el efecto de la fuente de carbono se empleo glucosa, sacarosa y miel
intermedia B. Los resultados obtenidos (Tabla 4) demostraron que empleando miel
intermedia B se obtuvo la mayor productividad de etanol (2.5 g/Lh) en
comparación con el empleo de glucosa y sacarosa (1.02 y 0.95 g/Lh,
respectivamente). Sin embargo, el rendimiento de etanol empleando glucosa y
sacarosa (0.37 y 0.36 g/g) fue mayor que al empleo de miel intermedia B (0.31
g/g), lo cual es debido a que las cinéticas fueron realizadas sin esterilizar el medio
de cultivo. Además, la viabilidad al final de la fermentación fue del 100%
empleando miel intermedia B y menor para el uso de glucosa y sacarosa (82 y
79%, respectivamente) como fuente de carbono. Por lo anterior, se seleccionó
como la mejor fuente de carbono a la miel intermedia B debido a que se obtuvo
una mayor productividad y viabilidad al final de la fermentación.
TABLA 4. Viabilidad, rendimiento (Yp/s) y productividad (Pe) de etanol en S. cerevisiae ITV01 DR
en diferentes fuentes de carbono.
Parámentro/Fuente
de Carbono
Glucosa Sacarosa Miel intermedia B
Yp/s (g/g) 0.37 0.36 0.31
Pe (g/Lh) 1.02 0.95 2.50
Viabilidad (%) 82 79 100
Los resultados indican que la miel intermedia B es una muy buena fuente de
carbono para la producción de etanol, concordando con lo reportador previamente
por Campos (2008).
40
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.6.2 EFECTO DE LA FUENTE DE NITRÓGENO.
Con el fin de evaluar la fuente de nitrógeno fueron seleccionadas las más
comunes empleadas en procesos industriales para la producción de etanol: sulfato
de amonio, fosfato de potasio y urea. A continuación se presentan los resultados
obtenidos con cada una de las fuentes de nitrógeno evaluadas.
2.6.2.1 EFECTO DEL SULFATO DE AMONIO.
El sulfato de amonio es una sal que tiene la característica de proporcionar a la
célula, tanto el nitrógeno amoniacal necesario, como el azufre, en forma de
sulfatos. En S. cerevisiae ITV01 DR al aumentar la concentración de sulfato de
amonio en un medio de cultivo realizado con 180 g/L de azúcares totales,
empleando miel intermedia B, como fuente de carbono, no se presentó un efecto
en la estimulación del crecimiento, de la producción de etanol y glicerol (producto
secundario de la fermentación alcohólica), así como en el consumo de los
azúcares presentes (sacarosa, glucosa y fructosa). De manera particular en
cuanto al crecimiento no se observaron diferencias en cuanto al tiempo de la fase
de latencia (adaptación de la célula al medio de cultivo), como en el tiempo de
inicio de la fase estacionaria (ver Figura 12). La cantidad de biomasa producida no
fue significativamente diferente de acuerdo al análisis de varianza realizado (p =
0.95).
Previamente, ha sido reportado el uso de sulfato de amonio por Ancona (2006) y
por Pérez-Bibbins (2007) en levaduras de género Saccharomyces y Candida,
respectivamente; donde se encontró que concentraciones mayores a 4 g/L de
sulfato de amonio las levaduras presentan un efecto de inhibición debido al exceso
de este componente en el medio de cultivo; no obstante, este fenómeno no se
observó en S. cerevisiae ITV01 DR lo cual puede ser debido a que el medio de
cultivo empleado es diferente del empleado en los trabajos previos (melazas de
caña de azúcar e hidrolizado de bagazo de caña).
41
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Figura 12. Efecto del sulfato de amonio sobre la cinética de S. cerevisiae ITV01 DR en un medio
basado en miel intermedia B. Sulfato de amonio: 0 (), 1 (), 2 (), 3 (), 4 () y 5 () g/L.
De la cinética de producción de etanol se puede corroborar el estado deficiente
respiratorio de la cepa ITV01 DR debido a la falta de consumo de etanol,
causando la ausencia del crecimiento diaúxico característico de las levaduras
competentes en respiración.
En la Figura 13 se demuestra que no existe efecto en la suplementación del medio
de cultivo basado en miel intermedia B con sulfato de amonio sobre los
rendimientos y productividades de biomasa, etanol y glicerol.
42
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Figura 13. Rendimientos y productividades de S. cerevisiae ITV01 DR en un medio de cultivo
basado en miel intermedia B a diferentes niveles de sulfato de amonio. Sulfato de amonio: 0 (), 1
(), 2 (), 3 (), 4 () y 5 () g/L.
2.6.2.2 EFECTO DE LA UREA.
Con respecto al efecto de la urea se evaluaron diferentes concentraciones de 1 a 5 g/L empleando el medio con miel intermedia B únicamente con agua destilada como testigo. Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 5, demuestran que la urea no afectó el rendimiento de etanol en los niveles evaluados. Además, no hubo efecto en cuanto a la producción de glicerol (producto secundario). La suplementación del medio de cultivo con urea originó una disminución del efecto de la urea sobre en el rendimiento específico de etanol-biomasa. Sin embargo, las variaciones que se obtuvieron no permiten concluir sobre la presencia de un efecto negativo o positivo sobre el crecimiento y producción de etanol por S. cerevisiae ITV01 DR B14.
2.6.2.3 EFECTO DEL FOSFATO DE AMONIO
Con el fin de evaluar el efecto del fosfato de amonio, de manera similar se presentan los datos obtenidos en la Tabla 6, donde es posible observar que se presentó efecto sobre el rendimientos de etanol al verse incrementado para los niveles de fosfato de amonio más bajos evaluados (1 y 2 g/L); glicerol, biomasa y la productividad de etanol. Además, se presentó una estimulación del metabolismo
43
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
fermentativo de acuerdo a los valores de Ye/x puesto que a las concentraciones de 1 y 2 g/L de fosfato de amonio, se presentó un incremento en el rendimiento específico de etanol, lo cual está relacionado con el efecto del ión fosfato sobre la regulación del efecto Pasteur en levaduras (Efecto Harden-Young, regulación de la fosfructocinasa), lo cual ha sido previamente reportado en la literatura (Walker, 1998). Esta estimulación se refleja a su vez con el aumento de la productividad de etanol.
TABLA 5. Rendimientos de etanol (Ye/s), glicerol (Yg/s), biomasa(Yx/s), específico de etanol (Ye/x) y productividad de etanol (Pe) de S. cerevisiae ITV01 DR B14 empleando como medio testigo miel intermedia B sin suplementar con urea.
Parámetr
oTestig
o
Urea (g/L)
1 2 3 4 5
Ye/s (g/g) 0.37 0.38 0.36 0.36 0.37 0.36
Yg/s (g/g) 0.06 0.06 0.06 0.06 0.05 0.07
Yx/s (g/g) 0.06 0.08 0.08 0.07 0.06 0.08
Ye/x (g/g) 6.49 5.72 4.28 5.10 5.82 5.26
Pe (g/Lh) 1.95 1.90 1.78 1.93 1.87 2.03
TABLA 6. Rendimientos de etanol (Ye/s), glicerol (Yg/s), biomasa (Yx/s), específico de etanol (Ye/x) y productividad de etanol (Pe) de S. cerevisiae ITV01 DR B14 empleando como medio testigo miel intermedia B sin suplementar con fosfato de amonio.
Parámetr
o
Testig
o
Fosfato de amonio (g/L)
1 2 3 4 5
Ye/s (g/g) 0.37 0.41 0.410.37
0.39
0.40
Yg/s (g/g) 0.06 0.07 0.070.07
0.07
0.07
Yx/s (g/g) 0.06 0.04 0.040.05
0.11
0.14
Ye/x (g/g) 6.49 10.2 10.5 8.3 3.5 2.8
44
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
5 8 0 4 0
Pe (g/Lh) 1.95 2.19 2.212.04
2.10
2.14
Sin embargo, los cambios obtenidos por la suplementación del medio de cultivo con bajas concentraciones de fosfato de amonio no representan cambios importantes en la cinética de crecimiento que permitan optar por su uso, más allá del incremento en el rendimiento y productividad de etanol. Sin embargo, esta aseveración está en función de la probabilidad de que la fermentación sea contaminada por bacterias y otras levaduras en función de las condiciones de cultivo empleadas.
Por todo lo anterior, es posible sugerir que el medio de cultivo basado en miel intermedia B es una excelente fuente de carbono, puesto que no requiere de su suplementación, tanto por fuentes de nitrógeno y otros iones de importancia para las levaduras, como lo es el ión fosfato.
45
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.7 CONCLUSIONES.
La mejor fuente de carbono fue la miel intermedia B, ya que fue la que presentó
la mejor productividad de etanol y viabilidad, en comparación a la glucosa y
sacarosa. La miel intermedia B es una opción viable como fuente de carbono ya
que en la actualidad solo se usa para fabricación de azúcar y no para la obtención
de etanol.
Utilizando sulfato de amonio con diferentes concentraciones (1 al 5 g/L) como
fuente de nitrógeno en un medio con miel intermedia B no se presentó un efecto
sobre la producción de etanol y el crecimiento en S. cerevisiae ITV01 DR.
Al utilizar la urea con diferentes concentraciones (1 al 5 g/L) se demostró que no
tuvo un efecto en el rendimiento de etanol en los niveles evaluados, tampoco
afecto en la producción de glicerol que es un producto secundario en la
fermentación. La urea no afecto el crecimiento de la levadura.
Con fosfato de amonio, al igual que con las anteriores fuentes de nitrógeno se
evaluaron cinco concentraciones (1 al 5 g/L) con la concentración más bajas (1 y 2
g/L) se presentó una estimulación del metabolismo fermentativo, esto hizo que se
obtuviera un incremento en la producción de etanol, lo cual está relacionado con la
presencia del efecto Pasteur en S. cerevisiae ITV01 DR.
46
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.8 RECOMENDACIONES.
Evaluar otras fuentes de carbono para la producción de etanol, tales como: jugo
de caña, sorgo, hidrolizados de almidones (papas, maíz).
Probar en fermentador empleando miel intermedia B y con 1 y 2 g/L de
concentración de fosfato de amonio como fuente de nitrógeno en cultivo continuo
para obtener una mayor productividad de etanol.
Evaluar las fuentes de nitrógeno (urea, sulfato de amonio, fosfato de amonio) con
otras fuentes de carbono (jugos de caña, sorgo, hidrolizado de bagazo de caña)
para estudiar los efectos que pueden tener sobre la producción de etanol.
Utilizar mango de la región de la cuenca del Papaloapan como fuente de carbono
en una fermentación, utilizando la levadura S.cerevisiae ITV 01 DR y evaluar los
rendimientos de etanol.
47
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
2.9 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Aguilar, MG., (1998). Caractérisation cinétique et metabolique d’ une souche
Brettanomyces. Tesis Doctoral. I.P.N. Toulouse, Francia.
Alfenore, S., C. Molina-Jouve, S.E. Guillouet, J-L. Uribelarrea, G. Goma y L.
Benbadis (2002) Improving ethanol production and viability of Saccharomyces
cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 60: 67-72.
Alfenore, S., X. Cameleyre, L. Benbadis, C. Bideaux, J-L. Uribelarrea, G. Goma, C.
Molina-Jouve y S.E. Guillouet (2004) Aeration strategy: a need for very high
ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 63: 537-542.
Arneborg, N. y Z. Chi (1999) Relationship between lipid composition, frequency of
ethanol-induced respiratory deficient mutants, and ethanol tolerance in
Saccharomyces cerevisiae. J. Appl. Microbiol. 86:1047-1052.
Brown, S.W., Sugden, D.A. y Olivier, S.G. (1984) Ethanol production and tolerance
in grande and petite yeasts. Journal of Chemical Technology and Biotechnology
34B: 116-120.
Bungay , H. R. (2004) Confessions of a bioenergy advocate. Trends Biotechnol.
22: 67-71.
Busturia, A. y Lagunas, R. (1986). Catabolite inactivation of the glucose transport
system in Saccharomyces cerevisiae. J. G. Microbiol.132: 379-385.
Carlson, M. (1987). Regulation of sugar utilization in Saccharomyces species.J.
Bact.169: 4873-4877.
48
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Campos, J. (2008). Establecimiento de un proceso de producción de etanol a partir de jugo de caña y miel intermedia B con Saccharomyces cerevisiae ITV01. Tesis de Maestría, UNIDA-ITV, México.
Cot, M. (2007). Etudes physiologiques de l’adaptation et de la résistance de la
levure Saccharomyces cerevisiae au cours de la production intensive d’ethanol.
Tesis Doctoral INSA, Toulouse, Francia.
Daugherty, PJ., S.C. Hixon y J.E.T. Adil Ocak (1980) Resistance to adriamycin
cytotoxiticity among respiratory deficient mutants in yeasts.
De Deken, R.H. (1966) The Crabtree Effect: a regulatory system in yeast. J. G.
Microbiol.44: 149-418.
Dombek, K.M. e Ingram, L.O. (1988). Intracellular acumulation of AMP as a cause
for the decline in the rate ethanol production by Saccharomyces cerevisiae during
batch fermentation.Appl. Environ. Microbiol.54: 98-104.
Fiechter, A., Fuhrmann, G.F., y kappeli, O. (1981).Regulation of glucose
metabolism in growing yeast cell.Adv. Microbiol Physiol.22, 123-183.
François, J., Van Schaftingen, E. y Hers, H.G. (1984) The mecanism by which
glucose increases fructose-2-6-bisphosphate concentration in Saccharomyces
cerevisiae. J. Biochem.145: 187-193.
Gancedo, C. (1992) Carbon catabolic repression in yeast. J. Biochem.193: 111-
119.
Gilis, F. (1999). Etude de Contaminations de Fermentations alcooliques
Industrialles par les levures Brettanomyces. Tesis Doctoral, INPT, Francia.
49
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Gong, C-S., L.F. Chen, M.C. Flickinger, L.C. Chiang y G.T. Tsao (1981) Production
of ethanol from D-xylose by using D-xylose isomerase and yeasts. Appl.
Enviroment. Microbiol. 41-2: 430-436.
Guiraud, J.P., J. Bourgi, M. Stervinou, M. Claisse y P. Galzy (1987) Isolation of a
respiratory deficient Kluyveromyces fragilis mutant for the production of ethanol
from Jerusalem artichoke. Biotechnol & Bioeng.29: 850-858.
Henschke P.A y Jiranek V.(1993). Yeasts metabolism of nitrogen compounds wine
microbiol. And Biotechnol.Ed.G.H. Fleet. Harwood Academic Publishers Chur
Switzerland. 77-164..
Heslot, H., C. Louis y A. Goffeau (1970) Segregational respiratory-deficient
mutants of a petite negative yeast Schizosaccharomyces pombe 972h-. J.
Bacteriol.104:482-491
Hipkin C.R (1989) Nitrate assimilation in yeasts. Molecular and genetic aspects of
nitrate assimilation. Oxford science publications.Ed. J.L Wray and J.R Kinghorn 51-
68.
Holzer, H. (1961). Regulation of carbohydrate metabolism by competition.Cold
Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 26: 277-288.
Holzer, H. (1976). Catabolite inactivation in yeast.Trends in Biochemical Sciences,
1: 178-181.
Horecker, B.L. (1978). Yeast enzymology: retrospectives and perspetives. In
Biochemestry and Genetics of Yeasts (eds. M. Bacila, B.L. Horecker y A.O.M.
Stoppani), pp. 1-15. Academic Press Inc., New York.
50
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Horta Nogueira Luiz Augusto; “Ethanol and ETBE production and end-use in
Mexico”; Dast 5; Potenciales y Viabilidad del Uso de Bioetanol y Biodiesel para
Transporte en México; Sener, BID-GTZ.
Hutter, A., y Oliver, SG. (1998) Ethanol production using nuclear petite yeast
mutants.Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 511-516.
Ingram L.O., Aldrich H.C., Borges A.C.C., Causey T.B., Martinez A., Morales F.,
Saleh A., Underwood S.A., Yomano L.P., York S.W., Zaldivar J., Zhou S. (1999)
Enteric Bacterial Catalysts for Fuel Ethanol Production. Biothechnol. Prog. 15: 855-
866.
Kruckeberg, A.L. (1996). The hexose transporter family of Saccharomyces
cerevisiae.Archiv. Microbiol.166. 283-292.
Kuyper, M. (2006) Enginnering of Saccharomyces cerevisie for production of fuel
ethanol from xilose.Tesis Doctoral, TUDelft, Holanda.
Lagunas, R. (1979). Energetic irrevelance of aerobiosis for S. cerevisiae growing
on sugars.Mol. Cel. Biochem.27, 139-146.
Lagunas, R. (1993) Sugar transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS
Microbiology Reviews104: 229-242.
Lagunas, R. y Gancedo, C. (1983) Role of phosphate in the regulation of Pasteur
effect in Saccharomyces cerevisiae.J. Biochem.137: 479-483.
Lagunas, R., Dominguez, C., Busturia, A. y Saez, M.J. (1982). Mechanisms of
appearance of the Pasteur effect in Saccharomyces cerevisiae: inactivation of
sugar transport systems. J. Bact.152, 19-25.
Lange, H., Bavouzet, J.M., Taillandier, P. y Delorme, C. (1993). Systematic error
and comparison of four methods for assessing the viability of Saccharomyces
cerevisiae suspensions.Biotechnol. Tech.7: 223-228.
51
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Lloyd, D., Krinstensen, B., y Degn, H. (1983). Glycolysis and respiration in yeasts:
the effect of ammonium ions studied by mass spectrometry. J. G. Microbiol.129,
2125-2127.
Martínez A., Bolívar F., Gosset G. (2002). Biotecnología energética sustentable:
etanol carburante para el transporte. Revista Universidad de México.
Mielenz J.R. (2001) Etanol producction from biomass: technology and
commercialization status. Current Opinion Microbiol. 4: 324-329.
Moulin, G., Boze, H. y Galzy, P. (1984). Inhibition of alcoholic fermentation.
Biotechnol. Gen. Eng. Rev.2: 365-382.
Muller, S., Boles, E., May, M. Y Zimmerman, F.K. (1995) Diferent internal
metabolites trigger the induction of glycolytic gene expression in Saccharomyces
cerevisiae. J. Bact.177: 4517-4519.
Nagai, S., N. Yanagishima y H. Nagai (1963) Advances in the study of respiration-
deficient (RD) mutation in yeast and other microorganisms. Instituto Politécnico,
Osaka, Japón.
O’Connor R.M., C.R. McArthur y G.D. Clark-Walker (1976) Respiratory deficient
mutants of Torulopsis glabrata, a Yeast with circular mitochondrial
deoxyribonucleic acid of 6 m.J. Bacteriol. 126-2:959-968.
Öner, E.T. (2006) Optimization of ethanol production from starch by an amylolytic
nuclear petite Saccharomyces cerevisiae strain.Yeast 23: 849-856
Öner, E.T., S.G. Oliver y b. Kirdar (2005) Production of ethanol from starch by
respiration-deficient recombinant Saccharomyces cerevisiae.Appl. Environment.
Microbiol.71: 6443-6445
Ortiz-Muñiz, B. (2009) Estudio de la fisiología de S. cerevisiae ITV01 y su
déficiente respiratoria para la producción de etanol. Documento Predoctoral.
UNIDA-ITV.
52
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Panchal, C. (1990) Yeast strain selection. Biotechnology and Bioprocessing
Series. Marcel Dekker Inc.
Poinsot, C., G. Moulin, M. Claisse y P. Galzy (1987) Isolation and characterization
of a mutant of Schwanniomyces castellii with altered respiration. Antonie van
Leeuwenhoek 53:65-75.
Postma, E., Verduyn, C., Scheffers, W.A. y Van Dijken, J.P. (1989).Enzymatic
analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of
Saccharomyces cerevisiae.Appl. Environ. Microbiol. 53: 468-477.
Poy, M (2005). Producción de etanol anhidro en ingenios azucareros. Cámara
Nacional de la Industria Azucarera.
Pronk, J.T., Steensma, H.Y. y Van Dijken, J.P. (1996). Pyruvate metabolism in
Saccharomyces cerevisiae.Yeast 12 1607-1633.
Rowe, S.M., Simpson, W.J., y Hammond, J.R.M. (1994) Intracellular pH of yeast
during brewery fermentation. Lett. Appl. Micriobiol.18: 135-137.
Santos, E., Rodríguez, L., Elorva, M.V., y Sentandreu, R. (1982). Uptake of
sucrose by Saccharomyces cerevisiae. Archiv. Biochem. Biophysics, 216. 652-
660.
Strehaiano, P. (1984). Phénomenes d’inhibition et fermentation alcoolique, These
Dr. és Sciences. I.N.P. Toulouse, Francia.
Thomas V., Kwong, A. (2001) Ethanol as led replacement: phasing out leded
gasoline in Africa. Energ.policy 29:1133-1143.
Van Dijken J.P.,Scheffers W.A. Redox balances in the metabolism of sugars by
yeasts. F.E.M.S.Rev.,32: 199-224.
53
Evaluación de la fuente de carbono y nitrógeno en S. cerevisiae para la producción de etanol.
Vergara W., Castello-Branco J.R. (1981) Energy Use for Etanol Production.
Proceedings of the internacional conference on Energy Use Management
(I.C.E.U.M) Editor R. Fazzolaire. Pergamon Press. Oxford.
Wainwright M. y Falith A.M.K (1996). Involvement of yeasts in urea hydrolysis and
nitrification in soil amended with a natural source of sucrose. Mycological.
Research, 100:307-310.
Walker, M.G. (1998). Yeast Phisiology and Biotechnology. John Wiley & Sons.
England.
Zimmerman, F.K. (1992). Glycolytic enzymes as regulatory factors. J.
Biotechnol.27: 17-26.
54