Análisis De Comunidades

Microbianas Por Polimorfismo De

Longitud De Fragmentos De

Restricción Terminales (T-RFLP)

PRESENTADO POR:

Lina María Parra Quitian

Jessika Disney Giraldo

• T-RFLP es una técnica utilizada para estudiar

las comunidades microbianas complejas sobre

la base de la variación en el gen 16S rRNA.

T-RFLP se puede utilizar para:

• Examinar comunidades microbianas

• Estructura y dinámica de la comunidad

• Poblaciones bacterianas en sus hábitats

naturales

Genetica y Biologia Molecular

T-RFLP

• Aislamiento y purificación de ADN

• Amplificación por PCR y digestión con enzimas

de restricción

• Separación y detección de la productos

digeridos a través de electroforesis

• Análisis de los datos para generar el perfil

fragmento para cada muestra

• Agrupación de análisis basado en el perfil de las

muestras

Genetica y Biologia Molecular

T-RFLP COMPRENDE CINCO PASOS

PRINCIPALES:

AISLAMIENTO DEL ADN DE LA COMUNIDAD

Retirar las células del sustrato y

Realizar Lisis

Método Indirecto Método directo

• El DNA se extrae

directamente del suelo

solido .

• Tratamientos con lizosima

• SDS

• Cambios de temperatura

extrema

• Separar las células del

suelo.

• Lisis de la suspensión

celular para maximizar la

liberación de DNA.

Finalmente se extrae el ADN de las células rotas

• Se utiliza rRNA 16S

• Secuencias que se han mantenido bastante

uniformes a lo largo de la evolución

• Se ven claramente las diferencias entre los

distintos microorganismos y se pueden realizar

árboles filogenéticos (clasificar)

SELECCIÓN DE CEBADORES

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PCR - AMPLIFICACION

La técnica de PCR tiene diferentes aplicación una de ellas es en T-RFLP:

• Generan, bandas de DNA que son resueltas mediante electroforesis en gel.

• “huellas digitales” (del inglés, “fingerprints”).

• Pueden distinguirse especies, variedades e incluso individuos.

La amplificación in vitro del DNA se logra en tres pasos básicos:

• Separar las dos cadenas que componen la doble hélice del DNA.

•94oC, durante, 1 minuto

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA A COPIAR (MOLDE O DIANA)

• pequeñas secuencias de DNA de cadena sencilla se unan a sus secuencias

•

•40-60ºC oscila entre ½ minuto y 2 minutos.

HIBRIDACIÓN O APAREAMIENTO DE LOS

CEBADORES U OLIGOS AL DNA MOLDE

• Se duplica el número inicial de moléculas de DNA.

•

•72 oC y se deja actuar a la Taq polimerasa durante 1 ó 2 minutos.

COPIA DE LAS CADENAS DELIMITADAS POR LOS

CEBADORES. V

• Algunos productos de PCR pueden ser

perjudiciales para las etapas posteriores del

análisis.

• Por lo tanto, los productos de PCR se purifican.

con el objetivo de eliminar proteínas,

oligonucleótidos y restos de primers.

LA PURIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

DIGESTION DEL DNA CON ENZIMAS DE

RESTRICCIÒN

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. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes.

USOS

Para la realización de mapas físicos

Huella genética ó fingerprinting

Búsqueda de polimorfismos

DIGESTION CON ENZIMAS DE

RESTRICCION

• Asegurarán de que los fragmentos de

restricción sean legítimos.

• La actividad enzimática debe ser matado

por calentamiento.

• Se almacena la muestra a -20 ° C hasta la

electroforesis.

• El producto de digestión se puede cargar

directamente sobre el gel.

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SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE

RESTRICCIÓN

• Se utilizan los extremos del fragmento de

DNA para realizar una replicación

específica.

• Fragmentos terminales se separan en un

gel de desnaturalización.

• Electroforesis

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ANALISIS COMPARATIVO DE LA

COMUNIDAD

• Software que hacen referencias a los perfiles de

T-RFLP con una base de datos de secuencias.

• Los resultados se guardan en archivos que

contienen los datos de la exploración tabulados

y una presentación gráfica.

• Software relativos a las normas de tamaño

GeneScan (ABI), GeneFlo (Chimerix), y

MegaBACE ET (Amersham Biosciences).

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ENFOQUES ANALAITICOS

• ( crude similarity)

similitud crudo

• (Cluster analysis approaches)

enfoques de análisis de racimo

• (Ordination)

ordenación

• (presumtive phylogenetics)

filogenética presuntiva

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CONCLUSIONES

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