Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Санкт-Петербургский государственный университет»

На правах рукописи

Галкин Алексей Петрович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И

АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Специальность 03.02.07 – генетика

диссертация на соискание учѐной степени

доктора биологических наук

Научный консультант:

Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2015

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и

различия

13

1.1. Амилоиды 13

1.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов 18

1.3.Функциональные и патологические амилоиды 27

1.3.1. Функциональные амилоиды 27

1.3.2. Патологические амилоиды 31

1.3.2.1. Системный амилоидоз АА 31

1.3.2.2. Латеральный склероз 32

1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера 32

1.3.2.4. Болезнь Хангтингтона 36

1.4. Прионы 37

1.4.1. Прионы млекопитающих 37

1.4.1.1. Прионный белок PrP 37

1.4.1.2. Альфа – синуклеин 40

1.4.1.2.Белок tau 41

1.4.2. Прионы низших эукариот 42

1.4.2.1. Фактор [URE3] 44

1.4.2.2. Фактор [PSI+] 46

1.4.2.3. Фактор [PIN+] 48

1.4.2.4. Фактор [SWI+] 49

1.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3

+], [OCT

+] и [MOD

+] 50

1.4.2.6. Факторы [β] и [GAR+] 52

1.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina 53

1.4.3. Функциональная значимость прионов 55

1.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на

регуляцию протеомных сетей

59

3

1.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании

прионов и амилоидов

65

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 68

2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 68

2.2. Плазмиды 76

2.3. Методы дрожжевой генетики 86

2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 87

2.5. Метод бицистронной люминесценции 88

2.6. Флуоресцентная микроскопия 89

2.7. Иммунохимический анализ белков. 91

2.7.1. Выделение белка из дрожжей 91

2.7.2. Дифференциальное центрифугирование 93

2.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы К 93

2.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация 93

2.8. Протеомный метод выявления и идентификации амилоидов PSIA 96

2.8.1. Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке

ионными детергентами

97

2.8.2. Разделение и идентификация белков 98

2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE) 98

2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE 100

2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией

(LC-MALDI)

101

2.9. Статистические методы 102

ГЛАВА3.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

103

3.1. Прионный фактор [NSI+] 103

3.1.1. Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического

детерминанта [NSI+]

103

3.1.2. A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+] 106

4

3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции 107

3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+] 110

3.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 118

3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых

влияет на фенотипическое проявления [NSI+]

118

3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия

которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-]

121

3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в

дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»

126

3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов» 126

3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме

[NSI+]

137

3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые

агрегаты в штамме [NSI+]

137

3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+] 141

3.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN

+] 146

3.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных

агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей

154

3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo

амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом Aβ в дрожжах S. cerevisiae

157

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 166

ВЫВОДЫ 171

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 172

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 175

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Амилоиды представляют собой белковые полимеры, которые формируются

за счѐт образования упорядоченных межмолекулярных бета-складчатых слоѐв

[по: Baxa, 2008]. Инфекционные амилоидные полимеры (прионы), в отличие от

неинфекционных, расщепляются на олигомеры, которые в свою очередь

способны присоединять и конвертировать новые мономеры белка в амилоидную

изоформу [по: Галкин и др., 2006]. Прионы и неинфекционные амилоиды

выявлены у самых разных организмов и, зачастую, их формирование вызывает

цитотоксический эффект. Согласно медицинской классификации болезни,

связанные с образованием межклеточных амилоидных агрегатов, принято

называть «амилоидозами», тогда как патологии, которые определяются

накоплением внутриклеточных амилоидов, относят к «амилоидозоподобным»

заболеваниям [Sipe et al., 2014]. К числу наиболее социально значимых

амилоидных заболеваний относятся болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также

прионные болезни. В настоящее время известно более 30 различных амилоидных

заболеваний человека [Eisenberg and Jucker, 2012]. У дрожжей S. cerevisiae

охарактеризовано восемь белков, которые могут формировать прионные агрегаты

и вызывать наследуемые эпигенетические изменения, которые стабильно

наследуются в ряду поколений [Нижников и др., 2015].

Открытие инфекционных амилоидов (прионов) у одноклеточных

организмов привело к созданию новой концепции «белковой наследственности»

[Wickner, 1994]. Согласно этой концепции, в случае прионизации белок

инактивируется или изменяет свои функции, что вызывает наследуемое

изменение признака без каких бы то ни было изменений в геноме [Wickner, 1994].

Открытие прионов поколебало центральную догму биологии – в случае прионной

конверсии перенос информации идѐт непосредственно от белка к белку [Инге-

Вечтомов, 2013].

6

Актуальность исследования процесса амилоидогенеза связана также с тем,

что возникновение одних амилоидов зачастую индуцирует агрегацию других

амилоидогенных белков [Derkatch et al., 2001] и провоцирует глобальные

изменения в регуляции протеомных взаимодействий [Nevzglyadova et al., 2009].

Работы последних лет свидетельствуют о том, что некоторые амилоиды могут

выполнять жизненно-важные функции, в частности амилоидные конформеры

CPEB и Orb2 регулируют долговременную память у Aplysia californica и

Drosophila melanogaster, соответственно [Si et al., 2010; Mastushita-Sakai et al.,

2010; Majumdar et al., 2012]. Несмотря на определѐнные успехи в исследовании

амилоидогенеза, из-за отсутствия универсальных биохимических методов поиска

амилоидов, имеющиеся данные носят разрозненный характер и не позволяют

оценить распространѐнность и значимость амилоидов в живой природе. Наша

работа посвящена решению таких актуальных задач, как идентификация

амилоидов в масштабах протеома и анализ их взаимодействия in vivo.

Степень разработанности темы

Идентификация каждого нового приона или неинфекционного амилоида

крайне трудоѐмка и является заметным научным событием. У млекопитающих

новые амилоиды выявляются либо в результате исследования биохимических

свойств отдельных белков, либо вследствие анализа состава патологических

белковых депозитов [Glenner et al., 1984; McKinley et al., 1983]. Дрожжевые

прионные белки обычно выявляют в результате генетических скринингов

факторов, стабильно передающихся в ряду поколений и демонстрирующих

неменделевское наследование [Derkatch et al., 1997; 2001; Rogoza et al., 2010;

Suzuki et al., 2012]. С помощью генетических подходов можно выявлять лишь те

белки, амилоидогенез которых вызывает видимые фенотипические изменения в

конкретной модельной системе. Такой подход не является системным и не может

дать полного представления о распространѐнности и значимости амилоидов в

регуляции физиологических и патологических процессов. Прогресс в данном

7

направлении исследований может обеспечить разработка универсального

биохимического метода скрининга и идентификации инфекционных и

неинфекционных амилоидов в протеоме различных организмов. Принцип для

разработки биохимического метода выявления неизвестных амилоидов,

основанный на их уникальной устойчивости к обработке додецилсульфатом

натрия (SDS), был предложен в работе лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна

[Kushnirov et al., 2006]. Этот подход позволил выявлять сверхпродуцирующиеся

амилоидные белки, но оказался не достаточно чувствительным [Kushnirov et al.,

2006]. Недавно подход, основанный на SDS-устойчивости амилоидных фибрилл,

был усовершенствован, что позволило выявить некоторые глутамин-аспарагин

обогащѐнные белки, образующие прионные агрегаты в дрожжах [Kryndushkin et

al., 2013]. Вместе с тем, этот метод даѐт много ложно-позитивных результатов и

его нельзя считать универсальным, поскольку известны амилоиды неустойчивые

к обработке SDS [Kryndushkin et al., 2013].

Исследование взаимодействия амилоидов представляет особый интерес с

биомедицинской точки зрения, поскольку экспериментально доказано, что

возникновение патологических амилоидных агрегатов одного белка может

способствовать амилоидогенезу других белков [Derkatch et al., 2001]. Показано,

что индукции амилоидогенеза за счѐт взаимодействия мономеров одного белка с

предсуществующим амилоидным агрегатом другого белка способствует сходство

их аминокислотных последовательностей [Kovacs et al., 2002; Rank et al., 2002;

Giasson et al., 2003; Schwarze-Eicker et al., 2005]. Согласно предложенной модели,

амилоиды являются «затравкой» для присоединения мономеров другого белка,

что способствует физическому сближению мономеров, изменению конформации

и агрегации [Derkatch et al., 2001]. Вместе с тем, теоретические предсказания

такого рода взаимодействий на нынешнем уровне наших знаний невозможны.

Недавно было показано, что предсуществующие амилоидные агрегаты могут

индуцировать агрегацию других белков не только за счѐт механизма «затравки».

Так, прионизация дрожжевого транскрипционного регулятора Mod5 способствует

прионизации Sup35, хотя физически эти белки не взаимодействуют [Arslan et al.,

8

2015]. Механизмы, определяющие такого рода взаимодействия, пока остаются

неисследованными.

Изучение взаимодействия амилоидогенных белков в экспериментах на

трансгенных животных сопряжено с определѐнными методическими

сложностями, занимает много времени и требует больших материальных затрат.

Использование иммортализованных культур клеток для этих целей не всегда

возможно, поскольку патологические амилоиды убивают клетки. Эксперименты

in vitro безусловно помогают ответить на определѐнные вопросы, но имеют ряд

ограничений, и их результаты не всегда воспроизводятся in vivo. Наибольший

прогресс в исследованиях взаимодействий прионов и неинфекционных амилоидов

in vivo достигнут благодаря использованию дрожжевой модельной системы [Inge-

Vechtomov, 2011].

Цель и задачи работы

Целью работы является идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в

протеоме дрожжей, а также анализ взаимодействия амилоидогенных белков

млекопитающих in vivo в дрожжевой модельной системе.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Выявление и характеристика новых наследуемых изменений признаков,

опосредованных прионизацией белков дрожжей S. cerevisiae.

2. Идентификация белков, прионизация которых вызывает наследуемые

изменения признаков.

3. Разработка универсального метода протеомного скрининга амилоидов и его

использование для идентификации белков, образующих агрегаты,

обладающие амилоидными свойствами.

9

4. Проверка адекватности дрожжевой модели для анализа взаимодействия

белков млекопитающих, формирующих амилоидные агрегаты.

Научная новизна

В результате проведѐнных исследований впервые показано, что

взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI

+] вызывает наследуемое изменение

признака. Предложена гипотеза, объясняющая механизм прионных

взаимодействий. Показано, что белки Rnq1 и Swi1 в прионной форме

приобретают новую, ранее не охарактеризованную функциональную активность.

Выявлен список белков, которые демонстрируют амилоидные свойства in vivo и

являются кандидатами на роль функциональных амилоидов дрожжей S. cerevisiae.

Разработана и успешно апробирована новая методология, позволяющая выявлять

и идентифицировать прионы и неинфекционные амилоиды различных

организмов. В дрожжевой модельной системе выявлены аминокислотные

последовательности прионного белка млекопитающих, ответственные за

взаимодействие патогенных агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета

(Aβ), агрегация которого связана с болезнью Альцгеймера.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе результаты дополняют теорию белковой

наследственности. Предложена концепция, согласно которой функциональные

взаимодействия прионов, опосредованные другими компонентами протеомной

сети, вызывают наследуемые изменения признаков. Показано, что эффекты

функционального взаимодействия прионов могут быть описаны в рамках

традиционной классификации генных взаимодействий. Охарактеризованное в

нашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI

+] в дрожжах может являться

удобной модельной системой для исследования закономерностей, определяющих

взаимодействие амилоидов человека, вызывающих социально-значимые

10

амилоидные заболевания. Теоретическая значимость работы определяется также

выявлением в протеоме дрожжей S. cerevisiae ряда белков, являющихся

потенциальными кандидатами на роль функциональных амилоидов.

Практическая значимость работы определяется тем, что разработанная

методология протеомного скрининга амилоидов открывает широкие перспективы

для выявления функциональных и патологических амилоидов у различных

биологических объектов и позволяет оценить распространѐнность и значимость

явлений прионогенеза и амилоидогенеза в живой природе. В частности,

разработанный нами подход может быть использован для выявления ещѐ не

охарактеризованных амилоидов, вызывающих заболевания человека, этиология

которых пока неизвестна. Выявление аминокислотных последовательностей

прионного белка млекопитающих, ответственных за регуляцию физического

связывания патологических агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета,

может иметь значение для разработки новых подходов к лечению и

предотвращению амилоидных заболеваний.

Методология и методы исследования

В работе использованы стандартные методы классической и молекулярной

генетики дрожжей и разработаны новые подходы для протеомного скрининга и

идентификации амилоидов у различных организмов. В частности, в работе

использовали классические методы культивирования E.coli и S. cerevisiae

[Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990], стандартный набор методов генной

инженерии [Sambrook et al., 1989], различные вариации методов выделения белка,

электрофореза в агарозном и акриламидном геле, Вестерн-блот гибридизации

[Rubel et al., 2013]. Для сравнительного анализа уровня транскрипции

исследуемых генов, а также для оценки эффективности терминации трансляции,

использовали методы ПЦР в реальном времени [Livak and Schmittgen, 2001] и

бицистронной люминесценции [Valouev et al. 2009], соответственно. Для анализа

11

взаимодействия амилоидных белков in vivo применяли методы флуоресцентной

микроскопии и метод FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [Roszik et al.,

2013]. Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение

выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили при

помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0. (“StatSoft

Inc.”, США).

Разработана новая методология для выявления и идентификации в

масштабах протеома белков, формирующих амилоидные агрегаты in vivo. Этот

подход объединяет ряд биохимических и протеомных методов, в частности,

ультрацентрифугирование белкового лизата, очистку фракции детергент-

устойчивых белковых агрегатов, двумерный электрофорез окрашенных

флуорохромами белков, расщепление сложных белковых смесей на пептиды, их

разделение методом HPLC и идентификацию белков методом масс-

спектрометрии.

Положения, выносимые на защиту

1. Дополнена теория белковой наследственности – установлено, что

взаимодействие прионов может вызывать наследуемые изменения признаков.

2. Белки Rnq1 и Swi1 в результате прионизации приобретают новую

функциональную активность.

3. С помощью новой методологии в протеоме S. cerevisiae идентифицированы

белки, демонстрирующие амилоидные свойства и являющиеся кандидатами на

роль функциональных амилоидов.

4. Показана адекватность использования дрожжевой модели для исследования

агрегации и взаимодействия гетерологичных амилоидов.

12

Степень достоверности и апробация результатов

Полученные результаты достоверны и были представлены в виде устных

докладов на следующих российских и международных конференциях:

«Нобелевские чтения» 2003, Санкт-Петербург; XXI th YGM Conference, 2003,

Гетеборг, Швеция; 2-я конф. МОГиС «Актуальные проблемы современной

генетики», 2003, Москва; “Prion 2006”, Турин, Италия; V съезд ВОГиС, 2009,

Москва; «Нейронаука для медицины и психологии», 2012, Судак, Украина; FEBS

Congress, 2013, Санкт-Петербург; VI Съезд ВОГиС, 2014, Ростов-на-Дону. Кроме

того, результаты представлены в виде стендовых сообщений на других

международных конференциях и опубликованы в виде тезисов. Результаты

представлены также в докладах на заседании президиума Санкт-Петербургского

научного центра РАН в 2011 г, на заседании по программе Президиума РАН

«Фундаментальные науки – медицине», 2010, Москва, в приглашѐнном докладе в

Georgia institute of Technology, США, 2008 и на научных семинарах кафедры

генетики и биотехнологии СПбГУ.

Результаты опубликованы в тринадцати научных статьях в международных и

отечественных рецензируемых журналах и включены в главу монографии.

Оформлен патент на изобретение РФ №- 2294964.

13

Глава1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и различия

1.1. Амилоиды

Исходно термин «амилоид» (крахмалоподобный) был предложен Матиасом

Шлейденом в 1838 году для описания конгломератов крахмала, в норме

присутствующих в клетках растений [по: Sipe and Cohen, 2000]. Рудольф Людвиг

Карл Вирхов в 1854 году распространил этот термин для описания

патологических отложений в печени, которые подобно крахмалу окрашивались

йодом [по: Andree and Sedivy, 2005]. Достаточно скоро стало понятно, что

амилоидные включения, формирующиеся в различных органах и тканях человека,

не содержат вещества сходного с крахмалом [Sipe and Cohen, 2000].

Молекулярная природа амилоидов стала окончательно понятна относительно

недавно, после внедрения в медицину и биологию метода твѐрдофазного ядерного

магнитного резонанса.

С точки зрения молекулярной биологии амилоиды представляют собой

упорядоченные белковые фибриллы, в которых бета-складчатые листы

формируются за счѐт образования межмолекулярных водородных связей. В

результате присоединения к амилоидному олигомеру новых мономеров

образуются поперечно исчерченные протофибриллы, которые объединяются в

фибриллы и крупные амилоидные агрегаты. Межмолекулярные связи образуют

одни и те же последовательности взаимодействующих мономеров, что определяет

упорядоченность амилоидных агрегатов [Kajava et al., 2010]. Вместе с тем,

трактовка термина «амилоид» по-прежнему неоднозначна. Фибриллы

амилоидогенного белка обычно связывают ряд других белков, в том числе

протеогликаны, что и объясняет окрашивание амилоидов йодом [Snow et al.,

1994]. В связи с этим, зачастую в биомедицинской литературе амилоидами

называют весь комплекс белков, связанных с фибриллой амилоидогенного белка.

Более того, в соответствии с современной медицинской классификацией

амилоидами принято считать лишь межклеточные агрегаты, которые

окрашиваются амилоид-специфическими красителями [Sipe et al., 2014].

14

В отличие от медицины, для которой характерен оправданный консерватизм,

определения, принятые в биохимии и молекулярной биологии, должны

основываться на современных знаниях о молекулярных свойствах исследуемых

соединений. Именно поэтому, последние пятнадцать лет в молекулярно-

биологической литературе в качестве амилоидов принято рассматривать белковые

фибриллы любых организмов, имеющие кросс-бета структуру, вне зависимости

от ассоциированных с ними компонентов, а также от их внутриклеточной,

межклеточной или внеклеточной локализации [Lansbury et al., 1995; Kajava et al.,

2010; Shewmaker et al., 2011; Syed and Boles, 2014; Knowles et al., 2014]. В нашей

работе, посвящѐнной идентификации и анализу взаимодействия амилоидов, мы

будем придерживаться именно такой точки зрения.

В качестве иллюстрации амилоидной структуры на рисунке 1 приведено

схематическое изображение бета слоѐв, образующихся в результате связывания

двух мономеров в параллельной (рис. 1 А) и антипараллельной ориентации (рис. 1

Б). При образовании межмолекулярных бета структур карбоксильные и

аминогруппы аминокислот взаимодействующих молекул белка формируют

водородные связи [Kajava et al., 2010]. Вероятно, радикалы аминокислот в

формировании таких связей не участвуют, но этот вопрос изучен не достаточно

полно. Для большинства исследованных амилоидных структур с той или иной

степенью достоверности доказана параллельная ориентация цепей (так

называемая структура “parallel in register” [Wickner et al., 2010]. Вместе с тем,

совсем недавно появились доказательства, что некоторые амилоиды формируют

антипараллельные структуры [Gu et al., 2014]. Показано также, что амилоиды

могут формировать структуру спирали [Van Melckebeke et al., 2010; Saupe, 2011].

В этом случае бета слой формируется за счѐт связывания N-терминальной

последовательности одного мономера с C-терминальной последовательностью

другого мономера.

15

Рисунок 1. Схематическое расположение мономеров одного и того же белка в

параллельной (А) и антипараллельной (Б) ориентации в составе амилоидной

фибриллы. Водородные межмолекулярные связи обозначены красными

чѐрточками.

Есть экспериментальные основания полагать, что последовательности,

образующие бета слои, укладываются в виде так называемых «арок» (рис. 2),

структура которых может стабилизироваться за счѐт внутримолекулярных

взаимодействий [Kajava et al., 2010]. Типичная амилоидная фибрилла

представляет собой гомополимер [Wickner et al., 2010], хотя нельзя исключать,

что фибриллы могут включать мономеры другого белка, с гомологичными или

сходными аминокислотными последовательностями.

16

Рисунок 2. «Арочная модель» укладки последовательностей, формирующих бета

слои. [по Kajava et al., 2010].

Следует отметить, что наряду с альфа спиралью, бета слои являются одной

из форм укладки белка, и большинство белков содержит последовательности,

формирующие такие вторичные структуры. Уникальность амилоидов

заключается в том, что они образуются за счѐт формирования не

внутримолекулярных, а межмолекулярных упорядоченных бета слоѐв. Нередко

приходится встречать утверждение - «любой белок может формировать

амилоидные агрегаты». В этом утверждении есть лишь небольшое зерно истины с

точки зрения химика, который ставит эксперименты in vitro, однако с точки

зрения биолога, оно лишено смысла. Биолог имеет дело с живыми объектами, и in

vivo, даже в условиях сверхпродукции, лишь немногие белки образуют

амилоидные агрегаты. Более того, даже in vitro при широком варьировании

условий (солевого состава буферов, кислотности и температуры) далеко не всякий

белок или пептид может формировать амилоидные фибриллы [Maji et al., 2009].

Амилоидогенные свойства определяет аминокислотный состав

17

последовательности полипептидов. Экспериментально установлено, что

наибольшим амилоидогенным потенциалом обладают последовательности,

обогащѐнные гидрофобными аминокислотами, такими как фенилаланин,

изолейцин и валин, а наименьшим - обогащѐнные заряженными аминокислотами

[Ahmed and Kajava, 2013]. Такая аминокислота как пролин вообще не образует

бета связей и, соответственно, препятствует амилоидогенезу, так как у неѐ

отсутствует стандартная аминогруппа.

Разработано несколько теоретических алгоритмов, позволяющих

предсказывать способность полипептидов к амилоидогенезу, но эти алгоритмы

удовлетворительно работают только для коротких пептидов [по: Ahmed and

Kajava, 2013]. Есть основания полагать, что амилоидные свойства белка,

определяют не только последовательности способные образовывать бета слои, но

и соседние участки полипептидной цепи. Таким образом, теоретические

предсказания в настоящее время малоэффективны.

Большинство выявленных амилоидов являются патогенными и

демонстрируют цитотоксические эффекты [по: Нижников и др., 2015].

Образование патогенных амилоидных полимеров чаще всего может быть вызвано

двумя причинами – аномальным повышением концентрации амилоидогенного

белка, или возникновением аминокислотных замен, способствующих агрегации.

Вместе с тем, у некоторых организмов выявлены как конститутивные

функциональные амилоиды, так и функциональные амилоиды, формирование

которых индуцирует внешнее воздействие [Sugiyama and Tanaka, 2014].

Для амилоидов можно выделить несколько универсальных физико-

химических свойств [по: Нижников и др. 2015]:

- поперечная исчерченность, которая определяется поперечным расположением

мономеров белка по отношению к центральной оси протофибриллы;

- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный

и тиофлавин Т;

18

- высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов,

растворяющих почти все белковые комплексы и агрегаты, но не амилоидные

фибриллы;

- способность к автокаталитическому росту за счѐт присоединения свободных

мономеров к протофибрилле [McLaurin et al., 2000].

Отметим, что при присоединении к амилоидной протофибрилле мономер

изменяет конформацию, что зачастую приводит к инактивации белка, или к

приобретению белком новых функций [по: Winklhofer et al., 2008]. Для

большинства исследованных белков есть полный спектр доказательств

амилоидных характеристик фибрилл, полученных in vitro, а в экспериментах in

vivo показано лишь связывание с амилоидспецифическими красителями. Это

объясняется серьѐзными методическими сложностями выделения и очистки

амилоидов от прочих белков.

1.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов

Впервые термин «Prion» (“proteinaceous infectious (particles)”) был

предложен Стенли Прусинером для описания особой формы одноимѐнного белка

PrP (Prion Protein), вызывающей инфекционные нейродегенеративные

заболевания человека и животных. Прионная форма белка была обозначена PrPSc

(от первого описанного прионного заболевания овец “Scrapie”). Нормальная

форма белка PrP обозначается PrPC

(от Cellular) [по: Prusiner and Scott, 1997].

Согласно определению С. Прусинера «прионы – это инфекционные белковые

частицы», которые способны к самовоспроизведению. Эти инфекционные

частицы представляют собой амилоидные агрегаты белка Prion Protein. Агрегаты

PrPSc

удивительно устойчивы и могут передаваться от организма к организму

даже принадлежащим разным видам. Инфекционные частицы PrPSc

содержатся

не только в мозге, но и в других органах и тканях, а также в выделениях

лимфатической системы и фекалиях [по: Aguzzi et al., 2008]. Большинство

19

выявленных впоследствии у разных организмов белков, подпадающих под

определение «прион» (т.е. инфекционная белковая частица), формируют

амилоидные агрегаты.

Рассмотрим основные сходства и различия понятий «амилоид» и «прион». В

первую очередь нужно заметить, что описаны некоторые прионы, не обладающие

амилоидными свойствами [Brown and Lindquist, 2009], а возникновение

дрожжевого приона [β] вообще не связано с конформационными изменениями

[Roberts and Wickner, 2003]. Подробнее об этом будет сказано в разделе

«Прионы». Здесь мы сосредоточимся на обсуждении отличительных черт

инфекционных и неинфекционных амилоидов.

Инфекционными являются только те агенты, которые способны

размножаться в организме-хозяине. Классическими примерами инфекционных

агентов являются бактерии, патогенные грибы, бактерии и вирусы. Поскольку

прионы являются инфекционными белковыми частицами, то само определение

постулирует способность этих частиц (иначе говоря, амилоидных агрегатов)

размножаться, то есть самовоспроизводиться. Именно размножение прионных

частиц объясняет распространение прионных инфекций у млекопитающих [Sun et

al., 2008] и передачу прионной формы белка в ряду поколений у микроорганизмов

[Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Если говорить о S. cerevisiae, то прионный

агрегат, образовавшийся в одной клетке, стабильно передается всем еѐ потомкам

в ряду клеточных поколений, что однозначно доказывает наличие механизма,

обеспечивающего размножение, то есть расщепление прионного агрегата. Для

описания прионизации белка PrP было предложено две базовые модели,

получивших название «гетеродимерной» и «полимеризационной» [Prusiner, 1989;

Lansbury and Caughey, 1995] (рис. 3).

20

Рисунок 3. Модели, объясняющие передачу приона [по: Chernoff , 2001].

Отметим, что «полимеризационная» модель отражает механизм

амилоидогенеза, но никак не объясняет механизм передачи приона, который

должен включать в себя не только рост полимера, но и увеличение количества

прионных частиц. Согласно «гетеродимерной» модели два мономера белка

взаимодействуют, что приводит к изменению их конформации, далее изменѐнные

мономеры разделяются и служат матрицами для присоединения и конверсии

новых мономеров. Эта модель оказалась ошибочной – как было показано в ряде

работ, свободные мономеры белка не способны сохранять прионную

конформацию. Если говорить об амилоидных прионах, то, как мы понимаем

теперь, бета-структуры молекул, формирующих прион, сохраняются лишь в

составе полимеров.

Гипотеза, объяснившая механизм размножения амилоидных прионов, была

предложена В. Кушнировым и М. Тераванесяном [Kushnirov and Ter-Avanesyan,

1998]. Основываясь на экспериментальных данных, авторы предположили, что в

клетках дрожжей прионные агрегаты расщепляет на олигомеры шаперон Hsp104.

Делеция гена, кодирующего этот шаперон, приводит к утрате приона, поскольку

амилоидные агрегаты перестают расщепляться и не могут передаваться из клетки

в клетку. Позднее было показано, что Hsp104 в комплексе с другими шаперонами

21

обеспечивает расщепление агрегатов большинства дрожжевых прионов

[Romanova and Chernoff, 2009]. Размножение агрегатов приона млекопитающих

(т.е. увеличение количества инфекционных частиц) было доказано при

инфицировании иммортализованной культуры клеток патогенными агрегатами

PrPSc

. У потомков инфицированных клеток прионный белок был представлен в

амилоидной изоформе PrPSc

[Butler et al., 1988]. Факторы, обеспечивающие

расщепление агрегатов PrPSc

по-прежнему остаются неизвестными. Было

показано, что агрегаты PrPSc

могут расщепляться in vitro при механическом

воздействии, а также в результате активности шаперона альфа-кристаллина [Sun

et al., 2008], однако эта работа не получила продолжения. Именно расщепление

прионных агрегатов на олигомеры, приводящее к увеличению количества

инфекционных частиц, является ключевым отличием прионов от классических

амилоидов. Эту мысль иллюстрирует схема, приведѐнная на рисунке 4.

На этапе инициации процессы амилоидогенеза и прионогенеза ничем не

отличаются друг от друга. В случае формирования конститутивных

функциональных амилоидов уровень продукции белка оказывается достаточным

для того, чтобы мономеры связались друг с другом за счѐт формирования

межмолекулярных бета слоѐв. Образовавшаяся затравка присоединяет новые

мономеры, что приводит к формированию олигомера и протофибриллы (рис. 4,

этап 1).

22

Рисунок 4. Схема амилоидогенеза и прионогенеза. Красный круг – мономер белка

в исходной конформации. Зелѐный квадрат – мономер того же белка в

амилоидной конформации.

Примерно так же происходит формирование патологических амилоидов и

прионов, за исключением того, что в данном случае этот процесс индуцируется

аномальным повышением концентрации амилоидогенного белка, или

нарушением его взаимодействия с функциональными партнѐрами.

Образовавшиеся протофибриллы собираются в фибриллы и более крупные

агрегаты.

Каждый новый неинфекционный амилоидный агрегат (прион) образуется

независимо от предсуществующего. Иначе обстоит дело в случае прионогенеза.

Амилоидные прионные агрегаты, в отличие от неинфекционных амилоидов,

расщепляются на олигомеры (рис.4, этап 2), каждый из которых является

матрицей для присоединения новых мономеров. Образовавшийся олигомер растѐт

23

и вновь расщепляется на олигомеры, что приводит к возникновению цикла

прионной конверсии (рис. 4). У дрожжей расщепление агрегатов обеспечивает

возникновение воспроизводящегося цикла прионной конверсии и позволяет

мелким агрегатам передаваться в дочерние клетки, то есть стабильно

наследоваться.

Поскольку в случае прионизации белок входит в состав амилоидных

агрегатов, это приводит к его полной или частичной инактивации. Прионная

инактивация белка может приводить к наследуемому изменению признака у

одноклеточных организмов. Именно в этом заключается феномен «белковой

наследственности» впервые сформулированный Ридом Викнером – в случае

прионизации возникает наследуемое изменение признака без каких бы то ни было

изменений в геноме [Wickner, 1994; Wickner et al., 1999]. Кроме того, открытие

прионов привело к констатации ещѐ одного феномена – один и тот же белок в

идентичных условиях может быть представлен в организме как минимум в двух

альтернативных конформациях. Инфицирование организма прионным агрегатом,

или возникновение приона de novo, в результате лишь временного повышения

концентрации белка, вызывает наследуемое у микроогранизмов, или стабильно

воспроизводящееся в организме высших эукариот, изменение конформации и

активности белка. В отличие от прионов, неинфекционные патологические

амилоиды могут поддерживаться только в случае постоянной сверхпродукции

соответствующих белков. Например, показано, что ряд мутаций, способствующих

повышенному уровню секреции амилоидного пептида бета (Aβ), вызывают

наследственные формы болезни Альцгеймера [Goate and Hardy, 2012].

Отличие прионов от неинфекционных амилоидных агрегатов удобно

проиллюстрировать на следующем примере – прион [PSI+] (прионная форма

дрожжевого белка Sup35) стабильно наследуется, поскольку шаперон Hsp104

расщепляет прионные агрегаты, обеспечивая тем самым цикл прионной

конверсии [Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Делеция HSP104 или его

инактивация приводит к потере прионных агрегатов, так как в отсутствие этого

24

шаперона агрегаты продолжают расти, но не расщепляются и крупные агрегаты

не передаются в дочерние клетки, то есть становятся неинфекционными

[Borchsenius et al., 2001; Kryndushkin et al., 2003; Kushnirov et al., 2007]. В этом

случае, в отсутствие конформационной матрицы (прионных агрегатов) в дочерних

клетках вновь синтезируемый белок Sup35 представлен в мономерной

конформации. В зависимости от активности Hsp104 белок Sup35 может

формировать в дрожжах как прионные, так и неприонные агрегаты. Таким

образом, как ни тонка грань между прионами и неинфекционными амилоидами,

но она существует.

Доказать или опровергнуть наличие прионных свойств амилоидов

млекопитающих значительно сложнее. Для того, чтобы утверждать, что однажды

инъецированный агрегат размножается (т.е. запускает цикл прионной конверсии)

необходимо использовать модельных животных или культуры клеток, у которых

исследуемый белок стабильно поддерживается в нормальной клеточной

конформации. Некоторые авторы не могут устоять перед соблазном назвать

исследуемый ими амилоид прионом, не имея для этого серьѐзных оснований. Так

в целом ряде работ используется следующая логика: условный белок «Х»

формирует амилоидные фибриллы in vitro. Добавление этих фибрилл к раствору,

содержащему мономеры белка «Х» ускорят процесс агрегации. На основании

этих данных авторы делают вывод, что исследуемый белок обладает прионными

свойствами [Raveendra et al., 2013; Ren et al., 2009; Prusiner, 2013]. В связи с

большим количеством таких работ нужно отметить, что ускорение процесса

агрегации мономеров за счѐт добавления предсуществующего агрегата

характерно для любого амилоида, да и не только амилоида (достаточно вспомнить

из школьной программы пример с добавлением кристалла соли в насыщенный

раствор). Предполагается, что данные эксперименты доказывают способность

агрегатов к самовоспроизведению, но на самом деле происходит подмена

понятий. Самовоспроизведение это увеличение количества агрегатов, а не

увеличение их размеров. Очевидно, что эксперименты, рассмотренные на

примере гипотетического белка «Х», доказывают увеличение размера

25

предсуществующих агрегатов, но не свидетельствуют об их

самовоспроизведении.

Амилоидные агрегаты некоторых белков, подобно прионам, могут

транспортироваться из клетки в клетку, в частности, в составе секреторных

везикул [Joshi et al., 2015; Medina and Avila, 2014]. Более того, показано, что

инъекция амилоидных фибрилл белка в мозг трансгенных мышей,

сверхпродуцирующих этот белок, может ускорять процесс амилоидогенеза [Eisele

et al., 2010; Morales et al., 2012; Rosen et al., 2012]. Здесь важно сказать, что в

условиях сверхпродукции эти белки могут образовывать агрегаты и без инъекции.

В данном случае нельзя утверждать, что именно инъекция приводит к появлению

альтернативной формы белка. Ускорение амилоидогенеза может быть вызвано

ростом введѐнных в организм фибрилл.

Вместе с тем, совсем недавно были получены доказательства прионных

свойств амилоидных конформеров белков альфа-синуклеин и tau, агрегация

которых вызывает нейродегенеративные заболевания. Амилоидные фибриллы

белка альфа-синуклеин, полученные in vitro, при инъекции в мозг мышам дикого

типа, индуцируют нейродегенерацию, связанную с амилоидогенезом [Luk et al.,

2012]. Данных о возникновении патологии в результате инъекции полученных in

vitro фибрилл tau пока нет, но появление агрегатов tau и развитие

нейродегенерации были показаны при инъекции мышам дикого типа гомогената

из мозга человека, содержащего олигомеры tau и пептида Aβ [Lasagna-Reeves, et

al., 2012]. Отметим, что в контроле (без инъекции фибрилл альфа-синуклеина или

гомогената, содержащего олигомеры tau) эти белки в мозге мышей дикого типа не

агрегируют.

26

Таблица 1. Прионные и амилоидные свойства некоторых белков

млекопитающих, агрегация которых вызывает патологию.

Белок

Патология

Индукция амилоидогнегенза у модельных животных в

результате инъекции амилоидных фибрилл

без изменения

последовательности и

уровня продукции

соответствующего

белка в организме-

хозяине (прионные

свойства)

На фоне сверхпродукции и

(или) изменения

последовательности

соответствующего белка в

организме-хозяине

(амилоидные свойства)

PrP Прионные

заболевания

млекопитающих

+ +

альфа-

синуклеин

Болезнь

Паркинсона + +

Tau Различные

таутопатии +* +

AA Системный

амилоидоз АА - +

A Болезнь

Альцгеймера - +

Hungtingtin Болезнь

Хангтингтона - +

Sod1 Латеральный

склероз - +

* - В случае с исследованием прионных свойств белка tau, нейродегенерация,

связанная с агрегацией tau была вызвана инъекцией белкового лизата из мозга

человека, умершего от болезни Альцгеймера [Lasagna-Reeves, et al., 2012].

Для доказательства прионных свойств необходимо показать, что при

физиологических условиях, без сверхпродукции белка, инъекция его агрегатов

приводит к формированию самовоспроизводящихся агрегатов. Не претендуя на

абсолютную истину, мы будем рассматривать в качестве прионов только те

27

амилоиды млекопитающих, для которых чѐтко доказаны инфекционные свойства

и способность агрегатов к воспроизведению (см. Табл.1).

1.3. Функциональные и патологические амилоиды

1.3.1. Функциональные амилоиды

В качестве функциональных амилоидов наибольшую известность получили

белки спидроин и фиброин, являющиеся основными компонентами

соответственно паутины и шѐлка, из которого состоят домики куколок тутового

шелкопряда и некоторых других видов насекомых. До сих пор структура этих

природных амилоидов почти не охарактеризована. Процесс образования данных

амилоидных фибрилл происходит в секреторных железах за счѐт быстрого

снижения pH и обезвоживания секрета желѐз [Kenney et al., 2002]. Фиброин на

80% состоит из глицина, аланина и серина. Бета слои формируются

повторяющейся последовательностью (Gly-Ala-GIy-AIa-GIy-Ser)n [Ruan et al.,

2008]. В случае спидроина бета структуры формируют повторяющиеся

последовательности аланина, расположенные в центральной части белка

[Humenik et al., 2015].

Функциональные амилоиды обнаружены также у бактерий [по: Syed and

Boles, 2014]. Большинство из них является необходимым компонентом

экстраклеточной биоплѐнки, которая соединяет клетки бактерий при

определѐнных условиях внешней среды. Помимо этого, некоторые бактерии

секретируют амилоидные олигомеры, токсичные для клеток организма-хозяина,

клеток грибов, или для других бактерий. Примеры охарактеризованных

бактериальных амилоидов приведены в таблице 2 [по: Syed and Boles, 2014].

Микроцин E492 в амилоидной изоформе выполняет как минимум две функции.

Продукция этого белка и его секреция в виде амилоидных олигомеров отмечена

на стадии экспоненциального роста культуры Klebsiella pneumoniae. Олигомеры

токсичны для клеток организма – хозяина, а при понижении pH олигомеры

28

собираются в нетоксичные амилоидные фибриллы, которые необходимы для

формирования биоплѐнки. Этот процесс обратимый – при повышении pH

фибриллы вновь расщепляются на токсичные олигомеры [Biéler et al., 2005].

Таблица 2. Бактериальные амилоиды [по: Syed and Boles, 2014]

Бактерии Амилоидные

белки

Функции амилоидов

Escherichia coli Curli (CsgA) Компонент биоплѐнки, адгезия на

субстрате

Salmonella ssp. Curli/Tafi (CsgA) Компонент биоплѐнки, адгезия на

субстрате

Mycobacterium

tuberculosis

Mtp Формирование пилей, связывание с

ламинином

Klebsiella

pneumoniae

MccE492 Антимикробная активность

Pseudomonas

fluorescens

FapC Компонент биоплѐнки

Streptomyces

coelicolor

Chaplins (ChpA-H) Поверхностный белок бактериальных

спор

Staphylococcus

aureus

Phenol soluble

modulins

Компонент биоплѐнки

Bacillus

subtillus

TasA Компонент биоплѐнки, поверхностный

белок бактериальных спор

Xanthomonas

axonopodis

Harpins (HpaG) Цитотоксическая активность

Известны также функциональные амилоиды у дрожжей - фибриллы белка

Als3 Candida albicans играют роль в клеточной адгезии [Otoo et al., 2008], а белок

29

Bgl2 в амилоидной изоформе стабилизирует структуру клеточной стенки S.

cerevisiae [Kalebina et al., 2008]. Есть основания полагать, что клеточная стенка

дрожжей сахаромицетов включает в себя амилоидные фибриллы и других белков

[Chan and Lipke, 2014; O'Rourke et al., 2015].

Белок CPEB моллюска Apyisia californica и его ортолог Orb2 у Drosophila

melanogaster занимают особое место в ряду функциональных амилоидов. Белок

CPEB ответственен за транспорт мРНК в нейронах [Cao et al., 2005]. При

прохождении нервного импульса в ответ на выброс серотонина этот белок

образует амилоидные олигомеры в зонах нервных синапсов. Показано, что

олигомеры CPEB стабилизируют синапсы и способствуют их долговременному

сохранению [Si et al., 2010]. Такие же функции выполняют олигомеры Orb2 у

дрозофилы. Более того, было показано, что мутации, препятствующие

олигомеризации Orb2, блокируют долговременную память дрозофилы [Majumdar

et al., 2012]. Таким образом, амилоидные конформеры CPEB и Orb2 обеспечивают

долговременную память.

В свете тенденций последних лет эти белки очень быстро стали называть

прионами. Для этого у авторов были следующие основания:

1. Было показано, что добавление предсуществующих фибрилл CPEB и Orb2

ускоряет процесс амилоидогенеза мономеров этих белков in vitro. Чтобы не

повторяться, скажем только, что это типичное свойство всех амилоидов.

2. Однажды индуцированные агрегаты CPEB поддерживаются в нейронах

долгое время, причѐм уровень продукции этого белка остаѐтся неизменным.

3. Амилоидогенная последовательность белка CPEB в составе химерного

белка демонстрирует прионные свойства в дрожжах S. cerevisia. [Heinrich

and Lindquist, 2011].

С нашей точки зрения, рассматривая белки CPEB и Orb2, мы сталкиваемся с

совершенно особой ситуацией. С одной стороны речь не идѐт о межклеточной

передаче прионных конформеров, но с другой стороны, однажды индуцированная

30

амилоидная конформация поддерживается в неделящейся клетке долгое время.

Вряд ли это можно объяснить постоянным увеличением размера первоначально

возникших агрегатов. Можно допустить, что эти агрегаты расщепляются и

инициируют воспроизводящиеся акты конформационных переключений вновь

синтезируемого белка. В этом случае мы имеем аналогию с дрожжевыми

прионами, за тем исключением, что нейроны в отличие от клеток дрожжей не

делятся. Возможно, это уникальная ситуация – олигомеры постоянно

расщепляются, индуцируют конформационное переключение новых молекул

белка, и этот процесс многократно воспроизводится в неделящейся клетке. Пока,

для окончательного заключения о прионных свойствах этих белков, информации

явно недостаточно.

У человека в меланоцитах в результате процессинга от белка Pmel17

отщепляется фрагмент полипептидной цепи, который формирует амилоидные

фибриллы, связывающие меланин. Вероятно, амилоидный «скелет» Pmel17

служит для запасания и хранения пигмента [Fowler et al., 2006].

Есть основания полагать, что млекопитающие запасают многие гормоны

секреторных гранул в виде амилоидных агрегатов [Maji et al., 2009]. Было

показано, что 31 белок секреторных гранул из 42-х протестированных формируют

амилоидные агрегаты in vitro, правда, белки инкубировали 30 дней в условиях,

сильно отличающихся от физиологических. Кроме того, секреторные гранулы как

непосредственно в организме крысы, так и в иммортализованной клеточной

культуре, связывают амилоидспецифический краситель [Maji et al., 2009]. Можно

предположить, что гормоны, запасаемые в виде амилоидов, при определѐнных

условиях могут секретироваться в растворимом виде.

Возможно, известные нам функциональные амилоиды – это лишь вершина

айсберга. Разработанные ранее методы позволяли лишь направлено проверять, с

той или иной степенью достоверности, амилоидные характеристики выбранных

для анализа белков, но масштабный протеомный скрининг амилоидов оставался

невозможным.

31

1.3.2. Патологические амилоиды

К настоящему времени охарактеризовано около сорока белков, которые

могут формировать патологические амилоидные агрегаты в организме человека и

других млекопитающих [по: Нижников и др., 2015]. Целая группа патологических

амилоидов связана с нейродегенеративными заболеваниями, но известны и

амилоиды, вызывающие нарушения работы печени, почек, сердца, а также

других органов и тканей. Мы рассмотрим только несколько социально значимых

амилоидных патологий, для которых активно обсуждаются возможные прионные

характеристики. Патологии млекопитающих, связанные с формированием

агрегатов PrPSc

, а также белков tau и альфа-синукленина будут рассмотрены

отдельно в разделе «Прионы млекопитающих».

1.3.2.1. Системный амилоидоз АА

Системный амилоидоз АА связан с амилоидогенезом белка SAA (Serum

Amyloid A) и охарактеризован у разных видов млекопитающих, в том числе у

человека, гепарда, домашней кошки и домовой мыши. Это заболевание

развивается при ревматоидном артрите, различных опухолях, неспецифическом

язвенном колите, малярии и туберкулѐзе. У человека выявлено три гена,

кодирующих белки SAA - SAA1, SAA2 и SAA4. Белок SAA4 продуцируется

конститутивно, а уровень продукции белков SAA1 и SAA2 в печени может

повышаться в тысячу раз в ответ на бактериальную инфекцию [Westermark and

Westermark, 2009]. В случае хронической инфекции в сыворотке крови

представлены цитотоксичные амилоидные агрегаты, мажорным компонентом

которых является белок SAA1. Показано, что если модельных животных

инфицировать не только бактериями, но и инъецировать им в кровь фибриллы

SAA1, то амилоидогенез значительно ускоряется. Интересно, что фибриллы SAA1

гепарда могут ускорять амилоидогенез белка SAA1 мыши [Murakami et al., 2013].

Некоторые авторы считают это достаточным основанием для того, чтобы

32

утверждать, что амилоид SAA1 обладает инфекционными свойствами. С нашей

точки зрения, ускорение амилоидогенеза за счѐт чужеродных фибрилл на фоне

спровоцированного бактериями тысячекратного увеличения уровня продукции

собственного белка не является достаточным доказательством прионных свойств

фибрилл SAA1.

1.3.2.2. Латеральный склероз

Латеральный (боковой) амиотрофический склероз - это

нейродегенеративное заболевание, которое сопровождается поражением

двигательных нейронов и вызывает паралич и атрофию мышц. Цитотоксическим

эффектом обладают агрегаты белка супероксиддисмутазы (SOD1) [Elam et al.,

2003]. В норме SOD1 катализирует превращение высокотоксичных кислородных

радикалов в кислород и пероксид водорода. Механизм цитотоксичности,

связанный с агрегацией этого белка, пока не охарактеризован. В ряде случаев

амилоидные олигомеры или фибриллы образуются в результате мутаций в гене

SOD1, но зачастую болезнетворные агрегаты формирует и интактный белок SOD1

[Stathopulos et al., 2003; Chattopadhyay et al., 2008]. Показано, что олигомеры,

возникающие в результате мутаций, могут транспортироваться из клетки в клетку

и провоцировать агрегацию нормального белка [Furukawa et al., 2013]. Вместе с

тем, индукции самовоспроизводящихся агрегатов за счѐт инъекции амилоидных

конформеров SOD1 не отмечено.

1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) – наиболее распространенная форма старческого

маразма, для которой характерно прогрессирующее расстройство памяти и

высших корковых функций вплоть до полной утраты интеллекта. Одним из

факторов, приводящих к дисфункции нервных синапсов и к гибели нейронов при

33

БА, является патологическое накопление амилоидного пептида (A), который

образуется в результате разрезания трансмембранного белка APP (Amyloid

Precursor Protein). Белок APP расщепляют на несколько фрагментов три секретазы

- , и (рис. 5) [по: Selkoe, 2011].

Рисунок. 5. Схема процессинга белка APP [по: Selkoe, 2011].

В результате активности и секретаз образуются крупные растворимые

белки, играющие роль в пролиферации нервных клеток (рисунок 5). При

расщеплении APP за счѐт действия и секретаз образуется три продукта, и

одним из них является A. Охарактеризованы две основные формы пептида Aß,

состоящие из 40 и 42 аминокислот [Iwatsubo et al., 1994]. В норме реализуются все

возможные варианты протеолиза APP, но в результате мутаций, затрагивающих

ген APP, или гены, контролирующие активность секретеаз, может происходить

патологическое накопление пептида A, что ведѐт к его агрегации в

межклеточном пространстве. Наибольшей нейротоксичностью обладают

олигомеры пептида A, состоящего из 42-х аминокислот [Cohen et al., 2006].

Крупные межклеточные агрегаты, основным компонентом которых является

34

фибриллы A, утрачивают токсичность. Помимо формирования агрегатов A в

межклеточном пространстве, при БА в нейронах выявляются внутриклеточные

амилоидные филаменты гиперфосфорилированного белка tau [Grundke-Iqbal et al.,

1986]. Накопление агрегатов tau отмечается также и при других

нейродегенеративных заболеваниях (так называемых таутопатиях). Есть

основания полагать, что в случае БА гипер-фосфорилирование и агрегация tau

является следствием патологического каскада, который провоцируют олигомеры

A [Roberson et al., 2007].

Известны как наследственные формы БА, которые ассоциированы с

мутациями и могут поражать людей среднего возраста, так и спонтанные,

проявляющиеся, как правило, после 70 лет [по: Selkoe, 2011]. Остаѐтся неясным, с

чем связано накопление Aß в стареющем мозге. Некоторые данные

свидетельствуют о том, что агрегация A может быть не первопричиной

заболевания, а лишь одним из его проявлений. В частности, у большинства линий

трансгенных мышей, сверхпродуцирующих человеческий APP, отмечено

накопление в головном мозге межклеточных амилоидных агрегатов, однако у них

практически отсутствуют такие характеристики БА как агрегация tau, дисфункция

синапсов и гибель нейронов [Irizarry et al., 1997]. Кроме того, в экспериментах с

трансгенными животными показано, что нейродегенерация может быть связана не

только с агрегацией пептида A, но и с изменением уровня продукции

полноразмерного белка APP [Sarantseva et al., 2009].

Инфекционные свойства амилоидных конформеров A исследуют на

трансгенных мышах или крысах, сверхпродуцирующих A и предрасположенных

к амилоидогенезу этого пептида. Инъекция фибрилл, полученных in vitro, или

гомогената из мозга больных животных, приводит к ускорению амилоидогенеза

[Meyer-Luehmann et al., 2006]. Наибольший интерес представляет эксперимент с

трансгенными линиями крыс, у которых сверхподуция A не приводит к

формированию амилоидных агрегатов, детектируемых с помощью

гистологических методов. Инъекция белкового гомогената из мозга человека,

35

поражѐнного БА, провоцировала формирование агрегатов A в мозге этих крыс

[Morales et al., 2012]. Это серьезный аргумент в пользу гипотезы, постулирующей

прионные свойства A, однако авторы работы не показали, что в мозге

исследуемых трансгенных крыс нет предсуществующих олигомеров пептида A.

Этиология БА по-прежнему остаѐтся загадкой. Очевидно, что в случае

наследственных форм заболевания, вызванных мутациями, повышающими

уровень экспрессии APP или секреции A, первопричиной БА является агрегация

пептида A. В случае спонтанных форм заболевания, возникающих у людей

преклонного возраста, причинно-следственные связи нейродегенерации пока не

ясны. На наш взгляд, агрегация A в ряде случаев может быть следствием

нарушения регуляции физиологических процессов, опосредованной, в частности,

изменением уровня гормонов. В рамках нашей гипотезы рассмотрим два на

первый взгляд далѐких от БА примера. Гормональный сигнал провоцирует ход

тихоокеанского лосося на нерест и сопутствующую этому перестройку и

дегенерацию различных тканей. Дегенерация мозга сопровождается увеличением

экспрессии APP и образованием нейротоксичных агрегатов пептида A у лосося

[Maldonado et al., 2000; 2002a; 2002b]. Очевидно, что в этом случае агрегация A

является не первопричиной, а лишь одной из ступеней каскада событий, которые

запущены в результате изменения гормональной регуляции. Другим примером,

иллюстрирующим возможную гормональную регуляцию амилоидогенеза A,

является преэклампсия – патология беременности, являющаяся основной

причиной выкидышей и смерти беременных женщин. Совсем недавно стало

известно, что в моче беременных женщин, страдающих этой патологией,

выявляются амилоидные депозиты, включающие пептид A [Buhimschi et al.,

2014]. Вполне вероятно, что первопричиной патологии и амилоидогенеза A

является изменение уровня гормонов в организме беременных женщин. В ряде

работ показано, что снижение уровня инсулина (диабет первого типа) и

нарушение чувствительности тканей к действию инсулина (диабет второго типа)

резко стимулируют агрегацию A [Ohno et al., 2006; 2007; Oakley et al., 2006; Devi

36

et al., 2012]. Важно отметить, что у беременных женщин, страдающих

преэклампсией, снижается чувствительность тканей к инсулину. Известно, что

уровень инсулина и чувствительность к нему меняются также в процессе

старения. Таким образом, изменения метаболизма инсулина следует

рассматривать как один из важнейших факторов, провоцирующих

цитотоксическую агрегацию A в случае БА и преэклампсии. С этой точки зрения

интересно оценить возможную взаимосвязь возрастных изменений уровня

гормонов с развитием других амилоидозов.

1.3.2.4. Болезнь Хангтингтона

Болезнь Хангтингтона, которая также имеет название "Пляска святого

Витта" является наследственным нейродегенеративным заболеванием, которое

встречается у европейцев с частотой около 1х10-4

[Costa and Scorrano, 2012].

Причиной заболевания является экспансия тринуклеотидных повторов ЦАГ, в

гене хантгтингтин (HTT). В норме количество повторяющихся триплетов ЦАГ,

кодирующих глутамин, в этом гене у разных людей варьирует, но не превышает

34 аминокислотных остатка глутамина [по: Lee et al., 2013]. В случае увеличения

числа повторов, полиглутаминовые последовательности отщепляются от белка и

формируют нейротоксические амилоидные агрегаты, которые накапливаются как

в ядре, так и в цитоплазме моторных нейронов базальных ганглиев и других

отделов головного мозга [Schilling et al., 1999]. Чем длиннее полиглутаминовые

тракты, тем раньше проявляются первые симптомы заболевания. Сначала болезнь

проявляется в нарушении моторики, судорожных непроизвольных движениях, в

дальнейшем развивается танцующая (хореическая) походка и в конечном итоге

болезнь приводит к летальным последствиям, что связано с атрофией стриатума и

коры головного мозга [Vonsattel and DiFiglia, 1998].

Последовательности, содержащие аномально большое количество остатков

глутамина (например, 103 аминокислотных остатка - «Q103»), формируют

37

агрегаты, в которые включается и нормальный белок Htt [по: Lee et al., 2013],

однако об инфекционности речь не идѐт. Инъекция агрегатов полиглутаминовых

последовательностей не вызывает развития патологии у модельных животных

«дикого типа». Формирование цитотоксичных агрегатов «Q103» показано и при

продукции этого белка в дрожжах S. cerevisiae [Meriin et al., 2002; Duennwald et

al., 2006; Kochneva-Pervukhova et al., 2012].

1.4. Прионы

1.4.1. Прионы млекопитающих

1.4.1.1. Прионный белок PrP

Амилоидные агрегаты белка, получившего название Prion Protein (PrP) были

идентифицированы Стенли Прусинером с коллегами в качестве инфекционного

агента, вызывающего болезнь «Скрепи» у овец. В отличие от нормальной

клеточной изоформы, обозначенной PrPC (от «cellular»), изоформа PrP

Sc (от

“Scrapie”) имеет повышенное содержание бета структур и характеризуется

удивительной устойчивостью к обработке протеиназой К и ионными

детергентами [Prusiner, 1989]. С. Прусинер постулировал, что инфекционным

агентом является исключительно высокомолекулярные агрегаты белка PrP в

аномальной конформации и эта конформация может поддерживаться

автокаталитически. Прионная конверсия этого белка является причиной

нейродегенерации в случае болезни Кройцфельда-Якоба, синдрома Герстмана -

Штраусслера - Шейнкера, фатальной семейной бессонницы у людей и

аналогичных заболеваний млекопитающих – скрепи овец, коз, мышей, хомяков,

норок и т.д. [по: Prusiner and Scot, 1997]. Аномальная изоформа PrPSc

является

также инфекционным агентом при болезни «Куру», распространенной среди

аборигенов Папуа-Новой Гвинеи и связанной с ритуальным каннибализмом

[Gajdusek, 1991; Cohen et al., 2006]. К этой же группе заболеваний относится

“коровье бешенство”, или губчатая энцефалопатия коров (BSE от Bovine

38

Spongiform Encephalopathy) [по: Prusiner, 2001]. Известны спонтанные

(спорадические), инфекционные и наследственные формы прионных болезней. В

случае «наследственных» форм речь идѐт о том, что определѐнные мутации

вызывают предрасположенность к развитию прионной патологии обычно в

зрелом возрасте. Отмечены случаи межвидовой передачи - белковый гомогенат,

выделенный из мозга животных одного вида, может вызывать инфекцию у

животных другого вида, причѐм инфекция передаѐтся как в случае инъекции в

мозг или кровь подопытных животных, так и при оральной передаче [Gajdusek et

al., 1966; Gibbs et al., 1968; Nathanson et al., 1997]. В частности установлено, что

инфекция передаѐтся от овец коровам, от коровы человеку, но не может

передаваться от овцы или от мыши человеку. Таким образом, существуют

межвидовые барьеры прионных инфекций, связанные с различиями в

аминокислотной последовательности белка PrP у различных видов позвоночных

[по: Prusiner, 2001].

Важно отметить, что конформация PrPSc

характерна лишь для белка,

представленного в агрегатах. Эта конформация поддерживается за счѐт

формирования межмолекулярных бета слоѐв, которые стабилизированы

водородными связями между аминокислотными остатками взаимодействующих

мономеров. У мыши, протеазоустойчивый фрагмент, формирующий бета слои,

соответствует С-терминальной последовательности с 90-й по 231-ю аминокислоту

[Ma and Lindquist, 1999]. Спектральный анализ показал, что PrPC содержит 42% α-

спиралей и 3% β-структур, тогда как PrPSc

содержит 30% α-спиралей и 43% β-

структур [Pan et al, 1993].

Эксперименты на мышах подтвердили, что частицы PrPSc

устойчивы к

кипячению и к некоторым режимам автоклавирования, при попадании в

кишечник их не расщепляют ферменты желудочно-кишечного тракта [по:

Nicotera, 2001]. Агрегаты PrPSc

попадают через кровь в лимфатические органы и

накапливаются в фолликулярных дендритных клетках. Именно в этих клетках

чужеродный агрегат PrPSc

конвертирует собственный белок PrPC в аномальную

39

изоформу PrPSc

. На следующем этапе олигомеры PrPSc

организма-хозяина из

фолликулярных дендритных клеток транспортируются в клетки периферической,

а затем и центральной нервной системы [Heikenwalder et al., 2007]. У мышей с

делецией гена, кодирующего белок PrP, инфекционная передача прионных

заболеваний не происходит. Это закономерно, поскольку частицы PrPSc

, попавшие

в организм извне, вызывают заболевание лишь в том случае, когда они запускают

цикл прионной конверсии белка PrP организма-хозяина. В отличие от

большинства других амилоидозов, для передачи прионных заболеваний нет

необходимости искусственно повышать уровень продукции PrP в организме

реципиента. Окончательные доказательства постулата, согласно которому

инфекционным агентом является исключительно самовоспроизводящаяся

аномальная форма белкаPrPSc

, были получены относительно недавно – в 2010-м

году в лаборатории И. Баскакова. Полученные in vitro фибриллы полноразмерного

белка PrP интрацеребрально инокулировали сирийским хомячкам, что приводило

к развитию инфекционной губчатой энцефалопатии [Makarava et al., 2010].

Множество работ посвящено исследованию функций белка PrP. Мыши с

делецией гена Prnp, как правило, не претерпевают видимых физиологических

изменений [Bueler et al., 1992], за исключением линии с нарушением режима «сон

- бодрствование», что указывает на возможную роль белка PrPC в регуляции

циркадных ритмов [Tobler et al., 1996]. PrP выявлен в разнообразных тканях и

органах: поджелудочной железе, почках, сердце, мышцах, вторичных

лимфоидных органах, а также, в центральной и периферической нервной системе,

что может указывать на многообразие его функций [по: Aguzzi et al., 2008]. Так,

PrP участвует в регуляции Т-клеточного иммунного ответа, выполняет функции

нейропротектора, связан с регуляцией апоптоза, участвует в сигнальной

трансдукции и синаптической передаче, связывает ионы меди и других

двухвалентных металлов и является антиоксидантом, взаимодействует с

молекулами клеточной адгезии [по: Heikenwalder et al., 2007; по: Vana et al., 2007;

по: Aguzzi et al., 2008]. В ряде работ показано, что PrP участвует в формировании

40

миелиновых оболочек нервных волокон [Radovanovic et al., 2005; Bremer et al.,

2010].

В 2009-м году были опубликованы данные, согласно которым PrPC,

заякоренный на мембране нейронов, является рецептором для олигомеров

пептида Aβ, вызывающих болезнь Альцгеймера [Lauren et al., 2009]. Более того,

оказалось, что PrPC универсальный рецептор для самых разнообразных

патологических амилоидных олигомеров [Resenberger et al., 2011]. Подробнее

взаимодействие PrP и пептида Aβ будет рассмотрено в разделе 1.5.

«Взаимодействия прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на регуляцию

протеомных сетей». Функциональная значимость такого рода взаимодействий

пока остаѐтся непонятной. Возможно, связывание различных патологических

амилоидов с PrPC, а также c никотиновым и глютаматным рецепторами, приводит

к запуску апоптоза.

Экспериментально доказано существование различных конформационных

вариантов PrPSc

, которые могут отличаться друг от друга инфекционностью,

повреждать разные участки мозга, влиять на длительность инкубационного

периода и клинические проявления болезни [по: Prusiner, 2001]. В экспериментах

на модельных животных [по: Morales et al., 2007], а также in vitro [Castilla et al.,

2005], показано, что при передаче от организма к организму прион не меняет

своих свойств. Это означает, что если заражать лабораторных животных разными

вариантами PrPSc

, то при развитии болезни у них будет обнаружен именно тот

вариант приона, которым их заразили [Telling et al., 1996].

1.4.1.2. Альфа -синуклеин

Болезнь Паркинсона – нейродегенеративное заболевание, связанное с

гибелью нейронов, вырабатывающих дофамин в субстанции «нигра» (чѐрное

тело), а также в других отделах ЦНС. Недостаток дофамина провоцирует

активацию коры головного мозга [по: Goedert et al., 2012]. Основные симптомы

41

данного заболевания – тремор, мышечная ригидность, замедленность движений и

неспособность удерживать равновесие при изменении позы. Первые симптомы

проявляются только когда в «чѐрной субстанции» остаѐтся не более 30 – 40%

нейронов [по: Goedert et al., 2012]. Характерная особенность болезни Паркинсона

– наличие в нейронах «чѐрного тела» и других зон головного мозга

патологических включений – телец Леви, основным компонентов которых

являются агрегаты белка альфа-синуклеина [Polymeropoulos et al., 1997;

Poulopoulos et al., 2012]. Мутации, способствующие олигомеризации альфа-

синуклеина, вызывают предрасположенность к болезни Паркинсона [по: Goedert

et al., 2012]. Высокую нейротоксичность демонстрируют не крупные агрегаты, а

олигомеры этого белка. Есть основания полагать, что формирование телец Леви –

это защитная реакция нейрона, который капсулирует токсичные агрегаты альфа-

синуклеина. В экспериментах с иммортализованной культурой клеток,

сверхпродуцирующих альфа-синуклеин, показана передача олигомеров этого

белка из клетки в клетку [Emanuele et al., 2015]. Амилоидные фибриллы альфа-

синуклеина, полученные in vitro, и гомогенат мозга модельных животных,

содержащих соответствующие агрегаты, при инъекции в мозг мышам дикого

типа, индуцируют амилоидогенез и нейродегенерацию [Luk et al., 2012; Masuda-

Suzukake et al., 2013]. В отличие от частиц PrPSc

, прионные фибриллы белка -

synuclein, вероятно, не передаются естественным путѐм и не могут вызывать

эпидемии. Вместе с тем, сам факт инфекционной передачи в результате инъекции

и размножения агрегатов этого белка не вызывает сомнения.

1.4.1.2. Белок tau

Белок tau играет важную роль в стабилизации структуры микротрубочек в

нейронах [Weingarten et al., 1975]. В результате процессинга образуется шесть

изоформ этого белка. Внутриклеточные амилоидные агрегаты

гиперфосфорилированного tau являются маркѐром целого ряда

нейродегенеративных заболеваний [по: Iqbal et al., 2009]. В случае некоторых

42

заболеваний, таких как болезнь Альцреймера и синдром Дауна, помимо tau

выявляются амилоидные агрегаты и других белков. В экспериментах с

культурами клеток было установлено, что агрегаты tau могут транспортироваться

из клетки в клетку [Medina et al., 2014]. Более того, относительно недавно были

получены свидетельства инфекционных свойств олигомеров tau. Олигомеры этого

белка, выделенные из мозга человека, умершего от болезни Альцгеймера,

инъецировали в мозг мышам дикого типа, что индуцировало возникновение

агрегатов tau в различных областях мозга мыши и вызывало нарушение памяти

[Lasagna-Reeves et al., 2012]. Эти результаты позволяют полагать, что олигомеры

tau обладают инфекционностью, т.е. демонстрируют прионные свойства.

Передача инфекции от одного организма другому естественным путѐм для

олигомеров tau, как и для прионных агрегатов альфа-синуклеина, пока не

показана.

1.4.2. Прионы низших эукариот

Существенный прогресс в понимании феномена прионизации был

достигнут благодаря открытию прионов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В

1994 году Рид Викнер выдвинул гипотезу, согласно которой два

цитоплазматически наследуемых нехромосомных детерминанта [PSI+] и [URE3]

являются дрожжевыми прионами [Wickner, 1994]. Неменделевски наследуемые

детерминанты [PSI+] и [URE3] были выявлены и генетически охарактеризованы

более 40 лет назад [Cox, 1965; Lacroute, 1971], однако их физическая природа

долгое время оставалась загадкой. Происхождение обоих упомянутых

детерминантов было успешно объяснено в рамках прионной модели, согласно

которой [PSI+] и [URE3] представляют собой прионные изоформы белков Sup35 и

Ure2 [Wickner, 1994]. Sup35 выполняет функцию фактора терминации трансляции

[Zhouravleva et al., 1995; Stansfield et al., 1995], Ure2 является негативным

регулятором азотного метаболизма [Lacroute, 1971]. К настоящему времени у

дрожжей выявлено девять прионных факторов, у которых идентифицированы

белки-детерминанты. Помимо [PSI+] и [URE3], в их число входят [PIN

+] [Derkatch

43

et al., 1997, 2001], [ISP+] [Rogoza et al., 2010], [SWI

+] [Du et al., 2008], [MOT3

+]

[Alberti et al., 2009], [OCT+] [Patel et al., 2009], [MOD

+] [Suzuki et al., 2012], [Het-S]

[Coustou et al., 1997] и [β] [Roberts and Wickner, 2003] (см. табл. 3).

Таблица 3. Прионы грибов

[Прион] (белок и его

функции)

Структурный

ген

Вид Ссылки

[PSI+]; (Sup35, фактор

терминации трансляции)

SUP35* S. cerevisiae Cox, 1965;

Wickner, 1994

[URE3]; (Ure2, усвоение

уреидосукцината)

URE2 S. cerevisiae Wickner, 1994

[PIN+]; (Rnq1, инициация

[PSI])

RNQ1 S. cerevisiae Derkatch et al.,

2001

[Het-s]; (HET-s, фактор

несовместимости)

HET-s Podospora

anserina

Coustou et al.,

1997

[ISP+];

(Isp1, транскрипционный

регулятор)

SFP1 S. cerevisiae Rogoza et al.,

2010

[SWI+]; (Swi1, регуляция

структуры хроматина)

SWI1 S. cerevisiae Du et al., 2008

[OCT+]; (Cyc8,

транскрипционный

регулятор)

CYC8 S. cerevisiae Patel et al., 2009

[MOT3]; (Mot3,

транскрипционный

регулятор)

MOT3 S. cerevisiae Alberti et al.,

2009

[MOD+]; (Mod5,

транскрипционный

регулятор)

MOD5

S. cerevisiae Suzuki et al.,

2012

[β] (протеаза B) YEL060C S. cerevisiae Roberts and

Wickner, 2003

Есть основания полагать, что все эти белки, за исключением Het-s, Sfp1 и

протеазы B (детерминант приона [β]), в прионной форме образуют амилоидные

44

агрегаты. Показано также, что Q/N обогащѐнные последовательности белка New1

и ещѐ 18 дрожжевых белков также демонстрируют прионные свойства

[Osherovich and Weissman 2001; Alberti et al., 2009]. Вместе с тем, это отнюдь не

означает, что полноразмерные белки, содержащие эти последовательности,

способны прионизоваться. Совсем недавно была опубликована статья, авторы

которой утверждают, что белки Tia1 и Pub1 также способны прионизоваться [Li et

al., 2014]. Мы позволим себе не согласиться с этим утверждением, поскольку оно

основано лишь на данных об агрегации белков Tia1 и Pub1 при сверхпродукции.

Авторы не показали ни наличие альтернативной изоформы при нормальном

уровне продукции этих белков, ни инфекционности, ни наследования прионных

свойств.

1.4.2.1. Фактор [URE3]

Фактор [URE3] представляет собой прионную форму белка Ure2 - продукта

гена URE2 [Wickner, 1994; Wickner et al., 2004]. Белок Ure2 участвует в регуляции

катаболизма азота и функционирует в клетке в виде димера. При росте клеток на

средах с богатыми источниками азота белок Ure2 блокирует активность белка

Gln3 - позитивного регулятора транскрипции гена DAL5, продукт которого

обеспечивает транспорт уреидосукцината в клетку [Mitchell and Magasanik, 1984].

Мутации в гене URE2, как и наличие фактора [URE3], приводят к дерепрессии

Dal5, в результате чего клетки приобретают способность использовать

уреидосукцинат в качестве источника азота и предшественника урацила [Drillien

et al., 1973]. Таким образом, штаммы, ауксотрофные по урацилу и содержащие

фактор [URE3], приобретают способность расти на среде без урацила.

Показано, что пассирование дрожжей на среде с 5мМ GuHCl приводит к

потере приона [URE3]. Элиминация приона обратима – частота спонтанного

возникновения de novo составляет примерно 10-6

. Временная сверхпродукция

белка Ure2 увеличивает частоту возникновения [URE3] примерно в 100 раз.

45

Фенотип [URE3] сходен с фенотипическим проявлением мутаций в гене URE2, а

для воспроизведения приона [URE3] необходимо наличие интактного гена URE2

[по: Wickner, 1994; Wickner et al., 2004].

Белок Ure2 дрожжей состоит из 354 аминокислотных остатков и его можно

разделить на N- и С-терминальные домены [Fernandez-Bellot et al., 1999]. C-

терминальный домен репрессирует транскрипцию гена DAL5, тогда как N-

терминальная часть Ure2 (аминокислоты 1-65) необходима и достаточна для

индукции и поддержания приона [URE3] [Masison and Wickner, 1995]. N-

терминальный домен Ure2 обладает способностью образовывать агрегаты,

имеющие -складчатую структуру [Taylor et al., 1999]. Следует отметить, что N-

домен Ure2 обогащен аспарагиновыми остатками (их содержание составляет

около 40%). Аспарагин-богатая область продолжается вплоть до 80-го

аминокислотного остатка. Последовательность, ответственная за прионизацию

Ure2, консервативна, аминокислоты с 10 по 39 идентичны у дрожжей S.cerevisiae,

Ashbya gossypii, Candida kefyr, Candida glabrata, Candida lactis [Edskes and

Wickner et al., 2002].

Химерный белок Ure2-GFP образует агрегаты в штаммах [URE3], но этого

белка приводит к потере приона. Это, возможно, связано с тем, что

присоединение химерного белка, включающего последовательность GFP, к

протофибриллам Ure2 препятствует дальнейшей полимеризации. В клетках

[URE3] что белок Ure2 образует глобулярные структуры из филаментозных

полимеров [Speransky et al., 2001], причем эти структуры устойчивы к кипячению

и для их разрушения необходима дополнительная обработка мочевиной. Белок

Ure2 также может образовывать амилоидные структуры in vitro, сходные с

фибриллами прионных белков млекопитающих [Taylor et al., 1999; Thual et al.,

1999].

Стабильность фактора [URE3] зависит от наличия в клетке белков-

шаперонов Hsp104 и Ydj1 (Hsp40). При этом сверхэкспрессия гена HSP104 не

изгоняет прион, тогда как сверхэкспрессия YDJ1 приводит к его элиминации.

46

Штаммы с делецией гена HSP104 не могут поддерживать [URE3] [Moriyama et al.,

2000]. На поддержание [URE3] влияют также мутации в гене SSA2, кодирующем

шаперон семейства Hsp70. Показано, что белки Ure2 из дрожжей S. paradoxus и S.

uvarum также способны прионизоваться в дрожжах S. cerevisiae, при этом

возможна передача прионной конформации между белками из дрожжей разных

видов [Baudin-Baillieu et al., 2003; Crapeau et al., 2009].

1.4.2.2. Фактор [PSI+]

[PSI+] является доминантным омнипотентным нонсенс-супрессором или

аллосупрессором, то есть его появление в клетке дрожжей способствует

считыванию всех трех кодонов-нонсенсов как значащих [Cox, 1965; Liebman and

Sherman, 1979]. Гипотеза о прионной природе фактора [PSI+] была высказана Р.

Викнером [Wickner, 1994]. Фактор [PSI+] представляет собой прионную форму

фактора терминации трансляции eRF3 - продукта гена SUP35 [Zhuravleva et al.,

1995]. В прионной форме белок Sup35 частично инактивирован и не может

эффективно функционировать в качестве вспомогательного фактора терминации

трансляции eRF3. В этом случае в клетках штамма, маркированного нонсенс-

мутацией (например ade1-14), рибосома с определѐнной частотой прочитывает

преждевременный стоп-кодон UGA как значащий, в результате чего образуется

полноразмерный белок Ade1 и клетки приобретают способность расти на среде

без аденина. Таким образом, прионизация Sup35 вызывает наследуемое

изменение признака и может детектироваться на фенотипическом уровне (см. рис.

6).

В рамке считывания, соответствующей белку Sup35 (685 а. к.), принято

выделять три домена, начинающихся с остатка метионина: N (1-123 а. к.), M (124-

253 а. к.), C (254-685 а. к.) [Kushnirov et al., 1988]. С-домен необходим для

поддержания жизнеспособности клетки и выполняет функцию фактора eRF3 в

терминации трансляции, он консервативен у всех эукариот и имеет высокую

47

степень сходства с фактором элонгации трансляции EF-1А эукариот и EF-Tu

прокариот. N- и M-домены несущественны для жизнеспособности клеток [Ter-

Avanesyan et al., 1993]. N-домен необходим для прионизации белка, он содержит

участки, обогащѐнные Q/N и олигопептидные повторы из 9 аминокислотных

остатков PQGGYQQYN [Кushnirov et al., 1988;Ter-Avanesyan et al., 1994].

Рисунок 6. Фенотипическое проявление прионизации белка Sup35.

Пояснения: Мономеры белка Sup35 в нормальной клеточной конформации

изображены в виде красных кружков. Мономеры Sup35 в прионной изоформе

изображены в виде красных квадратов. Жѐлтой четырѐхконечной звѐздочкой

обозначен преждевременный кодон UGA в гене ADE1 и в соответствующей

последовательности РНК.

Аспарагин-глутамин богатый участок необходим для индукции и передачи

в ряду поколений прионных свойств Sup35. Делеционный анализ Sup35 показал,

что минимальный фрагмент, достаточный для индукции [PSI+], включает

аспарагин-глутамин богатый участок и первые два олигопептидных повтора. Для

[PSI+]

ade1-14

YPD YPD -Ade -Ade

ade1-14

мономеры Sup35

SUP35

[psi-] SUP35

агрегаты Sup35

48

поддержания [PSI+] необходимо наличие всех пяти олигопептидных повторов

[Osherovich et al., 2004]. Одно из характерных свойств приона [PSI+] –

зависимость от уровня экспрессии гена HSP104 [Chernoff et al., 1995]. Передача

[PSI+] дочерним клеткам требует оптимального уровня продукции шаперона

Hsp104, необходимого для разрезания агрегатов Sup35 и образования т.н.

«прионных зерен» – небольших агрегатов, за счет которых происходит передача

приона в дочернюю клетку при клеточном делении.

Агрегаты белка Sup35, как выделенные из клеток штамма [PSI+], так и

полученные in vitro, при введении их в клетки дрожжей с помощью метода

белковой трансформации индуцируют прионизацию клеточного белка Sup35

[King and Diaz-Avalos, 2004]. Эти же эксперименты показали, что наличие

вариантов прионов у дрожжей связано исключительно со структурными

особенностями прионных агрегатов Sup35, и не зависит от других белков.

1.4.2.3. Фактор [PIN+]

В экспериментах И. Л. Деркач с соавторами было показано, что индукция

фактора [PSI+] при сверхэкспрессии полноразмерного гена SUP35 зависит от

наличия другого прионоподобного элемента - [PIN+] ([PSI

+] inducibility) [Derkatch

et al., 1997]. Фактор [PIN+], также как и фактор [PSI

+], передаѐтся с цитоплазмой,

изгоняется под воздействием GuHCl и способен возникать в клетках [pin-] de novo.

В отличие от фактора [PSI+], к элиминации фактора [PIN

+] приводит только

делеция гена HSP104, но не его сверхэкспрессия.

Данные о молекулярной природе фактора [PIN+] были получены в

результате работ двух исследовательских групп. В 2000-м году было показано,

что белок Rnq1 присутствует в некоторых дрожжевых штаммах в мономерном

состоянии, а в других штаммах образует агрегаты [Sondheimer and Lindquist,

2000]. В работе других исследователей было доказано, что именно прионная

форма белка Rnq1 выполняет функцию фактора [PIN+], т.е. прионизация этого

49

белка способствует прионной конверсии Sup35 в случае его сверхпродукции

[Derkatch et al., 2001].

В белке Rnq1 выделяют два домена: N-терминальный (1-152 а.к.) и С-

терминальный (153-405 а.к.), богатый Asn/Gln и способный к переходу в

прионную конформацию [Sondheimer and Lindquist, 2000]. Какие-либо функции

этого белка, не связанные с участием в прионизации eRF3, неизвестны, однако

диплоиды, гомозиготные по делеции гена RNQ1, образуют восьмиспоровые аски с

частотой 1-4% [Orlowska-Matuszewska and Wawrzycka, 2006]. Прионная природа

фактора [PIN+] была подтверждена в экспериментах по трансформации клеток

дрожжей [pin-] агрегатами белка Rnq1, полученными in vitro, и экстрактами

клеток, несущих фактор [PIN+]. В обоих случаях экзогенные агрегаты белка Rnq1

индуцировали прионизацию [Patel and Liebman, 2007].

1.4.2.4. Фактор [SWI+]

Фактор [SWI+] представляет собой прионную форма белка Swi1, входящего

в эволюционно консервативный АТФ-зависимый хроматин-ремодулирующий

комплекс SWI/SNF, участвующий в транскрипционной регуляции примерно 6%

генов дрожжей S. cerevisiae. Интересно отметить, что по приблизительным

оценкам в дрожжевой клетке представлено всего порядка 80 молекул белка Swi1,

но тем не менее прионные агрегаты [SWI+] (по всей вероятности олигомеры)

стабильно передаются в ряду клеточных поколений. Фактор [SWI+] доминантен и

способен передаваться цитоплазматически [Du et al., 2008]. Прионная

инактивация Swi1 вызывает задержку роста штаммов на средах с

неферментируемыми источниками углерода, такими как раффиноза и галактоза, а

также приводит к нарушению споруляции [Du et al., 2008]. Сверхпродукция Swi1

не способствует заметному повышению частоты индукции фактора [SWI+], однако

возникновение приона отмечается в результате трансформации штаммов [swi-]

амилоидными фибриллами N-терминального фрагмента белка Swi1 [Du et al.,

50

2010]. Было показано, что для поддержания приона [SWI+] необходима и

достаточна продукция аспарагин-обогащѐнного фрагмента Swi1, содержащего

всего 37 N-терминальных аминокислот этого белка [Crow et al., 2011].

Клетки дрожжей утрачивают фактор [SWI+] при инкубации на среде с

GuHCl, или в результате делеции гена HSP104. Кроме того, данный прион с

высокой частотой теряется при тепловом шоке и в результате изменения уровня

продукции шаперонов семейства Hsp70 [Hines et al., 2011]. Сверхэкспрессия гена

HSP104 не влияет на стабильность фактора [SWI+].

1.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3

+], [OCT

+] и [MOD

+]

Целенаправленный поиск прионов и исследование факторов,

предположительно имеющих прионную природу, привели к открытию в начале

XXI века ряда новых белков дрожжей S. cerevisiae, способных к прионному

превращению. Фактор [ISP+] снижает эффективность нонсенс-супрессии у

мутантов по гену SUP35. Этот фактор проявляет нехромосомный характер

наследования, обратимо изгоняется при инкубации на среде с GuHCl и

демонстрирует доминантное наследование при скрещивании штаммов [ISP+] со

штаммами [isp-]. Отсутствие шаперона Hsp104, так же как и его сверхпродукция,

не влияет на проявление и поддержание [ISP+] [Рогоза и др., 2009]. Структурный

ген фактора [ISP+] - SFP1 кодирует транскрипционный фактор, регулирующий

экспрессию рибосомных генов [Marion et al., 2004; Xu and Norris, 1998; Cipollina

et al., 2005]. Сверхэкспрессия гена SFP1 индуцирует появление [ISP+], делеция

гена SFP1 приводит к потере этого фактора [Рогоза и др., 2009; Rogoza et al.,

2010].

Фактор [MOT3+] обнаружен в результате направленного скрининга прионов

среди дрожжевых белков, содержащих Q/N-обогащѐнные последовательности

[Alberti et al., 2009]. Белок Mot3p - это транскрипционный регулятор,

участвующий в контроле метаболизма углерода и стресс-ответа [Grishin et al.,

51

1998]. В аэробных условиях он подавляет экспрессию генов, отвечающих за рост

в анаэробных условиях. Прионный домен белка Mot3, слитый с желтым

флуоресцирующим белком EYFP, образует видимые агрегаты в штаммах

[MOT3+]. Прионный домен белка Mot3 образует in vitro амилоидные агрегаты,

устойчивые к 2% SDS. Фактор [MOT3+] наследуется доминантно, изгоняется при

инкубации на среде с GuHCl, его стабильность зависит от шаперона Hsp104

[Alberti et al., 2009].

Фактор [OСT+] – прионная форма белка Cyc8, входящего в состав

транскрипционного регуляторного комплекса Cyc8-Tup1, контролирующего

экспрессию более 7% генов дрожжей S. cerevisiae. Cyc8 был выявлен в скрининге

белков, сверхпродукция которых повышает частоту возникновения фактора [PSI+]

de novo. Сверхпродукция прионного С-терминального домена белка Cyc8

приводит к появлению фактора [OСT+]. Фактор [OСT

+] наследуется доминантно,

передается при цитодукции, изгоняется при инкубации на среде с GuHCl и в

результате инактивации белка Hsp104. Сверхэкспрессия гена HSP104 не влияет на

стабильность фактора [OСT+]. В клетках [OСT

+] химерный белок Cyc8-YFP

образует агрегаты как в цитоплазме, так и в ядре [Patel et al., 2009].

Фактор [MOD+] представляет собой прионную форму белка Mod5 [Suzuki et

al., 2012]. Mod5 в отличие от всех прочих дрожжевых белков, формирующих

амилоидные агрегаты, не содержит Q/N-обогащѐнных последовательностей.

Сверхпродукция Mod5, а также трансформация дрожжей амилоидными

фибриллами этого белка, вызывает индукцию фактора [MOD+] [Suzuki et al.,

2012]. Делеция Hsp104 или пассирование штамма [MOD+] на среде с GuHCl

вызывают элиминацию прионного детерминанта. Интересно отметить, что в

результате прионизации Mod5 в дрожжевой клетке повышается уровень

эргостерола, что способствует большей устойчивости культуры к антигрибковым

агентам, таким как флюконазол и кетоконазол [Suzuki et al., 2012].

52

1.4.2.6. Факторы [] и [GAR+]

Определение Стенли Прусинера, согласно которому прионы представляют

собой инфекционные белковые частицы [Prusiner, 1989], не постулирует, что

белок обязательно должен изменять конформацию. В соответствии с этим,

формирование самовоспроизводящихся (расщепляющихся) амилоидных

агрегатов нельзя рассматривать как единственно возможный механизм

прионогенеза. Робертс и Викнер описали альтернативный механизм

самовоспроизводящихся изменений белка, приводящих к наследственным

изменениям [Roberts and Wickner, 2003]. Активация вакуолярной протеазы В

(PrB) происходит в результате нескольких последовательных этапов процессинга.

Процессинг регулируется протеазой А (PrA), а также автокаталитически за счѐт

активности зрелого белка PrB. Активная форма PrB осуществляет протеолиз

белков. В частности, белки PrA и PrB совместно регулируют процессинг ещѐ

одной протеазы CpY, и их инактивация блокирует споруляцию. Было показано,

что при пассировании дрожжей на среде с галактозой делеция гена PEP4,

кодирующего PrA, не приводит к инактивации PrB, то есть в этих условиях

процессинг PrB может осуществляться автокаталитически. Пересев клеток Δpep4

на среду с глюкозой приводит к необратимой элиминации активности PrB.

Активная форма белка PrB передаѐтся цитодукцией, если в качестве донора

используется штамм Δpep4, пассирующийся на среде с галактозой, а в качестве

реципиента такой же штамм, в котором PrB инактивирован пассированием на

среде с глюкозой. Таким образом, активная форма PrB, как и прионы,

поддерживается автокаталитически и обладает инфекционностью (передаѐтся

цитодукцией). Исходя из этих данных, авторы предложили называть

процессированный белок PrB прионом [] [Roberts and Wickner, 2003]. По сути, в

этой работе был описан новый механизм белковой наследственности, который

принципиально отличается от механизма наследования инфекционных

амилоидов.

53

Другим примером неамилоидных прионов является фактор [GAR+]. В норме,

при наличии в среде глюкозы, в дрожжевой клетке происходит репрессия

потребления других источников углерода. Фактор [GAR+] блокирует глюкозную

репрессию, штаммы [GAR+] способны потреблять глицерин в присутствие

глюкозамина [Ball et al. 1976]. Фактор [GAR+], как и прочие прионы, доминантен,

наследуется 4:0 в мейозе, передаѐтся цитодукцией, и может возникать de novo.

Исследованию данного фактора посвящѐн ряд работ, но по-прежнему нет ясности

в вопросе о его детерминантах. Индукция [GAR+] происходит с высокой частотой

при сверхэкспрессии гена STD1, а к его элиминации приводит одновременная

делеция гена STD1 и N-терминальной части гена PMA1 [Brown and Lindquist,

2009]. Белки Pma1 и Std1 не образуют амилоидные полимеры в штаммах [GAR+]

[Brown and Lindquist, 2009]. Косвенным свидетельством в пользу неамилоидной

природы [GAR+] является его независимость от активности шаперона Hsp104

[Brown and Lindquist, 2009]. Возможно, возникновение фактора [GAR+], не связано

с конформационными изменениями белка, а является примером структурной

наследственности, сходным с кортикальной наследственностью у инфузорий

[Beisson and Sonneborn, 1965]. Можно допустить, что наличие или отсутствие

фактора [GAR+] определяется разными способами сборки белкового комплекса,

состоящего из двух или нескольких элементов. Мы можем предложить и другую

возможную модель – временная сверхпродукция белка Std1, который является

активатором киназ [Kuchin et al., 2003], вызывает гипперфосфорилирование Pma1,

и однажды распознав этот белок в качестве мишени, киназы продолжают

обеспечивать фосфорилирование Pma1 в ряду поколений. Наша гипотеза имеет

право на жизнь, поскольку последовательность Pma1 содержит необычайно много

(а именно 28) потенциальных сайтов фосфорилирования [Swaney et al., 2013].

1.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina

Фактор [Het-s] это ещѐ один пример эпигенетического изменения,

обусловленного прионной конверсией. Слияние гиф грибов, принадлежащих к

54

двум разным мицелиям, приводит к образованию гетерокариона, однако в ряде

случаев этот процесс заканчивается гибелью гетерокариона из-за отличий между

двумя мицелиями по аллелям генов несовместимости (рисунок 7). У гриба-

аскомицета Podospora anserina известно 9 локусов het (от heterokaryon formation),

контролирующих вегетативную несовместимость. Один из них - локус het-s

представлен двумя аллелями (het-s и het-S). Прион образует только белковый

продукт аллели het-s [Coustou et al., 1997]. В штаммах [Het-s*] белок HET-s

находится в нативной конформации. Если происходит прионизация белка, то

фенотип штамма обозначают как [Het-s]. При слиянии прионсодержащих гиф

([Het-s]) и гиф [Het-s*], в которых белок представлен в мономерной изоформе,

образуется гетерокарион и весь пул белка HET-s переходит в прионное состояние.

При слиянии прионсодержащих гиф ([Het-s]) и гиф, содержащих аллель het-S,

происходит гибель гетерокариона. Таким образом, прион контролирует

вегетативную несовместимость [Coustou et al., 1997; Wickner, 1997].

Белок HET-s отличается от большинства известных прионных белков

низших эукариот отсутствием участков с повышенным содержанием глутамина и

аспарагина. В ходе изучения трехмерной структуры белка HET-s границы и

функции доменов были определены следующим образом: N-домен

(аминокислоты 1-217), образованный в основном α-спиралями, важен для

регуляции несовместимости, тогда как неструктурированный С-домен

(аминокислоты 218-289) отвечает за прионизацию [Balguerie et al., 2003]. После

перехода в прионную конформацию в С-домене преобладают β-слои, образующие

структуру устойчивую к обработке протеиназой К [Balguerie et al., 2004].

Изучение фибрилл, полученных in vitro, показало, что HET-s(218-289) образует

левозакрученный β-соленоид с треугольным гидрофобным основанием [Wasmer et

al., 2008]. Для фибрилл HET-s(218-289) характерна полярность, и добавление

новых мономеров в условиях in vitro при комнатной температуре происходит

только с одного конца. Механизм добавления мономера к уже имеющемуся

амилоиду включает в себя присоединение неструктурированного прионного

домена к концу протофибриллы с последующим конформационным изменением и

55

встраиванием в структуру фибриллы. [Baiesi et al., 2011]. Белок HET-s (218-289)

способен прионизоваться и при экспрессии его структурного гена в клетках

дрожжей S.cerevisiae. В этом случае поддержание прионной конформации требует

наличия белка-шаперона Hsp104 [Taneja et al., 2007].

Рисунок 7. Система несовместимости [Het-s]/[Het-S] [по: Saupe, 2011].

Гетерокарион, образующийся в результате слияния мицелиев [Het-s] и [Het-S]

(обозначен серым цветом), погибает.

1.4.3. Функциональная значимость прионов

В последние годы разгорелась дискуссия о функциональной значимости

прионов микроорганизмов, причѐм наиболее активно обсуждаются две гипотезы,

абсолютно противоречащие друг другу. Авторы одной гипотезы утверждают, что

наследуемые изменения, возникающие в результате прионизации дрожжевых

белков адаптивны, и клетки, содержащие прионы, приобретают селективные

преимущества. Апологетом этой точки зрения является С. Линдквист. В серии

работ, проведѐнных в лаборатории С. Линдквист [Halfmann et al., 2010; 2012;

56

Holmes et al., 2013; Jarosz et al., 2014], были получены следующие доказательства

в пользу гипотезы об адаптивной роли прионов:

1) В некоторых штаммах S. cerevisiae, взятых в коллекцию из природы, белки

Rnq1 и Sup35 представлены в прионной форме. По мнению авторов, это

доказывает, что индукция прионизации может обеспечивать преимущества

в меняющихся условиях внешней среды.

2) Некоторые варианты приона [PSI+] обеспечивают лучшую адгезию клеток с

агаром, что позволяет клеткам прочнее связываться с субстратом.

3) Индукция приона [MOT3+] вызывает повышение устойчивости клеток к

некоторым химическим соединениям.

Рид Викнер напротив, утверждает, что дрожжевые прионы - это патология

[Wickner et al., 2011; 2014; Kelly and Wickner, 2013]. В поддержку своей позиции

он приводит элегантный эксперимент, в котором было показано, что некоторые

варианты [PSI+] убивают дрожжевые клетки.

Ко всем приведѐнным доводам возникают вопросы и комментарии. В

частности, доказывает ли присутствие прионов в природных штаммах их

адаптивные свойства? Ведь широкое распространение вируса гриппа в

популяциях людей не говорит о том, что он обеспечивает преимущества

организму-носителю. Достаточно того, что есть механизм, обеспечивающий

распространение вируса. Кроме того, прионизация обычно сопровождается если

не полной, то частичной инактивацией белка. Всегда ли те преимущества,

которые обеспечивает прионизация, компенсируют негативные эффекты

инактивации прионного белка? С другой стороны, наличие некоторых вариантов

прионов, которые убивают клетку, не доказывает, что другие варианты не могут

обеспечивать селективное преимущество в определѐнных условиях внешней

среды.

57

Для обсуждения функциональной значимости прионов полезно провести

сравнительный анализ последствий прионизации и мутаций, рассмотрев схему,

предложенную Ю. Черновым (рис. 8) [по: Chernoff, 2001].

Рисунок 8. Сравнительный анализ последствий мутаций и прионизации [по:

Chernoff, 2001].

Как видно из приведѐнного рисунка, прионизация, как и мутация, приводит

к изменению конформации и, следовательно, к изменению функциональной

активности белка. Такой сравнительный анализ последствий прионизации и

мутаций позволяет нам рассмотреть прионы микроорганизмов с эволюционной

точки зрения. Можно допустить, что прионная конверсия, как и доминантные

мутации, чаще всего отметается отбором, но иногда возникновение нового приона

может приводить к адаптивным изменениям. Это, в частности, может

происходить в тех случаях, когда прионизация приводит к возникновению новой

функции белка, а частичная потеря его исходной функциональной активности

58

несущественна. Пожалуй, известен только один прион, имеющий эволюционную

значимость. Речь идѐт о прионе Het-s Podospora anserina, поскольку его наличие

препятствует вегетативному слиянию гиф различных штаммов и предотвращает

тем самым распространение вредных симбионтов, паразитирующих в гифах

[Coustou et al., 1997]. Говорить о том, что все прионы полезны или вредны, так же

бессмысленно, как рассуждать о пользе или вреде всех мутаций. Каждый случай

нужно рассматривать индивидуально.

Прионы млекопитающих теоретически могут иметь эволюционную

значимость только в том случае, когда они передаются по наследству. Пока таких

прионов не обнаружено. Возникновение приона PrPSc

или инфекционных

агрегатов белков tau и -synuclein приводит лишь к развитию ненаследуемой

патологии. Рассматривая прионы млекопитающих, уместней обсуждать не их

эволюционную значимость, а возможную роль в регуляции процессов онтогенеза.

Теоретически можно предположить, что запрограммированная индуцибельная

прионизация может быть эффективной системой регуляции некоторых процессов

в организме млекопитающих. Как мы уже отмечали, не исключено, что

амилоидные олигомеры белков CPEB и ORB2, стабилизирующие нервные

синапсы, воспроизводятся в нейронах за счѐт прионоподобного механизма.

Известны и другие системы регуляции жизненно-важных процессов, в которых

важную роль играет индуцибильная агрегация белка. Так, в случае вирусной

инфекции белок RIG-I связывается с вирусной РНК и димеризуется. Димеры RIG-

I, в комплексе с РНК связывают полиубиквитиновую цепочку, после чего этот

комплекс взаимодействует с белком MAVS, который является рецептором

митохондриальной мембраны. В результате этого, MAVS формирует

высокомолекулярные агрегаты, что провоцирует антивирусный каскад –

наработку интерферона и фактора NFkB [Hou et al., 2011]. Мы привели этот

интереснейший пример функциональной активности индуцибельных белковых

агрегатов, несмотря на то, что агрегаты MAVS, совершенно очевидно, не

являются ни амилоидами, ни прионами. Авторы цитируемой работы поспешили

назвать MAVS прионом, основываясь лишь на том факте, что предсуществующие

59

фибриллы MAVS присоединяют мономеры этого белка в пробирке. Если пойти

вслед за авторами, то прионом можно считать любой белковый агрегат (даже не

амилоидный) способный присоединять новые мономеры. Поскольку в данном

случае речь не идѐт о самовоспроизведении (т.е. размножении) агрегатов и их

инфекционности, то мы не можем согласиться с такой трактовкой. Если

представить, что агрегаты MAVS действительно могли бы размножаться (а не

просто расти) и передаваться из клетки в клетку в организме человека, то любая

вирусная инфекция провоцировала бы пожизненное повышение температуры

тела, и, вероятно, эта жизнь была бы недолгой. Рассматривая прионную

конверсию как потенциальный регулятор различных процессов в органах и

тканях, надо помнить, что такой регулятор сложно выключить. Если для

прекращения неинфекционного амилоидогенеза достаточно снизить уровень

продукции соответствующего белка, то цикл прионной конверсии будет

воспроизводиться и без сверхпродукции.

1.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на

регуляцию протеомных сетей

Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что

инфекционные и неинфекционные амилоиды могут взаимодействовать, и наличие

амилоидных полимеров одного белка может инициировать агрегациию другого.

Классической иллюстрацией этого тезиса является взаимодействие прионов

[PIN+] и [PSI

+]. Наличие приона [PIN

+] является необходимым условием как для

спонтанного появления [PSI+], так и для возникновения приона [PSI

+] на фоне

сверхпродукции белка Sup35 [Derkatch et al., 1996; Derkatch, Liebman, 2007]. На

этапе инициации прионной конверсии Sup35 этот белок колокализуется с

прионными агрегатами Rnq1 [Vitrenko et al., 2007; Du and Li 2014]. После

возникновения приона [PSI+] агрегаты Sup35 и Rnq1 уже не колокализуются. На

основании этих данных прионные агрегаты Rnq1 рассматривают в качестве

60

«затравки» для агрегации Sup35. Можно предложить две альтернативные

гипотезы, объясняющие как функционирует такого рода затравка:

1. Прионные агрегаты Rnq1 присоединяют мономеры Sup35, что

способствует их сближению. Сближение мономеров Sup35, в свою

очередь, провоцирует их физическое взаимодействие и прионную

конверсию.

2. В результате присоединения мономера Sup35 к прионному агрегату Rnq1

N-домен Sup35 формирует бета-структуру. Мономер Sup35 с изменѐнной

конформацией является эффективной матрицей для присоединения и

конверсии новых мономеров Sup35. В рамках этой гипотезы [PIN+]

является конформационной матрицей для прионизации другого белка.

Вполне возможно, что справедливы обе гипотезы - [PIN+] может

способствовать одновременно и физическому сближению мономеров Sup35 и

изменению их конформации. Есть основания полагать, что индукции одного

приона другим способствует сходство аминокислотной последовательности

белков Rnq1 и Sup35. Наличие приона [SWI+] также способствует повышению

частоты индукции [PSI+] в штаммах [pin

-][psi

-] [Du and Li, 2014]. Напомним, что

прионные домены Rnq1, Swi1 и Sup35 содержат Q/N-обогащѐнные

последовательности. Более того, в ходе скрининга детерминанта фактора [PIN+]

было выявлено 11 белков, сверхпродукция которых повышает частоту индукции

приона [PSI+]. Семь из них содержат Q/N-обогащѐнные последовательности

[Derkatch et al. 2001].

Интересно, что индукция одного приона другим не может объясняться

исключительно в рамках модели «затравки». Показано, что белок Mod5,

представленный в прионной форме [MOD+], повышает частоты индукции [PSI

+],

однако физического взаимодействия агрегатов Mod5 с белком Sup35 не отмечено

[Arslan et al., 2015]. Здесь необходимо вспомнить, что Mod5 в отличие от других

дрожжевых прионогенных белков не содержит последовательностей,

обогащѐнных глутамином или аспарагином. По всей вероятности, прионная

61

инактивация Mod5, который является транскрипционным регулятором [Pratt-Hyatt

et al., 2013], влияет на продукцию Sup35 или его функциональных партнѐров.

После этапа инициации прионогенеза, опосредованного агрегатами другого

белка, прионные конформеры разных белков как правило уже не

взаимодействуют в дрожжевой клетке [Bagriantsev and Liebman, 2004]. При

наличии «сильного» варианта [PSI+] (вариант в котором активно идѐт

полимеризация белка и фрагментация полимеров) мономеры Sup35 уже не

присоединяются к матрице [PIN+] или [SWI

+]. По крайней мере, сильные варианты

[PSI+] стабильно поддерживаются и не меняют свои свойства в ряду поколений.

Переключения вариантов прионов отмечены с частотой, сопоставимой с частотой

спонтанного мутагенеза, лишь для «слабых», нестабильных вариантов [PSI+].

Очевидно, что эффективность присоединения белка к прионной затравке зависит

от гомологии последовательностей белков. Замена даже одной аминокислоты в

последовательности Sup35 может привести к тому, что изменѐнный белок

утрачивает способность присоединяться к предсуществующей матрице [PSI+]

[Marchante et al., 2013; Bondarev et al., 2015]. Индукция одного приона другим

представляет собой редкое событие, происходящее с низкой частотой. После

инициации прионизации на этапе элонгации мономеры белка в каждом клеточном

поколении присоединяются уже к собственной матрице, что обеспечивает

стабильное наследование приона. Различия в эффективности взаимодействия

мономеров с гетерологичной и гомологичной матрицей могут быть объяснены в

рамках «арочной» модели, предложенной А. Кайавой [Kajava et al., 2010] (см.

также рис.2). При инициации приона определѐнные последовательности белка

формируют кросс-бета структуру, стабилизированную межмолекулярными

водородными связями. Пространственная укладка этих последовательностей в

виде «арок», поперечных оси протофибриллы, определяется расположением

амилоидогенных трактов и их размером. У некоторых прионов могут

реализовываться различные варианты укладки, что зависит от того, какие

последовательности взаимодействуют на этапе инициации прионогенеза. На этапе

элонгации структура приона остаѐтся неизменной. Молекулы других прионых

62

белков имеют иную аминокислотную последовательность и содержат иные

амилоидогенные тракты, что препятствует присоединению к чужой матрице и

способствует взаимодействию с собственной прионной протофибриллой.

В некоторых случаях различные прионы вступают в антагонистические

отношения. Так, при скрещивании штаммов [PSI+] и [URE3] диплоиды теряют тот

или иной прион [Schwimmer, Masison, 2002]. Следует упомянуть о том, что

некоторые варианты [PIN+] оказывают дестабилизирующее воздействие на

слабые варианты [PSI+] [по: Derkatch, Liebman, 2007]. В штаммах, содержащих

одновременно три приона - [PSI+][PIN

+] и [SWI

+], последний элиминируется с

высокой частотой [Du and Li, 2014]. Механизмы антагонистического влияния

прионов не изучены. Можно предположить, что некоторые прионные варианты

одного белка могут блокировать рост (элонгацию) прионных конформеров

другого белка. Вполне вероятно также, что влияние прионов на стабильность друг

друга может быть опосредовано изменением активности других компонентов

протеомных сетей.

Неинфекционные амилоиды, в отличие от прионов, не фрагментируются и,

вследствие этого, не наследуются, однако они могут способствовать индукции

прионов и, таким образом, вовлекаться в регуляцию эпигенетических событий у

одноклеточных организмов. Так, мутантная последовательность белка

Хангтингтина человека (Q103) при сверхпродукции в дрожжевых штаммах [PIN+]

формирует амилодоподобные агрегаты, что значительно повышает частоты

индукции приона [PSI+] [Derkatch et al., 2004]. Кроме того, амилоид Q103 в

дрожжах индуцирует формирование детергент-устойчивых агрегатов Rnq1, Def1

и Bmh1 [Urakov et al., 2010; Duennwald et al., 2006; Wang et al., 2007].

Возникновение прионов также может провоцировать индукцию неинфекционных

амилоидов. Так, белок Pub1 при сверхпродукции формирует детергент-

устойчивые агрегаты в штаммах [PSI+], но не в штаммах [psi

-]. Без

сверхпродукции в штаммах [PSI+] белок Pub1 также выявляется во фракции

высокомолекулярных агрегатов, но лишь в следовых количествах [Urakov et al.,

2010].

63

Сходные взаимодействия отмечены и для амилоидогеных белков

млекопитающих. В частности, мономеры PrPС связывают амилоидные агрегаты

Aβ и α-синуклеина, которые выявляются в головном мозге в случаях болезней

Альцгеймера и Паркинсона, соответственно [Majd et al., 2013]. Более того,

прионные конформеры PrPSc

инициируют агрегацию пептида Aβ, образующего

амилоиды при болезни Альцгеймера [Schwarze-Eicker et al., 2005]. Агрегация Aβ,

а также α-синуклеина, вызывает гипперфосфорилирование и олигомеризацию

пептида tau, что приводит к развитию нейродегенерации [Rank et al., 2002;

Giasson et al., 2003]. Агрегаты tau, в свою очередь, индуцируют образование

амилоидных конформеров α-синуклеина [Giasson et al., 2003]. Наиболее полно

охарактеризованы взаимодействия PrP и Aβ. Показано, что белок PrP в

мономерной изоформе PrPC, заякоренный на мембране нейронов, является

рецептором для патогенных олигомеров Aβ [Lauren et al., 2009]. Парадоксально,

но факт - белок PrP, конформационные изменения которого вызывают прионные

заболевания, в нормальной клеточной изоформе может быть вовлечѐн в патогенез

болезни Альцгеймера. Более того, показано, что олигомеры Aβ индуцируют

агрегацию PrP, также как прионные полимеры PrPSc

инкорпорируют пептид Aβ и

способствуют его агрегации [Morales et al., 2010]. Важно отметить, что

физическое связывание PrP и Aβ отмечается лишь в том случае, когда один из

этих двух белков представлен в виде амилоидных олигомеров. Мономеры PrP и

Aβ друг с другом не взаимодействуют [Freir et al., 2011]. Исходя из этих данных,

можно заключить, что взаимодействие провоцирует конформационное изменение

одного из партнѐров. Установлено, что ключевую роль в связывании PrPС с

олигомерами Aβ играют положительно заряженные последовательности PrP23–27aa

и PrP90–110aa [Fluharty et al., 2013].

Приведѐнные в этом разделе данные свидетельствуют о том, что

предсуществующие амилоидные агрегаты зачастую способствуют индукции

амилоидогенеза других белков, но из-за отсутствия методов, позволяющих

проводить комплексную идентификацию амилоидов в масштабах протеома, эти

данные носят отрывочный характер. На данном этапе можно лишь заключить, что

64

индукции амилоидогенеза одного белка за счѐт агрегатов другого способствует

сходство исследуемых белков. Кроме того, такого рода взаимодействия не всегда

предполагают физическое связывание амилоидогенных белков. Как мы уже

упоминали, белок Mod5 в прионной форме не колокализуется с Sup35, но

способствует его прионизации. Вероятно, прионизация транскрипционного

регулятора Mod5 может вызывать изменения уровня экспрессии целого ряда

генов и таким образом влиять на возможность амилоидогенеза соответствующих

белков.

Рассматривая последствия амилоидогенеза необходимо помнить, что

агрегация одного белка может вызывать целую цепочку событий, изменяющих

взаимодействия компонентов протеомной сети. В частности, прионные агрегаты

Sup35 секвестрируют мономеры белка Sup45, играющего роль основного фактора

терминации трансляции [Paushkin et al., 1997; Gong et al., 2012; Vishveshwara et

al., 2009]. Более того, в работе лаборатории Т.Р. Сойдлы было показано, что

прионные агрегаты белка Sup35 связывают сорок белков, примерно половину из

которых составляют шапероны и белки, регулирующие глюкозный метаболизм

[Nevzglyadova et al., 2009]. Таким образом, прионизация одного белка может

вызывать глобальные изменения в регуляции протеомных взаимодействий.

Отметим, что прионизация может приводить не только к частичной инактивации

белка, но и к приобретению им новых функций. Так, прионные агрегаты Sup35

связывают белки, с которыми мономеры Sup35 не взаимодействуют

[Nevzglyadova et al., 2009]. Такую же способность приобретают многие

патологические амилоиды млекопитающих [по: Gruschus, 2008]. Кроме того,

совсем недавно было показано, что белок Rnq1 клеточные функции которого

неизвестны, только в прионной форме вызывает гипперфосфорилирование Pub4

[Yang et al., 2014] и, возможно, других белков. По всей вероятности, наиболее

существенное влияние на регуляцию протеомных сетей может оказывать

прионизация транскрипционных регуляторов, таких как Isp1, Swi1, Cyc8 и Mod5.

65

1.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании

прионов и амилоидов

Вопрос о распространѐнности функциональных и патологических прионов

и амилоидов у различных организмов и значимости амилоидогенеза по-прежнему

остаѐтся открытым. На нынешнем уровне наших знаний невозможно с высокой

степенью достоверности предсказать, какие белки обладают амилоидными

свойствами in vivo. Наличие потенциально амилоидогенных последовательностей

ещѐ не гарантирует возможность амилоидогенеза белка. Например, Q/N-

обогащѐнная последовательность New1, слитая с М и С доменами Sup35,

прионизуется, тогда как полноразмерный белок New1 не обладает прионными

свойствами [Osherovich et al., 2004]. Помимо аминокислотной

последовательности возможность амилоидогенеза in vivo зависит также от уровня

продукции белка, который в свою очередь может меняться. Многофакторный

характер регуляции амилоидогенеза препятствует возможности применения

биоинформационных алгоритмов для выявления амилоидов. Новые

функциональные и патологические амилоиды выявляют не вследствие системного

анализа, а в результате направленного изучения свойств отдельных белков или

анализа конкретных патологий. У дрожжей прионные белки обычно выявляют в

результате генетического скрининга факторов, определяющих фенотипические

изменения признака, либо благодаря анализу биохимических свойств белков,

имеющих сходство с известными прионами. Такой подход не может дать

информацию о масштабах и значимости исследуемого феномена. С нашей точки

зрения, существенный прогресс в понимании вопроса о масштабности и

значимости амилоидогенеза может быть достигнут за счѐт использования

принципиально новых подходов, позволяющих идентифицировать не отдельные

инфекционные и неинфекционные амилоиды, а выявлять и идентифицировать

«амилоидом» различных организмов в целом.

Впервые подход для разработки универсального метода идентификации

различных амилоидов был предложен в работе наших коллег из лаборатории М.Д.

Тер-Аванесяна [Kushnirov et al., 2006]. Авторы обратили внимание на

66

универсальное биохимическое свойство амилоидных фибрилл – их высокую

устойчивость к обработке ионным детергентом додецилсульфатом натрия (SDS).

Очистив высокомолекулярную фракцию SDS-устойчивых белковых полимеров,

авторам удалось без помощи антител выявить амилоидные агрегаты белка

Sup35NM, но лишь на фоне его сверхпродукции [Kushnirov et al., 2006].

Использование этого подхода в комплексе с современными протеомными

методами может позволить разработать универсальный биохимический метод,

позволяющий идентифицировать даже минорные белки, формирующие

амилоидные агрегаты.

В исследовании взаимодействия прионов и амилоидов также остаѐтся много

открытых вопросов. Как мы уже обсуждали, одни амилоиды могут инициировать

возникновение других, но чаще всего такие исследования проводят на фоне

искусственно вызванной сверхпродукции одного из взаимодействующих белков.

Прионная конверсия транскрипционных регуляторов, таких как Swi1, может

вызывать амилоидогенез других белков не только за счѐт непосредственного

взаимодействия с гетерологичной матрицей, но и в результате изменения уровня

продукции целого ряда белков. Задача выявления комплексных изменений

амилоидома также может быть решена за счѐт разработки универсального

биохимического метода, позволяющего выявлять амилоиды в масштабах

протеома.

Несмотря на активные исследования прионных взаимодействий все

известные факты сводятся к индукции одним прионом другого. По-прежнему не

известно – могут ли взаимодействия прионов, подобно взаимодействиям

классических генов, приводить к наследуемым изменениям признаков? Пока

такие взаимодействия не описаны. Анализ взаимодействия патологических

амилоидов млекопитающих in vivo зачастую представляет собой крайне сложную

и дорогостоящую задачу. Многие паталогические амилоидные агрегаты убивают

клетки млекопитающих, что крайне затрудняет анализ каких-либо

взаимодействий. Эта проблема может быть решена за счѐт использования

адекватных и удобных модельных систем, лишѐнных перечисленных недостатков.

67

Целый ряд работ, проведѐнных в последние годы, убедительно доказывает, что

дрожжи S. cerevisiae являются наиболее перспективным модельным объектом для

исследования агрегации гетерологичных амилоидогенных белков [Coughlan and

Brodsky, 2005; Mason and Giorgini, 2011]. В частности показано, что при

продукции в дрожжевой клетке ряд белков млекопитающих формирует агрегаты,

обладающие амилоидными характеристиками [Ma and Lindquist, 1999; Meriin et

al., 2002; Winderickx et al., 2008; Mallik et al., 2010]. Уровень продукции

амилоидных белков в дрожжах легко регулировать за счѐт использования

различных индуцибельных промоторов. Важно отметить, что в дрожжах

амилоидогенез начинается практически сразу после запуска продукции

соответствующего белка, тогда как в организме млекопитающих процесс

формирования амилоидов может длиться месяцы и годы. Кроме того, амилоидные

агрегаты белков млекопитающих не убивают дрожжевые клетки, что позволяет

разрабатывать различные модельные системы для скрининга факторов,

контролирующих процесс амилоидогенеза. На наш взгляд, дрожжи S. cerevisiae

представляют собой уникальный модельный объект для исследования

взаимодействия гетерологичных амилоидов in vivo.

68

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования

Для культивирования дрожжей использовали стандартные дрожжевые

среды [Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990]: полные среды YAPD (содержит

глюкозу в качестве источника углерода) или СПГ (содержит все компоненты

полной среды, за исключением глюкозы, замененной на глицерин (24 мл/л));

минимальные среды – MD (содержит глюкозу в качестве источника углерода),

также MG и MGly, содержащие соответственно галактозу и глицерин в качестве

источника углерода. В селективные среды на основе MD и MG добавляли

витамины, микроэлементы, а также, аминокислоты и азотистые основания

производства “Sigma” (США) в следующих концентрациях: аденин – 20мг/л, L-

лизин – 30мг/л, урацил – 20мг/л, L-лейцин – 60мг/л, L-триптофан – 20мг/л.

Для индукции споруляции диплоидных штаммов использовали

преспоруляционную среду и среду с ацетатом калия.

Использовали также среды модифицированного состава:

среду YAPD с добавлением хлорида гуанидина “QIAGEN” (США) в

концентрации 5 мМ;

среду YAPD с добавлением циклогексимида “Sigma” (США) в

концентрации 1мг/л;

Для отбора цитодуктантов использовали селективную среду ME, или полную

среду YPE, в которых глюкоза заменена на 96º этанол (20мл/л) и добавлен

циклогексимид в концентрации 1мг/л. Аминогликозидные антибиотики

паромомицин (100 мкг/мл) и генетицин (50 мкг/мл) добавляли в среду для анализа

роста дрожжей на фоне общего ингибирования трансляции. Для экспрессии

конструкций, находящихся под контролем индуцибельного промотора CUP1, в

среды добавляли CuSO4 «РЕАХИМ» (Россия) в концентрациях от 3 до 150 мкМ.

69

Для культивирования бактерий использовали твѐрдую и жидкую среды LB

(Sambrook et al., 1989). Селекцию устойчивых к ампициллину трансформантов

проводили на среде LB с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Дрожжевые

штаммы культивировали при температуре 30ºС, штаммы бактерий при 37ºС. В

работе использован штамм Escherichia coli DH5α следующего генотипа: supE44

ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 .

Генотипы штаммов S. cerevisiae приведены в Таблице 4. Диплоидный

штамм D931 был получен в результате трансформации штамма GT111 [Chernoff et

al., 2000] плазмидой pU-Aβ-Sup35MC. Гаплоидный сегрегант 1-D931 с делецией

хромосомной копии гена SUP35, содержащий плазмиду pU-Aβ-Sup35MC, был

получен с помощью метода случайной выборки аскоспор. Штамм 1-1-D931 был

получен как описано в разделе «3.1.» и содержит прионный детерминант [NSI+].

Штамм 6-1-1-D931 был получен в результате переключения типа спаривания

MATa на MATα у штамма 1-1-D931 за счѐт использования плазмиды YEpHO.

Штамм 4-1-1-D931 получен за счѐт замены плазмиды pU-Aβ-Sup35MC на pL-Aβ-

Sup35MC в штамме 1-1-D931. Штамм 3-4-1-1-D931 получен за счѐт замены

плазмиды pL-Aβ-Sup35MC на pFL38-SUP35P в штамме 4-1-1-D931. Гаплоидный

сегрегант 1-D933 был получен в результате споруляции диполоида D933 и

селекции клона нужного генотипа (см. табл. 4). Гаплоидный штамм 2-1-1-1-D931

был получен в результате замены плазмиды pU-Aβ-Sup35MC в штамме 1-1-1-

D931 на плазмиду pRS315-SUP35MC. Гаплоидные штаммы[nsi-] 1-1-1-D931 [nsi-],

1-4-1-1-D931, 1-3-4-1-1-D931,и 1-2-1-1-D931 и 1-2-D934 были получены в

результате трѐхкратного пассирования штаммов 1-1-D931, 4-1-1-D931, 1-3-4-1-1-

D931, 2-1-1-D931 и 2-D934, соответственно, на среде с 5mM GuHCl и

последующего отбора клонов, утративших способность к росту на селективной

среде без аденина. Штамм 2-1-1-D931 получен из штамма 1-1-D931 путѐм замены

плазмиды pU-Aβ-Sup35MC на плазмиду pRS315-SUP35MC. Штаммы 6-1-4-1-1-

D931 и 7-1-4-1-1-D931, содержащие прионные детерминанты [SWI+] и [PIN

+],

соответственно, получены в результате трансформации сферопластов штамма 1-4-

1-1-D931 белковым лизатом штамма 1-1-D931 (описание метода белковой

70

трансформации приведено ниже). Штамм 2-4-1-1-D931 [PIN+] получен путѐм

трансформации сферопластов штамма 1-4-1-1-D931 [pin-] белковым лизатом

штамма BY4742 [PIN+]. Штамм 2-2-1-1- D931 получен на основе штамма 2-1-1-

D931 за счѐт замены плазмиды pRS315-Sup35MC на плазмиду pRS316-Sup35MC.

Штамм 1-2-2-1-1-D931 был получен из штамма 2-2-1-1-D931 в результате замены

плазмиды pRS316-Sup35MC на pASB2. Штамм 18-3-2-1-1- D931 получен из

штамма 3-2-1-1-D931 в результате замены плазмиды pRS316-Sup35MC на pASB2.

Штаммы 4-2-1-1-D931 [NSI+] и 5-2-1-1-D931 [nsi

-] были получены в результате

замены плазмиды pRS315-SUP35MC на плазмиду pYCH-U2 в штаммах, 2-1-1-

D931 [NSI+] и его деривате [nsi

-], соответственно. Штаммы 1-4-2-1-1-D931 и 1-5-2-

1-1-D931 получены из штаммов 4-2-1-1-D931 и 5-2-1-1-D931, соответственно,

путем замещения плазмиды pYCH-U2 на плазмиду pNR-ABF1. Гаплоидный

штамм 1P-74-D694, содержащий встроенную в хромосому кассету SUP35 P.m.-

LEU2 вместо последовательности гена SUP35 S. cerevisiae, был описан ранее

[Derkatch et al., 2000]. Штаммы 1-D934 и 2-D934 являются гаплоидными

сегрегантами штамма D934, полученными с помощью метода случайной выборки

аскоспор. Штамм 1-D932 является гаплоидным сегрегантом штамма D932,

полученным с помощью метода случайной выборки аскоспор. Штаммы 7-1-1-

D931, 9-1-1-D931 и 7-4-1-1-D931 были получены в результате замещения

последовательности хромосомных копий генов RNQ1, VTS1 и SWI1,

соответственно, на последовательность KanMX4 , экспрессия которой вызывает

устойчивость дрожжевых клеток к антибиотику генетицину.

71

Таблица 4. Штаммы S. cerevisiae, использованные в работе

Штамм Генотип, эпигенетические детерминанты, описание

GT111 MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 his3/ his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1 lys2/lys2 ura3/ura3

leu2/leu2 [pU-Aβ-Sup35MC] [psi-] [PIN

+]

D931

MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 his3/ his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1 lys2/lys2 ura3/ura3

leu2/leu2 [pU-Aβ-Sup35MC] [psi-] [PIN

+]

1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [PIN+]

1-1-D931 [NSI+] дериват штамма 1-D931

1-1-1-D931 [nsi-] дериват штамма 1-1-D931

6-1-1-D931 MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+ PIN

+]

4-1-1-D931 Дериват штамма 1-1-D931, несущий плазмиду pL-Aβ-Sup35MC вместо плазмиды pU-Aβ-

Sup35MC

1-4-1-1-D931 [nsi-] дериват штамма 4-1-1-D931

3-4-1-1-D931 Дериват штамма 4-1-1-D931, несущий плазмиду pFL38-SUP35P вместо плазмиды pL-Aβ-

Sup35MC

1-3-4-1-1-D931 [nsi-] дериват штамма 4-1-1-Д931

72

Продолжение таблицы 4.

2-1-1-1-D931 MATα дериват штамма 1-1-1-D931, содержащий плазмиду pL-Aβ-Sup35MC вместо pU-Aβ-

Sup35MC

6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin

-] дериват штамма 1-4-1-1-Д931

7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN

+] дериват штамма 1-4-1-1-Д931

7-4-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 swi1Δ::KanMX4 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pL-Aβ-Sup35MC]

[PIN+]

2-4-1-1-D931 [PIN+] дериват штамма 1-4-1-1-D931

3-1-1-D931 Дериват hsp104Δ::LEU2 штамма 1-1-D931

9-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 vts1Δ::KanMX [pU-Aβ-Sup35MC]

[NSI+]

2-1-1-D931 MATa sup35 Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [ pRS315-SUP35MC]

1-2-1-1-D931 [nsi-][pin

-] дериват штамма 2-1-1-D931

1-2-2-1-1-D931 Дериват 2-2-1-1-D931, несущий плазмиду pASB2, [NSI+]

18-3-2-1-1- D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pASB2]

2-2-1-1- D931 MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pRS316-Sup35MC] [NSI+][PIN

+]

4-2-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [pYCH-U2]

73

Продолжение таблицы 4.

1-4-2-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [pNR-ΔABF1]

5-2-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pYCH-U2]

1-5-2-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pNR-ΔABF1]

7-1-1-D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 rnq1Δ::KanMX [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+][PIN

+]

7B-D901 MATa ade2-28 his3 LEU2 lys 9-21 ura3-525 trp1 cyhR kar1-1 [pin

-]

D933 MATα/MATa sup35Δ::HIS3/sup35Δ::HIS3 his3/his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/ trp1-289 lys2/lys2

ura3/ura3 leu2/leu2 [pU-Ab-Sup35MC] [pL-Aβ-Sup35MC] [nsi- ] [PIN

+]

1-D933 MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [nsi-][PIN

+]

GT81-1C MATa ade1–14 his3-Δ200 leu2–3,112 lys2–801 trp1–289 ura3–52 [PSI+][PIN

+]

GT409 [psi-][pin-] дериват штамма GT81-1C

BY4742 MATα his3-Δ1 leu2-Δ0 lys2-Δ0 ura3-Δ0 [psi-][PIN

+]

1-BY4742 [pin-] дериват штамма BY4742

D955 MATα// MATa his3-Δ1//his3 leu2-Δ0// leu2 lys2-Δ0// lys2 ura3-Δ0// ura3 trp1-289//+ ade1-14//+

sup35Δ::HIS3//SUP35 [PIN+] [SWI

+]

D956 MATα// MATa his3-Δ1//his3 leu2-Δ0// leu2 lys2-Δ0// lys2 ura3-Δ0// ura3 trp1-289//+ ade1-14//+

sup35Δ::HIS3//SUP35 mit1Δ::KANMX4//MIT1 [pL-Aβ-Sup35MC] [PIN+] [SWI

+]

74

Продолжение таблицы 4.

1-D956 MATα his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 ade1-14 sup35Δ::HIS3 mit1Δ::KANMX4MIT1 [pL-Aβ-

Sup35MC] [PIN+] [SWI

+]

1-D934 MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1 [NSI+]

2-D934 MATα sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1 [NSI+]

1-2-D934 [nsi-][pin

-] дериват штамма 2-D934

1P-74-D694 MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3Δ ura3-52 leu2-3,112 trp1

ATCC 201388

GAS1-YFP

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 gas1Δ::GAS1-YFP

D934 MATa/MATa sup35Δ::HIS3/sup35Δ::SUP35P_LEU2 his3Δ/his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1

LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+]

D935 MATa/MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2/sup35Δ::SUP35P LEU2 his3/his3 ade1-14/ade1-14

trp1/trp1 LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [NSI+]

D936 MATa/MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2/sup35Δ::SUP35P LEU2 his3/his3 ade1-14/ade1-14

trp1/trp1 LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [nsi-]

75

Продолжение таблицы 4.

D932 MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 ADE1/ade1-14 ADE2/ade2-28 HIS3/his3 LEU2/leu2

LYS2/lys2 LYS9/lys 9-21 ura3/ura3-525 trp1/trp1-289 CYH/cyhR KAR1/kar1-1[pL-Aβ-Sup35MC]

[nsi=]

1-D932 MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 ura3 trp1-289 cyhR kar1-1 [rho

0]

[pL-Aβ-Sup35MC] [nsi-]

Примечание. Генотипы приведены в соответствии со стандартной трехбуквенной номенклатурой [Захаров и др. 1984;

Sherman et al., 1986]. Аллель ade1-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trp1-289 – нонсенс-мутацию UAG; ura3-52 –

инсерцию дрожжевого мобильного элемента Ty1 в кодирующую часть гена URA3; leu2-3,112 – двойные мутации в гене

LEU2.

76

Штамм 3-1-1-D931 был получен в результате замещения

последовательности хромосомных копий гена HSP104 в штамме 1-1-D931 на

последовательность гена LEU2. 1-D956 – гаплоидный сегрегант штамма D956,

полученный с помощью случайной выборки аскоспор.

Штаммы GT81-1C, GT409 и BY4742 были любезно предоставлены проф.

Ю.О. Черновым. 1-BY4742 – [pin-] дериват штамма BY4742. Штамм ATCC

201388 GAS1-YFP, любезно предоставленный А.А. Александровым, содержит

интегрированную в хромосому последовательность гена GAS1 под контролем

собственного промотора, слитую в рамке с последовательностью гена GFP [Huh

et al., 2003]. Штамм 7B-D901 [Saifitdinova et al., 2010] любезно предоставлен Ю.В.

Соповой.

Ниже указан способ получения диплоидных штаммов, используемых в

работе:

D933 (1-D931 MATa х 2-1-1-1-D931 MATα); D955 (1-1-D931 MATa х BY4749

MATα); D934 (1P-74-D694 MATa x 6-1-1-D931 MATα); D935 (1-D934 MATa x 2-

D934 MATα); D936 получен в результате пассирования на среде с GuHCl штамма

D935; D932 (7B-D901 MATa x 2-1-1-1-D931 MATα); D956 получен в результате

скрещивания штамма 4-1-1-D931 клоном BY4742 mit1Δ:: KanMX4 делеционной

дрожжевой библиотеки “BY deletion collection” (Invirtogene, США), созданной на

базе штамма BY4742. Клон BY4742 mit1Δ:: KanMX4 из делеционной библиотеки

любезно предоставлен проф. Ю.И. Павловым (Небраска, США).

2.2. Плазмиды

Плазмида pcDNA3-1-3F4 содержит мышиный ген Prnp, модифицированный

для распознавания моноклональными антителами 3F4, а также ориджины,

необходимые для репликации плазмиды в E. coli и культурах клеток

млекопитающих [Narwa and Harris, 1999].

77

Все остальные плазмиды представляют собой челночные вектора, имеющие

дрожжевые и бактериальные ориджины репликации. Их основные

характеристики представлены в таблице 5. Плазмида pRS315 была описана ранее

[Christianson, et al., 1992]. Плазмида pmCUPNMsGFP содержит

последовательность, кодирующую химерный ген под контролем индуцибельного

промотора CUP1 [Serio et al., 1999]. Плазмида pRS316CG, содержащая

последовательность гена GFP под контролем промотора CUP1, была описана

ранее [Liu and Lindquist, 1999]. Плазмида pRS315-SUP45, любезно

предоставленная проф. Г.А. Журавлѐвой, была описана ранее [Moskalenko et al.,

2003]. Плазмида pFL38-SUP35P, предоставленная И.Л. Деркач, содержит

последовательность гена SUP35 Pichia methanolica [Derkatch et al., 2000].

Плазмида pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) любезно предоставлена С.П. Задорским

(СПбФ ИОГен РАН, Россия). Плазмида pNR-ΔABF1, несущая полноразмерный

SUP35 с делецией сайта связывания транскрипционного фактора Abf1p в

промоторе, любезно предоставлена Н.А. Рябинковой. Плазмиды YEpHO [Jensen et

al., 1983] и pRS315 [Sikorski and Hieter, 1989] были описана ранее.

Мультикопийная плазмида pLH105 содержит ген HSP104 под контролем

промотора GPD [Vogel et al., 1995]. Плазмиды pRS315-SUP35MC и pRS316-

SUP35MC, любезно предоставленные проф. Ю.О. Черновым, содержат

последовательность, кодирующую домены М и С белка Sup35 под контролем

собственного промотора. После промотора перед последовательностью SUP35MC

встроен полилинкер, содержащий сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI и

SacI [Saifitdinova et al., 2010]. Плазмида pYCH-U2, любезно предоставленная И.Л.

Деркач, содержит ген SUP35 под контролем собственного промотора [Derkatch et

al., 1997]. Плазмиды pSP-YFP и pSP-CFP любезно предоставлены С.П.Задорским.

Плазмида p426GPD–SWI1YFP, любезно предоставленная проф. Г.А. Журавлѐвой,

была описана ранее [Du and Li, 2014]. Центромерная плазмида pID129,

содержащая ген RNQ1 была описана ранее [Kadnar et al., 2010].

78

Плазмиды pDB691 (UGAC) и pDB690 (CGAC) любезно предоставлены М.Д.

Тер-Аванесяном. Эти плазмиды несут тандемно расположенные гены,

кодирующие люциферазы коралла Renilla и жука-светлячка, разделенные стоп-

кодоном UGA (pDB691) или значащим кодоном CGA (pDB690) [Keeling et al.,

2006; Kallmeyer et al., 2006].

Далее описаны плазмиды, сконструированные в ходе данной работы.

Плазмида pmCUP1-SUP35MC была сконструирована следующим образом –

фрагмент XhoI-BamHI, содержащий последовательность промотора CUP1 из

плазмиды pmCUP1 [Serio, et al. 1999] был встроен в вектор pRS425 [Labbe-Bois

1990]. На следующем этапе последовательность SUP35MC, фланкированная

сайтами рестрикции BamHI-SacI, была встроена вслед за промотором CUP1

[Saifitdinova et al., 2010].

Плазмида pU-Aβ-SUP35MC [Цапонина и др., 2005] были сконструированы

как описано ниже. Последовательность, кодирующая пептид Аβ (40 аминокислот)

человека, была получена из тотальной РНК мозга абортуса при помощи метода

RT-PCR (обратной полимеразной цепной реакции). Синтез кДНК проводился с

помощью набора реактивов и согласно протоколу фирмы “Fermentas”. Праймеры

содержат сайты рестрикции BamHI и SacI, стартовый кодон АТГ и

последовательности комплементарные 5’ и 3’ концам ДНК, кодирующей пептид

Аβ (таблица 6).

Амплифицированная последовательность была секвенирована и встроена в

плазмиду pmCUP1-SUP35MC по сайтам BamHIи SacI, расположенным вслед за

промотором CUP1. Центромерная плазмида pU-Aβ-SUP35MC содержит

последовательность Аβ-SUP35MC под контролем индуцибельного промотора

CUP1, бактериальный и дрожжевой ориджины репликации и ген устойчивости к

ампициллину – AmpR и ген URA3.

Для получения плазмиды pL-Aβ-SUP35MC, содержащей маркѐрный ген

LEU2, последовательность PCUP1-Aβ-SUP35MC из плазмиды pU-Aβ-SUP35MC,

79

фланкированная сайтами рестрикции XhoI-SacI, была встроена в вектор pFL36

(Bonneaud, et al. 1991).

PCUP1-GFP(URA3) – многокопийная плазмида, созданная на основе вектора

pFL44S, содержит последовательность гена sGFP под контролем промотора

CUP1, гены – ampR, URA3, бактериальный и дрожжевой ориджины репликации.

Плазмида получена путѐм интеграции фрагмента XhoI-SacI из плазмиды

pRS316CG, несущего последовательность гена GFP под контролем промотора

CUP1, в вектор pFL44S, гидролизованный эндонуклеазами рестрикции XhoI и

SacI.

PGPD-GFP(URA3) [Рубель и др., 2008] – многокопийная плазмида, созданная

на базе вектора pFL44S, содержит последовательность гена sGFP под контролем

промотора GPD, гены – ampR, URA3, бактериальный и дрожжевой ориджины

репликации. Плазмида pGPD-GFP(LEU2) была получена за счѐт инсерции

фрагмента плазмиды PGPD-GFP(URA3), содержащего последовательность PGPD-

GFP (SalI-SacI) в плазмиду pRS425 гидролизованную рестриктазами SalI и SacI.

Плазмиды pGPD-YFP(URA3), pGPD-YFP(LEU2), pGPD-CFP(URA3) и

pGPD-CFP(LEU2) были получены путѐм замены фрагмента 0.7-kb SacII-SacI ,

кодирующего последовательность ген GFP в составе плазмид PGPD-GFP(URA3)

и pGPD-GFP(LEU2), на последовательность генов YFP и CFP.

Последовательности YFP и CFP, были выделены из плазмид pSP-YFP и pSP-CFP,

гидролизованных эндонуклеазами SacII и SacI.

Плазмиды pGPD-PrP23-231-CFP(LEU2), pGPD-PrP28-231-CFP(LEU2) pGPD-

PrP90-231-CFP(LEU2) и pGPD-PrP110-231-CFP(LEU2) были сконструированы

следующим образом – последовательности, кодирующие фрагменты белка PrP

мыши PrP23-231, PrP28-231, PrP90-231 и PrP110-231, фланкированные сайтами рестрикции

BamHI и SacII , были интегрированы в вектор pGPD-CFP(LEU2) по тем же сайтам,

расположенным вслед за промотором GPD. Таким же образом, на базе вектора

pGPD- YFP(URA3) была получена плазмида pGPD-PrP23-231-YFP(URA3). Цифрами

80

в названии плазмид обозначены номера первой и последней аминокислоты в

составе соответствующих фрагментов белка PrP мыши. Последовательности

использованных праймеров приведены в таблице 6.

Плазмиды pGPD-PrP23-231-GFP(URA3), PGPD- PrP90-231-GFP(URA3) и pGPD-

Aβ-GFP(URA3) были получены за счѐт интеграции ПЦР фрагментов PrP23-231

PrP90-231, и Aβ (40 аминокислот), фланкированных сайтами рестрикции BamHI и

SacII в вектор pGPD-GFP(URA3).

Плазмида pGPD-Aβ-YFP(URA3) была получена за счѐт замены

последовательности GFP в плазмиде PGPD-Aβ-GFP(URA3) на

последовательность YFP из плазмиды pSP-YFP, гидролизовованной

эндонуклеазами SacII и SacI.

pU-VTS1 – мультикопийная плазмида содержит последовательность,

кодирующую ген VTS1 под контролем индуцибельного промотора CUP1.

Последовательность VTS1 была амплифицирована из геномной ДНК штамма 2-1-

1-D931 и интегрирована в плазмиду PCUP1-GFP(URA3), гидролизованную по

сайтам рестрикции BamHI and SacII. Последовательность праймеров

FVTS1BamH1 и RVTS1Sac2 приведена в таблице 6.

PMIT1-MIT1-GFP – центромерная плазмида, содержит гены – ampR, URA3,

бактериальный и дрожжевой ориджины репликации. Последовательность гена

MIT1, включая промоторную область, была амплифицирована с помощью

праймеров MIT1F и MIT1R (таблица 6). В качестве матрицы использовалась

плазмида YGPM21o12 геномной дрожжевой библиотеки. Амплифицированный

фрагмент был встроен в плазмиду pRS316CG, гидролизованную эндонуклеазами

рестрикции ClaI и BamHI.

PGPD-GAS1-YFP – мультикопийная плазмида, содержит гены – ampR, URA3,

бактериальный и дрожжевой ориджины репликации. Плазмида была получена

путѐм замены последовательности PrP23-231 в плазмиде pGPD-PrP23-231-YFP(URA3)

на последовательность GAS1, амплифицированную с помощью праймеров FGAS1

81

и RGAS1 (таблица 6) и фланкированную сайтами рестрикции ВамHI и SacI. В

качестве матрицы для амплификации гена GAS1 использовали геномную ДНК,

выделенную из штамма BY4742.

Для проведения геномных скринингов в работе использовали адресную

дрожжевую геномную библиотеку YSC4613 “Open Biosystems” (ЕС). Библиотека

включает 1588 клонов E. coli, несущих челночный многокопийный вектор pGP564

с уникальными фрагментами генома S. cerevisiae, клонированными в вектор по

сайтам гидролиза BamHI. Вставки содержат несколько открытых рамок

считывания. Каждый клон содержит одну плазмиду с несколькими генами S.

cerevisiae с известной нуклеотидной последовательностью. Вектор pGP564

маркирован геном устойчивости к антибиотику канамицину для селекции в

бактериях и геном прототрофности по лейцину для селекции в дрожжах.

Таблица 5 Плазмиды, использованные в работе

Плазмида Тип/

маркер

Промотор Белок Ссылка

pFL38-SUP35P CEN/URA3 SUP35

P.m.

Sup35 P.m. Derkatch, et al.

2000

pRS315 CEN/LEU2 Sikorski and

Hieter, 1989

pFL44S 2µ /URA3 American Type

Culture Collecti

on

pRS316CG CEN/URA3 PCUP1 GFP Liu and

Lindquist, 1999

82

Продолжение таблицы 5

pRS315-

SUP35MC

CEN/LEU2 PSUP35 Sup35MС Saifitdinova et

al., 2010

pRS316-

SUP35MC

CEN/URA3 PSUP35 Sup35MС Saifitdinova et

al., 2010

pmCUPNMsGFP 2µ /URA3 PCUP1 Sup35NM-

GFP

Serio et al. 1999

pSP-YFP CEN/URA3 PCUP1 Sup35SP-YFP Rubel et al.,

2013

pSP-CFP CEN/URA3 PCUP1 Sup35SP-CFP Rubel et al.,

2013

pmCUP1-

SUP35MC

2µ/LEU2 PCUP1 Sup35MС Saifitdinova et

al., 2010

PCUP1-

GFP(URA3)

2µ /URA3 PCUP1 GFP Рубель и др.

2008

pRS315-SUP45 CEN/LEU2 PSUP45 Sup45 Moskalenko et

al. 2003

pYCH-U2 CEN/URA3 PSUP35 Sup35 Derkatch et al.

1997

pASB2 CEN/LEU2 PSUP35 Sup35 Nizhnikov et al.,

2012

PGPD-

GFP(URA3)

2µ /URA3 PGPD GFP Рубель и др.

2008

PGPD-

GFP(LEU2)

2µ / LEU2 PGPD GFP Rubel et al.,

2013

83

Продолжение таблицы 5

pL-Aβ-

Sup35MC

CEN/LEU2 PCUP1 Aβ-Sup35MC Saifitdinova et

al. 2010

pU-Aβ-

Sup35MC

CEN/URA3 PCUP1 Aβ-Sup35MC Цапонина и

др. 2005

YEpHO 2µ / LEU2 PHO Ho Jensen et al.,

1983

pDB690

(CGAC),

CEN/URA3 PPGK LucR-CGAC-

LucF

Keeling et al.

2004

pDB691

(UGAC),

CEN/URA3 PPGK LucR-UGAC-

LucF

Keeling et al.

2004

pDB720

(UAGC)

CEN/URA3 PPGK LucR-UAGC-

LucF

Keeling et al.

2004

pDB721

(CAGC)

CEN/URA3 PPGK LucR-CAGC-

LucF

Keeling et al.

2004

pLH105 2µ /LEU2 PGPD1 Hsp104 Vogel et al.,

1995

PGPD1-GAS1-

YFP

2µ / URA3 PGPD1 Gas1

pID130 CEN/LEU2 PRnq1 Rnq1 Kadnar et al.,

2010

p426GPD–

SWI1YFP

2µ /URA3 PGPD1 Swi1 Du and Li,

2014

pCUP1-RNQ1-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PCUP1 Rnq1-CFP

PGPD-Aβ-

GFP(URA3)

2μ/URA3 PGPD1 Aβ-GFP Rubel et al.,

2013

84

Продолжение таблицы 5

pGPD-Aβ-

YFP(URA3)

2μ/LEU2 PGPD1 Aβ-YFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP23-231-

GFP(URA3)

2μ/URA3 PGPD1 PrP23-231-GFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP23-231-

YFP(URA3)

2μ/LEU2 PGPD1 PrP23-231-YFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP23-231-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 PrP23-231-CFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP28-231-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 PrP28-231-CFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP90-231-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 PrP90-231-CFP Rubel et al.,

2013

PGPD-PrP90-231-

GFP(URA3)

2μ/URA3 PGPD1 PrP90-231-CFP Rubel et al.,

2013

pGPD-PrP110-231-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 PrP110-231-CFP Rubel et al.,

2013

pGPD-

YFP(URA3)

2μ/URA3 PGPD1 YFP Rubel et al.,

2013

pGPD-

YFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 YFP Rubel et al.,

2013

pGPD-

CFP(LEU2)

2μ/LEU2 PGPD1 CFP Rubel et al.,

2013

pGPD-

CFP(URA3)

2μ/URA3 PGPD1 CFP Rubel et al.,

2013

PMIT1-MIT1-GFP CEN/URA3 PMIT1 Mit1

85

Продолжение таблицы 5

pU-VTS1 2µ /URA3 PCUP1 Vts1 Nizhnikov et al.,

2012

pNR-ΔABF CEN/LEU2 PSUP35 Abf1 Нижников и

др., 2013

Примечание. CEN – центромерная плазмида, 2µ- многокопийная плазмида. Все

плазмиды в таблице содержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в E.

coli.

Таблица 6. Праймеры, использованные для плазмидного конструирования

Праймер Последовательность 5'-3'

FPrP23 CCCGGATCCTATATGTCTAAAAAGCGGCCAAAGCCTGGAGG

GT

FPrP28 GACTTTGGATCCTATATGCCTGGAGGGTGGAACAC

FPrP90 GTTCATGGATCCTATATGTCTCAAGGAGGGGGTACCCAT

FPrP110 GAATAGGATCCACAATGCATATGGCAGGGGCTGCG

FAβ GGGTCCACGGATCCTATATGTCTGATGCAGAATTCCGACAT

RAβ GTTATAAAGGATCCGACAACACCGCCCACCAT

RPrP231 CATCCGCGGGCTGGATCTTCTCCCGTCGTAATAGGCCT

FAβ GGGTCCACGGATCCTATATGTCTGATGCAGAATTCCGACAT

RAβ GTTATAAAGGATCCGACAACACCGCCCACCAT

FVTS1 GAGCGGATCCATGAAACATCCGTATGAGGAATTCC

RVTS1 CATCCCGCGGTGCAACGTCAAGACAATCAAC

FMIT1 CCGATCGATGCTTCGATTGGTAACAGTG

RMIT1 CGCCCGCGGTTGTGTAGTAGTTGAAGTGTT

FGAS1 GACTTAGGATCCTATATGTTGTTTAAATCCCTTTCA

RGAS1 CAAATACCGCGGTCCGGAACCCAAATCAACA

86

2.3. Методы дрожжевой генетики

В работе применяли стандартные генетические методы, используемые при

работе с дрожжами: метод рассева истощающим штрихом, метод селективных

сред для анализа ауксотрофности штаммов, метод отпечатков, методы тетрадного

анализа и случайной выборки аскоспор [Инге-Вечтомов, 1971, Захаров и др., 1984;

Rose et al., 1990]. Тип спаривания исследуемых штаммов определяли по

способности образовывать гибриды с тестерными штаммами. Для элиминации

прионоподобных детерминантов штаммы пассировали 3 раза на среде YAPD,

содержащей хлорид гуанидина (GuHCl). Затем дрожжи клонировали на среде

YAPD и перепечатывали на среду без аденина [Tuite et al., 1981]. Отбирали

клоны, утратившие способность к росту на среде без аденина. Супрессию

мутаций ade1-14 (UGA) trp1-289 (UAG) оценивали по способности к росту

штаммов на селективных средах без аденина и без триптофана, соответственно.

Потерю плазмид, содержащих маркер URA3, производили на селективной среде с

добавлением 5-FOA [Kaiser et al., 1994]. Селекцию клонов, устойчивых к

генетицину, проводили путем трехкратного пассирования на твердой среде YAPD

с добавлением G418 [Sambrook et al. 1989]. Анализ роста штаммов на среде MG и

MGly проводили путем трех последовательных перепечатываний штаммов с

инкубацией после каждого перепечатывания в течение суток при 300С. Тетрадный

анализ проводили под микроскопом производства “Carl Zeiss” (Германия),

используя микроманипулятор Ergaval Series 10 “Carl Zeiss” (Германия).

Для изучения возможности переноса цитоплазматических детерминантов

путѐм цитодукции использовали систему отбора цитодуктантов, основанную на

том, что донором цитоплазмы является штамм [rho+], а реципиентом – штамм

[rho0] (полная делеция митохондриальной ДНК), маркированный рецессивной

мутацией устойчивости к циклогексимиду (cyhr) и мутацией kar1-1,

препятствующей кариогамии.

87

Трансформацию дрожжей плазмидной ДНК проводили по стандартной

методике с использованием ацетата лития [Rose et al., 1990]. Для повышения

эффективности трансформации в каждую пробу добавляли по 6 мкг ДНК-

носителя (обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, “Fermentas” (Литва)).

Получение компетентных клеток E. coli и трансформацию бактерий проводили по

стандартной методике [Inoue et al., 1990].

Белковую трансформацию для передачи прионных факторов из клеток

одного штамма в другой проводили согласно методике, описанной ранее [Tanaka

and Weissman 2006; Patel and Liebman 2007]. Для отбора трансформантов,

получивших прион [PIN+], сферопласты [pin

-] трансформировали белковым

лизатом из штамма [pin-], а также плазмидой pmCUPNMsGFP, продуцирующей

химерный белок Sup35NM-GFP. Отбирали трансформантов, в которых белок

Sup35NM-GFP формировал цитологически детектируемые агрегаты, что

характерно для штаммов [PIN+]. В остальных случаях о передаче прионов судили

по фенотипическим изменениям исследуемых штаммов и по данным

биохимического анализа, позволяющего выявлять прионные агрегаты.

2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из исследуемых штаммов дрожжей с

использованием реагента “Trizol” (“Invitrogene”, США) по протоколу

производителя. Для исключения возможности контаминации ДНК, выделенную

тотальную РНК обрабатывали ДНК-зой I (“Fermentas”). Реакцию обратной

транскрипции проводили с использованием набора Super Script III (“Invitrogene”,

США) согласно протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию в

реальном времени (ПЦРРВ) проводили в амплификаторе АНК-16 (ИАнП РАН).

Последовательности праймеров и зондов TaqMan приведены в таблице 7. Анализ

независимо выделенных проб тотальной мРНК проводили при помощи метода 2-

Ct, предложенного Ливаком и Шмитгеном [Livak and Schmittgen, 2001]. В

88

данном методе используется параметр Ct, который показывает различия в

интенсивности сигналов между исследуемым и контрольным (ACT1) генами.

Затем, рассчитывают параметр Ct, который равен разности между параметрами

Ct в эксперименте и контроле. В заключение рассчитывается 2-C(t)

. Это

значение соответствует разнице в количестве мРНК между экспериментальной и

контрольной пробой. Результаты представлены с планками погрешностей,

соответствующими стандартному отклонению. Достоверность отличий оценивали

при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием

программного обеспечения “Statistica” версии 6.0 (“StatSoft”).

Таблица 7. Праймеры и зонды для ПЦРРВ

Название Последовательность 5’-3’

ACT1probe

ACT1f

ACT1r

SUP35probeF

RTSUP35R

RTSUP35F

(FAM*)CGTGCTGTCTTCCCATCTATCGTCGGT(BHQ1**)

TAACGGTTCTGGTATGTGTAAAG

TCATCACCAACGTAGGAGTCTT

(R6G***)CACCCTACTGATGCCTAACAAAACCGCT(BHQ1)

GTTTAACTTGCTCACCACACATA

TATTGCCGCTAAGATGAAGGAT

Примечания:

* (FAM) – флуорофор FAM.

** (BHQ1) – гаситель флуоресценции BHQ1.

*** (R6G) – флуорофор R6G.

2.5. Метод бицистронной люминесценции

Эффективность терминации трансляции оценивали с помощью метода

бицистронной люминесценции [по: Valouev et al., 2009]. Были использованы

плазмиды pDB691 (UGAC), pDB690 (CGAC), pDB720 (UAGC) и pDB721 (CAGC)

любезно предоставленные М.Д. Тер-Аванесяном. Эти плазмиды несут тандемно

89

расположенные гены, кодирующие люциферазы коралла Renilla и жука-

светлячка, разделенные стоп-кодоном UGA (pDB691), UAG (pDB720) или

значащим кодоном CGA (pDB690) и CAG (pDB721) (таблица 5) [Keeling et al.

2006; Kallmeyer et al. 2006]. Измерения проводили в люминометре с

использованием набора реактивов Dual Reporter Assay (“Promega”, США).

Эффективность считывания стоп-кодона как значащего вычисляли как частное

показаний активности люциферазы Renilla и люциферазы светлячка,

экспрессируемых с плазмиды, содержащей стоп-кодон, умноженное на частное

показаний активности люциферазы светлячка и люциферазы Renilla ,

экспрессируемых с плазмиды не содержащей стоп-кодон, и умноженное на 100

для выражения значения в процентах. Достоверность отличия от контроля

проверяли непараметрическим критерием Манна-Уитни с использованием

программного обеспечения “Statistica” версии 6.0 (“StatSoft”).

2.6. Флуоресцентная микроскопия

Анализ колокализации флуоресцентных белков, а также эксперименты по

измерению эффективности FRET, проводили при помощи лазерного

сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 «Leica Microsystems

GmBH» (Германия) и программного обеспечения «LAS AF Application Wizard

Version 1.7.0» «Leica Microsystems GmBH» (Германия), на базе центра

коллективного пользования СПбГУ «Хромас». Для детекции CFP или CFP

содержащих белков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 458нм, сигнал

детектировали в пределах 461-510 нм, для детекции YFP или YFP содержащих

белков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 514 нм, сигнал

детектировали в пределах 518-580 нм.

Небольшое количество дрожжевых клеток, после одного – двух дней

инкубации на твѐрдой или жидкой селективной среде, растворяли в 7 мкл

стерильной воды и равномерно распределяли по поверхности стекла. После

90

высыхания препарат заключали в раствор «VECTASHIELD Mounting Media»

фирмы «Vector Laboratories Inc.» (США) и накрывали покровным стеклом.

Излишки раствора удаляли с помощью фильтровальной бумаги, после чего края

покровного стекла заклеивали лаком для ногтей.

Для определения частот клеток с видимыми агрегатами белков, слитых с

последовательностями GFP, YFP или CFP, микроскоп переводили в режим

фазового контраста и случайным образом выбирали поле зрения. Клетки

фотографировали, используя видеокамеру и систему компьютерного анализа

изображения. Далее, микроскоп переводили в режим детекции флуорохромов

GFP, YFP или CFP и фотографировали то же поле зрения. Подсчѐт общего

количества клеток в выбранных полях зрения, а также подсчѐт клеток,

содержащих флуоресцентные агрегаты, проводили, используя файлы

компьютерных изображений.

Для определения частот колокализации белков, слитых с флуорохромами

YFP и CFP, подсчитывали количество клеток, содержащих оба флуорохрома, а

также количество клеток, в которых локализация агрегатов, маркированных YFP

и CFP совпадала. Частоты колокализации определяли как отношение количества

клеток с совпадающей локализацией агрегатов, маркированных YFP и CFP, к

количеству клеток, содержащих оба флуорохрома.

Дрожжевые вакуоли окрашивали с помощью красителя FM4-64 (Synapto-

Red) “Invitrogen” (США) согласно протоколу [Meriin et al., 2002]. Окраску

ядерной и митохондриальной ДНК проводили, используя краситель DAPI

“Invitrogen” (США). Окраску эндосом проводили с помощью красителя Liso-

tracker Blue “Invitrogen” (США) согласно протоколу и рекомендациям

производителя. Эндоплазматическую сеть (ЭПС) и аппарат Гольджи (АГ)

окрашивали с помощью красителя ER-Tracker™ Red “Invitrogen” (США) согласно

протоколу и рекомендациям производителя. Для детекции флуоресценции DAPI и

эндосом, окрашенных Liso-tracker Blue, использовали Ar UV лазер 405 и

91

детектировали сигнал в пределах 425-475 нм. Для детекция вакуолярных

мембран, окрашенных SynaptoRed, использовали лазеры DPSS 561, HeNe 633 и

594, сигнал детектировали в пределах 615-758 нм (максимум флуоресценции 680

нм).

Анализ физического взаимодействия белков Aβ-YFP и различных вариантов

PrP-CFP методом AB FRET (Acceptor photobleaching fluorescence resonance energy

transfer) проводили, используя метод фотовыжигания акцептора [по: Roszik et al.,

2013]. Эффективность передачи энергии и, соответственно, степень

взаимодействия белков, оценивали при сравнении интенсивности флуоресценции

донора в присутствии и в отсутствии акцептора.

Показатели FRET оценивали в зоне клетки, содержащей цитологически

детектируемый агрегат PrP-CFP, который колокализуется Aβ-YFP. В области

интереса (ROI) замеряли флуоресценцию донора (CFP) до и после

фотовыжигания акцептора. Для фотовыжигания акцептора использовали

аргоновый лазер с длиной волны 514 нм при максимальной интенсивности

светового потока. Время выжигания составляло 10 сек. Эффективность FRET

(FRETeff) рассчитывали по формуле: FRETeff=[Dpost−Dpre]/Dpost.

Dpost – это флуоресценция донора после фотовыжигания акцептора,

Dpre – флуоресценция донора до фотовыжигания акцептора.

2.7. Иммунохимический анализ белков.

2.7.1. Выделение белка из дрожжей

Выделение суммарного белка из дрожжей проводили методом разрушения

клеток стеклянными шариками. Дрожжевые культуры выращивали сутки на

жидкой среде YAPD, или на среде MD с необходимыми добавками. Клетки

переносили в центрифужные пробирки “Beckman” (45 мл). Добавляли

циклогексемид, до конечной концентрации 200 мкг/мл, и качали на шейкере в

92

течение 20 минут. После этого клетки осаждали в центрифуге “Beckman J2-21” (5

мин, 3000 об/мин) при +4° C. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в

1 мл циклогексемида (200 мкг/мл) и переносили в микропробирку (1,5 мл). После

этого клетки снова осаждали в центрифуге “Jouan CR3i” (Франция) (5 мин, 3000

об/мин) при +4° C. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в 0,5 мл

ледяного лизирующего буфера (50 мM Tris-HCI pH 7,5; 0,1 мM ЭДТА; 5 мM

MgCI2; 0,1 мM DTT; 100 мкг/мл РНКазаA; 10 мM KCI; 100 мкг/мл циклогексемид;

2 мM PMSF; 1 мM бензамидин; 2 мкг/мл пепстатин A; 10 мкг/мл; леупептин) или

буфера TNE (150 мM NaCl, 50мM Tris-HCl, pH7,5; 2мM ЭДТА; 2 мM PMSF; 1 мM

бензамидин; 2 мкг/мл пепстатин A; 10 мкг/мл леупептин). Полученную

суспензию центрифугировали (5 мин, 3000 об/мин) при 4ºС, супернатант сливали,

а полученный осадок ресуспендировали в равном объѐме лизирующего или TNE

буфера. Далее, для разрушения клеток к осадку добавляли равный объѐм отмытых

в азотной кислоте стеклянных шариков (glass beads) “Sigma” (США) и проводили

9 циклов дизрупции на шейкере по 20 сек, с перерывами не менее 1 мин на льду.

Клеточный лизат переносили в пробирки типа эппендорф, дважды отмыв

стеклянные шарики 150 мкл лизирующего буфера. Полученный клеточный лизат

центрифугировали (5 мин, 3000 об/мин) при 4ºС, супернатант делили на 2 части,

одну из которых использовали для анализа, а вторую – для оценки концентрации

белка.

Для денатурации белков перед нанесением их на гель или хранением (при -

70ºС) к пробам добавляли 1/3 объѐма 4-х кратного буфера для образцов (100 мM

Tris-HCI pH 6,8, 20% 2-меркаптоэтанол, 8% SDS, 0,2% бромфеноловый синий,

40% глицерин), после чего инкубировали 10 минут при 100ºС.

Перед анализом белков с помощью метода полуденатурирующего

электрофореза в агарозном геле к пробам добавляли 1/3 объѐма 4-х кратного

буфера для образцов 2 (50 мM Tris-HCI pH 6,8, 4% SDS, 0,2% бромфеноловый

синий, 20% глицерин) и инкубировали 7 минут при комнатной температуре.

93

2.7.2. Дифференциальное центрифугирование

Дифференциальное центрифугирование дрожжевых клеточных лизатов

[Patino et al., 1996; Chernoff et al., 2002] проводили при 12000 g 30 мин при 4ºС,

или в случае с анализом агрегатов Swi1-YFP при 75000 g 50 мин при 4ºС.

Надосадочную фракцию переносили в новую пробирку, а к осадку добавляли

равный объѐм лизирующего буфера.

2.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы К

Для анализа устойчивости белков к действию протеиназы К (ПК) из

дрожжей выделяли суммарный белок, используя TNE буфер (см. выше) без

добавления ингибиторов протеаз, или, чтобы уменьшить активность эндогенных

дрожжевых протеаз, добавляли ингибиторы, которые не влияют на работу ПК

(0,5х хемостатин и пепстатин А) [Ma and Lindquist, 1999]. Образцы с добавлением

ПК в различной концентрации, а также, контрольный образец без ПК,

инкубировали 30 минут при 37oC. Для ингибирования ПК в каждую пробу

добавляли PMSF до конечной концентрации 0,2 мМ. Далее, в пробы добавляли

1/3 объѐма 4х буфера для образцов 1 и инкубировали 10 минут при 100ºС, после

чего пробы наносили на гель или хранили при -70ºС.

2.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация

Денатурирующий белковый электрофорез проводили в 10% или 12%

полиакриламидном геле в камере “Mini-PROTEAN 3 Cell” “Bio-Rad” (Италия).

Белки переносили в трис-глициновом буфере (Laemmli, 1970) с помощью модуля

для переноса “Mini-PROTEAN 3 Cell” “Bio-Rad” (Италия) на нитроцеллюлозную

мембрану Hybond ECL или мембрану PVDF Hybond-P “Amersham”

94

(Великобритания). Для ориентировочного определения размера белков

использовали маркер молекулярного веса “RainBow” “Amersham”

(Великобритания).

Оценку устойчивости агрегатов белков к обработке 3% саркозинатом

натрия или 1% SDS проводили с помощью метода полуденатурирующего

белкового электрофореза в агарозном геле [Kryndushkin et al., 2003] с

модификациями [Bagriantsev et al., 2006]. Белковый лизат инкубировали 10 минут

с 3% саркозинатом натрия или 1% SDS при комнатной температуре.

Полуденатурирующий белковый электрофорез проводили как описано ранее

[Kushnirov et al., 2006] в 1,5% агарозном геле в буфере Лэмли [Laemmli, 1970],

содержащем 0,1% SDS при напряжѐнности электрического поля 5 В/см, в течение

3,5-4 часов. Электроперенос белков с агарозного геля на мембрану PVDF Hybond-

P мембрану проводили с помощью модуля для переноса “Mini-PROTEAN 3 Cell”

“Bio-Rad” (Италия) в буфере Лэмли, содержащем 0,1% SDS при напряженности

электрического поля 25V, в течение ночи.

Выравнивание количества суммарного белка для полуденатурирующего

электрофореза проводили согласно протоколу, предложенному Брэдфордом

(Bradford, 1976), и набору реактивов компании “BioRad” (США).

Иммунохимическую реакцию проводили с использованием первичных

антител, представленных в таблице 8, и вторичных моноклональных антител к

иммуноглобулинам мыши или к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными

с пероксидазой хрена фирмы “Amersham” (Великобритания). Вторичные антитела

детектировали с использованием наборов реактивов “ESL” и “ESL-advanced”

фирмы “Amersham” (Великобритания), согласно прилагающейся инструкции.

95

Таблица 8. Описание антител, использованных в работе

Антитела Источник Рекомендуемое

разведение

NAB228 - моноклональные

мышиные антитела против Aβ

Sigma-Aldrich,

США

1:5000

11E5 - моноклональные мышиные

антитела против GFP

“Invitrogen”, США 1:3000

Anti-GFP ИБХ - моноклональные

мышиные антитела против GFP

Любезно

предоставлены

Н.С. Егоровой,

ИБХ, Россия

1:10000

6H4 - моноклональные мышиные

антитела против PrP

“Prionics”,

Швейцария

1:6000

3F4 - моноклональные мышиные

антитела против PrP

Sigma-Aldrich,

США

1:10000

Ab-502604 - моноклональные

кроличьи антитела против PrP

Abcam, США 1:3000

Anti-Sup35C поликлональные

кроличьи антитела против домена С

белка Sup35 S. cerevisiae

Chabelskaya et

al., 2004

1:2000

SE-45-2 - поликлональные кроличьи

антитела против Sup45 S. cerevisiae

Kiktev et al., 2009 1:5000

T6074 - моноклональные мышиные

антитела против Tub1

Sigma-Aldrich,

США

1:3000

96

2.8. Протеомный метод выявления и идентификации амилоидов

Общая схема протеомного метода выявления и идентификации амилоидов,

включающая два варианта разделения и идентификации белков приведена на

рисунке 9.

Рисунок 9. Схема, отражающая два варианта метода протеомного скрининга и

идентификации белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты. А -

Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке 1% SDS или 3%

саркозинатом натрия. Б – разделение белков методом двумерного электофореза и

и их идентификация с помощью масс-спектрометрии. В – разделение и

идентификация белков методом HPLC-MALDI.

97

2.8.1. Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке

ионными детергентами

Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными

детергентами проводили в соответствии методикой описанной ранее [Kushnorov

et al., 2006], и нашими существенными модификациями [Nizhnikov et al., 2014].

1. Культуру дрожжей растили сутки в 250 мл среды YPD.

2. Клетки осаждали при 2500g, 10 мин., 4оС.

3. Осадок (примерно 4 – 5 грамм клеток) суспендировали в 5мл буфера (50 mM

Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT).

4. Добавляли к суспензии равный объѐм стеклянных бус (0.4 mm GLC, Merck-

BDH) и ставили на лѐд. Клетки разрушали на дезинтеграторе “Fisher Scientific”

шесть циклов по одной минуте с перерывом в одну минуту между каждым

циколом для охлаждения проб на льду.

5. Пробы центрифугировали при 2500g, 10мин. 4oC, осадок удаляли,

надосадочную фракцию переносили в другую пробирку и добавляли 5мг РНК-

азы.

6. Инкубировали белковый лизат в течение 30 мин. при 30°С.

7. Белковый лизат наслаивали на 2мл. сахарозной подушки (25% сахароза в

буфере TBS).

8. Пробы ультрацентрифугировали 2ч., 223 600g при 4oC в роторе Ti75.

9. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок тщательно суспендировали в 1 мл

буфера ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM

DTT), доводили объѐм до 5.4 мл. и добавляли 0.6мл 10% раствора SDS (конечная

концентрация 1% SDS). Альтернативно, в других экспериментах вместо 1% SDS

98

использовали саркозинат натрия в конечной концентрации 3%. Аккуратно

перемешивали, не допуская образования пены.

10. Пробы наслаивали на 2 мл подушки (25% сахароза в буфере TBS). Пробирки

устанавливали в ротор Ti75 ультацентрифуги и включали режим «отложенный

старт». Таким образом, пробы инкубировались 4-6 часов при температуре 18оС.

11. Центрифугировали пробы 8ч., 223 600g при 4oC в пробирках для ротора Ti75.

12. Полученный осадок детергент-устойчивых белковых агрегатов

суспендировали в 8мл воды и вновь центрифугировали при тех же условиях.

13. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC (при необходимости

дольше).

14. В случае разделения белков с помощью двумерного электрофореза осадок

растворяли в хаотропных агентах (смотри раздел «Двумерный разностный

электрофорез белков»). В случае использования методики “HPLC – MALDI”

осадок растворяли в 100 мкл 96%муравьиной кислоты. Если осадок не

растворялся, увеличивали объем муравьиной кислоты. Инкубировали 30 мин при

комнатной температуре.

15. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC.

16. Осадок суспендировали в 90 мкл воды, добавляли 30 мкл буфера (100mM Tris-

HCL-6.8, 20% меркаптоэтанол, 10% SDS, 0.2% бромфеноловый синий, 40%

глицерин) и кипятили белки 10мин при 100оС.

2.8.2. Разделение и идентификация белков

2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE)

Белки растворяли в регидратирующем буфере (7М мочевина, 2М

тиомочевина, 4% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат

99

(ХАМПс), 25 мМ Трис, рН 8,5) и коньюгировали с флурохромами Cy5 (опытный

образец) или Cy3 (контрольный образец) (Luminoprobe, BioDye) в соотношении

400 пмоль флуорохрома на 50 мкг белка. Концентрацию белка оценивали по

величине поглощения при длине волны 280 нм. Образцы инкубировали с

флуорохромами на льду в течение 30 мин. в темноте. Реакцию останавливали

добавлением 10 мкмоль L-лизина с последующей инкубацией в течение 10 мин.

при тех же условиях, затем белки центрифугировали 2500g, 10 мин. Растворѐнные

белки, меченные разными флуорохромами, объединяли и загружали в стрип с

градиентом рН 3-10 (7 см, BioRad, США). Процесс загрузки был сопряжен с

пассивной регидратацией стрипа (16-18 ч. при комнатной температуре в темноте).

Разделение первого направления проводили в ячейке для изоэлектрического

фокусирования (Protean IEF Cell, BioRad), следуя рекомендациям производителя

(10000 Вольт-часов, финальное напряжение 4000 В, 20°C, ток не более 25

мА/стрип).

Перед разделением второго направления стрипы с фокусированными

образцами последовательно инкубировали по 15 мин. в эквилибрирующих

буферах: первом (6 M мочевина, 2% додецил-сульфат натрия, 20% глицерин, 2%

дитиотреитол, 0,375 M Трис, pH 8,8) и втором, где дитиотреитол заменен на 2,5%

иодоацетамид. Электрофорез второго направления проводили в ячейке

MiniProtean TetraCell (BioRad) в 15% полиакриламидном геле в трис-глициновой

буферной системе (tris/glycine/SDS buffer, BioRad) при напряжении 200 В. Для

визуализации электрофоретической картины использовали лазерный сканнер GE

Typhoon FLA 9500. Наложение электрофореграмм проводили в программном

обеспечении ImageJ версии 1.48v (Wayne Rasband, National Institute of Health,

USA, http://imagej.nih.gov.ij). Гель окрашивали кумасси G250 (Coomassie Brilliant

Blue R250, BioRad). Пятна окрашенные кумасси G250 и соответствующие

сигналам, выявленным при лазерном сканирования вырезали из геля.

100

2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE

Идентификацию белков, вырезанных из SDS-PAGE геля, проводили при

помощи матрично-ассоциированной лазерной дисорбционно-ионной

времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI) на приборе Ultraflextrime (Bruker

Daltonics). Кусочки геля отмывали деионизованной водой и 40% ацетонитрилом в

50 мМ бикарбонате аммония. Далее проводили дегидратацию в 100%

ацетонитриле с дополнительным высушиванием на вакуумном концентраторе

(Labconco). К высушенным фрагментам геля добавляли 10 мМ раствор

дитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали смесь (45 мин.,

56°С). Смесь охлаждали, удаляли жидкость и добавляли раствор 55 мМ

йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 30 мин. при

комнатной температуре в темноте, далее добавляли 1 мкл раствора дитиотрейтола

для инактивации йодацетамида и высушивали пробы на вакуумном

концентраторе (Labconco). К высушенным кусочкам геля добавляли 5 мкл

раствора трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Трипсин инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной

кислоты, затем экстрагировали пептиды из геля 2%, 25% и 50% раствором

йодацетамида с 50 мМ бикарбонатом аммония, проводя три последовательные

инкубации в ультразвуковой бане по 10 минут. Далее пробы осаждали в течение

30 мин. (20000 g, 4°С) и высушивали на вакуумном концентраторе (Labconco).

Далее к высушенным образцам добавляли 5 мкл 0,1% раствора трифторуксусной

кислоты и наносили их на 384-луночную подложку MTP AnchorChip™ 800/384

(Bruker Daltonics). В качестве матрицы была использована α-циано-4-

гидроксикоричная кислота. При анализе пиков было использовано программное

обеспечение flexAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Белки идентифицировали при

помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2 (Matrix Science,

http://www.matrixscience.com) с использованием базы данных NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве допустимых модификаций были

установлены карбоксиметилирование цистеина и частичное окисление

101

метионина. Также в качестве допустимого было указано два пропущенных сайта

трипсинолиза.

Показатель «счѐт масс-спектрометрии», отражающий достоверность

идентификации белка, прибор автоматически определяет по адаптированному

алгоритму «MOWSE», представленному в базе данных “Mascot database”

(http://www.matrixscience.com/help/interpretation_help.html#SCORING). Показатель

«счѐт масс-спектрометрии» отражает:

1. количество пептидов в последовательности идентифицированного белка,

масса которых совпадает с массой пептидов, выявленных в анализе;

2. точность совпадения массы выявленных пептидов с теоретически

ожидаемым показателем.

Счѐт масс-спектрометрии существенно повышает выявление уникальных

пептидов, характерных только для одного белка в исследуемом протеоме. Счѐт

превышающий 50 условных единиц как правило свидетельствует о достоверной

идентификации белка на 5% уровне значимости (p<0.05).

2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией

(HPLC-MALDI)

Удаление детергентов и обессоливание проб проводили при помощи

колонок HiPPR Detergent Removal column (Thermo Scientific) и Zeba Desalting

column (Thermo Scientific), соответственно, согласно протоколу производителя. К

полученным пробам (50 мкл, концентрация тотального белка 0,2 мг/мл)

добавляли 1 мкл свежеприготовленного раствора 50 мМ дитиотрейтола в 50 мМ

бикарбонате аммония, инкубировали 15 минут при 50°С, после чего добавляли 1

мкл 100 мМ раствора йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония и

инкубировали пробу в течение 15 мин., 20°С в темноте. Далее к пробам добавляли

1 мкл дитиотрейтола для инактивации йодацетамида, 5 мкл трипсина (10 нг/мкл,

Sigma) и проводили инкубацию при 37°С в течение ночи. Трипсин

102

инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты,

после чего проводили центрифугирование в течение 30 мин. (20000 g, 4°С).

Полученные смеси пептидов наносили (1 мкл) на обратнофазовую колонку для

HPLC Acclaim™ PepMap 300 (150 мм × 75 мкм, размер частиц 5 мкм, Thermo

Scientific) и разделяли в градиенте ацетонитрила (2-90%) в течение 45 мин. на

высокоэффективном нанопоточном жидкостном хроматографе UltiMate 3000

UHPLC+ RSLCnano (Dionex). Фракции пептидов наносили на 384-луночную

подложку MTP AnchorChip™ 800/384 (Bruker Daltonics) с помощью

автоматического коллектора фракций «Proteineer fc II» (Bruker Daltonics) через

каждые 10 с. В качестве матрицы была использована α-циано-4-гидроксикоричная

кислота. В качестве стандартов использовали Peptide calibration standard II

8222570 (Bruker Daltonics). Идентификацию проводили на

приборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Для каждой фракции определяли MS-

спектр. Полученные спектры анализируются при помощи программного

обеспечения WARP-LC с учетом того, что они получены в результате жидкостной

хроматографии. Программа определяет набор уникальных пептидов,

характеризующихся задержкой, зарядом и молекулярной массой. Для этих

пептидов проводили MS/MS в тех фракциях, где концентрация (интенсивность

пика) этих пептидов максимальна. Соответствие полученных спектров белкам

определялось при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2.

Показатель «счѐт масс-спектрометрии», отражающий достоверность

идентификации белка, определялся как описано в разделе 2.8.2.2.

2.9. Статистические методы

Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение

выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили при

помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0. (“StatSoft

Inc.”, США).

103

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Прионный фактор [NSI+]

3.1.1. Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического

детерминанта [NSI+]

Эпигенетичесикй детерминант, вызывающий нонсенс-супрессию, был выявлен

при работе с дрожжевым штаммом 1-D931 (таблица 4), маркированным нонсенс-

мутациями ade1-14 и trp1-289 и содержащем плазмиду pU-A-SUP35MC на фоне

делеции хромосомной копии гена SUP35. Гибридный ген A-SUP35MC содержит

последовательность, кодирующую амилоидный пептид бета человека, слитую в

рамке с последовательностью, кодирующей домены М и С белка Sup35. Ген A-

SUP35MC находится под контролем промотора CUP1, который активируется

добавлением ионов меди в питательную среду. Эффективность терминации

трансляции оценивали в соответствии с темпами роста штамма на среде без

аденина и без триптофана, что отражает частоты ошибочного прочтения стоп-

кодонов ade1-14(UGA) или trp1-289 (UAA), как значащих (рис.10 А и Б).

Как видно из результатов, представленных на рисунке 10А, темпы роста

штамма на среде без аденина закономерно снижаются при увеличении

концентрации ионов меди в питательной среде, и, соответственно, с увеличением

уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC. Относительное количество

белка A-Sup35MC в клетках штамма 1-D931 при изменении концентрации ионов

меди в среде оценивали методом Вестерн-блот гибридизации с использованием

моноклональных антител 4G8, специфичных к пептиду Аβ (рис. 10А). При

добавлении в среду 150 µМ сульфата меди штамм 1-D931 на среде без аденина и

без триптофана не растѐт (рис.10А и Б).

104

Рисунок 10. Характеристика нонсенс-супрессорного фенотипа штамма 1-D931 и

его деривата 1-1-D931, которые продуцируют гибридный белок A-Sup35MC. А-

Рост штамма 1-D931 на среде без аденина с добавлением сульфата меди в

различной концентрации. Результаты Вестерн-блот гибридизации с

использованием антител 4G8 отражают изменение уровня продукции белка A-

Sup35MC. Б – Рост штамма 1-1-D931 на средах без аденина и без триптофана с

добавлением 150 µМ сульфата меди до и после пассирования клеток на среде с

GuHCl. В – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC в клетках

штаммов 1-D931 и 1-1-D931 методом Вестерн-блот гибридизации. Выравнивание

количества тотального белка в обоих случая (1А и 1В) проводилось с помощью

метода Бредфорда [Bradford, 1976].

В результате отбора индивидуальных колоний мы выявили один клон,

обозначенный 1-1-D931, демонстрирующий нонсенс-супрессорный фенотип при

добавлении в питательную среду даже 150 µМ сульфата меди (рис 10Б).

Супрессия проявления нонсенс-мутаций ade1-14(UGA) и trp1-289 (UAG) не была

связана с изменением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC (рис

10В). Нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследовался в митозе и

105

элиминировался в результате пассирования клеток исследуемого штамма на среде

с 5mM хлоридом гуанидина (GuHCl) у 124 из 128 клеток (97%) (рис 10Б).

Напомним, что GuHCl инактивирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 и

вызывает элиминацию большинства известных дрожжевых прионов [Tuite et al.,

1981;. Derkatch et al., 1997; Wickner, 1994]. На основании этих фактов мы

заключили, что нонсенс-супрессия в штамме 1-1-D931 детерминируется

эпигенетическим фактором, который мы назвали [NSI+] (Nonsense Suppression

Iducer). Штаммы, не содержащие этот фактор, были обозначены [nsi-].

Анализ роста штаммов на средах с неферментируемыми источниками

углерода показал, что наличие фактора [NSI+] ингибирует рост штаммов на

средах, содержащих в качестве источника углерода галактозу или глицерин (рис.

11). Элиминация фактора [NSI+] в результате пассирования штамма на среде с

GuHCl приводит к восстановлению нормальных темпов роста дрожжей на средах

с неферментируемыми источниками углерода (рис. 11).

Рисунок 11. Фактор [NSI+] вызывает нонсенс-супрессию и подавление роста на

средах с неферментируемыми источниками углерода. Рост штаммов 1-1-D931

[NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-] на средах MD без добавления аденина и триптофана, а

также на средах с галактозой (MG) и глицерином (MGly) в качестве источника

углерода. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC во все используемые

среды добавляли 150 μМ сульфата меди. Фотографии сделаны на третий день

инкубации дрожжей на селективных средах при 30oC.

106

3.1.2. Aβ-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]

Пептид Аβ человека как в организме млекопитающих, так и при продукции

в дрожжевых клетках, может формировать агрегаты [Bagriantsev and Liebman,

2006; Porzoor and Macreadie, 2013]. Для проверки гипотезы, согласно которой

фактор [NSI+] возник в результате прионной конверсии гибридного белка A-

Sup35MC, мы провели сравнительный анализ агрегации этого белка в штаммах

[NSI+] и [nsi

-], используя метод дифференциального центрифугирования и

Вестерн-блот гибридизации. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC здесь

и во всех дальнейших экспериментах во все используемые среды добавляли 150

μМ сульфата меди. Как в штамме [NSI+], так и в штамме [nsi

-] большая доля белка

A-Sup35MC представлена в растворимой надосадочной фракции (рис.12 А).

Рисунок 12. Гибридный белок Aβ-Sup35MC не является детерминантом фактора

[NSI+]. А – Сравнительный анализ количества белка Aβ-Sup35MC методом

Вестерн-блот гибридизации с использованием антител “Anti-Sup35C”,

распознающих последовательность Sup35MC. Для выравнивания количества

тотального белка использовался метод Бредфорда. Б – Рост дрожжей на среде без

аденина в эксперименте с последовательной заменой плазмид в штамме [NSI+].

Плазмиду pL-Ab-SUP35MC замещали на плазмиду pYCH-U2, а затем проводили

обратную замену плазмид.

107

Распределение белка между надосадочной и осадочной фракциями не

различается. Таким образом, полученные результаты не подтверждают гипотезу о

том, что возникновение фактора [NSI+] связано с прионной агрегацией A-

Sup35MC.

Как известно, делеция гена, кодирующего прионформирующий белок,

неизбежно приводит к элиминации приона [Wickner et al., 1999]. Замена

плазмиды pL-Aβ-Sup35MC на центромерную плазмиду pYCH-U2, содержащую

ген SUP35 под контролем собственного промотора, вызвала потерю

супрессорного фенотипа (рис. 12Б), однако обратная замена плазмиды pYCH-U2

на pL-Aβ-Sup35MC привела к полному восстановлению супрессорного фенотипа

(рис. 12Б). Данные, полученные в этом эксперименте доказывают, что потеря

гена, кодирующего белок Aβ-Sup35MC лишь маскирует проявление фактора

[NSI+], но не вызывает его элиминации. На основании полученных результатов

можно заключить, что гибридный белок Aβ-Sup35MC не является детерминантом

фактора [NSI+].

3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции

Поскольку нонсенс-супрессию наблюдали в штаммах [NSI+] лишь на фоне

продукции Aβ-Sup35MC, мы предположили, что гибридный белок даже при

сверхпродукции хуже выполняет функцию фактора терминации трансляции, чем

нативный белок Sup35. Для проверки этого предположения мы заменили в

штаммах 4-1-1-D931[NSI+] и 1-1-D931[NSI

+] плазмиды, кодирующие белок Aβ-

Sup35MC, на следующие конструкции:

1. Плазмида pFL38-SUP35P, кодирующая ген SUP35 P. methanolica;

2. Плазмида pNR-ΔABF1, содержащая ген SUP35 с мутацией в промоторной

области, снижающей уровень экспрессии;

108

3. Плазмида pASB2, содержащая ген SUP35 под контролем собственного

промотора.

На фоне продукции белка Sup35 P. methanolica, для штамма 3-4-1-1-D931

[NSI+] характерна нонсенс-супрессия (рис. 13А), которая элиминируется на среде

с GuHCl. По всей вероятности, этот белок, как и Aβ-Sup35MC, недостаточно

эффективно выполняет функцию фактора терминации трансляции, а фактор

[NSI+] является провокационным фоном, позволяющим выявлять снижение

эффективности терминации трансляции на фенотипическом уровне.

Штамм [NSI+], содержащий плазмиду pNR-ΔABF1, демонстрирует сильный

рост на среде без аденина (рис. 13А). После пассирования клеток на среде с

GuHCl интенсивность роста на среде без аденина заметно снижается. С помощью

ПЦР в реальном времени мы показали, что уровень экспрессии гена SUP35 в

штамме, содержащем плазмиду pNR-ΔABF1 с мутацией в промоторе SUP35,

достоверно ниже (p ≤ 0.01), чем в штамме, несущем плазмиду pASB2 (рис 13Б).

Рисунок 13. А- Анализ нонсенс-супрессии в дериватах штамма [NSI+], в которых

гибридный ген Aβ-SUP35MC замещѐн на: 1) ген SUP35 P.methanolica (pFL38-

SUP35P); 2) ген SUP35 S. cerevisiae с делецией локуса ABF в промоторной

области; 3) интактный ген SUP35 S. cerevisiae. Б - сравнение количества мРНК

SUP35 в штаммах [nsi–], несущих плазмиды pASB2 и pNRΔABF1. Данные

представлены как ΔСt ± стандартное отклонение.

109

Значение параметров ΔСt (см. «Материалы и методы») соответствует 2.12 ± 0.431

для pASB2 и –0.59 ± 0.381 для pNRΔABF1 (рис. 13Б). Таким образом, уровень

экспрессии гена SUP35 в штамме с плазмидой pNRΔABF1 примерно в шесть раз

ниже, чем в штамме, несущем плазмиду pASB2. Полученные данные

свидетельствуют о том, что супрессия, опосредованная [NSI+], может

наблюдаться как на фоне аминокислотных замен в белке, выполняющем роль

фактора eRF3, так и при снижении уровня экспрессии соответствующего гена.

Рисунок 14. Сравнительный анализ частот считывания стоп-кодонов UGA и UAG

как значащих в штаммах [NSI+] и [nsi

-].

Нонсенс-супрессия, опосредованная фактором [NSI+], может являться

следствием снижения эффективности терминации трансляции, или вызываться

иными причинами – например, изменением регуляции биохимического пути

деградации нонсенс-содержащих мРНК. Для выяснения возможной взаимосвязи

проявления [NSI+] с регуляцией терминации трансляции изогенные штаммы 2-1-

1-D931 [NSI+] и 1-2-1-1-D931 [nsi

-] были трансформированы плазмидами pDB691

или pDB721, в составе которых два гена, кодирующих две различные

люциферазы, разделены стоп-кодонами UGA и UAG, соответственно.

110

Исследуемые штаммы трансформировали также плазмидами pDB690 или

pDB720, в которых на месте стоп-кодонов расположены значащие триплеты.

Показатель, отражающий сравнительную активность двух люцифераз в

штаммах [NSI+] и [nsi

-], вычисляли как указано в разделе «Материалы и методы».

Полученные данные показали, что [NSI+] вызывает статистически достоверное

увеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG как значащих (рис.14).

Таким образом, детерминант [NSI+] вызывает снижение эффективности

терминации трансляции, и этот эффект может проявляться в виде омнипотентной

нонсенс-супрессии на фоне мутаций в гене SUP35, не имеющих собственного

проявления.

3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+]

[NSI+], как и большинство дрожжевых прионов, эффективно элиминируется

при пассировании клеток на среде с GuHCl. Эти данные позволили предположить,

что фактор [NSI+] имеет прионную природу. GuHCl -зависимая элиминация

дрожжевых прионов связана с тем, что это вещество ингибирует АТФ-азную

активность шаперона Hsp104 [Ferreira et al., 2001], который необходим для

расщепления (т.е. размножения) прионных агрегатов. Мы оценили влияние

делеции и сверхэкспрессии HSP104 на передачу фактора [NSI+] в ряду клеточных

поколений. Все клоны штамма 3-1-1-D931 (дериват 1-1-D931 [NSI+]) с делецией

HSP104) утратили супрессорный фенотип (рис. 15). Известно, что

сверхэкспрессия HSP104 вызывает элиминацию [PSI+][Chernoff et al., 1995], но не

влияет на поддержание всех остальных дрожжевых прионов. Штамм 1-1-D931

[NSI+] трансформировали многокопийной плазмидой pLH105, содержащей ген

HSP104 под контролем собственного промотора. Трансформантов отбирали на

селективной среде без лейцина, трижды переносили методом «отпечатков» на

такую же среду и затем перепечатывали на среду без аденина. Как показано на

111

рисунке 15, сверхэкспрессия HSP104 не вызывает элиминацию супрессорного

фенотипа в штамме [NSI+] (рис. 15).

Рисунок 15. Влияние делеции и сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание и

проявление фактора [NSI+]. Дрожжи фотографировали на третий день роста на

среде без аденина.

Поскольку у дрожжей прионизация вызывает наследуемое изменение формы

белка, прионные факторы обладают общими характеристиками [по: Wickner et al.,

1999] с изменениями:

1. могут возникать de novo после элиминации;

2. наследуются как нехромосомные доминантные факторы;

3. демонстрируют инфекционность (передаются цитодукцией и в результате

белковой трансформации);

4. наследование большинства дрожжевых прионов зависит от продукции

шаперона Hsp104.

Фактор [NSI+] демонстрирует сходство с дрожжевыми прионами – он

элиминируется при пассировании на среде с GuHCl и для его поддержания

требуется продукция шаперона Hsp104. Мы проверили соответствие фактора

[NSI+] всем остальным характеристикам дрожжевых прионов.

112

Фактор [NSI+] исходно был выявлен в штамме 1-1-D931, который содержит

прион [PIN+] (прионная форма белка Rnq1). Прион [PIN

+] является затравкой,

необходимой для возникновения другого приона [PSI+], а также для агрегации

некоторых амилоидных белков [Derkatch et al., 1997; Vitrenko et al., 2007; Du and

Li 2014]. С учѐтом этих фактов, мы оценивали частоты спонтанного

возникновения [NSI+] в изогенных штаммах 1-4-1-1-D931 [pin

-] и 2-4-1-1D931

[PIN+]. Штамм 1-4-1-1-D931 был получен за счѐт пассирования клеток 4-1-1-D931

[NSI+] на среде с GuHCl. Для получения штамма 2-4-1-1D931, содержащего

фактор [PIN+], сферопласты штамма 1-4-1-1-D931 [pin

-] трансформировали

белковым экстрактом из штамма BY4742 [PIN+] и плазмидой pmCUPNMsGFP,

продуцирующей белок Sup35NM-GFP. Для дальнейшей работы с помощью

флуоресцентной микроскопии отбирали трансформантов, содержащих агрегаты

белка Sup35NM-GFP, которые выявляются лишь в клетках, имеющих фактор

[PIN+]. Возникновение отдельных клонов, демонстрирующих фенотип [NSI

+]

(рост на среде без аденина, который элиминируется пассированием клеток на

среде с GuHCl), было отмечено с частотой 5 x 10-6

лишь в штамме 2-4-1-1D931

[PIN+], но не в изогенном ему штамме 1-4-1-1-D931 [pin

-] (табл. 9).

Таблица 9. Спонтанное возникновение de novo фактора [NSI+]

Штамм

Кол-во

клеток

Количество клонов Ade+

Не

стабильные

в митозе

Стабильные в митозе Всего

Не лечатся

GuHCl лечатся

GuHCl

([NSI+])

2-4-1-1-

D931

2x104 2 1 0 88

[nsi-][PIN

+] 2x10

5 7 12 3

2x106 25 30 8

113

1-4-1-1-

D931

2x104 0 2 0 66

[nsi-][pin

-] 2x10

5 4 14 0

2x106 11 35 0

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+]

способен возникать повторно после элиминации. Мы не можем сделать вывод о

возможном влиянии приона [PIN+] на спонтанное возникновение фактора [NSI

+],

поскольку различия не являются статистически достоверными.

Для анализа характера наследования фактора [NSI+] штамм 1-1-D931[NSI

+] a-

типа спаривания, содержащий плазмиду pU-Aβ-Sup35MC, скрещивали с

изогенным ему штаммом 2-1-1-1-D931 [nsi-] α-типа спаривания, содержащим

плазмиду pL-Aβ-Sup35MC. Диплоидов отбирали на среде –Leu-Ura.

Диплоидный статус отдельных клонов проверяли контрольным скрещиванием

с тестерами типа спаривания. Все отобранные диплоиды демонстрировали

нонсенс-супрессорный фенотип, изгоняемый при трѐхкратном пассировании

клеток на среде с 5mM GuHCl (рис. 16). Таким образом, [NSI+] демонстрирует

доминантное проявление.

114

Рисунок 16. Рост на среде без аденина диплоидных штаммов, полученных в

результате скрещивания гаплоидов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi

-], до и после

пассирования на среде с GuHCl.

При споруляции диплоидных клонов в тетрадах выявлялось лишь от одной до

трѐх жизнеспособных аскоспор. В связи с этим наследование фактора [NSI+] у

мейотических сегрегантов анализировали с помощью случайной выборки

аскоспор. В потомстве всех проанализированных диплоидных клонов

подавляющее большинство гаплоидных сегрегантов (237 клонов)

демонстрировали супрессорный фенотип (Ade+) и лишь 9 клонов не росли на

среде без аденина (табл. 10).

Таблица 10. Фенотип гаплоидных сегрегантов диплоидных клонов, полученных в

результате скрещивания штаммов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi

-]

№

диплоидного

клона

Кол-во

гаплоидных

сегрегантов

Кол-во

гаплоидных

сегрегантов

Расщепление

по полу

115

Ade+ Ade

–

1 27 3 15 a: 15

2 29 0 14 a: 15

3 29 2 18 a: 13

4 27 2 11 a: 18

6 31 1 17 a: 15

7 32 1 16 a: 17

8 29 0 17 a: 12

9 33 0 19 a: 14

Всего: 237 9 127 а: 119α

Клоны утрачивали способность к росту на среде без аденина после

пассирования на среде с GuHCl (результаты не представлены). Расщепление по

типу спаривания статистически достоверно не отличалось от 1:1 (χ2

< 3,84). В

контроле при скрещивании изогенных гаплоидных штаммов [nsi-] были получены

диплоидные клоны, фенотипа Ade-. Все гаплоидные сегреганты (150 клонов),

полученные от таких диплоидов, также имели фенотип Ade-.

Дефекты споруляции исследуемых штаммов могут быть вызваны как наличием

фактора [NSI+], так и тем, что жизненно-важный ген Aβ-SUP35MC не

интегрирован в хромосому, а представлен на центромерной плазмиде. Для

проведения тетрадного анализа были получены штаммы 1-D934 [NSI+] и 1-2-D934

[nsi-], содержащие интегрированную в хромосому кассету, включающую ген

SUP35P.m. и маркерный ген LEU2. В результате скрещивания этих штаммов был

получен диплоид D935 [NSI+], демонстрирующий GuHCl-изгоняемый

116

супрессорный фенотип. Тетрады на среде для споруляции выявлялись лишь на

десятый день, и большинство аскоспор оказались нежизнеспособными. На

основании этих данных можно предположить, что фактор [NSI+] вызывает

дефекты споруляции. Во всех двенадцати тетрадах, которые образовали четыре

жизнеспособные аскоспоры, наблюдали соотношение 4Ade+:0Ade-.

Супрессорный фенотип элиминировался при пассировании гаплоидных

сегрегантов на среде с GuHCl. В качестве контроля использовался диплоидный

штамм D936 [nsi-], полученный в результате пассирования штамма D935 на среде

с GuHCl и утративший супрессорный фенотип. Во всех тетрадах, полученных в

результате споруляции контрольного диплоидного штамма D936 [nsi-],

наблюдалось соотношение 0Ade+:4Ade-. Таким образом, фактор [NSI+], подобно

дрожжевым прионам, имеет доминантное проявление и характеризуется

неменделевским наследованием в мейозе.

Инфекционность фактора [NSI+] оценивали с помощью цитодукции и метода

белковой трансформации. Цитодукцией называется процесс слияния цитоплазмы

двух клеток разного типа спаривания с последующей абортивной утратой ядра

одной из клеток [Zakharov and Yarovoy, 1977]. Цитодукция происходит с высокой

частотой, если один из скрещивающихся штаммов маркирован мутацией kar1-1,

препятствующей кариогамии. Для оценки инфекционности фактора [NSI+]

донорный штамм 1-1-D931 [NSI+] скрещивали с реципиентным штаммом 1-D932,

который помимо kar1-1 маркирован мутацией cyhR, вызывающей устойчивость к

циклогексимиду, и не содержит митохондрий. Цитодуктанты получают

митохондрии донорного штамма, что позволяет селектировать их на среде с

неферментируемым источником углерода. Супрессорным фенотипом, который

элиминируется при пассировании на среде с GuHCl, обладали 11 и 16%

цитодуктантов в двух независимых выборках (таблица 11). Таким образом, [NSI+]

демонстрирует цитоплазматическую инфекционность, то есть передаѐтся от

донорного штамма реципиентному при слиянии цитоплазмы.

117

Таблица 11. Передача фактора [NSI+] при цитодукции

Донор №

Эксперимента

Кол-во цитодуктантов % цитидуктантов

[NSI+] Всего Из них Ade

+

([NSI+])

1-1-D931

[NSI+]

1 96 14 16% ± 3.6

2 54 6 11% ± 4.3

1-1-1-D931

[nsi-]

1 108 0 0% + 0.3

Примечание: После знака «±» приведена ошибка среднего.

Для подтверждения инфекционных свойств [NSI+] мы трансформировали

сферопласты штамма 1-D933 [nsi-] вектором pRS315 и белковым экстрактом из

штамма 4-1-1-D931 [NSI+]. Вектор pRS315 использовали для повышения

эффективности отбора сферопластов, компетентных к трансформации.

Трансформантов отбирали на селективной среде и проверяли тип спаривания. В

трѐх независимых экспериментах клоны, демонстрирующие супрессию, которая

элиминируется на среде с GuHCl, выявлялись с частотами от 5 до 7% (таблица

12). В контрольном эксперименте, где белковый экстракт был выделен из штамма

[nsi-], трансформанты, демонстрирующие нонсенс-супрессию не выявлялись.

Интересно отметить, что цитоплазматические прионные детерминанты,

такие как [PSI+] и [URE3], передаются цитодукцией с частотой близкой к 100%,

тогда как частоты передачи фактора [NSI+] значительно ниже. Вместе с тем, при

помощи метода белковой трансформации детерминант [NSI+] передаѐтся так же

эффективно, как прион [PIN+] [Patel and Liebman, 2007]. Невысокие частоты

цитодукции характерны для факторов, белки-детерминанты которых имеют

преимущественно ядерную локализацию [Du et al. 2008; Patel et al., 2009]. Эти

118

данные позволяют предположить, что детерминант фактора [NSI+] локализован в

ядре.

Таблица 12. Передача фактора [NSI+] методом белковой трансформации

Штамм-донор Штамм-

реципиент

№ эксп-

еримента

Отобрано

транс-

формантов

Количество

транс-

формантов

[NSI+]

Процент транс-

формантов

[NSI+]

4-1-1-D931

[NSI+]

1-D933

[nsi-]

1 100 5 5,0 ± 2,2

2 100 7 7,0 ± 2,6

3 100 6 6,0 ± 2,4

1-4-1-1-

D931 [nsi-]

1-D933

[nsi-]

1 100 0 0 + 0,3

2 100 0 0 + 0,3

3 100 0 0 + 0,3

Примечание: После знака «±» указана величина ошибки среднего.

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+]

обладает всеми характеристиками дрожжевого приона – возникает de novo после

элиминации, демонстрирует доминантное нехромосомное наследование и

обладает инфекционностью.

3.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+]

3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет

на фенотипическое проявление [NSI+]

Для выявления генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на

фенотипическое проявление [NSI+], мы оценили эффект сверхэкспрессии всех

дрожжевых генов в штамме 1-1-D931 [NSI+]. Этот штамм был трансформирован

плазмидами библиотеки YSC4613. Библиотека включает 1588 клонов E. coli,

несущих челночный многокопийный вектор pGP564 с уникальными фрагментами

генома S. cerevisiae, размером от 9 до 13 тысяч пар нуклеотидов и содержащими

119

от 4 до 12 открытых рамок считывания. Каждый клон содержит одну плазмиду с

несколькими генами S. cerevisiae с известной индивидуальной нуклеотидной

последовательностью. Штамм 1-1-D931 был трансформирован всеми плазмидами

библиотеки, трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина и

переносили методом отпечатков на среду без лейцина и аденина. Всего на

селективной среде без аденина было проанализировано по восемь

трансформантов каждой из 1588-ми плазмид. В результате скрининга было

установлено, что на рост штамма на селективной среде без аденина влияют шесть

плазмид геномной библиотеки: YGPM18l24, YGPM25e16, YGPM27n12,

YGPM4g14, YGPM17m07 и YGPM18d16, причем трансформация плазмидами

YGPM4g14 и YGPM17m07 приводит к усилению роста, а YGPM18l24,

YGPM25e16, YGPM27n12 и YGPM18d16 – к подавлению.

Плазмиды YGPM4g14 и YGPM17m07 содержат ген ADE1, сверхэкспрессия

которого закономерно приводит к усилению роста штамма на среде без аденина,

однако не влияет на рост штамма на среде без триптофана. Плазмида YGPM18d16

содержит ген SUP35, экспрессия которого, как мы показали ранее, маскирует

[NSI+]-зависимую нонсенс-супрессию. Интересно отметить, что штамм 1-1-D931

содержит фактор [PIN+], и сверхэкспрессия гена SUP35 в таких штаммах обычно

приводит к прионизации Sup35 и индукции нонсенс-супрессии, но в присутствии

фактора [NSI+] этого не происходит.

Оставшиеся три плазмиды (YGPM18l24, YGPM18l24 и YGPM25e16) наряду с

другими генами содержали ген SUP45. Этот ген кодирует основной фактор

терминации трансляции eRF1 эукариот [Zhouravleva et al., 1995]. Мы

предположили, что сверхэкспрессия именно этого гена вызывает повышение

эффективности терминации трансляции в штамме 1-1-D931 и маскирует [NSI+]-

опосредованную нонсенс-супрессию. Для проверки этого предположения мы

использовали центромерную плазмиду pRS315-SUP45, любезно предоставленную

Г.А. Журавлевой (СПбГУ), несущую ген SUP45 дикого типа под контролем

собственного промотора. Трансформация плазмидой pRS315-SUP45

120

действительно вызвала подавление роста штамма на среде без аденина (Рис.17А).

Элиминация этой плазмиды приводила к восстановлению супрессорного

фенотипа.

Мы предположили, что детерминант [NSI+] участвует в регуляции экспрессии

SUP45 на уровне мРНК. Если на фоне [NSI+] происходит снижение

относительного количества мРНК SUP45, то это может приводить к уменьшению

количества данного белка и снижению эффективности терминации трансляции.

Для проверки этого предположения мы сравнили относительные количества

мРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-] при помощи ПЦРРВ.

Данные, полученные для четырнадцати независимо полученных проб мРНК

каждого из штаммов, воспроизведѐнные в трѐх повторностях, показали, что в

штамме [NSI+] достоверно (p≤0,01) снижено количество мРНК SUP45 в сравнении

со штаммом [nsi-] (значения параметров Сt составляют 2,08±0,521 и 1,00±0,289

для [NSI+] и [nsi

-] штаммов, соответственно) (Рисунок 17Б).

121

Рисунок 17. Фактор [NSI+] снижает уровень экспрессии гена SUP45. А –

Трансформация штамма [NSI+] центромерной плазмидой с копией гена SUP45

вызывает маскировку супрессорного фенотипа, но после потери плазмиды

фенотип восстанавливается. Б - Относительное количество мРНК SUP45 в

штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-]. В – Сравнительный анализ

относительного количества белка Sup45 в штаммах [NSI+] и [nsi

-], находящихся в

экспоненциальной и стационарной фазе роста. Показаны результаты Вестерн-блот

гибридизации для одной пары клонов [NSI+] и [nsi

-]. Количественные данные

денситометрического анализа вычислены для четырѐх пар независимых клонов и

представлены как среднее значение измерений интенсивности сигналов

Sup45/Tub1 ± стандартное отклонение.

Наблюдаемая разница соответствует снижению количества мРНК SUP45 в

штамме [NSI+] приблизительно в два раза (2

-Ct=2,14), что полностью объясняет

антисупрессорный эффект введения SUP45 на центромерной плазмиде. С

помощью Вестерн-блот гибридизации мы сравнили количество белка Sup45 в

штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-] на экспоненциальной и стационарной

стадии роста (дрожжи инкубировали в течение одного и трѐх дней,

соответственно, в жидкой среде при 300С). Количество тотального белка в клетках

штаммов [NSI+] и [nsi

-] выравнивали по методу Бредфорда [Bradford, 1976] и в

соответствии с интенсивностью сигнала тубулина (Tub1) при использовании

антител T6074. Результаты количественной оценки данных Вестерн-блот

гибридизации показали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах

[NSI+] статистически достоверно (p=0,009) снижено в сравнении со штаммами

[nsi-] в клетках, находящихся в стационарной, но не в экспоненциальной фазе

роста. На рисунке 17В представлены результаты сравнительного анализа

количества белка Sup45 в клетках [NSI+] и [nsi

-] в одной из четырех пар

независимо полученных клонов. Полученные медианы относительного

содержания Sup45p в штаммах [NSI+] и [nsi

-] равны 0,54±0,088 и 1,00±0,260, что

122

соответствует снижению содержания Sup45p в штаммах [NSI+] в стационарной

фазе роста приблизительно в два раза. Таким образом, возникновение

детерминанта [NSI+] вызывает снижение содержания мРНК SUP45 в клетке, что

закономерно приводит к уменьшению количества белка Sup45 в стационарной

фазе роста и к нонсенс-супрессии.

3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия

которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-]

Сверхпродукция прионформирующих белков, зачастую, хотя и не всегда,

резко повышает частоту индукции прионной изоформы de novo [Wickner et al.,

2002; Du and Li, 2014]. На этом свойстве базируется один из основных методов

идентификации дрожжевых прионов. Для поиска белков, сверхпродукция

которых вызывает индукцию нонсенс-супрессорного фенотипа в штамме [nsi-],

была использована дрожжевая адресная библиотека YSC4613 “Open Biosystems”,

плазмиды которой содержат перекрывающиеся фрагменты генома S. cerevisiae

(см. главу «Материалы и методы» и предыдущий раздел).

Поскольку спонтанное возникновение фактора [NSI+] было отмечено

исключительно в штаммах [PIN+], для трансформации плазмидами библиотеки

был использован штамм 1-D933 [nsi-], содержащий прионный детерминант [PIN

+].

В результате эксперимента было выявлено 24 плазмиды, трансформация

которыми вызывала нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] (таблица 13). Эти

плазмиды содержат 178 индивидуальных генов. Следует отметить, что

последовательности геномных фрагментов, клонированных в плазмиды

библиотеки, перекрываются. С учѐтом этого, потенциальными кандидатами на

роль детерминанта фактора [NSI+] могут быть только те гены, которые

представлены в составе выявленных 24 плазмид, однако отсутствуют в

плазмидах, трансформация которыми не приводит к супрессии. Таким образом,

123

количество потенциальных кандидатов на роль гена-детерминанта фактора [NSI+]

сокращается до 75 генов.

Помимо супрессии нонсенс-мутации ade1-14(UGA), фактор [NSI+]

супрессирует мутацию trp1-289(UAA) и ингибирует рост дрожжей на среде с

галактозой. Мы оценили влияние выявленных в предварительном скрининге

последовательностей на весь комплекс признаков.

Супрессия нонсенс–мутации trp1-289(UAA), как и ингибирование роста на

среде с галактозой, была отмечена при трансформации штамма 1-D933 [nsi-] лишь

одной из 24-х плазмид. Эта плазмида содержит 11 генов, влияние которых на

супрессию нонсенс-мутаций ранее показано не было. Один из этих генов, а

именно VTS1 (плазмида YGPM2f04, таблица 13), контролирует стабильность

мРНК [Aviv et al., 2003] и, кроме того, кодирует потенциально прионогенный

белок, содержащий глутамин-аспарагин обогащѐнную последовательность

[Harrison and Gerstein, 2003].

Таблица 13. Плазмиды геномной библиотеки YSC4613, трансформация

которыми вызывает нонсенс-супрессию в штамме 1-D933 [nsi-]

Плазмида

плазмиды

Название генов в составе плазмиды

YGPM10p05 CHD1, PAB1, YER165C-A, DNF1*

YGPM11n12 SAC3**

, SSY1, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1**

YGPM11p20 CHD1**

, PAB1, YER165C-A, DNF1*

YGPM14f05 LCD1**

, RPL37B, PLM5, SAM2, LPP1, SPG3, PSP1, YDR506C**

YGPM14k18

YPR150W***

, SUE1, YPR152C, YPR153W, PIN3, NCA2, TPO3, YPR157W*

YGPM14l17 ABC1***

, , YGL118C, YGL117W, CDC20, SNF4, YGL114W,

SLD3*

YGPM15k07

YHR054C***

, RUF5-2, YHR054W-A, CUP1-2, RSC30, YHR056W-A,

CPR2**

YGPM17i23

RSM23*, CWC23, SOH1, SCS3, MET13, MON1, RPS2, YGL123C-A,

NAB2, GPG1, PRP43***

YGPM17m07

YAR009C*, YAR010C, , BUD14, ADE1, KIN3, CDC15

**

YGPM1l02 PSF1***

, RAD61, YDR015C, DAD1, KCS1***

Trp

CCAтРНК

Ala

UGCтРНК

124

YGPM20f17

CWC25*, SUI1, SLA2, ATG2, ZWF1

**

YGPM21c11 , YKL071W, YKL070W, YKL069W, , YKL068W-A,

NUP100*

YGPM21j14

мяРНК19*, POP1, ADE12, ALG9, MGS1, YNL217W, RAP1

*

YGPM23o10 DNF2**

, YDR094W, YDR095C, GIS1, MSH6, GRX3,

YGPM25l04

NUP120***

, YKL056C, OAR1, DEF1, MDM35, YKL053W, ASK1***

YGPM28b10

DDC1**

, RSA1, PRM3, YPL191C, NAB3, YPL189C-A, GUP2, POS5

YGPM29j24

SMF2**

, YHR050W-A, COX6, CIC1, RUF5-1, YHR052W-A, CUP1-1,

YHR054C, RUF5-2***

, YHR054W-A, CUP1-2***

YGPM2f04 YOR356W***

, GRD19, HAP5, VTS1, PDE2, PRT1, PRE10, PIP2,

YOR364W, YOR365C***

, YOR366W

YGPM31d16 ABC1***

, , YGL118C, YGL117W, CDC20, SNF4, YGL114W*

YGPM32c09

ALK1**

, MDM39, CKB1, JAC1, ATE1, KAP122, YGL015C, PUF4,

YGL014C-A, PDR1**

YGPM4g14

BUD14*, ADE1, KIN3, CDC15, YAR019W-A, PAU7, YAR023C

***

YGPM4p01 SMY1**

, DHR2, YKL077W, PSY1, YKL075C, MUD2, LHS1,STB6,

YGPM7c22 SAC3**

, SSY1*, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1, TRM82

*

YGPM7l21 GLT1*, UGA3, UGX2, SFA1, NRP1, FAP7, CDC36

*

Примечания. *У гена отсутствует 3’ последовательность.

**У гена отсутствует

5’последовательность. ***

У гена могут отсутствовать некоторые регуляторные элементы [по:

Нижников и др., 2011].

Мы сконструировали плазмиду pU-VTS1, в которой последовательность,

кодирующая белок Vts1, находится под контролем индуцибельного промотора

CUP1. Сверхэкспрессия VTS1 в штамме 1-4-1-1-D931 [nsi-], как мы и ожидали,

вызывает супрессию нонсенс-мутаций ade1-14 и trp1-289, а также вызывает

ингибирование роста дрожжей на среде с галактозой, но не на среде с глицерином

(рис. 18А). Таким образом, эффекты сверхпродукции гена VTS1 имеют сходное

проявление с фактором [NSI+].

Trp

CCAтРНКValAACтРНК

lnG

UUGтРНК

Trp

CCAтРНК

Trp

CCAтРНК

125

Рисунок 18. Влияние изменения уровня экспрессии гена VTS1 на фенотип

штаммов, содержащих фактор [NSI+]. А – Сверхэкспрессия гена VTS1 в штамме

[nsi-], также как и фактор [NSI

+], вызывает рост клеток на средах без аденина и

триптофана и ингибирует рост на среде с галактозой, но, в отличие от [NSI+], не

влияет на темпы роста на среде с глицерином; Б – Нонсенс-супрессия,

возникающая в штамме [nsi-] при трансформации плазмидой pU-VTS1,

элиминируется после потери плазмиды; В – Штамм 9-1-1-D931 [NSI+] с делецией

гена VTS1 демонстрирует супрессию, которая элиминируется GuHCl.

Вместе с тем, элиминация плазмиды pU-VTS1 приводит к потере супрессорного

фенотипа (рис. 18Б). Кроме того, супрессорный фенотип сохраняется в штамме

[NSI+] на фоне делеции гена VTS1 (рис. 18 В). Супрессия элиминируется на среде

с GuHCl. Эти данные однозначно доказывают, что ген VTS1 не является

детерминантом фактора [NSI+].

На основании полученных результатов можно заключить, что генетический

скрининг позволил выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияет

на проявление фактора [NSI+] или вызывает сходные эффекты, однако ген-

детерминант [NSI+] этим методом обнаружить не удалось.

126

3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в

дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»

Генетический скрининг не позволил выявить ген-детерминант фактора

[NSI+]. Делеционный скрининг не может использоваться для выявления

жизненно-важных генов, кодирующих прионные белки, а сверхэкспрессия генов-

детерминантов прионов не всегда приводит к заметному повышению частот

индукции прионов [Du and Li, 2014]. Таким образом, генетические подходы при

идентификации прионов могут быть неэффективны. Для решения поставленных в

работе задач мы разработали метод идентификации амилоидов, основанный на

знании их универсальных биохимических свойств.

3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»

При разработке метода протеомного скрининга и идентификации

амилоидов, названного нами PSIA (Proteomic Screening for Identification of

Amyloid proteins) мы основывались на предложенном ранее подходе по

выделению и очистке высокомолекулярной фракции детергент-устойчивых

белковых агрегатов, обогащѐнной амилоидами [Kushnirov et al., 2006]. Для

выявления и идентификации в этой фракции любых, даже минорных белков,

формирующих амилоидные агрегаты, мы разработали схему экспериментов,

объединяющую несколько биохимических и протеомных методов, и

апробировали еѐ на примере выявления уже известных дрожжевых прионов

[PIN+] и [PSI

+].

Методика включает три основных этапа:

1) Выделение и очистка при помощи серии ультрацентрифугирований

белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами.

127

2) Разделение фракции белков, формирующих детергент-устойчивые

агрегаты, при помощи двумерного электрофореза белков, связанных с

флуорохромами.

3) Выделение окрашенных белков из геля, трипсинолиз и идентификация с

помощью масс-спектрометрии.

Выделение белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, в клетках

штамма GT81-1C [PSI+][PIN

+] и его изогенного деривата GT409 [psi

-][pin

-] было

проведено как описано в главе «Материалы и методы». Детергент-устойчивую

фракцию белковых агрегатов растворяли в буфере, содержащем хаотропные

агенты, а нерастворимые в буфере белковые агрегаты отделяли

центрифугированием. Растворимые в буфере белки из штамма [PSI+][PIN

+]

окрашивали красным флуорохромом Cy5, а из штамма [psi-][pin

-] зелѐным

флуорохромом Cy3. На следующем этапе белки, выделенные из обоих штаммов,

смешивали и разделяли методом двумерного гель-электрофореза. На рис 19А и

19Б представлены результаты выделения белковых агрегатов, устойчивых к

обработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, соответственно. Необходимость

использования саркозината связана с тем, что некоторые амилоиды неустойчивы

к обработке SDS, но не растворяются при использовании более мягких

детергентов [Urakov et al., 2010; Coalier et al., 2013]. Белкам, представленным в

обоих штаммах, соответствуют жѐлто-зелѐные сигналы, тогда как белки,

образующие агрегаты исключительно в штамме [PSI+][PIN

+], окрашены красным

цветом. Красные пятна, как в случае обработки SDS, так и при обработке

саркозинатом, были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии как

белок Rnq1 – детерминант приона [PIN+] (данные спектрометрии представлены в

таблицах 14 и 15). В обоих случаях белку Rnq1 соответствовали несколько

сигналов, различающихся по изоэлектрической точке, но не по массе. Это может

быть связано с посттрансляционными модификациями белка Rnq1. Белкам,

формирующим агрегаты, устойчивые к 1% SDS как в штамме [PSI+][PIN

+], так и в

штамме [psi-][pin

-], соответствовали жѐлтые сигналы, образующиеся в результате

128

наложения флуорохромов Cy3 и Cy5. Этим сигналам соответствовали белки Gas1,

Ape1 и Ape4 (рис. 19 А; таблица 14).

Белки Gas1, Ape1 и Ape4 были выявлены также при обработке фракции

белковых агрегатов 3% саркозинатом натрия (рис. 19Б; таблица 15). Эти белки

либо образуют конститутивные амилоидные полимеры в дрожжах, либо

формируют детергент-устойчивые агрегаты неамилоидной природы. В результате

обработки белковых агрегатов саркозинатом, который является более мягким

детергентом в сравнении с SDS, на геле выявляется гораздо больше жѐлтых

сигналов, которым соответствуют белки, образующие агрегаты в штаммах

[PSI+][PIN

+] и [psi

-][pin

-]. Существенная часть этих белков, являются

компонентами 20S субъединицы протеасомы (рис. 19Б; таблица 15). К ним

относятся все белки семейства Pre, а также белки Pup3 и Scl1 (SGD,

http://www.yeastgenome.org). Очевидно, этот белковый комплекс не имеет

отношения к амилоидам, но демонстрирует устойчивость к обработке 3%

саркозинатом натрия. Важно отметить, что наличие относительно большого

количества белков не мешает выявлению прионов, поскольку использование

разноцветных флуорохромов позволяет чѐтко выявлять белки, формирующие

агрегаты исключительно в прионсодержащем штамме. Отметим, что белок Sup35,

образующий прионные агрегаты в штамме [PSI+][PIN

+], не выявлен с помощью

двумерных электрофорезов (рис. 19 А и 19Б). Мы показали, что Sup35 выявляется

в штамме [PSI+][PIN

+], во фракции белковых агрегатов, нерастворимых в буфере

для двумерного электрофореза. Белки из этой фракции, выделенные из опытного

и контрольного штаммов, были денатурированы кипячением в 2% SDS,

разделены с помощью одномерного гель-электрофореза и визуализированы

окрашиванием кумасси R250. Полоска, представленная исключительно в штамме

[PSI+][PIN

+] (рис.19В), была идентифицирована масс-спектрометрией как белок

Sup35 (таблица 16).

129

Рисунок 19. Белки, формирующие детергент-устойчивые агрегаты в штаммах

GT81-1C [PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-]. А - Изображение двумерного гель

электрофореза белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты. Белки из штаммов

GT81-1C [PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-] окрашены флуорохромами

Cy5(красный) и Cy3(зелѐный), соответственно. Б – Изображение двумерного гель

электрофореза белков, образующих саркозинат-устойчивые агрегаты. Белки из

штаммов GT81-1C [PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-] окрашены флуорохромами

Cy5(красный) и Cy3(зелѐный), соответственно. В – Изображение одномерного

электрофореза, белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты, нерастворимые в

буфере с хаотропными агентами.

130

Таким образом, мы показали, что прионные агрегаты Sup35 демонстрируют

высокий уровень устойчивости к обработке хаотропными агентами (8 M

мочевина, 2 M тиомочевина и 4% CHAPS).

Таблица 14. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих

SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-]

(рис. 19A).

Белок

Счѐт1

Идентифицирован

в штамме

[PSI+][PIN

+]

Идентифицирован

в штамме

[psi-][pin

-]

Ape1 126 + +

Ape4 93 + +

Gas1 151 + +

Rnq1* 109 + -

Примечания:

1 Здесь и далее - счѐт – показатель, отражающий достоверность идентификации

белка (см. «Материалы и методы»). Указан счѐт, с которым были

идентифицированы белки в образце из штамма GT81-1C [PSI+][PIN

+].

* Белок выявлен и идентифицирован только в штамме GT81-1C [PSI+][PIN

+]

(Здесь и далее для таблиц 14 -17).

131

Таблица 15. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих

агрегаты, устойчивые к обработке саркозинатом натрия, в штаммах GT81-1C

[PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-] (рис. 19Б).

Белок

Счѐт1

Идентифицирован в

штамме [PSI+][PIN

+]

Идентифицирован в

штамме

[psi-][pin

-]

Ape1 271 + +

Ape4 263 + +

Gas1 190 + +

Pre1 78 + +

Pre2 42 + +

Pre3 99 + +

Pre4 69 + +

Pre6 158 + +

Pre7 100 + +

Pre8 190 + +

Pre9 104 + +

Pup2 164 + +

Pup3 101 + +

Put2 101 + +

Rnq1* 73 + -

Scl1 186 + +

Примечания те же, что к таблице 14.

132

Таблица 16. Идентификация белков, выявленных на одномерном электрофорезе в

штаммах GT81-1C [PSI+][PIN

+] и GT409 [psi

-][pin

-] (рис. 19В), методом масс-

спектрометрии.

Белок

Счѐт1

Идентифицирован

в штамме

[PSI+][PIN

+]

Идентифицирован в

штамме

[psi-][pin

-]

Nop1 160 + +

Rpl28 130 + +

Rpl3 88 + +

Rps26 66 + +

Sup35*

143 + -

Tef2 129 + +

Примечания те же, что к таблице 14.

Несмотря на эффективность и удобство для демонстрации результатов, этот

метод имеет определѐнные ограничения:

1) Белки с экстремальной изоэлектрической точкой (ниже 3,5 и выше 9,5)

не разделяются с помощью двумерного электрофореза и выпадают из

анализа;

2) Белки, которые продуцируются на крайне низком уровне, могут, не

детектироваться на геле.

Для того, чтобы повысить разрешающую способность методики, мы

отказались от использования двумерного электрофореза. Фракцию белков,

образующих агрегаты устойчивые к обработке 1% SDS при комнатной

температуре, выделяли так же как описано выше.

133

Таблица 17. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C

[PSI+][PIN

+] и GT409[psi

-][pin

-], идентифицированные методом PSIA HPLC-

MALDI,

Белок Счѐт масс-

спектрометрии,

отражающий

достоверность

идентификации1

Идентифицирован

в штамме [PSI+]

Идентифицирован

в штамме [psi-]

Sup35* 869 + -

Gas1 623 + +

Tif1 559 + +

Sis1 551 + -

Rnq1* 485 + -

Ecm33 438 + +

Rim1 406 + +

Toh1 376 + +

Plb1 355 + +

Gas5 316 + +

Gas3 292 + +

Ssb1* 222 + -

Ssb2* 204 + -

Ape1 195 + +

Ilv2 174 + +

Ira1 147 + +

Utp20 126 + +

YBL100W-B 110 + +

Mlp1 110 + +

Ssa2* 103 + -

Примечания те же, что к таблице 14.

Указаны показания счѐта масс-спектрометрии для образца из штамма GT81-1C

[PSI+][PIN

+].

На следующем этапе белки растворяли в концентрированной муравьиной

кислоте, высушивали в вакуумном испарителе и денатурировали кипячением в

буфере с 2% SDS. Далее пробы обессоливали, расщепляли на пептиды с помощью

трипсина, пептиды разделяли на колонке HPLC и идентифицировали с помощью

134

масс-спектрометрии (см. главу “Материалы и методы»). Такой подход лишѐн

недостатков, которые возникают при использовании двумерного электрофореза.

Кроме того, отсутствие этапа выделения белка из геля повышает

чувствительность метода. Необходимость использования муравьиной кислоты

связана с тем, что фибриллы некоторых амилоидных белков не растворимы даже

при кипячении в буфере с SDS.

В таблице 17 представлены белки, идентифицированные с помощью новой

модификации нашего метода в штамме GT81-1C [PSI+][PIN

+] и его изогенном

деривате GT409 [psi-][pin

-]. Данный подход позволяет идентифицировать белки,

представленные в пробах даже в следовых количествах. В таблице 17

представлены лишь первые 30 белков, идентифицированных в штамме GT81-1C

[PSI+][PIN

+] с самым высоким счѐтом. Из таблицы исключены данные

идентификации белков большой и малой субъединиц рибосомы, которые были

выявлены в обоих штаммах (результаты не представлены). Для всех этих

рибосомных белков характерна экстремально щелочная изоэлектрическая точка

(pI ≥ 10), что препятствовало их выявлению при использовании двумерного

электрофореза (см. рис. 19А и 19Б). По всей вероятности, субъединицы

дрожжевой рибосомы представляют собой прочный РНП-комплекс, который не

полностью распадается на отдельные белки в результате обработки РНК-азой А и

1% SDS при комнатной температуре.

В штамме [PSI+][PIN

+], но не в его изогенном деривате [psi

-][pin

-], были

идентифицированы белки Sup35 и Rnq1 - детерминанты прионных факторов

[PSI+] и [PIN

+], соответственнo, а также белки Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1. Известно,

что шапероны Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1 взаимодействуют с прионными агрегатами

белка Sup35 и играют роль в поддержании этого приона [Newnam et al., 1999;

Chernoff et al., 1999; Sondheimer et al., 2001; Higurashi et al., 2008]. Исходя из этих

данных, выявление перечисленных шаперонов методом PSIA объясняется их

физическим взаимодействием с прионом [PSI+].

135

Разработанный нами метод впервые позволил оценить возможность

присутствия в клетках прионов, не имеющих фенотипического проявления. По

всей вероятности, прионизация является редким событием – в штаммах

[PSI+][PIN

+] идентифицированы белки Sup35 и Rnq1, но, помимо шаперонов, не

выявлено других белков, по которым различаются фракции SDS-устойчивых

агрегатов тестируемых штаммов.

Модификация метода PSIA HPLC-MALDI впервые позволила на основании

данных протеомного анализа составить список перспективных кандидатов на

роль функциональных дрожжевых амилоидов. В этот список входят белки Gas1,

Tif1, Ecm33, Rim1, Toh1, Plb1, Gas5, Gas3, Ape1, Ilv2, Ira1, Utp20, YBL100W-B и

Mlp1. Белки Gas3, Gas5, Ecm33 и Toh1, также как и Gas1, являются белками

клеточной стенки [Nuoffer et al., 1991; Rolli et al., 2010; Terashima et al., 2003;

Hamada et al., 1998]. Особый интерес представляет белок Toh1. Продукция этого

белка резко усиливается при повреждениях клеточной стенки, а также при

остановке клеточных делений [García et al., 2004; Tkach et al., 2012]. Можно

предположить, что формирование амилоидных фибрилл белка Toh1 в клеточной

стенке помогает клетке пережить стресс.

Для оценки агрегации одного из выявленных кандидатов на роль

функциональных амилоидов проведены дополнительные эксперименты. Мы

сконструировали плазмиду PGPD1-GAS1-YFP, содержащую химерный ген GAS1-

YFP, под контролем промотора GPD1. При трансформации штамма BY47-42

плазмидой PGPD1-GAS1-YFP белок Gas1-YFP образует цитологически

детектируемые агрегаты (рис. 20А). Более того, в штамме ATCC 201388 GAS1-

YFP, содержащем химерный ген GAS1-YFP под контролем промотора GAS1,

также детектируются агрегаты, которые локализуются в основном по периферии

клеток и, возможно, входят в состав клеточной стенки (рис. 20А). Агрегаты Gas1-

YFP демонстрируют устойчивость к обработке 1% SDS (рис.20 Б).

136

Рисунок 20. Агрегация белка Gas1-YFP в клетках штамма BY4742. А –

Выявление с помощью флуоресцентной микроскопии агрегатов белка Gas1-YFP,

продуцирующегося под контролем промоторов GPD1 и GAS1. Б – Выявление

SDS-устойчивых полимеров белка Gas1-YFP методом полуденатурирующего

электрофореза и Вестерн-блот гибридизации с использованием антител 11E5,

специфичных к YFP, GFP и CFP. Цифрами обозначены номера дорожек. 1 –

денатурированный белок Gas1-YFP; 2- неденатурированный белок YFP; 3- SDS-

устойчивые полимеры неденатурированного белка Gas1-YFP, продуцирующегося

под контролем промотора GPD1.

Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой белок Gas1 образует

конститутивные амилоидные агрегаты in vivo. Для окончательного заключения в

перспективе необходимо в экспериментах in vitro оценить способность белка Gas1

формировать фибриллы, которые окрашиваются амилоид-специфическими

красителями. В представленной работе мы выявляем кандидатов на роль

функциональных дрожжевых амилоидов, но не ставим задачу доказать

амилоидные свойства выявленных кандидатов.

137

В целом, полученные результаты позволяют заключить, что разработанный

метод может быть успешно использован для протеомного скрининга и

идентификации белков, формирующих прионные агрегаты. Минорный белок

Rnq1 (не более 1140 молекул на клетку) [Ghaemmaghami et al., 2003; Chong et al.,

2015], уверенно идентифицируется даже при использовании наименее

чувствительного варианта методики, включающей двумерный электрофорез.

Модификация методики PSIA, включающая HPLC-MALDI, наиболее

информативна и может дать преимущества при идентификации неизвестных

прионных детерминантов, таких как [NSI+]. Большое количество ложно-

позитивных сигналов, соответствующих, например, белкам рибосомы, легко

отсекается за счѐт сравнения списка белков, выявленных в прионном штамме и

его деривате, полученном в результате пассирования клеток на среде с GuHCl.

3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме

[NSI+]

3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые

агрегаты в штамме [NSI+]

Мы использовали метод PSIA HPLC-MALDI для выявления белков,

которые могут являться детерминантами прионного фактора [NSI+]. Фракция

белков, формирующих агрегаты, устойчивые к инкубации с 1% SDS, была

получена из культур штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-], как описано в

разделе «Материалы и методы». Белковые агрегаты растворяли в муравьиной

кислоте, высушивали, денатурировали кипячением и очищали от детергентов.

После трипсинолиза пептиды разделяли методом HPLC и идентифицировали с

помощью масс-спектрометрии. Эксперимент проведѐн в двух независимых

повторностях. В таблице 18 представлены в алфавитном порядке белки,

идентифицированные в штамме [NSI+] со счѐтом, превышающим 50 условных

единиц в обеих повторностях. Единственное исключение составляет Swi1,

138

который идентифицирован лишь в одном эксперименте. Это исключение сделано,

исходя из того, что Swi1 - один из самых минорных белков в дрожжевом

протеоме (примерно 120 молекул на клетку) [Chong et al., 2015], но в то же время

этот белок является детерминантом приона [SWI+] [Du et al., 2008; Crow et al.,

2008]. Можно предположить, что Swi1 детектируется на пределе

чувствительности метода PSIA HPLC-MALDI. Из таблицы исключены все

рибосомные белки, которые выявляются во фракции детергент-устойчивых

агрегатов, как в штамме [NSI+], так и [nsi

-].

Ряд белков, выявленных нами ранее в качестве кандидатов на роль

функциональных дрожжевых амилоидов (см. таблицу 17), был идентифицирован

также в штаммах [NSI+] и [nsi

-]. К этому списку относятся белки Gas1, Gas5, Rim1,

Toh1 и Ape1. Отметим, что здесь указаны лишь те белки, которые с высоким

счѐтом выявлялись в штаммах [NSI+] и [nsi

-] в двух независимых повторностях.

Полученные данные свидетельствуют о том, что присутствие этих белков во

фракции детергент-устойчивых амилоидов не является штаммоспецифичной

особенностью. Во фракции SDS-устойчивых агрегатов в штаммах [NSI+] и [nsi

-]

также выявлен белок Bgl2, который, как было показано ранее, образует

амилоидные полимеры в клеточной стенке дрожжей [Kalebina et al., 2008]. В

качестве потенциального амилоида интересно рассмотреть белок клеточной

стенки Ygp1, который идентифицирован методом PSIA HPLC-MALDI в штаммах

[NSI+] и [nsi

-]. Продукция Ygp1 активируется при остановке клеточных делений,

вызванной недостатком питательных веществ, и этот белок секретируется во

внешнюю среду, способствуя формированию биоплѐнки [Destruelle et al., 1994].

Учитывая функции Ygp1 и его способность формировать SDS-устойчивые

агрегаты, можно полагать, что этот белок образует функциональные амилоидные

агрегаты в стессовых условиях. Как было сказано в главе «Обзор литературы», в

формировании биоплѐнки бактерий важную роль играют амилоиды. Вполне

возможно, это справедливо и для S. cerevisiae.

139

Таблица 18. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты , в штаммах

1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi

-], идентифицированные методом PSIA HPLC-

MALDI

Белок

Счѐт масс-

спектрометрии,

отражающий

достоверность

идентификации

Идентифицирован

в штамме [NSI+]

Идентифицирован

в штамме [nsi-]

Act1 181 + +

Adh1 60 + +

Ape1 553 + +

Bgl2 333 + +

Cyc1 109 + +

Ape4 146 + +

Tef1 296 + +

EFT1 239 + +

Eno2 80 + +

Fas1 1194 + +

Nop1 197 + +

Gas1 391 + +

Gas5 174 + +

Ssb1 223 + +

Mit1* 61 + - Nsr1 630 + +

Rim1 510 + +

Rnq1* 460 + -

Sis1* 143 + -

Swi1* 65 + - Ygp1 111 + +

Toh1 140 + +

Примечания:

1Счѐт – показатель, отражающий достоверность идентификации белка в

соответствии с базой данных «MASCOT». Указан счѐт, с которым были

идентифицированы белки в образце из штамма 1-1-D931 [NSI+].

*Белок выявляется и идентифицируется только в штамме 1-1-D931 [NSI+].

140

Белки Rnq1, Swi1, Mit1 и Sis1 были идентифицированы только в штамме

[NSI+], но не в контрольном штамме [nsi

-] (табл. 18). Белки Rnq1 и Swi1 являются

детерминантами прионов [PIN+] и [SWI

+], соответственно [Derkatch et al., 2001;

Due et al., 2008]. Mit1 входит в список потенциально прионогенных белков,

поскольку содержит Q/N-обогащѐнную последовательность [Harrison and Gerstein

2003]. Шаперон Sis1 связывает неправильно уложенные белки и транспортирует

их в ядро для деградации. Показано, что данный шаперон взаимодействует с

различными дрожжевыми прионами [по: Higurashi et al., 2008]. В частности, мы

показали, что шаперон Sis1 выявляется методом PSIA HPLC-MALDI в штамме

[PIN+][PSI

+] (таблица 17). Основываясь на этих данных, можно исключить белок

Sis1 из списка кандидатов на роль детерминанта фактора [NSI+]. Таким образом,

белки Rnq1, Swi1 и Mit1 являются кандидатами на роль детерминанта фактора

[NSI+].

141

3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+]

С помощью метода PSIA были выявлены белки Rnq1, Swi1 и Mit1, которые

присутствуют во фракции детергент-устойчивых агрегатов в образцах из штамма

[NSI+], но отсутствуют в образцах [nsi

-] (табл. 18). Мы провели сравнительный

анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP и Mit1-GFP в штаммах [NSI+] и

[nsi-] с помощью Вестерн-блот гибридизации.

Методом полуденатурирующего электрофореза мы показали, что SDS-

устойчивые агрегаты Rnq1-CFP выявляются в штамме [NSI+], но не [nsi

-] (рисунок

21А). Агрегация Swi1-YFP в штамме [NSI+] и отсутствие агрегатов этого белка в

штамме [nsi-] было показано с помощью метода дифференциального

центрифугирования (рисунок 21Б). На основании этих данных можно заключить,

что штаммы [NSI+] содержат белки Rnq1 и Swi1 в принной изоформе [PIN

+] и

[SWI+], соответственно. Анализ агрегации белка Mit1-GFP был проведѐн как с

помощью метода дифференциального центрифугирования, так и методом

полуденатурирующего электрофореза. Результаты, представленные на рисунке

21Г, свидетельствуют о том, что белок Mit1-GFP агрегирует как в штамме [NSI+],

так и [nsi-]. Отметим, что в эксперименте была использована центромерная

плазмида PMIT1-MIT1-GFP и можно полагать, что агрегация химерного белка Mit1-

GFP отражает уровень агрегации нативного белка Mit1. С помощью

полуденатурирующего электрофореза мы показали, что лишь небольшая доля

белка Mit1-GFP оказывается устойчива к обработке SDS (рисунок 22В). По всей

вероятности, уровень агрегации белка Mit1 в штаммах [NSI+] и [nsi

-] не

различается. Сам по себе факт агрегации Mit1 интересен, поскольку этот белок

является ключевым транскрипционным фактором, регулирующим

псевдогифальный рост дрожжей (Cain et al, 2012). Возможно, при выращивании

штаммов на полной среде именно агрегация Mit1 приводит к его инактивации и

ингибированию псевдогифального роста. Вместе с тем, полученные результаты

свидетельствуют, что белок Mit1 не является детерминантом [NSI+].

142

Рисунок 21. Сравнительный анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP и

Mit1-GFP в штаммах [NSI+] и [nsi

-]. А – Белок Rnq1-CFP формирует SDS-

устойчивые полимеры в штамме [NSI+], но не в штамме [nsi

-]. Б - в штамме [NSI

+]

белок Swi1-YFP представлен в осадочной фракции («О» - осадочная фракция),

содержащей высокомолекулярные белковые агрегаты, а в штамме [nsi-]

представлен в надосадочной растворимой фракции («Н» - надосадочная фракция).

В – лишь небольшая доля белка Mit1-GFP выявляется во фракции SDS-

устойчивых полимеров. Г – Методом дифференциального центрифугирования

установлено, что белок Mit1-GFP представлен в осадочной фракции как в штамме

[NSI+], так и [nsi

-].

На основании полученных данных можно предположить, что признаки,

наблюдаемые в штаммах [NSI+], опосредованы прионами [PIN

+] и (или) [SWI

+].

143

Для проверки возможного влияния приона [PIN+] на проявление фактора [NSI

+]

был получен штамм 7-1-1-D931 с делецией гена RNQ1. Делеция гена RNQ1

вызвала резкое снижение уровня нонсенс-супрессии (рис. 22). Рост на среде без

аденина детектируется лишь на пятый день. Последующая трансформация

данного штамма плазмидой, содержащей ген RNQ1, не приводит к

восстановлению темпов роста на среде без аденина. Таким образом, как делеция

гена RNQ1, так и потеря фактора [PIN+], приводят к резкому ослаблению

супрессорного фенотипа. Слабый супрессорный фенотип стабильно наследуется и

элиминируется при пассировании на среде с GuHCl (рис. 22). Делеция гена RNQ1,

как и потеря фактора [PIN+], не оказывает влияния на рост дрожжей на средах с

неферментатируемыми источниками углерода (не представлено). На основании

полученных результатов можно заключить, что проявление фактора [NSI+]

определяется как минимум двумя компонентами - прионом [PIN+] и ещѐ одним

прионом, который элиминируется GuHCl.

Рисунок 22. Влияние приона [PIN+] на проявление фактора [NSI

+]. Анализ роста

на среде без аденина до и после пассирования на среде с GuHCl штаммов: 4-1-1-

D931 [NSI+]; 7-1-1-D931 (дериват штамма [NSI

+], с делецией гена RNQ1); 7-1-1-

D931, трансформированный плазмидой pID130, содержащей ген RNQ1 под

контролем собственного промотора.

144

Наиболее вероятным кандидатом на роль второго детерминанта фактора

[NSI+] является белок Swi1. Данные, представленные в разделе 3.1. «Выявление и

характеристика прионного фактора [NSI+]» предполагают, что детерминант

фактора [NSI+], как и Swi1, имеет ядерную локализацию и регулирует

транскрипцию других генов. Более того, мутации в гене SWI1, как и фактор

[NSI+], вызывают нарушения споруляции и дефекты роста на средах с

неферментируемыми источниками углерода [Nasmyth, 1987; Lohr et al., 1995].

Для проверки влияния приона [SWI+] на поддержание и проявление фактора

[NSI+] необходимо делетировать ген SWI1, а затем вновь ввести этот ген в

исследуемый штамм. Такой подход приводит к элиминации исследуемого приона

и позволяет оценить его возможные эффекты. Мы получили дериват штамма 4-1-

1-D931 [NSI+], с делецией гена SWI1. Делеция гена SWI1 в штамме 7-4-1-1-D931

приводит к усилению супрессорного фенотипа и вызывает задержку роста на

средах с галактозой и глицерином (рис. 23). Фенотипические изменения,

опосредованные делецией гена SWI1, не элиминируются в результате

пассирования клеток на среде с GuHCl (не представлено). Последующее введение

плазмиды p426GPD–SWI1YFP вызывает полную элиминацию всех проявлений

фактора [NSI+] – трансформанты, так же как клетки штамма [nsi

-] не растут на

средах без аденина и триптофана и не демонстрируют дефектов роста на средах с

галактозой (рис. 23). Таким образом, временная инактивация гена SWI1 вызывает

элиминацию всех проявлений прионного фактора [NSI+]. Вместе с тем,

супрессорный фенотип, характерный для штаммов [NSI+], наблюдается лишь при

наличии двух прионов [SWI+] и [PIN

+] (см. рисунки 22 и 23).

145

Рисунок 23. Влияние приона [SWI+] на проявление фактора [NSI

+]. Делеция гена

SWI1 и последующая трансформация исследуемого штамма плазмидой p426GPD-

SWI1YFP приводят к элиминации всех проявлений фактора [NSI+].

На основании полученных данных можно заключить, что наблюдаемые

наследуемые изменения признаков определяются не неизвестным прионным

фактором [NSI+], а зависят от взаимодействия двух прионов [SWI

+] и [PIN

+]. Мы

впервые показали, что взаимодействие прионов, подобно взаимодействию

классических генов, вызывает наследуемые изменения признаков.

146

3.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN

+]

Для исследования взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN

+] мы решили

оценить вклад каждого приона в регуляцию супрессорного фенотипа. Штаммы

[swi-][PIN

+] и [SWI

+][pin

-] были получены из исходного штамма [SWI

+][PIN

+] за

счѐт делеции хромосомных копий генов SWI1 и RNQ1, соответственно, и

последующей трансформации штаммов плазмидами, кодирующими данные гены.

Напомним, что временная потеря гена-детерминанта вызывает элиминацию

соответствующего приона [Wickner et al., 1999]. Был проведѐн сравнительный

анализ проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG) в клетках

штаммов [SWI+][PIN

+], [swi

-][PIN

+], [SWI

+][pin

-], [swi

-][pin

-] а также swi1Δ[PIN

+].

Полученные результаты представлены на рисунке 24.

В случае анализа супрессии trp1-289 (UAG) какого-либо взаимодействия

прионов отмечено не было – рост на среде без триптофана зависит исключительно

от приона [SWI+] (рисунок 24). Интересно отметить, что в случае прионизации

Swi1 уровень супрессии trp1-289 (UAG) заметно выше, чем в штамме с делецией

гена SWI1 (рисунок 24).

При анализа роста исследуемых штаммов на среде без аденина отмечается

взаимодействие прионных детерминантов. Слабая супрессия проявления нонсенс-

мутации ade1-14 (UGA) отмечается в штамме [pin-] [SWI

+] (рисунок 24). Сильный

супрессорный фенотип характерен для штамма [SWI+][PIN

+]. Делеция гена SWI1

вызывает ещѐ большее усиление супресии мутации ade1-14, чем наличие в

штамме прионов [SWI+] и [PIN

+]. С точки зрения формальной генетической

логики прослеживается следующая схема:

1. Прионная инактивация белка Swi1 в штаммах [SWI+][pin

-] вызывает слабую

супрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA);

2. На фоне прионизации белка Rnq1 в штаммах [SWI+][PIN

+] инактивация Swi1

усиливается, что закономерно приводит к усилению супрессорного

фенотипа;

147

3. Отсутствие белка Swi1 в штаммах swi1Δ приводит к ещѐ большей

супресии проявления исследуемой нонсенс-мутации.

Описанная схема полностью соответствует классическому типу

комплементарных взаимодействий – один наследственный детерминант

дополняет влияние другого на проявление признака. Есть только одно отличие

– в нашем случае имеет место не взаимодействие классических генов, а

взаимодействие прионов. Такой феномен описан впервые. Как мы показали

ранее, снижение эффективности терминации трансляции в исследуемых

штаммах определяется прион-зависимым подавлением уровня экспрессии гена

SUP45 (рисунок 17). Очевидно, тонкий эффект приона [PIN+] на терминацию

трансляции, который детектируется при анализе роста на среде без аденина, не

имеет фенотипического проявления при анализе супрессии нонсенс-мутации

trp1-289 (UAG).

Рисунок 24. Анализ влияния взаимодействий прионов [SWI+] и [PIN

+] на

супресиию проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG).

148

Для проверки гипотезы о влиянии приона [PIN+] на прионные агрегаты

белка Swi1 был проведѐн сравнительный анализ агрегации белка Swi1-YFP в

штаммах 1-1-D931 [SWI+][PIN

+]), 6-1-4-1-1-D931 [SWI

+][pin

-], 7-1-4-1-1-D931 [swi

-

][PIN+] и 1-4-1-1 [swi

-][ [pin

-] (рис. 25 и таблица 19). Наибольший процент клеток с

агрегатами Swi1-YFP отмечен в штамме 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin

-] (примерно

8%). Примерно такой же процент клеток с агрегатами Swi1-YFP характерен для

штаммов [SWI+], описанных ранее [Crow et al., 2011].

Рисунок 25. Агрегация белка Swi1-YFP в штаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN

+]; 6-1-

4-1-1-D931 [SWI+][pin

-], 7-1-4-1-1-D931 [swi

-][PIN

+] и 1-4-1-1-D931[swi

-][ [pin

-]

149

Таблица 19. Результаты сравнения частот агрегации химерного белка Swi1-YFP в

штаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN

+]; 6-1-4-1-1-D931 [SWI

+][pin

-], 7-1-4-1-1-D931

[swi-][PIN

+] и 1-4-1-1-D931[swi

-][ [pin

-]

Штамм

№

трансфор

манта

Общее

количество

клеток

Количество

клеток с

агрегатами

Процент

клеток с

агрегатами

Среднее

значение

процента

клеток с

агрегатами

4-1-1-D931

[SWI+][PIN

+]

1 2027 66 3,26

3,5

2 2226 78 3,5

3 2175 98 4,5

4 2195 120 5,4

5 2219 65 2,93

7-1-4-1-1-D931

[swi-][PIN

+]

1 1397 8 0,58

0,54

2 1464 7 0,48

3 1464 3 0,2

4 1359 8 0,59

5 1492 8 0,54

6-1-4-1-1-D931

[SWI+][pin

-]

1 1897 149 7,85

7,85

2 1813 160 8,82

3 1867 178 9,53

4 1944 111 5,7

5 1890 110 5,82

1-4-1-1-D931

[swi-][ [pin

-]

1 1836 20 1,09

1,09

2 1709 21 1,23

3 1821 6 0,33

4 1969 15 0,76

5 1787 26 1,45

Этот результат, как и данные делеционного анализа и дифференциального

центрифугирования, подтверждает наше заключение о наличии приона [SWI+] в

исследуемых штаммах. Важно отметить, что в штамме 4-1-1-D931 [SWI+][PIN

+],

который в отличие от штамма 6-1-4-1-1-D931 содержит прион [PIN+], процент

клеток с агрегатами Swi1-YFP примерно в два раза ниже (3,5%). С помощью

150

критерия Манна-Уитни мы показали, что наблюдаемые различия статистически

значимы (p=0,01). Исходя из полученных результатов, можно заключить, что

присутствие приона [PIN+] влияет на прионные агрегаты [SWI

+]. Наличие редких

агрегатов Swi1-YFP в штаммах 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN

+] и 1-4-1-1-D931 [swi

-

][pin-] связано с тем, что данный белок на фоне сверхпродукции спонтанно

агрегирует в небольшой доле клеток в штаммах [swi-] [Cow et al., 2011]. Различия

в уровне нонсенс-супрессии и в частотах агрегации белка Swi1-YFP, которые

демонстрируют штаммы [PIN+][SWI

+] и [pin

-][SWI

+], свидетельствуют о том, что

прион [PIN+] прямо или опосредованно влияет на прионные агрегаты белка Swi1.

Полученные результаты показывают также, что прионизация Rnq1 и Swi1

приводит к появлению новой функциональной активности этих белков.

Прионизация белка Rnq1 влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект прионных

агрегатов [SWI+] на супрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA).

Прионизация Swi1 вызывает супрессию проявления нонсенс-мутации trp1-289

(UAG), тогда как инактивация этого белка в результате делеции гена SWI1 такого

эффекта не вызывает.

Для проверки гипотезы, согласно которой имеет место физическое

взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI

+], штамм D955 [PIN

+][SWI

+]

трансформировали плазмидами pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) и p426GPD–SWI1YFP,

кодирующими гибридные белки Swi1-YFP и Rnq1-CFP. Клетки, в которых

одновременно присутствовали сигналы, соответствующие белкам Rnq1-CFP и

Swi1-YFP, выявлялись с очень низкой частотой. Известно, что сверхпродукция

Rnq1 токсична и, по всей вероятности, одновременная сверхпродукция Rnq1-CFP

и Swi1-YFP усиливает токсический эффект. Ни в одной из нескольких тысяч

проанализированных клеток колокализации агрегатов Rnq1-CFP и Swi1-YFP

отмечено не было(рисунок 27).

Ранее в работе других исследователей также было показано, что прионные

агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют в штаммах

151

[PIN+][SWI

+] [Du and Li, 2014]. Из наших и литературных данных следует, что

[PIN+] оказывает не прямое, а опосредованное влияние на прионные агрегаты

белка Swi1.

Рисунок 27. Агрегаты химерных белков Rnq1-CFP и Swi1-YFP не

колокализуются в клетках штамма [PIN+][SWI

+].

Как мы показали (см. рис. 14), супрессия, наблюдаемая в штаммах

[SWI+][PIN

+] (ранее обозначенных как [NSI

+]), приводит к снижению

эффективности терминации трансляции. Снижение эффективности терминации

трансляции опосредовано уменьшением уровня экспрессии гена SUP45 (рисунок

17). Поскольку белок Swi1 является транскрипционным регулятором более чем

6% дрожжевых генов [Peterson and Herskowitz, 1992; Burns and Peterson, 1997],

эффект его прионной инактивации на уровень экспрессии гена SUP45 и

терминацию трансляции вполне объясним, однако остаѐтся загадкой, каким

образом на этот процесс влияет прион [PIN+]. Наши и литературные данные

свидетельствуют о том, что прионные агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не

взаимодействуют. Исходя из этого, следует, что белок Rnq1 в прионной

конформации приобретает новую функцию и опосредовано влияет на свойства

прионных агрегатов [SWI+]. Недавно было показано, что Rnq1 только в прионной

изоформе вызывает гиперфосфорилирование белка Pin4 [Yang et al., 2014].

152

Вполне вероятно, что прионные агрегаты Rnq1 секвестрируют репрессор киназы,

которая ответственна за гиперфосфорилирование не только Pin4, но и некоторых

других белков, и в частности Swi1. В связи с этим, интересно отметить, что у

белка Swi1 выявлено необычно много (двенадцать) потенциальных сайтов

фосфорилирования (http://www.yeastgenome.org).

Полученные данные позволяют сформулировать концепцию, согласно

которой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другими

компонентами протеомной сети, могут вызывать наследуемые изменения

признаков. По аналогии с признаками, наследование которых контролируется

одним или несколькими генами, можно утверждать, что существуют признаки,

проявление которых контролируется прионизацией одного белка, или

взаимодействием различных прионов.

Несмотря на то, что взаимодействия прионов можно описать в рамках

традиционной классификации взаимодействий генов, мы не можем согласиться с

авторами, которые предлагают рассматривать прионы в качестве генов или

«белковых генов» [Chernoff , 2001; Wickner et al., 2004]. Ген представляет собой

единицу наследственного материала, кодирующую одну макромолекулу. Прион,

несомненно, является матрицей, кодирующей наследственную информацию о

конформации белка [Инге-Вечтомов, 2013], но он не кодирует молекулу белка, а

лишь изменяет еѐ конформацию и функциональную активность. Как было

показано ранее, прионизация приводит к тем же последствиям, что и мутации

[Chernoff, 2001]. Разница заключается в том, что мутация приводит к изменению

самого гена, а прионизация вызывает наследуемое изменение генного продукта.

На основании приведѐнных рассуждений мы приходим к заключению, что прион

не является геном, поскольку не кодирет макромолекулу, а вызывает изменение

еѐ свойств.

Когда мы говорим о взаимодействии генов, то на самом деле речь идѐт о

взаимодействии генных продуктов (в нашем случае белков). Исходя из этого,

153

становится понятным, почему взаимодействие прионов приводит к таким же

последствиям, как взаимодействие классических генов. Мы показали, что прионы

[SWI+] и [PIN

+] демонстрируют комплементарное взаимодействие по отношению

к признаку «супрессия нонсенс-мутации ade1-14(UGA)». Теоретически можно

предсказать, что прионы могут взаимодействовать также по типу эпистаза и

различных вариантов полимерии.

154

3.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных

агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей

Наш метод протеомного скрининга был успешно использован для

идентификации глутамин-аспарагин обогащѐнных дрожжевых белков,

формирующих прионные агрегаты. Мы предположили, что данный метод может

служить универсальным инструментом для выявления различных амилоидов у

любых организмов. Для проверки этой гипотезы мы оценили возможность

выявления агрегатов PrP и Aβ млекопитающих с помощью метода PSIA при

продукции этих белков в дрожжах S. cerevisiae. Ранее было показано, что белки

PrP и Aβ агрегируют в дрожжах, и агрегаты PrP, подобно полимерам PrPSc

в мозге

млекопитающих, демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработке

протеиназой К [Ma and Lindquist, 1999].

Штамм BY4742 [PIN+] трансформировали плазмидами PGPD-PrP90-231-

GFP(URA3) и PGPD-Aβ-GFP(URA3), продуцирующими гибридные белки PrP(90-

231)-GFP и Aβ40-GFP под контролем промотора GPD. Поскольку прион [PIN+]

уверенно идентифицируется методом PSIA (см. раздел «Разработка и апробация

метода «протеомного скрининга амилоидов»), сигнал, соответствующий белку

Rnq1, может служить положительным контролем. В качестве отрицательного

контроля использовали [pin-] дериват штамма BY4742, трансформированный

плазмидой pRS316CG, продуцирующей белок GFP под контролем промотора

CUP1. Фракции, содержащие белковые агрегаты, устойчивые к обработке 1% SDS

и 3% саркозинатом натрия, были выделены и очищены из опытных и

контрольных образцов как описано в разделе «Материалы и методы». Для

удобства демонстрации полученных результатов, была использована

модификация метода PSIA, включающая двумерный электрофорез белков,

окрашенных флуорохромами. Белки из «опытных» образцов, содержащих белки

Aβ-GFP или PrP(90-231)-GFP, окрашивали флуорохромом Cy5 (красный), а белки

из контрольного образца зелѐным флуорохромом Cy3. Белки Aβ-GFP и PrP(90-

231)-GFP были выявлены во фракции белковых агрегатов, устойчивых к

155

обработке 3% саркозинатом натрия (рис. 28; таблица 20), но не обнаружены при

обработке белковых лизатов 1% SDS (не представлено).

Рисунок 28. Изображения двумерных гель-электрофорезов белков, выделенных

методом PSIA из штамма BY4742, трансформированного плазмидами,

продуцирующими белки Aβ-GFP (А) и PrP(90-231)-GFP (Б) и из его деривата

[pin-]. Белки, выделенные из штамма BY4742 [PIN

+] и его деривата [pin

-], метили

флуорохромами Cy5 и Cy3, соответственно.

Эти результаты соответствуют ранее полученным данным, согласно

которым амилоидные конформеры пептида Aβ устойчивы к обработке

саркозинатом, но растворимы в SDS [Coalier et al., 2013]. На основании

представленных результатов можно заключить, что разработанный метод

достаточно универсален и может быть использован для идентификации

различных белков, формирующих амилоидные полимеры.

156

Таблица 20. Идентификация методом масс-спектрометрии белков,

формирующих агрегаты устойчивые к обработке саркоазинатом натрия, в

штаммах BY4742 / PGPD-Aβ-GFP(URA3) и BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFP

Штамм Белок Счѐт

BY4742 / pU-Ab-GFP Ab-GFP 137

Rnq1 215

BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFP PrP(90–231)-GFP 310

Rnq1 94

Независимо от нас был разработан сходный подход для идентификации

прионов и амилоидов [Kryndushkin et al., 2013]. Так же как и мы, авторы

обрабатывали белковый лизат додецилсульфатом натрия при комнатной

температуре, но затем не отделяли детергент устойчивые агрегаты от прочих

амилоидов ультрацентрифугированием, а разделяли белковую смесь в агарозном

геле. На заключительном этапе белковые полимеры выделяли из геля и

идентифицировали при помощи HPLC-MALDI [Kryndushkin et al., 2013]. Данный

подход, как и разработанный нами метод, позволил выявлять SDS-устойчивые

агрегаты дрожжевых прионов [PSI+] и [PIN

+], однако прионные агрегаты Sup35 и

Rnq1 выявлялись не во всех исследованных штаммах [PSI+] и [PIN

+]. Метод,

описанный в этой статье, также не позволяет выявлять SDS-чувствительные

амилоиды, подобные тем, которые образуют химерные белки Aβ-YFP и PrP-CFP.

Мы считаем, что наш метод значительно превосходит описанный аналог по ряду

параметров.

157

3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo

амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом Aβ в дрожжах S. cerevisiae

Как было отмечено в разделе «Обзор литературы», белок PrP и пептид Aβ

взаимодействуют друг с другом лишь в том случае, когда один из партнѐров

представлен в амилоидной конформации [Morales et al., 2010]. Взаимодействие

олигомеров Aβ с мономерами PrPC, по всей видимости, способствует гибели

нейронов в случае болезни Альцгеймера [Lauren et al., 2009; Kudo et al., 2013].

Это взаимодействие хорошо изучено и выявлены короткие последовательности

PrP23–30аа и PrP95–110аа, ответственные за связывание патологических

олигомеров Aβ с мономерами PrP [Lauren et al., 2009; Chen et al., 2010].

Поскольку взаимодействие PrP с Aβ зависит от конформационных изменений

этих белков, следует ожидать, что за физическое взаимодействие агрегатов PrPSc

с

Aβ отвечают иные последовательности. Мы исследовали взаимодействие

агрегатов PrP с пептидом Aβ в дрожжевой модельной системе.

Для анализа агрегации амилоидогенных белков млекопитающих в дрожжах

штамм BY4742 трансформировали плазмидой pGPD-Aβ-YFP(URA3), содержащей

гибридный ген Aβ-YFP, а также плазмидами pGPD-PrP23-231-CFP(LEU2), pGPD-

PrP28-231-CFP(LEU2) pGPD-PrP90-231-CFP(LEU2) и pGPD-PrP110-231-CFP(LEU2),

содержащими различные фрагменты PrP, слитые с последовательностью,

кодирующей CFP. С помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии мы

показали, что Aβ-YFP образует цитологически детектируемые агрегаты в

дрожжевых клетках (рис. 29). Все гибридные белки, содержащие полноразмерный

PrP (PrP23-231-CFP) и его различные делетированные производные (PrP28–231-

CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP), также агрегировали в дрожжах (рис.29).

158

Рисунок 29. Агрегация гибридных белков Aβ-YFP, PrP23-231-CFP, PrP28–231-

CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP в клетках штамма BY4742. Все

исследуемые белки образуют цитологически детектируемые агрегаты в клетках

дрожжей. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду,

продуцирующую белок CFP, который равномерно распределѐн в цитоплазме.

Мы показали, что агрегаты PrP23–231-GFP и Aβ-GFP локализованы в

цитоплазме дрожжевых клеток и не колокализуются с ядром, вакуолями,

эндосомами и липидными включениями (рис. 30). Ранее были опубликованы

данные, согласно которым Aβ–GFP колокализуется с липидными включениями в

клетках дрожжей [Caine et al., 2007]. В этой работе авторы использовали

159

флуоресцентный краситель «Нильский красный». Мы использовали краситель

«Судан чѐрный», поскольку, как мы показали, флуоресценция «Нильского

красного» детектируется как при использовании фильтра RFP, так и GFP, даже в

клетках, которые не содержат химерный белок Aβ–GFP. Таким образом, можно

заключить, что Aβ-GFP не колокализуется с липидными включениями в клетках

дрожжей, по крайней мере в штамме BY4742.

Рисунок 30. Сравнительный анализ локализации агрегатов PrP23–231-GFP и Aβ-

GFP с различными клеточными компартментами и липидными включениями.

Вакуолярная мембрана (красный цвет) окрашена красителем FM4–64, эндосома

(синий) красителем Liso-tracker Blue, ядро и митохондрии (синий цвет) выявляли

за счѐт использования ДНК-специфичного красителя DAPI. Липидные

включения окрашивали красителем Судан чѐрный (чѐрный цвет).

Методом дифференциального центрифугирования и иммуноблотинга с

использованием антител, распознающих последовательности GFP, YFP и CFP, мы

подтвердили, что белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–

231-CFP и Aβ-YFP формируют в дрожжевой клетке высокомолекулярные

160

нерастворимые агрегаты, которые детектируются в основном в осадочной

фракции “Pellet”, тогда как белок CFP выявляется исключительно в растворимой

фракции (рис. 31А).

Для оценки амилоидных свойств исследуемых белков мы охарактеризовали

устойчивость агрегатов к обработке ионными детергентами и протеиназой К. С

помощью метода полуденатурирующего электрофореза с использованием антител

Ab502604, специфичных к PrP, мы показали, что все исследуемые белки

формируют агрегаты, устойчивые к 3% саркозинату натрия (рис. 31Б), но не к 1%

SDS (результат не представлен). Более того, после обработки гибридных белков

PrP-CFP протеиназой К, в концентрации 50 µg/ml интактным остаѐтся фрагмент

размером 19-20 KDa (рис. 31В). Такой же фрагмент, размером 19-20 KDa,

соответствующий последовательности PrP(90-231), был выявлен раньше при

продукции белка PrP(23-231) в мозге больных млекопитающих и в клетках S.

cerevisiae [Ma and Lindquist, 1999]. Белок Aβ-YFP также демонстрирует высокий

уровень устойчивости к обработке протеиназой К, но, в отличие от вариантов PrP-

CFP, не фрагментируется, а сохраняется полноразмерным (рис. 31В).

На основании полученных результатов можно заключить, что исследуемые

белки (PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и Aβ-

YFP) при продукции в дрожжах демонстрируют амилоидные характеристики.

161

Рисунок 31. Белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-

CFP и Aβ-YFP демонстрируют амилоидные характеристики при продукции в

клетках дрожжей. А – анализ агрегации исследуемых белков методом

дифференциального центрифугирования. Белковые лизаты были разделены

центрифугированием (12,000 g) на растворимую (S – soluble) и нерастворимую (P

– pellet) фракции, после электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную

мембрану и детектировали с использованием антител Ab-13970, специфичных к

YFP (CFP). Б – Выявление детергент устойчивых полимеров исследуемых белков

методом полуденатурирующего электрофореза. Белковый лизат инкубировали 10

мин при RT с 3% саркозинатом натрия, белки детектировали с использованием

антител Ab-13970. В - Анализ устойчивости исследуемых белков к обработке

протеиназой К в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля

показано, что белок CFP деградирует при использовании низкой концентрации

протеиназы К.

Для анализа взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ штамм BY4742

был котрансформирован попарно плазмидой pGPD-Aβ-YFP(URA3) и одной из

162

плазмид, продуцирующих химерные белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP,

PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP. Частоты колокализации оценивали с помощью

флуоресцентной конфокальной микроскопии. При подсчѐте частот колокализации

учитывали клетки, которые одновременно содержали агрегаты PrP-CFP, и

сигналы, соответствующие Aβ-YFP. Агрегаты PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP и

PrP90–231-CFP колокализовались с гибридным белком Aβ-YFP с высокой

частотой (от 75 до 85% агрегатов, содержащих фрагменты PrP, имели общую

локализацию с Aβ-YFP) (рис. 32). Частота колокализации агрегатов PrP110–231-

CFP с белком Aβ-YFP примерно в пять раз ниже (около 17%) (рис. 32).

Рисунок 32. Анализ колокализации агрегатов белков PrP23–231-CFP, PrP28–231-

CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP с белком Aβ-YFP методом

флуоресцентной конфокальной микроскопии. А- фотографии клеток, ко-

продуцирующих исследуемые белки. Б – Диаграмма, отражающая частоты

колокализации исследуемых белков. Указаны достоверные различия (p < 0,05) и

ошибка среднего.

163

Физическое взаимодействие агрегатов гибридных белков PrP-CFP с Aβ-YFP

исследовали с помощью метода AB FRET (Acceptor Photobleaching Fluorescence

Resonance Energy Transfer). Метод AB FRET основан на том, что при облучении

донора (CFP) перенос энергии к реципиентной молекуле (YFP) происходит лишь

в том случае, когда расстояние между этими молекулами составляет менее 10нм.

Детекция переноса энергии методом AB FRET свидетельствует о физическом

взаимодействии исследуемых белков. Клетки, копродуцирующие PrP23–231-CFP

с PrP23–231-YFP, а также PrP23–231-CFP с YFP, были использованы в качестве

позитивного и негативного контроля, соответственно. Наибольший показатель AB

FRET (11.5%) отмечен в клетках, используемых в качестве положительного

контроля и копродуцирующих белки PrP23–231-CFP и PrP23–231-YFP (рис. 33).

Рисунок 33. Сравнительный анализ физического взаимодействия агрегатов

белков PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP с

белком Aβ-YFP методом AB-FRET. Указаны достоверные различия (p < 0,05) и

ошибка среднего.

164

Эффективность AB FRET в клетках, ко-продуцирующих белки PrP23–231-

CFP и Aβ-YFP, а также PrP28–231-CFP и Aβ-YFP, составляет примерно 6%, тогда

как этот показатель в клетках содержащих белки PrP90–231-CFP и Aβ-YFP или

PrP110–231-CFP и Aβ-YFP был значительно ниже и не отличался от негативного

контроля (рис. 33). Таким образом, фрагмент PrP28-89 необходим для

физического взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ.

В результате работы был выявлен интересный парадокс – агрегаты PrP90–

231-CFP с высокой частотой колокализуются с белком Aβ-YFP (рис. 32), тогда как

физическое взаимодействие не детектируется (показатели AB FRET не

отличаются от негативного контроля) (рис. 33). Для объяснения этого парадокса

мы предложили гипотезу, согласно которой агрегаты PrP90–231-CFP не

связывают мономеры Aβ, а взаимодействуют лишь с агрегатами этого пептида

(смотри схему на рис. 34 и описание схемы).

Поскольку колокализация отмечается в клетках, продуцирующих белки

PrP90–231-CFP и Aβ-YFP, но не PrP110–231-CFP и Aβ-YFP, следует полагать, что

короткая последовательность PrP90-109 играет важную роль в связывании

амилоидными конформерами PrP агрегатов Aβ, но не мономеров этого пептида.

Метод AB FRET позволяет детектировать перенос энергии при взаимодействии

агрегатов PrP с мономерами Aβ, но при связывании предсуществующих агрегатов

Aβ-YFP среднее растояние между молекулами PrP и Aβ оказывается больше 10нм

и перенос энергии не детектируется.

165

Рисунок 34. Схема, объясняющая противоречие между высокими частотами

колокализации и низкими показателями FRET при анализе взаимодействия

агрегатов PrP(90-231) с пептидом Aβ. Агрегаты PrP(23-231) способны связывать

как агрегаты, так и мономеры Aβ. В случае делеции последовательности PrP(23-

89) агрегаты PrP(90-231) могут связывать лишь агрегаты, но не мономеры Aβ. В

этом случае среднее расстояние между молекулами PrP(90-231) и Aβ оказывается

больше 10нм, в результате чего показатели FRET не отличаются от

отрицательного контроля.

На основании результатов, представленных в этом разделе, можно сделать

вывод, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной и адекватной моделью для

исследования агрегации и физического взаимодействия гетерологичных

амилоидных белков in vivo.

166

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе данные дополняют теорию белковой

наследственности. Согласно этой теории, изменение конформации белка может

поддерживаться автокаталитически и вызывать наследуемые изменения

признаков у микроорганизмов. Иными словами, наследуемые изменения могут

возникать без каких-либо мутаций в последовательности нуклеиновых кислот.

Наши результаты позволяют предложить концепцию, согласно которой не только

прионизация одного белка, но и функциональное взаимодействие различных

прионов вызывает наследуемые изменения признаков. Более того, мы показали,

что взаимодействия прионов могут быть описаны в рамках традиционной

классификации генных взаимодействий. В отношении признака «супрессия

нонсенс-мутации ade1-14 (UGA)» прионы [PIN+] и [SWI

+] демонстрируют

комплементарное взаимодействие – прион [PIN+] усиливает (дополняет) действие

приона [SWI+] на исследуемый признак. Согласно нашим результатам,

взаимодействия прионов, как и взаимодействия генов, не обязательно

предполагают физическое связывание генных продуктов, а может быть

опосредовано дополнительными компонентами протеомных сетей. Более того, с

учѐтом наших и литературных данных об отсутствии физического связывания

различных прионов одновременно представленных в клетках дрожжевых

штаммов, можно предсказать, что будущие исследования приведут к выявлению

не физического, а функционального взаимодействия прионов.

Суммируя полученные данные можно заключить, что сквозное прочтение

преждевременного стоп-кодона ade1-14 (UGA) определяется снижением уровня

продукции белка Sup45 (рисунок 17) на фоне прионизации белков Swi1 и Rnq1.

Гипотетическая схема, отражающая эффекты прионов [SWI+] и [PIN

+] на

супрессорный фенотип, представлена на рисунке 35. Вероятно, Swi1, являясь

глобальным транскрипционным регулятором, позитивно регулирует уровень

транскрипции гена SUP45. Прионная инактивация Swi1 в штаммах [SWI+][pin

-]

вызывает слабый супрессорный фенотип (рисунок 24). [PIN+] опосредованно

167

(возможно, за счѐт активации фосфорилирования) усиливает инактивацию белка

Swi1 в штаммах [PIN+][SWI

+], что способствует снижению уровня продукции

Sup45. Уменьшение уровня продукции белка Sup45 приводит к снижению

эффективности терминации трансляции (рисунок 14) и вызывает усиление

супрессорного фенотипа.

Рисунок 35. Влияние прионов [SWI+] и [PIN

+] на супрессию нонсенс-мутации

ade1-14 (UGA). Красная стрелка отражает позитивный эффект белка Swi1 на

экспрессию гена SUP45. Этот эффект снижается в результате прионизации белка

Swi1 (синяя стрелка), и ещѐ менее выражен в присутствии приона [PIN+] (чѐрная

штрихованная стрелка). «Х» - компонент (или компоненты) протеомной сети,

определяющие [PIN+]-зависимую модификацию прионной формы белка Swi1.

- Swi1-зависимая позитивная регуляция транскрипции гена SUP45 (число

стрелок отражает уровень эффективности регуляции транскрипции).

168

Отметим, что описанное в нашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и

[SWI+] принципиально отличается от ранее охарактеризованных белковых

взаимодействий, вызывающих возникновение приона [GAR+]. [GAR

+]

представляет собой единственный известный прион, который детерминируется

двумя или несколькими белками [Brown and Lindquist, 2009]. Однако, важно

отметить принципиальные различия между прионным фактором [GAR+] и

феноменом, описанным в нашей работе – наблюдаемая нами супрессия нонсенс-

мутации детерминируется двумя прионами, тогда как прион [GAR+]

предположительно определяется взаимодействием белков Pma1 и Std1, [Brown

and Lindquist, 2009]. В отличие от Swi1 и Rnq1, белки Pma1 и Std1не формируют

независимых прионов.

В ходе работы мы охарактеризовали не только новое проявление прионов

[PIN+] и [SWI

+] (их совместное влияние на нонсенс-супрессию), но и показали, что

прионная конверсия белков Rnq1 и Swi1 приводит к появлению новой

функциональной активности этих белков. Белок Rnq1 только в прионной форме

влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект приона [SWI+] на супрессию

нонсенс-мутации ade1-14 (UGA). Прионизация Swi1, в свою очередь, вызывает

супрессию нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), и эта функция не зависит от

инактивации Swi1.

Мы разработали и успешно апробировали метод PSIA, позволивший

идентифицировать прионные белки, взаимодействие которых определяет

изменения признака, а также выявить ряд белков, являющихся кандидатами на

роль конститутивных дрожжевых амилоидов. Амилоидные свойства агрегатов

одного из выявленных кандидатов, а именно белка клеточной стенки Gas1,

подтверждены с помощью других методов (рис. 20). Метод PSIA достаточно

универсален, поскольку позволил выявить агрегаты ранее охарактеризованных

прионов [PSI+], [PIN

+] и [SWI

+], амилоидные полимеры белка клеточной стенки

дрожжей Bgl2, а также агрегаты белков млекопитающих PrP и Aβ. Поскольку

генетические подходы применимы лишь для выявления прионов, обладающих

169

фенотипическим проявлением, разработанный нами метод впервые позволяет

оценить масштабность прионного феномена у исследуемых организмов.

Теоретически можно было ожидать, что помимо уже охарактеризованных

прионов в дрожжевых клетках могут присутствовать прионные конформеры

других белков, агрегация которых не вызывает видимых эффектов. Из

полученных результатов по исследованию протеома различных штаммов

дрожжей можно сделать вывод, что прионизация является редким событием.

Выявление списка кандидатов на роль дрожжевых функциональных

амилоидов открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.

Важно отметить, что возможность применения метода PSIA не ограничивается

единственным объектом. В настоящее время этот метод уже используется для

поиска функциональных и патологических амилоидов в клетках дрожжей и

бактерий, а также в мозге млекопитающих. Более того, как показали наши

коллеги из лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна, метод PSIA перспективен и для

исследования взаимодействия прионов и амилоидов. Используя этот метод,

удалось выявить шесть белков, агрегация которых индуцируется в результате

сверхпродукции в клетках дрожжей мутантной последовательности белка Htt

человека. Важно отметить, что пять из этих шести белков содержат глутамин-

аспарагин обогащѐнные последовательности, т.е. сходны по аминокислотной

последовательности с Htt и являются потенциально амилоидогенными. Эти

данные представлены в нашей совместной статье [Nizhnikov et al., 2014].

Поскольку амилоидогенез является автокаталитическим процессом, на

который влияет небольшое количество дополнительных факторов, многие

вопросы, возникающие при исследовании агрегации и взаимодействия

амилоидов, могут быть решены за счѐт использования адекватных модельных

систем. Мы показали, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной моделью,

предоставляющей уникальные преимущества для исследования взаимодействий

гетерологичных амилоидов in vivo. Белки PrP и Aβ при продукции в дрожжах

формируют агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами в

170

мозге больных млекопитающих (рис. 31). Используя преимущества,

предоставляемые модельным объектом, нам удалось выявить аминокислотные

последовательности, ответственные за взаимодействие агрегатов PrP с пептидом

Aβ.

Подводя итоги, отметим наиболее значимые результаты работы. Показано,

что взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков.

Установлено, что функциональное взаимодействие прионов, может быть описано

в рамках традиционной классификации генных взаимодействий.

Охарактеризовано новое проявление и новая функциональная активность прионов

[PIN+] и [SWI

+]. Разработан метод PSIA, позволяющий выявлять прионы и

амилоиды в масштабах протеома. Этот метод может быть использован для

выявления функциональных и патологических амилоидов различных организмов.

Использование данного метода впервые позволило на основании

экспериментальных данных составить список белков-кандидатов на роль

функциональных амилоидов в дрожжах S. cerevisiae. Показано, что использование

дрожжей в качестве модельной системы предоставляет уникальные преимущества

для анализа взаимодействий гетерологичных амилоидов in vivo.

171

ВЫВОДЫ:

1. Взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков:

взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI

+] приводит к изменению

эффективности терминации трансляции.

2. Прионизация Rnq1 и Swi1 вызывает появление новой функциональной

активности этих белков: [PIN+] изменяет свойства прионных агрегатов

[SWI+], а прионизация Swi1 вызывает супрессию нонсенс-мутации trp1-

289(UAG).

3. Разаботан и апробирован метод протеомного скрининга амилоидов,

позволяющий выявлять и идентифицировать прионы и амилоиды

различных организмов.

4. Выявлены белки, которые формируют детергент-устойчивые агрегаты в

клетках дрожжей и являются кандидатами на роль функциональных

амилоидов.

5. Дрожжи S. cerevisiae являются адекватной моделью, предоставляющей

уникальные преимущества для исследования взаимодействия

гетерологичных амилоидогенных белков - в дрожжевой модельной системе

выявлены короткие последовательности прионного белка млекопитающих,

определяющие специфичность взаимодействия агрегатов PrP с пептидом

Aβ.

172

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ – аденозинтрифосфат

кДа – килодальтон

мкМ – микромоль

ПК – Протеиназа-К

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦРРВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени

СПГ – среда полная, содержащая в качестве источника углерода глицерин

ЦНС – центральная нервная система

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

AB FRET - Acceptor photobleaching fluorescence resonance energy transfer

CFP – Сyan Fluorescent Protein (циановый флуоресцирующий белок)

CUP1 – промотор дрожжевого гена CUP1, активируемый добавлением ионов

меди

DAPI – 4,6- диамидино-2-фенилиндол

DTT – dithiotreitol (дитиотреитол)

EtBr – ethidium bromide (бромистый этидий)

GAL1 – индуцируемый галактозой промотор гена S. cerevisiae GAL1

GFP – Green Fluorescent protein (зелѐный флуоресцирующий белок)

GPD – конститутивный промотор гена S. cerevisiae GPD1

GuHCl – гидрохлорид гуанидина

173

HPLC-MALDI (или LC-MALDI) - Жидкостная хроматография, совмещенная с

масс-спектрометрией

LB – среда Luria-Bertani для культивирования E. coli

MD – дрожжевая минимальная синтетическая среда с глюкозой в качестве

источника углерода

ME – дрожжевая минимальная синтетическая среда с этанолом в качестве

источника углерода

MG – дрожжевая минимальная синтетическая среда с галактозой в качестве

источника углерода

PMSF – phenylmethylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонил флуорид)

PNM –мутации, вызывающие элиминацию приона [PSI+] ([PSI

+] No More)

PSIA – протеомный скрининг амилоидов (Proteomic Screening for Identification of

Amyloid proteins)

Poly-Q – poly-glutamine (аминокислотная последовательность, содержащая

расположенные друг за другом остатки глутамина)

PrP – Prion Protein

PVDF – Polyvinylidene Difluoride membrane (поливинилиден дифтористая

мембрана)

ROI – region of interest (Область фотохимического разложение флуорохрома)

Sc – screpi (амилоидная конформация белка PrP)

SDS – Sodium Dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)

YAPD – дрожжевая питательная среда (1% дрожжевой автолизат, 2% бакто

пептон, 2% глюкоза)

174

YFP – Yellow Fluorescent Protein (желтый флуоресцирующий белок)

YPE – дрожжевая питательная среда (1% дрожжевой экстракт, 2% бакто пептон,

2% этанол)

2D-DIGE - Двумерный разностный гель-электрофорез

175

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Галкин А.П., Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Прионы

дрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. //

Генетика. – 2006. – Т. 42. № 11. – С. 1–13.

2. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Фѐдорова И.В. Сборник методик

по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. – 1984. – 143 с.

3. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления у

Петергофских генетических линий дрожжей. // Генетика. – 1971. – Т. 7. – C.

113–124.

4. Инге-Вечтомов С.Г. Матричный принцип как парадигма современной

генетики // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 1. - С. 9-15.

5. Нижников А.А., А.М. Кондрашкина, А.П. Галкин. Взаимодействие

детерминанта [NSI+] с генами SUP35 и VTS1. // Генетика. - 2013. - Т.49, -

№10, С. 1155-1164.

6. Нижников А.А., Антонец К.С., Инге-Вечтомов С.Г. Амилоиды – от

патогенеза к функции. // Биохимия. – 2015. Т. – 80. - В. 9. - , С. 1356 – 1375.

7. Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В.,

Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного

прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью

инсерционной библиотеки генов. // Молекулярная Биология. - 2009. - Т. 43.

С. 392-399.

8. Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А, Инге-Вечтомов

С.Г., Галкмн А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию

генов на посттранскрипционном уровне. // Молекулярная биология. - 2008. -

Т.42. - №1. - С.123-130.

9. Цапонина О.Е., Лада А.Г., Рубель А.А., Наволоцкая В.В, Петрова И.Т.,

Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Аналз эффектов продукции гибридного

176

белка Аβ-Sup35MC в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. // Экологическая

генетика. - 2005. - Т. 3. - Вып. 1. С. 24-33.

10. Aguzzi A., Sigurdson C., Heikenwalder M. Molecular mechanisms of prion

pathogenesis // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. ¬– 2008. – Vol. 3. – P. 11–40.

11. Ahmed AB, Kajava AV. Breaking the amyloidogenicity code: methods to predict

amyloids from amino acid sequence. // FEBS Lett. – 2013. V. 587. - №8. – P

1089-1095.

12. Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey

identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. //

Cell. - 2009. - Vol. 137. - P. 146-158.

13. Andree C., Sedivy R. Discovery of a letter from Rokitansky to Virchow about

subependymal corpora amylacea. // Virchows Arch. – 2005. – Vol. 446, № 2. – P.

177 - 180.

14. Arslan F., Hong J.Y., Kanneganti V., Park S.K., Liebman S.W. Heterologous

aggregates promote de novo prion appearance via more than one mechanism. //

PLoS Genet. – 2015. – V. 11. - №1. - e1004814.

15. Aviv T., Lin Z., Lau S., Rend L.M., Sicheri F., Smibert C.A. The RNA-binding

SAM domain of Smaug defines a new family of post-transcriptional regulators. //

Nat Struct Biol. – 2003. Vol. 10. - № 8. - P.614-621.

16. Bagriantsev S., Liebman S.W. Specificity of prion assembly in vivo. [PSI+] and

[PIN+] form separate structures in yeast // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279. –

№49. – P. 51042–51048.

17. Bagriantsev S.N., Kushnirov V.V., Liebman S.W. Analysis of amyloid

aggregates using agarose gel electrophoresis // Methods Enzymol. – 2006. – Vol.

412. – P. 33–48.

18. Baiesi M., Seno F., Trovato A. Fibril elongation mechanisms of HET-s prion-

forming domain: topological evidence for growth polarity // Proteins. - 2011. -

Vol. 79. - P. 3067-3081.

19. Balguerie A., Dos Reis S., Ritter C., Chaignepain S., Coulary-Salin B., Forge V.,

Bathany K., Lascu I., Schmitter J.M., Riek R., Saupe S.J. Domain organization

177

and structure-function relationship of the HET-s prion protein of Podospora

anserina. // EMBO J. - 2003. - Vol. 22. - P. 2071-2081.

20. Balguerie A., Dos Reis S., Coulary-Salin B., Chaignepain S., Sabourin M.,

Schmitter J.M., Saupe S.J. The sequences appended to the amyloid core region of

the HET-s prion protein determine higher-order aggregate organization in vivo. //

J. Cell. Sci. - 2004. - Vol. 117. - P. 2599-2610.

21. Ball A.J.S., Wong D.K., Elliott J.J. Glucosamine resistance in yeast. I. A

preliminary genetic analysis. // Genetics. – 1976. Vol. 84. – P. 311–317.

22. Baudin-Baillieu A., Fernandez-Bellot E., Reine F., Coissac E., Cullin C.

Conservation of the prion properties of Ure2p through evolution. // Mol. Biol.

Cell. - 2003. - Vol. 14. - P. 3449-3458.

23. Baxa U. Structural basis of infectous and non-infectous amiloids. // Curr.

Alzheimer Res. - 2008. - V. 5. - P. 308-318.

24. Biéler S., Estrada L., Lagos R., Baeza M., Castilla J., Soto C. (2005). Amyloid

formation modulates the biological activity of a bacterial protein. // J. Biol.

Chem. – 2005. – Vol. 280. № 29. – P. 26880 - 26885.

25. Beisson J., Sonneborn T.M. Cytoplasmic inheritance of the organization of the

cell cortex in Paramecium Aurelia // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1965. – Vol.

53. P. 275-82.

26. Bondarev S.A., Zhouravleva G.A., Belousov M.V., Kajava A.V. Structure-based

view on [PSI(+)] prion properties. // Prion. – 2015. - Vol. 9. -№ 3. P. 190 - 199.

27. Borchsenius A.S., Wegrzyn R.D., Newnam G.P., Inge-Vechtomov S.G., Chernoff

Y.O. Yeast prion protein derivative defective in aggregate shearing and

production of new “seeds” // EMBO J. – 2001. – Vol. 20. – №2. – P. 6683–6691.

28. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding. // Anal.

Biochem. – 1976. – Vol. 72. – P. 248–254.

29. Bremer J., Baumann F., Tiberi C., Wessig C., Fischer H., Schwarz P., Steele

A.D., Toyka K.V., Nave K.A., Weis J., Aguzzi A. Axonal prion protein is

178

required for peripheral myelin maintenance. // Nat. Neurosci. – 2010. - Vol. 13. -

P. 310-318.

30. Brown J.C., Lindquist S. A heritable switch in carbon source utilization driven by

an unusual yeast prion. // Genes Dev. - . 2009. - V. 23. - № 19. - P. 2320-2332.

31. Bueler H., Fischer M., Lang Y., Bluethmann H., Lipp H.P., DeArmond S.J.,

Prusiner S.B., Aguet M., Weissmann C. Normal development and behavior of

mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. // Nature. – 1992. – Vol. 356.

– P. 577–582.

32. Buhimschi IA, Nayeri UA, Zhao G, Shook LL, Pensalfini A, Funai EF, Bernstein

IM, Glabe CG, Buhimschi CS. Protein misfolding, congophilia, oligomerization,

and defective amyloid processing in preeclampsia. // Sci Transl Med. – 2014. –

Vol. 6. - 245ra92.

33. Burns L.G., Peterson C.L. Protein complexes for remodeling chromatin. //

Biochim Biophys Acta. – 1997. Vol. 1350. - № 2. – P. 159-168.

34. Butler D.A., Scott M.R., Bockman J.M., Borchelt D.R., Taraboulos A., Hsiao

K.K., Kingsbury D.T., Prusiner S.B. Scrapie-infected murine neuroblastoma cells

produce protease-resistant prion proteins. // J Virol. – 1988. – V. 62. - №5. - P.

1558 - 1564.

35. Cain C.W., Lohse M.B., Homann O.R., Sil A., Johnson A.D. A conserved

transcriptional regulator governs fungal morphology in widely diverged species.

// Genetics. – 2012. – Vol. 190. № 2. – P. 511 - 521.

36. Caine J., Sankovich S., Antony H., Waddington L., Macreadie P., Varghese J.,

Macreadie I. Alzheimer's Abeta fused to green fluorescent protein induces growth

stress and a heat shock response. // FEMS Yeast Research. – 2007. Vol. 7. P.

1230 - 1236.

37. Cao Q., Huang Y.S., Kan M.C., Richter J.D. Amyloid precursor proteins anchor

CPEB to membranes and promote polyadenylation-induced translation. // Mol

Cell Biol. – 2005. – V. 25. - № 24. – P. 10930- 10939.

38. Castilla J., Saá P., Hetz C., Soto C. In vitro generation of infectious scrapie

prions. // Cell. - 2005. - Vol. 121. - P. 195-206.

179

39. Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G.

Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are

non-lethal. // Mol Genet Genomics. – 2004. – Vol. 272. P. 297-307.

40. Chan C.X., Lipke P.N. Role of force-sensitive amyloid-like interactions in fungal

catch bonding and biofilms. // Eukaryot Cell. - 2014 – V. 13. - №9. - P. 1136-

1142.

41. Chattopadhyay M., Durazo A., Sohn S.H., Strong C.D., Gralla E.B. et al.

Initiation and elongation in fibrillation of ALS-linked superoxide dismutase. //

Proc Natl Acad Sci USA. – 2008. – Vol. 105. – P. 18663–18668.

42. Chen S., Yadav S.P., Surewicz W.K. Interaction between human prion protein

and amyloid-beta (Abeta) oligomers: role OF N-terminal residues. // The Journal

of Biological Chemistry. – 2010. - Vol. 285. – P. 26377 - 26383.

43. Chernoff Y.O. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back? // Mutat

Res. – 2001. – Vol. 488. № 1. P. 39 - 64.

44. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., and Liebman S.

W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like

factor [PSI+] // Science. – 1995. – Vol. 268. – P. 880–884.

45. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a

protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation,

stability, and toxicity of the [PSI] prion. // Mol Cell Biol. – 1999. - Vol. 19. - №

12. P. 8103 - 8112.

46. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy

S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35

protein. // Mol Microbiol. – 2000. – Vol. 35, № 4. – P. 865-76.

47. Chernoff Y.O., Uptain S.M., Lindquist S.L. Analysis of prion factors in yeast. //

Methods Enzymol. – 2002. Vol. 351. – P. 499-538.

48. Chong Y.T., Koh J.L., Friesen H., Duffy K., Cox M.J., Moses A., Moffat J.,

Boone C., Andrews B.J. Yeast Proteome Dynamics from Single Cell Imaging and

Automated Analysis. // Cell. – 2015. – P. 161. № 6. P. 1413 - 1424.

180

49. Christianson T.W., Sikorski R.S., Dante M., Shero J.H., Hieter P. Multifunctional

yeast high-copy-number shuttle vectors. // Gene. - 1992. - Vol. 110. - P. 119-122.

50. Cipollina C., Alberghina L., Porro D., Vai M. SFP1 is involved in cell size

modulation in respiro-fermentative growth conditions. // Yeast. - 2005. - Vol. 22.

- P. 385-399.

51. Coalier K.A., Paranjape G.S., Karki S., Nichols M.R. Stability of early-stage

amyloid-β(1-42) aggregation species. // Biochim Biophys Acta. – 2013. - Vol.

1834. - P. 65 - 70.

52. Cohen E., Bieschke J., Perciavalle R.M., Kelly J.W., Dillin A. Opposing

activities protect against age-onset proteotoxicity. // Science. – 2006. – Vol. 313.

P. 1604 –1610.

53. Costa V., Scorrano L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of

Huntington's disease. // EMBO J. – 2012. – Vol. 31. - № 8. P. 1853–1864.

54. Coughlan C.M., Brodsky J.L. Use of yeast as a model system to investigate

protein conformational diseases. // Molecular Biotechnology. - 2005. - Vol. 30. -

P. 171 - 180.

55. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. The protein product of the het-s

heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a

prion analog. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1997. Vol. 94. - № 18. P. 9773 -

9778.

56. Cox B.S. [PSI], a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. //

Heredity. – 1965. – Vol. 20. – Р. 505–521.

57. Crapeau M., Marchal C., Cullin C., Maillet L. The cellular concentration of the

yeast Ure2p prion protein affects its propagation as a prion. // Mol. Biol. Cell. -

2009. - Vol. 20. - P. 2286-2296.

58. Crow E., Du Z., Li L. New insights into prion biology from the novel [SWI+]

system. // Prion. – 2008. - Vol. 2. № 4. P. 141 - 144.

59. Crow E.T., Du Z., Li L. A small, glutamine-free domain propagates the [SWI(+)]

prion in budding yeast. // Mol Cell Biol. – 2011. - Vol. 31. - № 16. – P. 3436 -

3444.

181

60. Derkatch I. L., Chernoff Y. O., Kushnirov V. V., Inge-Vechtomov S. G.,

Liebman S. W. Genesis and variability of [PSI] prion factors in Saccharomyces

cerevisiae. // Genetics. - 1996. - Vol. 144. P. 1375–1386.

61. Derkatch I.L., Bradley M.E.., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and

environmental factors affecting the de novo appearance of the [PSI+] prion in

Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. – 1997. – Vol. 147. – P. 507 - 519.

62. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-

Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of [PSI(+)] and

[PIN(+)]: a two-prion system in yeast? // EMBO J. – 2000. – Vol. 19. P. 1942 -

1952.

63. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the

appearance of other prions: The story of [PIN]. // Cell. – 2001. – Vol. 106. P. 171

- 182.

64. Derkatch I.L., Uptain S.M., Outeiro T.F., Krishnan R., Lindquist S.L., Liebman

S.W. Effects of Q/N-rich, polyQ, and non-polyQ amyloids on the de novo

formation of the [PSI+] prion in yeast and aggregation of Sup35 in vitro. // Proc

Natl Acad Sci U S A. – 2004. Vol. 101. № 35. P. 12934 - 1299.

65. Derkatch I.L., Liebman S.W. Prion-prion interactions. // Prion. – 2007. – Vol. 1. -

№ 3. P. 161 - 169.

66. Destruelle M., Holzer H., Klionsky D.J. Identification and characterization of a

novel yeast gene: the YGP1 gene product is a highly glycosylated secreted protein

that is synthesized in response to nutrient limitation. // Mol Cell Biol. – 1994. –

Vol. 4. - P. 2740 - 2754.

67. Devi L, Alldred M.J., Ginsberg S.D., Ohno M. Mechanisms underlying insulin

deficiency-induced acceleration of β-amyloidosis in a mouse model of

Alzheimer's disease. // PLoS One. – 2012. – Vol. 7. № 3. - e32792.

68. Drillien R., Aigle M., Lacroute F. Yeast mutants pleiotropically impaired in the

regulation of the two glutamate dehydrogenases. // Biochem. Biophys. Res.

Commun. - 1973. - Vol. 53. - P. 367-372.

182

69. Du Z., Park K.W., Yu H., Fan Q., Li L. Newly identified prion linked to the

chromatin-remodeling factor Swi1 in Saccharomyces cerevisiae // Nat Genet. -

2008. - Vol.40. - P. 460-465.

70. Du Z., Crow E.T., Kang H.S., Li L. Distinct subregions of Swi1 manifest striking

differences in prion transmission and SWI/SNF function. // Mol Cell Biol. –

2010. - Vol. 30. - № 19. - P. 4644 - 4655.

71. Du Z, Li L. Investigating the interactions of yeast prions: [SWI+], [PSI+], and

[PIN+]. // Genetics. – 2014. Vol. 197. - № 2. – P. 685-700.

72. Duennwald M.L., Jagadish S., Giorgini F., Muchowski P.J., Lindquist S. A

network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. // Proc Natl

Acad Sci USA. – 2006. - Vol. 103. P. 11051 - 11056.

73. Edskes H.K., Wickner R.B. Conservation of a portion of the S. cerevisiae Ure2p

prion domain that interacts with the full-length protein. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 16384-16391.

74. Eisele Y.S., Obermuller U., Heilbronner G., Baumann F., Kaeser S.A., et al.

Peripherally applied Aβ-containing inoculates induce cerebral beta-

amyloidosis. // Science. - 2010. - Vol. 330. P. 980 – 982.

75. Eisenberg D., Jucker M. The amyloid state of proteins in human diseases. // Cell.

– 2012. V. 148. - №6. – P. 1188-1203.

76. Elam J.S., Taylor A.B., Strange R., Antonyuk S., Doucette P.A et al. Amyloid-

like filaments and water-filled nanotubes formed by SOD1 mutant proteins linked

to familial ALS. // Nat Struct Biol. -2003. - Vol. 10. - № 6. – P. 461 - 467.

77. Emanuele M., Chieregatti E. Mechanisms of alpha-synuclein action on

neurotransmission: cell-autonomous and non-cell autonomous role. //

Biomolecules. – 2015. – Vol. 5. – 2. – P. 865 - 892.

78. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A.,

Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like

protein of yeast. // Biochem. J. -1999. -Vol. 338. - P. 403 - 407.

183

79. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination of the

yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation

// Mol.Microbiol. – 2001. – Vol.40. – P. 1357–1369.

80. Fluharty B.R., Biasini E., Stravalaci M., Sclip A., Diomede L. et al. An N-

terminal fragment of the prion protein binds to amyloid-β oligomers and inhibits

their neurotoxicity in vivo. // J Biol Chem. – 2013. - Vol. 288. № 11. P. 7857 -

7866.

81. Fowler D.M., Koulov A.V., Alory-Jost C., Marks M.S., Balch W.E., Kelly J.W.

Functional amyloid formation within mammalian tissue. // PLoS Biol. – 2006. –

Vol. 4. № 1. - e6.

82. Freir D.B., Nicoll A.J., Klyubin I., Panico S., Mc Donald J.M. Interaction

between prion protein and toxic amyloid β assemblies can be therapeutically

targeted at multiple sites. // Nat Commun. -2011. – Vol. 2. P. 336.

83. Furukawa Y., Kaneko K., Watanabe S., Yamanaka K., Nukina N. Intracellular

seeded aggregation of mutant Cu,Zn-superoxide dismutase associated with

amyotrophic lateral sclerosis. // FEBS Lett. – 2013. Vol. 587. - № 16. – P. 2500 -

2505.

84. Gajdusek D.C. The transmissible amyloidoses: genetical control of spontaneous

generation of infectious amyloid proteins by nucleation of configurational change

in host precursors: kuru-CJD-GSS-scrapie-BSE. // Eur J Epidemiol. – 1991. – V.

7. - №5. – P. 567-577.

85. Gajdusek D.C., Gibbs C.J., Jr, Alpers M. Experimental transmission of a kuru-

like syndrome to chimpanzees. // Nature. – 1966. – Vol. 209. Vol. 794 – 796.

86. García R., Bermejo C., Grau C., Pérez R., Rodríguez-Peña J.M. et al. The global

transcriptional response to transient cell wall damage in Saccharomyces

cerevisiae and its regulation by the cell integrity signaling pathway. // J Biol

Chem. – 2004. - Vol. 279. - № 15. – P. 15183 - 15195.

87. Ghaemmaghami S., Huh W.K., Bower K., Howson R.W., Belle A. et al. Global

analysis of protein expression in yeast. // Nature. – 2003. - Vol. 425. - № 6959. –

P. 737 - 741.

184

88. Giasson, B.I., Forman, M.S., Higuchi, M., Golbe, L.I., Graves et al. Initiation and

synergistic fibrillization of tau and alpha-synuclein. // Science. - 2003. - V. 300. -

№ 5619. - P. 636-640.

89. Gibbs C.J.Jr, Gajdusek D.C., Asher D.M., Alpers M.P., Beck E. et al.

Creutzfeldt-Jakob disease (spongiform encephalopathy): transmission to the

chimpanzee. // Science. – 1968. - Vol. 161. - P. 388 – 389.

90. Glenner G.G., Wong C.W. Alzheimer's disease: initial report of the purification

and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. // Biochem

Biophys Res Commun. – 1984. - Vol. 120. – P. 885 - 890.

91. Goate A., Hardy J. Twenty years of Alzheimer's disease-causing mutations. // J

Neurochem. – 2012. - V. 120. – Suppl. №1. P. 3-8.

92. Goedert M., Spillantini M.G., Del Tredici K., Braak H. 100 years of Lewy

pathology. // Nat Rev Neurol. – 2012. Vol. 9. P. 13 – 24.

93. Gong H., Romanova N.V., Allen K.D., Chandramowlishwaran P., Gokhale K. et

al. Polyglutamine toxicity is controlled by prion composition and gene dosage in

yeast. // PLoS Genet. – 2012. – Vol. 8. - № 4. - e1002634.

94. Grishin A.V., Rothenberg M., Downs M.A., Blumer K.J. Mot3, a Zn finger

transcription factor that modulates gene expression and attenuates mating

pheromone signaling in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. - 1998. - Vol.

149. - P. 879-892.

95. Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Tung Y-C, Quinlan M., Wisniewski H.M., Binder L.I.

Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau in

Alzheimer cytoskeletal pathology. // Proc Natl Acad Sci. USA. - 1986. - Vol. 83.

– P. 4913–4917.

96. Gruschus J.M. Do amyloid oligomers act as traps for misfolded proteins? A

hypothesis. // Amyloid. – 2008. Vol. 15. - № 3. – P. 160 - 165.

97. Gu L., Liu C., Stroud J.C., Ngo S,, Jiang L,, Guo Z. Antiparallel triple-strand

architecture for prefibrillar Aβ42 oligomers. // J Biol Chem. – 2014. – V. 289. -

№39. – P. 27300-27313.

185

98. Halfmann R., Alberti S., Lindquist S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic

diversity. // Trends Cell Biol. – 2010. - Vol. 20. - № 3. -P. 125–133.

99. Halfmann R., Jarosz D.F., Jones S.K., Chang A., Lancaster A.K., Lindquist S.

Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. //

Nature. – 2012. - Vol. 482. - № 7385. – P. 363–368.

100. Hamada K., Fukuchi S., Arisawa M., Baba M., Kitada K. Screening for

glycosylphosphatidylinositol (GPI)-dependent cell wall proteins in

Saccharomyces cerevisiae. // Mol Gen Genet. – 1998. – Vol. 258. № 1 – 2. P. 53 -

59.

101. Harrison P.M., Gerstein M. A method to assess compositional bias in

biological sequences and its application to prion-like glutamine/asparagine-rich

domains in eukaryotic proteomes. // Genome Biol. – 2003. – Vol. 4. № 6. - R40.

102. Heikenwalder M., Julius C., Aguzzi A. Prions and peripheral nerves: a

deadly rendezvous // J Neurosci. – 2007. – Vol. 85. – P. 2714–2725.

103. Heinrich S.U., Lindquist S. Protein-only mechanism induces self-

perpetuating changes in the activity of neuronal Aplysia cytoplasmic

polyadenylation element binding protein (CPEB). // Proc Natl Acad Sci U S A. –

2011. - V. 108. - № 7. – P. 2999-3004.

104. Higurashi T., Hines J.K., Sahi C., Aron R., Craig E.A. Specificity of the J-

protein Sis1 in the propagation of 3 yeast prions. // Proc Natl Acad Sci U S A. –

2008. – Vol. 105. - № 43. - P. 16596 - 16601.

105. Hines J.K., Li X., Du Z., Higurashi T., Li L., Craig E.A. [SWI], the prion

formed by the chromatin remodeling factor Swi1, is highly sensitive to alterations

in Hsp70 chaperone system activity. // PLoS Genet. – 2011. – Vol. 7. - № 2. -

e1001309.

106. Holmes D., Lancaster A.K., Lindquist S., Halfmann R. Heritable

remodeling of yeast multicellularity by an environmentally responsive prion. //

Cell. – 2013. - Vol. 153. - № 1. – P. 153 - 165.

186

107. Hou F., Sun L., Zheng H., Skaug B., Jiang Q.X., Chen Z.J. MAVS forms

functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune

response. // Cell. – 2011. - Vol. 146. – P. 448 – 461.

108. Huh W.K., Falvo J.V., Gerke L.C., Carroll A.S. et al. Global analysis of

protein localization in budding yeast. // Nature. – 2003. - Vol. 425. - № 6959. – P.

686 - 691.

109. Humenik M., Smith A.M., Arndt S., Scheibel T. Ion and seed dependent

fibril assembly of a spidroin core domain. // J Struct Biol. – 2015. - pii: S1047-

8477. № 15. P. 30025 - 30033.

110. Inge-Vechtomov S.G. Yeast prions as a model of neurodegenerative

infectious amyloidoses in humans. // Ontogenez. - 2011. – V. 5. – P. 337-345.

111. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High Efficiency transformation of

Esherichia coli with plasmids. Gene. – 1990. – Vol. 96. – P. 23–28.

112. Iqbal K, Liu F, Gong CX, Alonso Adel C, Grundke-Iqbal I. Mechanisms of

tau-induced neurodegeneration. // Acta Neuropathol. – 2009. – V. 118. - №1. - P.

53 - 69.

113. Irizarry M.C., Soriano F., McNamara M., Page K.J., Schenk D. et al., Aβ

deposition is associated with neuropil changes, but not with overt neuronal loss in

the human amyloid precursor protein V717F (PDAPP) transgenic mouse. // J

Neurosci. – 1997. - Vol. 17. - 7053 – 7059.

114. Iwatsubo T., Odaka A., Suzuki N., Mizusawa H., Nukina H., Ihara Y.

Visualization of Aβ42(43) and Aβ40 in senile plaques with end-specific Aβ

monoclonals: Evidence that an initially deposited species is Aβ42(43). // Neuron.

- 1994. – Vol. 13. – P. 45–53.

115. Jarosz D.F., Lancaster A.K., Brown J.C., Lindquist S. An evolutionarily

conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to

generalists. // Cell. - 2014. – Vol. 158. -№ 5. - P. 1072 - 1082.

116. Jensen R., Sprague G.F. Jr, Herskowitz I. Regulation of yeast mating-type

interconversion: feedback control of HO gene expression by the mating-type

locus. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1983. - Vol. 80. - № 10. – P. 3035 - 3039.

187

117. Joshi P., Benussi L., Furlan R., Ghidoni R., Verderio C. Extracellular

vesicles in Alzheimer's disease: friends or foes? Focus on Aβ-vesicle interaction.

// Int J Mol Sci. – 2015. – Vol. 16. - № 3. - P. 4800 - 4813.

118. Kadnar M.L., Articov G., Derkatch I.L. Distinct type of transmission

barrier revealed by study of multiple prion determinants of Rnq1. // PLoS Genet.

– 2010. - Vol. 6. - № 1. - e1000824.

119. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. N.Y.: Cold

Spring Harbor Lab. Press. – 1994. – 234 p.

120. Kajava AV1, Baxa U, Steven AC. Beta arcades: recurring motifs in

naturally occurring and disease-related amyloid fibrils. // FASEB J. – 2010. - V.

5. - P. 1311-1399.

121. Kalebina T.S., Plotnikova T.A., Gorkovskii A.A., Selyakh I.O.,

Galzitskaya O.V. et al, Amyloid-like properties of Saccharomyces cerevisiae cell

wall glucantransferase Bgl2p: prediction and experimental evidences. // Prion. –

2008. - V. 2. - № 2. - P. 91-96.

122. Kallmeyer AK, Keeling KM, Bedwell DM. Eukaryotic release factor 1

phosphorylation by CK2 protein kinase is dynamic but has little effect on the

efficiency of translation termination in Saccharomyces cerevisiae. // Eukaryot

Cell. – 2006. – Vol. 5. - № 8. – P. 1378 - 1387.

123. Keeling K.M., Lanier J., Du M., Salas-Marko J., Gao L. et al. Leaky

termination at premature stop codons antagonizes nonsense-mediated mRNA

decay in S. cerevisiae. // RNA. – 2006. - Vol. 10. P. 691 - 703.

124. Kelly A.C., Wickner R.B. Saccharomyces cerevisiae: a sexy yeast with a

prion problem. // Prion. – 2013. – Vol. 7. - № 3. – P. 215 - 220.

125. Kenney J.M., Knight D., Wise M.J., Vollrath F. Amyloidogenic nature of

spider silk. // Eur J Biochem. – 2002. – V. 269. - № 16. - P. 4159-4163.

126. Kiktev D, Moskalenko S, Murina O, Baudin-Baillieu A, Rousset JP,

Zhouravleva G. The paradox of viable sup45 STOP mutations: a necessary

equilibrium between translational readthrough, activity and stability of the

protein. // Mol Genet Genomics. – 2009. Vol. 282. № 1. P. 83-96.

188

127. King C.Y. and Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast

prion strains. // Nature. - 2004. - Vol. 428. - P. 319-323.

128. Knowles T.P., Vendruscolo M., Dobson C.M. The amyloid state and its

association with protein misfolding diseases. // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2014. –

Vol. 15. № 6. – P. 384 - 396.

129. Kochneva-Pervukhova N.V., Alexander I. Alexandrov, Michael D. Ter-

Avanesyan. Amyloid-Mediated Sequestration of Essential Proteins Contributes to

Mutant Huntingtin Toxicity in Yeast. // PLoS One. – 2012. – Vol. 7. - № 1. -

e29832.

130. Kovacs G.G., Zerbi P., Voigtlander T., Strohschneider M., Trabattoni G. et

al. The prion protein in human neurodegenerative disorders. // Neurosci. Lett. -

2002. - V. 329. - № 3. - P. 269-272.

131. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov

V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers

fragmented by Hsp104. // J Biol Chem. – 2003. – Vol. 278. - № 49. – P. 49636 -

49643.

132. Kryndushkin D.S., Pripuzova N., Burnett B.G., Shewmaker F. Non-

targeted identification of prions and amyloid-forming proteins from yeast and

mammalian cells. // J Biol Chem. – 2013. – Vol. 288. – P. 27100 - 27111.

133. Kuchin S., Vyas V.K., Kanter E., Hong S.P., Carlson M. Std1p (Msn3p)

positively regulates the Snf1 kinase in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. –

2003. – Vol. – 163. - P 507 - 514.

134. Kudo W., Petersen R.B., Lee H.G.. Cellular prion protein and Alzheimer

disease: link to oligomeric amyloid-beta and neuronal cell death. // Prion. – 2013.

– Vol. 7. – P. 114 - 116.

135. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telcov M.V., Surguchov A.P.,

Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35)

gene of Saccharomyces cerevisiae. // Gene. – 1988. – Vol. 66. – P. 45–54.

136. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast

prions // Cell. – 1998. – Vol. 94. – P. 13–16.

189

137. Kushnirov V.V., Alexandrov I.M., Mitkevich O.V., Shkundina I.S., Ter-

Avanesyan M.D. Purification and analysis of prion and amyloid aggregates. //

Methods. – 2006. - Vol. – 39. P. 50 - 55.

138. Kushnirov V.V., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan

M.D. Prion and nonprion amyloids: a comparison inspired by the yeast Sup35

protein. // Prion. – 2007. – Vol. 1, № 3. – P. 179 - 184.

139. Labbe-Bois R. The ferrochelatase from Saccharomyces cerevisiae.

Sequence, disruption, and expression of its structural gene HEM15. // J Biol

Chem. - 1990. - Vol. 265. – P. 7278-7283.

140. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake

in yeast // J Bacteriol. – 1971. – Vol. 106. – №2. – P. 519–522.

141. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227. – P. 680–685.

142. Lansbury P.T., Caughey B. The chemistry of scrapie reaction: the “ice 9”

metaphore. // Chem. Biol. – 1995. - Vol. 2. - P. 1–5.

143. Lansbury P.T. Jr., Costa P.R., Griffiths J.M., Simon E.J., Auger M. et al.

Structural model for the beta-amyloid fibril based on interstrand alignment of an

antiparallel-sheet comprising a C-terminal peptide. // Nat Struct Biol. – 1995. -

Vol. 2, №11. – P. 990 - 998.

144. Lasagna-Reeves C.A., Castillo-Carranza D.L., Sengupta U, Guerrero-

Munoz MJ, Kiritoshi T. et al. Alzheimer brain-derived tau oligomers propagate

pathology from endogenous tau. // SciRep. – 2012. - Vol. 2. - e700.

145. Laurén J., Gimbel D.A., Nygaard H.B., Gilbert J.W., Strittmatter S.M.

Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta

oligomers // Nature. - 2009. - Vol. 457. - P. 1128-1132.

146. Lee C.Y., Cantle J.P., Yang X.W. Genetic manipulations of mutant

huntingtin in mice: new insights into Huntington's disease pathogenesis. // FEBS

J. – 2013. Vol. 280, № 18. – P. 4382 - 4394.

190

147. Li X., Rayman J.B., Kandel E.R., Derkatch I.L. Functional role of

Tia1/Pub1 and Sup35 prion domains: directing protein synthesis machinery to the

tubulin cytoskeleton. // Mol Cell. – 2014. – Vol. 55, № 2. – P. 305 - 318.

148. Liebman S.W., Sherman F. Extrachromosomal psi+ determinant suppresses

nonsense mutations in yeast // J. Bacteriol. - 1979. - Vol. 139. - P. 1068 - 1071.

149. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-

only' inheritance in yeast. // Nature. – 1999. Vol. 400, № 6744. – P. 573 - 576.

150. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using

real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. // Methods. –

2001. – V. 25, №4. – P. 402 - 408.

151. Lohr D., Venkov P., Zlatanova J. Transcriptional regulation in the yeast

GAL gene family: a complex genetic network. // FASEB J. – 1995. – Vol. 9, №

9. – P. 777 - 787.

152. Luk K. C., Kehm V., Carroll J., et al. Pathological α-synuclein transmission

initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. // Science. –

2012. – Vol. 338, № 6109. – P. 949–953.

153. Ma J., Lindquist, S. De novo generation of a PrPSc-like conformation in

living cells // Nat. Cell Biol. - 1999. - V. 1, № 6. - P. 358-361.

154. Majd S., Chegini F., Chataway T., Zhou X.F., Gai W. Reciprocal induction

between α-synuclein and β-amyloid in adult rat neurons. // Neurotox Res. – 2013.

– Vol. 23. № 1. – P. 69-78.

155. Maji S.K., Perrin M.H., Sawaya M.R., Jessberger S., Vadodaria K. et al.

Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory

granules. // Science. – 2009. – V. 325, №5938. - P. 328-332.

156. Majumdar A., Cesario W.C., White-Grindley E., Jiang H., Ren F.. et al.

Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of

memory. // Cell. – 2012. – V. 148, №3. – P. 515- 529.

157. Makarava N., Kovacs G.G., Bocharova O., Savtchenko R., Alexeeva I. et

al. Recombinant prion protein induces a new transmissible prion disease in wild-

type animals // Acta Neuropathol. - 2010. - Vol. 119. - P. 177-187.

191

158. Maldonado T.A., Jones R.E., Norris D.O. Distribution of beta-amyloid and

amyloid precursor protein in the brain of spawning (senescent) salmon: a natural,

brain-aging model. // Brain Res. – 2000. – Vol. 858, № 2. P. 237 - 251.

159. Maldonado T.A., Jones R.E., Norris D.O. Timing of neurodegeneration and

beta-amyloid (Abeta) peptide deposition in the brain of aging kokanee salmon. //

J Neurobiol. – 2002a. – Vol. 53, № 1. – P. 21 - 35.

160. Maldonado T.A., Jones R.E., Norris D.O. Intraneuronal amyloid precursor

protein (APP) and appearance of extracellular beta-amyloid peptide (abeta) in the

brain of aging kokanee salmon. // J Neurobiol. – 2002b. - Vol. 53, № 1. - P. 11 -

20.

161. Mallik S., Yang W., Norstrom E.M., Mastrianni J.A. Live cell fluorescence

resonance energy transfer predicts an altered molecular association of

heterologous PrPSc

with PrPC. // The Journal of Biological Chemistry. - 2010. –

Vol. 285. – P. 8967 - 875.

162. Marchante R., Rowe M., Zenthon J., Howard M.J., Tuite M.F.. Structural

definition is important for the propagation of the yeast [PSI+] prion. // Mol Cell.

– 2013. – Vol. 50, № 5. P. 675 - 685.

163. Marion R.M., Regev A., Segal E., Barash Y., Koller D. et al. Sfp1 is a

stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression. //

Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2004. - V. 101. - P. 14315-14322.

164. Masison D.C., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and

protease resistance of Ure2p in prion-containing cells // Science. - 1995. - Vol.

270. - P. 93-95.

165. Mason RP, Giorgini F. Modeling Huntington disease in yeast: perspectives

and future directions. // Prion. – 2011. – Vol. 5. – P. 269 - 276.

166. Mastushita-Sakai T., White-Grindley E., Samuelson J., Seidel C., Si K.

Drosophila Orb2 targets genes involved in neuronal growth, synapse formation,

and protein turnover. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2010. – V. 107, №26. – P.

11987 - 11992.

192

167. Masuda-Suzukake M., Nonaka T., Hosokawa M., Oikawa T., Arai T. et al.

Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. // Brain. – 2013. – Vol.

136. – P. 1128–1138.

168. McKinley M.P., Bolton D.C., Prusiner S.B. A protease-resistant protein is a

structural component of the scrapie prion. // Cell. – 1983. - Vol. 35. – P. 57 - 62.

169. McLaurin J., Yang D., Yip C.M., Fraser P.E. Review: modulating factors

in amyloid-beta fibril formation. // J Struct Biol. – 2000. – V. 130, №2-3. – P.

259 - 270.

170. Medina M., Avila J. The role of extracellular Tau in the spreading of

neurofibrillary pathology. // Front Cell Neurosci. – 2014. Vol. 8. - e113.

171. Meriin A.B., Zhang X., He X., Newnam G.P., Chernoff Y.O., et al.

Huntingtin toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation

mediated by a prion-like protein Rnq. // J Cell Biol. – 2002. – Vol. 157. - P. 997 –

1004.

172. Meyer-Luehmann M., Coomaraswamy J., Bolmont T., Kaeser S., Schaefer

C., et al. Exogenous induction of cerebral β-amyloidogenesis is governed by

agent and host. // Science. – 2006. – Vol. 313. – P. 1781 – 84.

173. Mitchell A.P., Magasanik B. Three regulatory systems control production

of glutamine synthetase in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell. Biol. - 1984. -

Vol. 4. - P. 2767-2773.

174. Morales R., Abid K., Soto C. The prion strain phenomenon: molecular

basis and unprecedented features // Biochim Biophys Acta. - 2007. - Vol. 1772. -

P. 681 - 691.

175. Morales R., Estrada L.D., Diaz-Espinoza R., Morales-Scheihing D., Jara

M.C. et al. Molecular cross talk between misfolded proteins in animal models of

Alzheimer's and prion diseases. // J Neurosci. – 2010. – Vol. 30. № 13. – P. 4528

- 4535.

176. Morales R., Duran-Aniotz C., Castilla J., Estrada L.D., Soto C. De novo

induction of amyloid-β deposition in vivo. // Mol Psychiatry. – 2012. - Vol. 17. –

P. 1347 – 53.

193

177. Moriyama H., Edskes H.K., Wickner R.B. [URE3] prion propagation in

Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hsp104 and curing by

overexpressed chaperone Ydj1p // Mol Cell Biol. – 2000. – Vol. 20. – P. 8916 –

8922.

178. Moskalenko S.E., Chabelskaya S.V., Inge-Vechtomov S.G., Philippe M.,

Zhouravleva G.A. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of

Saccharomyces cerevisiae. // BMC Mol Biol. - 2003. – Vol. 4. - e2.

179. Murakami T., Muhammad N., Inoshima Y., Yanai T., Goryo M., Ishiguro

N. Experimental induction and oral transmission of avian AA amyloidosis in

vaccinated white hens. // Amyloid. – 2013. – Vol. 20, № 2. – P. 80 – 85.

180. Narwa R., Harris D.A. Prion proteins carrying pathogenic mutations are

resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors. // Biochemistry. –

1999. – Vol. 38. № 27. – P. 8770 - 8777.

181. Nasmyth K. The determination of mother cell-specific mating type

switching in yeast by a specific regulator of HO transcription. // EMBO J. – 1987.

– Vol. 6, № 1. – P. 243 - 248.

182. Nathanson N., Wilesmith J., Griot C. Bovine spongiform encephalopathy

(BSE): causes and consequences of a common source epidemic. // Am J

Epidemiol. – 1997. – Vol. 145, № 11. – P. 959 - 969.

183. Nevzglyadova O.V., Artemov A.V., Mittenberg A.G., Solovyov K.V.,

Kostyleva EI et al. Prion-associated proteins in yeast: comparative analysis of

isogenic [PSI(+)] and [psi(-)] strains. // Yeast. – 2009. – V. 26, № 11. – P. 611 -

631.

184. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic

interactions between yeast chaperones Hsp104 and Hsp70 in prion curing. // Mol

Cell Biol. – 1999. – Vol. 19, № 2. – P. 1325 - 1333.

185. Nicotera P. A route for prion neuroinvasion. // Neuron. - 2001. – V. 31. –

P. 345-348.

186. Nizhnikov A.A., Magomedova Z.M., Rubel A.A., Kondrashkina A.M.,

Inge-Vechtomov S.G., Galkin A.P. [NSI+] determinant has a pleiotropic

194

phenotypic manifestation that is modulated by SUP35, SUP45, and VTS1 genes.

// Curr Genet. – 2012. – Vol. 58, № 1. – P. 35 - 47.

187. Nizhnikov A.A., Alexandrov A.I., Ryzhova T.A., Mitkevich O.V.,

Dergalev A.A., Ter-Avanesyan M.D., Galkin A.P. Proteomic Screening for

Amyloid Proteins. // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, № 12. - e116003.

188. Nuoffer C., Jeno P., Conzelmann A., Riezman H. Determinants for

glycophospholipid anchoring of the Saccharomyces cerevisiae GAS1 protein to

the plasma membrane. // Mol Cell Biol. – 1991. Vol. 11, № 1. – P. 27 - 37.

189. Oakley H., Cole S.L., Logan S., Maus E., Shao P. et al. Intraneuronal β-

amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with

five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque

formation. // J Neurosci. – 2006. – Vol. 26. – P. 10129 – 10140.

190. Ohno M., Chang L., Tseng W., Oakley H., Citron M., et al. Temporal

memory deficits in Alzheimer's mouse models: rescue by genetic deletion of

BACE1. // Eur J Neurosci. – 2006. – Vol. 23. – P. 251–260.

191. Ohno M., Cole S.L., Yasvoina M., Zhao J., Citron M., et al. BACE1 gene

deletion prevents neuron loss and memory deficits in 5XFAD APP/PS1

transgenic mice. // Neurobiol Dis. - 2007. – Vol. 26. – P. 134 –145.

192. Orlowska-Matuszewska G., Wawrzycka D. A novel phenotype of eight

spores asci in deletants of the prion-like Rnq1p in Saccharomyces cerevisiae //

Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006. - Vol. 340. - P. 190-193.

193. O'Rourke T.W., Loya T.J., Head P.E., Horton J.R., Reines D. Amyloid-like

assembly of the low complexity domain of yeast Nab3. // Prion. – 2015. - V. 9,

№1. - P 34 - 47.

194. Osherovich L.Z., Weissman J.S. Multiple Gln/Asn-rich prion domains

confer susceptibility to induction of the yeast [PSI(+)] prion. // Cell. - 2001. –

Vol. 106. – P. 183 – 194.

195. Osherovich L.Z., Cox B.S., Tuite M.F., Weissman J.S. Dissection and

design of yeast prions // PLoS. Biol. - 2004. - Vol. 2. - P. 442-451.

195

196. Otoo H.N., Lee K.G., Qiu W., Lipke P.N. Candida albicans Als adhesins

have conserved amyloid-forming sequences. // Eukaryot Cell. – 2008. – V.7, №5.

– P. 776 - 782.

197. Pan K.M., Baldwin M., Nguyen J., Gasset M., Serban A. et al. Conversion

of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion

proteins // Proc Natl Acad Sci USA. – 1993. – Vol. 90, №23. – P. 10962 – 10966.

198. Patel B.K., Liebman S.W. "Prion-proof" for [PIN+]: infection with in vitro-

made amyloid aggregates of Rnq1p-(132-405) induces [PIN+] // J Mol Biol. –

2007. – Vol. 365, №3. – P. 773–782.

199. Patel B.K., Gavin-Smyth J., Liebman S.W. The yeast global transcriptional

co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion. // Nat Cell Biol. - 2009. –

Vol. 11. – P. 344 – 349.

200. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion

hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. // Science. – 1996. – Vol.

273, № 5275. - P. 622 - 626.

201. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D.

Interaction between yeast Sup45p (eRF1) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain

release factors: implications for prion-dependent regulation. // Mol Cell Biol. –

1997. – Vol. 17, № 5. – P. 2798 - 2805.

202. Peterson C.L., Herskowitz I. Characterization of the yeast SWI1, SWI2,

and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription. // Cell. - 1992.

– Vol. 68, № 3. – P. 573 - 583.

203. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., Ide S.E., Dehejia A. et al.

Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's

disease. // Science. – 1997. – Vol. 276. – P. 2045 – 2047.

204. Porzoor A., Macreadie I.G. Application of yeast to study the tau and

amyloid-β abnormalities of Alzheimer's disease. // J Alzheimers Dis. – 2013. –

Vol. 35, № 2. – P. 217 - 225.

205. Poulopoulos M., Levy O.A., Alcalay R.N. The neuropathology of genetic

Parkinson's disease.// Mov Disord. – 2012. – Vol. 27. – P. 831 – 842.

196

206. Pratt-Hyatt M., Pai D.A., Haeusler R.A., Wozniak G.G., Good P.D. et al.

Mod5 protein binds to tRNA gene complexes and affects local transcriptional

silencing. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2013. – Vol. 110. № 33. – P. 3081 -

3089.

207. Prusiner S.B. Scrapie prions // Am. Rev. Microbiol. – 1989. – Vol. 43. – Р.

345 – 374.

208. Prusiner S.B. Shattuck lecture-neurodegenerative diseases and prions // N

Engl J Med. – 2001. – V. 344, №20. – P.1516 – 1526.

209. Prusiner S.B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. //

Annu Rev Genet. – 2013. – Vol. 47. - P. 601 - 23.

210. Prusiner S.B., Scott M.R. Genetics of prions // Annu Rev Genet. – 1997. –

Vol. 31. – Р. 139 – 175.

211. Radovanovic I., Braun N., Giger O.T., Mertz K., Miele G. et al. Truncated

prion protein and Doppel are myelinotoxic in the absence of oligodendrocytic

PrPC. // J Neurosci. - 2005. - Vol. 25. - P. 4879-4888.

212. Rank K.B., Pauley A.M., Bhattacharya K., Wang Z., Evans D.B. Direct

interaction of soluble human recombinant tau protein with Abeta 1-42 results in

tau aggregation and hyperphosphorylation by tau protein kinase II // FEBS Lett. -

2002. - Vol. 514, № 2-3. - P. 263-268.

213. Raveendra B.L., Siemer A.B., Puthanveetti S.V., Hendrickson W.A.,

Kandel E.R., McDermott A.E. Characterization of prion-like conformational

changes of the neuronal isoform of Aplysia CPEB. // Nat Struct Mol Biol. – 2013.

– Vol. 20, № 4. – P. 495 - 501.

214. Ren P.H., Lauckner J.E., Kachirskaia I., Heuser J.E., Melki R., Kopito R.R.

Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by

polyglutamine aggregates. // Nat Cell Biol. – 2009. – Vol. 11. – P. 219 – 25.

215. Resenberger U.K., Harmeier A., Woerner A.C., Goodman J.L., Müller V.

et al. The cellular prion protein mediates neurotoxic signalling of β-sheet-rich

conformers independent of prion replication. // EMBO J. - 2011 - Vol. 30. - P.

2057 - 2070.

197

216. Roberson E.D., Scearce-Levie K., Palop J.J., Yan F., Cheng I.H. et al.

Reducing endogenous tau ameliorates amyloid β-induced deficits in an

Alzheimer’s disease mouse model. // Science. - 2007. – Vol. 316. P. 750 – 754.

217. Roberts B.T., Wickner R.B. Heritable activity: a prion that propagates by

covalent autoactivation // Genes Dev. – 2003. – Vol. 17, №17. – P. 2083 – 2087.

218. Rogoza T., Goginashvili A., Rodionova S., Ivanov M., Viktorovskaya O.,

et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form

of the global transcriptional regulator Sfp1. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2010. –

Vol. 107. – P. 10573 - 10577.

219. Rolli E., Ragni E., Rodriguez-Pena J.M., Arroyo J., Popolo L. GAS3, a

developmentally regulated gene, encodes a highly mannosylated and inactive

protein of the Gas family of Saccharomyces cerevisiae. // Yeast. – 2010. – Vol.

27, № 8. – P. 597 - 610.

220. Romanova N.V., Chernoff Y.O. Hsp104 and prion propagation. // Protein

Pept Lett. – 2009. - V. 16, №6. – P. 598-605.

221. Rose M.D., Winstone F., Hieter P. Methods in yeast genetics // CSHL

Press. – 1990. – 198 p.

222. Rosen R.F., Fritz J.J., Dooyema J., Cintron A.F., Hamaguchi T., et al.

Exogenous seeding of cerebral β-amyloid deposition in βAPP-transgenic rats. // J

Neurochem. – 2012. – Vol. 120. – P. 660 – 666.

223. Roszik J., Toth G., Szollosi J., Vereb G. Validating pharmacological

disruption of protein-protein interactions by acceptor photobleaching FRET

imaging. // Methods Mol Biol. – 2013, № 986. – P. 165 - 178.

224. Ruan Q.X., Zhou P., Hu B.W., Ji D. An investigation into the effect of

potassium ions on the folding of silk fibroin studied by generalized two-

dimensional NMR-NMR correlation and Raman spectroscopy. // FEBS J. – 2008.

– V. 275. №2. - P. 219-232.

225. Rubel A.A., Ryzhova T.A., Antonets K.S., Chernoff Y.O, Galkin, A.P.

Identification of PrP sequences essential for the interaction between the PrP

198

polymers and Aβ peptide in a yeast-based assay. // Prion. – 2013. – Vol. 7, № 6. –

P. 469 - 476.

226. Saifitdinova A.F., Nizhnikov A.A., Lada A.G., Rubel A.A, Magomedova

Z.M., Ignatova V.V., Inge-Vechtomov S.G., Galkin A.P. [NSI+]: a novel non-

Mendelian nonsense suppressor determinant in Saccharomyces cerevisiae. // Curr

Genet. – 2010. – Vol. 56, № 5. – P. 467 - 478.

227. Sipe J.D., Cohen A.S. Review: history of the amyloid fibril. // J Struct Biol.

- 2000. - Vol. 130. № 2-3. – P. 88-98.

228. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S., Merlini G. et al.

Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the

amyloidosis. // Amyloid. – 2014. – Vol. 21. №. – P. 221 – 224.

229. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory

manual // New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. – 1989. – 1626 p.

230. Sarantseva S., Timoshenko S., Bolshakova O., Karaseva E., Rodin D. et al.

Apolipoprotein E-mimetics inhibit neurodegeneration and restore cognitive

functions in a transgenic Drosophila model of Alzheimer's disease. // PLoS One.

– 2009. – Vol. 4, № 12. - e8191.

231. Saupe S.J. The [Het-s] prion of Podospora anserina and its role in

heterokaryon incompatibility. // Semin Cell Dev Biol. – 2011. – V. 22, №5. - P.

460 - 468.

232. Schilling G., Becher M.W., Sharp A.H., Jinnah H.A., Duan K. et al.

Intranuclear inclusions and neuritic aggregates in transgenic mice expressing a

mutant N-terminal fragment of huntingtin. // Hum Mol Genet. – 1999. – Vol. 8. –

P. 397 – 407.

233. Schwarze-Eicker K., Keyvani K., Gortz N., Westaway D., Sachser N.,

Paulus W. Prion protein (PrPc) promotes beta-amyloid plaque formation //

Neurobiol. Aging. - 2005. - V. 26, № 8. - P. 1177 - 1182.

234. Schwimmer C., Masison D.C. Antagonistic interactions between yeast

[PSI(+)] and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperone

199

Ssa1p but not by Ssa2p. // Mol Cell Biol. – 2002. – Vol. 22, № 11. – P. 3590 -

3598.

235. Selkoe D.J. Alzheimer's disease. // Cold Spring Harb Perspect Biol. – 2011.

- Vol. 3, № 7. - pii: a004457.

236. Serio T.R., Cashikar A.G., Kowal A.S., Sawicki G.J., Moslehi J.J. et al. //

Nucleated conformational conversion and the replication of conformational

information by a prion determinant. // Science. – 2000. – Vol. 289. – P. 1317 -

1321.

237. Sherman F., Fink G.R., Hinks J.B. Methods in Yeast Genetics. // Cold

Spring Harbor Lab Press, New-York. - 1986.

238. Shewmaker F., McGlinchey R.P., Wickner R.B. Structural insights into

functional and pathological amyloid. // J Biol Chem. – 2011. – Vol. 286, №19. –

P. 16533 - 16540.

239. Si K., Choi Y., White-Grindley E., MajumdarA., Kandel E. Aplysia CPEB

can form prion-like multimers in sensory neurons that contribute to long-term

facilitation. // Cell. - 2010. – V. 140, №3. - P. 421 - 435.

240. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains

designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. //

Genetics. – 1989. – Vol. 122. – P. 19-27.

241. Snow A.D., Sekiguchi R., Nochlin D., Fraser P., Kimata K. et al. An

important role of heparan sulfate proteoglycan (Perlecan) in a model system for

the deposition and persistence of fibrillar A beta-amyloid in rat brain. // Neuron. –

1994. – Vol. 12, № 1. – P. 219 - 234.

242. Sondheimer N. and Lindquist S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein

function in yeast // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 5. - P. 163 - 172.

243. Sondheimer N, Lopez N, Craig EA, Lindquist S. The role of Sis1 in the

maintenance of the [RNQ+] prion. // EMBO J. – 2001. – Vol. 20, № 10. – P.

2435 - 2442.

200

244. Speransky V.V., Taylor K.L., Edskes H.K., Wickner R.B., Steven A.C.

Prion filament networks in [URE3] cells of Saccharomyces cerevisiae // J. Cell.

Biol. - 2001. - Vol. 153. - P. 1327-1336.

245. Stathopulos P.B., Rumfeldt J., Scholz G.A., Irani R.A., Frey H.E. et al.

Cu/Zn superoxide dismutase mutants associated with amyotrophic lateral

sclerosis show enhanced formation of aggregates in vitro. // Proc Natl Acad Sci

USA. // 2003. – Vol. 100. – P. 7021 - 7026

246. Sugiyama S., Tanaka M. Self-propagating amyloid as a critical regulator

for diverse cellular functions. // J Biochem. – 2014. – V. 155, №6. –P. 345-351.

247. Sun Y, Makarava N, Lee CI, Laksanalamai P, Robb FT, Baskakov IV.

Conformational stability of PrP amyloid fibrils controls their smallest possible

fragment size. // J Mol Biol. – 2008. V. 376, №4. – P. 1155-1167.

248. Suzuki G., Shimazu N., Tanaka M. A yeast prion, Mod5, promotes

acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. // Science.

– 2012. – Vol. 336. – P. 355 - 359.

249. Swaney D.L., Beltrao P., Starita L., Guo A., Rush J. et al. Global analysis

of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. // Nat

Methods. – 2013. – Vol. 10, № 7. – P. 676-82.

250. Syed AK, Boles BR. Fold modulating function: bacterial toxins to

functional amyloids. // Front Microbiol. – 2014. – V. 5: 401.

251. Tanaka M., Weissman J.S. An efficient protein transformation protocol for

introducing prions into yeast. // Methods Enzymol. – 2006 – Vol. 412. – P. 185 -

200.

252. Taneja V., Maddelein M.L., Talarek N., Saupe S.J., Liebman S.W. A non-

Q/N-rich prion domain of a foreign prion, [Het-s], can propagate as a prion in

yeast // Mol Cell. – 2007. - Vol. 27. - P. 67-77.

253. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion

domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. –

1999. – Vol. 283. – №5406. – P. 1339–1343.

201

254. Telling G.C., Parchi P., DeArmond S.J., Cortelli P., Montagna P. et al.

Evidence for the conformation of the pathologic isoform of the prion protein

enciphering and propagating prion diversity // Science. - 1996. - Vol. 274. - P.

2079-2082.

255. Terashima H., Hamada K., Kitada K. The localization change of

Ybr078w/Ecm33, a yeast GPI-associated protein, from the plasma membrane to

the cell wall, affecting the cellular function. // FEMS Microbiol Lett. – 2003. Vol.

218, № 1. – P. 175 - 180.

256. Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R.,

Didichenko S.A., Chernoff Y.O., Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.N. Deletion

analysis of the SUP35 gene of the yeast Sacchoromyces cerevisiae reveals two

non-overlapping functional regions in the encoded protein // Mol. Microbiol. –

1993. – Vol. 7. – P. 683 – 692.

257. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov

V.N. The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of

the non-Mendelian determinant [PSI+] in the yeast Sacchoromyces cerevisiae //

Genetics. – 1994. – Vol. 137. – P. 671 – 676.

258. Thual C., Komar A.A., Bousset L., Fernandez-Bellot E., Cullin C., Melki

R. Structural characterization of Saccharomyces cerevisiae prion-like protein

Ure2 // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 13666-13674.

259. Tkach J.M., Yimit A., Lee A.Y., Riffle M., Costanzo M. et al. Dissecting

DNA damage response pathways by analysing protein localization and abundance

changes during DNA replication stress. // Nat Cell Biol. – 2012. – Vol. 14, № 9. –

P. 966 - 976.

260. Tobler I., Gaus S.E., Deboer T., Achermann P., Fischer M., Rulicke T.,

Moser M., Oesch B., McBride P.A., Manson J.C. Altered circadian activity

rhythms and sleep in mice devoid of prion protein // Nature. – 1996. – Vol. 380. –

P. 639–642.

202

261. Tuite M., Mundy, C.R., Cox, B.S. Agents that cause a high frequency of

genetic change from [psi+] to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. –

1981. – Vol. 98. – P. 691–711.

262. Urakov V.N., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Kushnirov V.V.,

Smirnov V.N. et al. Interdependence of amyloid formation in yeast: implications

for polyglutamine disorders and biological functions. // Prion. – 2010. – Vol. 4. –

P. 45-52.

263. Valouev I.A., Fominov G.V., Sokolova E.E., Smirnov V.N., Ter-

Avanesyan M.D. Elongation factor eEF1B modulates functions of the release

factors eRF1 and eRF3 and the efficiency of translation termination in yeast. //

BMC Mol Biol. – 2009. – V. 10: 60.

264. Van Melckebeke H., Wasmer C., Lange A., Ab E., Loquet A., Bockmann

A., Meier B.H. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289)

amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. // J Am Chem Soc. – 2010. -

Vol. 132, №39. - P. 13765-13775.

265. Vana K., Zuber C., Nikles D., Weiss S. Novel Aspects of Prions, Their

Receptor Molecules, and Innovative Approaches for TSE Therapy // Cell. Mol.

Neurobiol. – 2007. – Vol. 27. – №1. – P. 107–128.

266. Vishveshwara N., Bradley M.E., Liebman S.W. Sequestration of essential

proteins causes prion associated toxicity in yeast. // Mol Microbiol. – 2009. –

Vol. 73, № 6. – P. 1101 - 1114.

267. Vitrenko Y.A., Gracheva E.O., Richmond J.E., Liebman S.W.

Visualization of aggregation of the Rnq1 prion domain and cross-seeding

interactions with Sup35NM. // J Biol Chem. – 2007. – Vol. 282, № 3. – P. 1779 -

1787.

268. Vogel J.L., Parsell D.A., Lindquist S. Heat-shock proteins Hsp104 and

Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation. // Curr Biol. – 1995. –

Vol. 5, № 3. – P. 306 - 317.

269. Vonsattel J.P., DiFiglia M. Huntington disease. // J Neuropathol Exp

Neurol. – 1998. – Vol. 57. - P 369 – 384.

203

270. Wang Y., Meriin A.B., Costello C.E., Sherman M.Y. Characterization of

proteins associated with polyglutamine aggregates: a novel approach towards

isolation of aggregates from protein conformation disorders. // Prion. – 2007. -

Vol. 1. – P. 128 - 135.

271. Wasmer C., Lange A., Van Melckebeke H., Siemer A.B., Riek R., Meier

B.H. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a

triangular hydrophobic core // Science. - 2008. - Vol. 319. - P. 1523 - 1526.

272. Weingarten M. D., Lockwood A. H., Hwo S. Y., Kirschner M. W. A

protein factor essential for microtubule assembly. // Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. – 1975. – Vol. 72. – P. 1858–1862.

273. Westermark G.T., Westermark P. Serum amyloid A and protein AA:

molecular mechanisms of a transmissible amyloidosis. // FEBS Lett. – 2009. –

Vol. 583, № 16. – P. 2685 – 2690.

274. Wickner R.B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion

analog in Saccharomyces cerevisiae. // Science. – 1994. – V. 264, №5158. - P.

566 - 569.

275. Wickner R.B. A new prion controls fungal cell fusion incompatibility. //

Proc Natl Acad Sci U S A. – 1997. Vol. 94, № 19. – P. 10012 - 10024.

276. Wickner R.B., Edskes H.K., Maddelein M.L., Taylor K.L., Moriyama H.

Prions of yeast and fungi. Proteins as genetic material. // J Biol Chem. – 1999. –

V. – 274, №2. – P. 555 - 558.

277. Wickner R.B., Edskes H.K., Roberts B.T., Pierce M., Baxa U. Prions of

yeast as epigenetic phenomena: high protein "copy number" inducing protein

"silencing". // Adv Genet. – 2002. – Vol. 46. – P. 485 - 525.

278. Wickner R.B., Edskes H.K., Ross E.D., Pierce M.M., Baxa U., Brachmann

A., Shewmaker F. Prion genetics: new rules for a new kind of gene // Annu. Rev.

Genet. - 2004. - Vol. 38. - P. 681-707.

279. Wickner RB.., Shewmaker F, Edskes H., Kryndushkin D., Nemecek J,

McGlinchey R, Bateman D, Winchester CL. Prion amyloid structure explains

204

templating: how proteins can be genes. // FEMS Yeast Res. – 2010. - Vol. 8. – P.

980-991.

280. Wickner R.B., Edskes H.K., Bateman D., Kelly A.C., Gorkovskiy A. The

yeast prions [PSI+] and [URE3] are molecular degenerative diseases. // Prion.

2011. – Vol. 4. – P. 258 – 262.

281. Wickner R.B., Edskes H.K., Bateman D.A., Kelly A.C., Gorkovskiy A. et

al. Amyloid diseases of yeast: prions are proteins acting as genes. // Essays

Biochem. – 2014. – Vol. 56. – P. 193 - 205.

282. Winderickx J., Delay C., De Vos A., Klinger H., Pellens K. et al. Protein

folding diseases and neurodegeneration: lessons learned from yeast. // Biochimica

et Biophysica Acta. – 2008. – Vol. 1783. P. 1381 - 1395.

283. Winklhofer K.F., Tatzelt J., Haass C. The two faces of protein misfolding:

gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. // EMBO J. – 2008. –

V. 27, №2. – P. 336 - 349.

284. Xu Z., Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae

regulates G2/M transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage

response. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae regulates G2/M

transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage response. // Genetics. –

1998. Vol. 150, № 4. – P. 1419 - 1428.

285. Yang Z., Stone D.E., Liebman S.W. Prion-promoted phosphorylation of

heterologous amyloid is coupled with ubiquitin-proteasome system inhibition and

toxicity. // Mol Microbiol. – 2014. – Vol. 93, № 5. – P. 1043 - 1056.

286. Zakharov I.A., Yarovoy B.P. Cytoduction as a new tool in studying the

cytoplasmic heredity in yeast. //Mol Cell Biochem. – 1977. Vol. 14, № 1-3. - P.

15 – 18.

287. Zhouravleva G.A., Frovola L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov

S.G. et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting

polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. // EMBO J. – 1995. – Vol. 14.

– P. 4065 - 4072.

205

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу поблагодарить коллектив кафедры генетики и в особенности сотрудников

лабораторий генетики животных и физиологической генетики, где мне

посчастливилось работать.

Благодарю руководителей и сотрудников ЦКП «Хромас» и «Развития

молекулярных и клеточных технологий». Без них эта работа не могла бы

состояться.

Личную благодарность я хочу высказать С.Г. Инге-Вечтомову, А. Ф. Смирнову,

П.А. Зыкину, а также людям, принимавшим непосредственное участие в этой

работе:

А. Рубелю, О. Цапониной, А. Лада, З. Магомедовой, А. Сайфитдиновой,

А. Нижникову, К. Антонцу, Т. Рыжовой, С. Задорскому и К. Волкову.

Я благодарен своей супруге С.А. Галкиной и маме Е.А. Галкиной за помощь и

поддержку.