sterolii - biochimiero.files.wordpress.com · acizi biliari componenta bilei conjugati acid...
TRANSCRIPT
Sterolii
in plante si drojdii
Localizare
Membrana eucariote / stabilitate
Rar procariote
Colesterolul
Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
La mamifere ateroscleroza
Forme Liber 30-40% membrane, rigid sau lipoproteine
Esterificat – in citoplasma celulelor / lipoproteine
diabetul zaharat nefrozehipotiroidism
Lipidele şi ateroscleoroza
Reducerea lumenului vascular
depuneri de lipide pe pereţii vaselor
plăcile de aterom
http://www.gridgit.com/
Lipidele şi ateroscleoroza
https://2015091.weebly.com/
Liproteine (LDL, HDL)
Bittencourt, J. A., The Power of Carbohydrates, Proteins, and Lipids (e-book), CreateSpace, 2013
LDLColesterol
HDLproteine:lipide
http://mesacharter.blogspot.com/2015/
Derivatii sterolilor
Glicozidelesterolilor
plante
alge
Acizi biliari
componenta bilei
conjugati
Acid taurocolic – absorbtie eficienta
Pavlovic,N..at al., (2018) Front. Pharmacol. 9:1283.
Derivatii sterolilor - glucocorticoizi
Natural Sintetic
Pflug, NC. El al., Environ. Sci.: Water Res. Technol., 2017,3, 450-461
https://www.ausmed.com.au/
Dexametazona
Reacții alergice
Artrita
Psoriasis
Boli respiratorii
afecteaza dezvoltarea si functiile sexuale
-estradiol - hormon s. feminin
Testosteronul - hormon s. masculin
Celulele Leydig
ovare
Hormonii
Lipida amfifila
Grupe nepolare(hidrofobe)
Grupe polare(hidrofile)
Strat bilipidic
Faza nepolara (resturi de acizi grasi, colesterol)
Faza polara(apoasa)
Membrana bifosfolipidica
Formarea straturilor bilipidice
Difuzia lipidelor
Difuzie transversala
Difuzie laterala
Functiile membranelor
“Granita” pentru celula
Structuri dinamice
2 tipuri: interna, externa
Temperatura de tranzitie
Structura ordonata, bine impachetata
Structura mai putin ordonata, lanturi hidrocarbonate labile
Transformarea bacteriilorCelule competentewww.edvotek.com
Inserarea ADN-ului
E.coli Mitocondria
Peroxizomi
Numarul de membrane
Distrubutia lipidelor in plasma membranara
Flexibilitatea lanturilor in aciziigrasi saturati/nesaturati
Deficienta lipidelor
• Grasimile trebuie sa constituie 3% din total caloriilor–prevenirea deficientelor
• Sindroamele datorate deficientei acizilor grasi
Uscarea pielii, dermatite (deficienta in ac. linoleic)
Tremuratul mainilor (deficienta a prostaglandinelor)
Inabilitatea de a controla presiunea sângelui
Rolul acizilor grași omega 3 în suprimareaCatabolismului proteinelor musculare
Malta, F.A.P.S. et al. (2019), Journal of Functional Food, 54,1-12
Cantitate ridicata de lipide
Cancer
Boli de inima
Diabet
Obezitate
Presiune mare a sangelui
Concentratie mare
a colesterolului în sange http://antararx.com/images/pi12.jpg
ADNul si ARNul- purtatori ai informatiei
Structurile ac. nucleici - criterii
- informatia geneticăforma stabilă
- informatia geneticădecodată
- informatia accesibila proteinelor acizilor nucleici
- copiere fidelatransferul informației
Clancy, S. & Brown, W. (2008) Translation: DNA to mRNA to Protein. Nature Education 1(1):101
Compusul izolat
- nucleina (contine P)
- acid nucleic
- acid deoxiribonucleic (ADN)
F. Meischer a izolat ADN-ulin 1869 din leucocite
Izolarea ADN-ului
http://www.dnaftb.org/15/bio.html
www.catawiki.de
http://www.dnaftb.org/12/bio.html
Teoria evolutiei speciilor
Localizarea ADNul
1914 R. Feulgen - fucsina (colorant) leaga ADNul
Localizarea acestuia
http://www.gettyimages.com/
www.slideshare.net
Robert Feulgen
Localizarea ADN-ul
Fibroblastele din soareceActina, FITC Tubulina, Cy5 Nucleu (ADN), DAPI
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/
SYBR Green I
www.company7.com
Purinele
Pirimidinele
Bazele purinice și pirimidinice
ARN
Componența acizilor nucleici
1920 P.A. LeveneADN 4 baze purinice/pirimidinice deoxiriboza si o grupare fosfat
Ipoteza gresita – Cuarteți de deoxitetranucleotide care se repetă5’-GATCGATCGATC-….-GATC-3’
http://www.dnaftb.org/15/bio-2.html
Diferența între nucleozide și nucleotide
Bază + riboză
https://www.zigya.com
Bază + riboză + fosfat
Legarea nucleotidelorLegături fosfodiesterice
http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/
Erwin Chargaff
Componența acizilor nucleici
Nicole Kresge et al.J. Biol. Chem. 2005;280:e21
2 descoperiri importante
(i) ponderile egale A şi T (G şi C)
(ii) compoziția ADN-ului variazade la o specie la alta
a infirmat teoria lui Levene
www.bio.miami.edu/dana/
https://moodle.clsd.k12.pa.us
Perechile de baze
Perechi de baze Hoogsteen
Perechi de baze Watson-Crick
Diplococcus pneumoniae Bacterie care cauzeaza pneumonia
Factorul de transformare
www.sciencemag.orgStreptococcus pneumoniae
www.visionlearning.com
F. Griffith
1920 F. Griffith – factorul de transformare
ADN-ul este materialul ereditar - M. DelBruck şi S. Luria. Aceştia au analizat bacteriofagele (inveliş proteic + ADN) care atacă bacteriile E.Coli
http://www.dnaftb.org/17/animation.html
http://www.ck12.org/biology/
1944, O. Avery, C. MacLeod si M. McCarty
Factorul de transformare
ADNul– factorul de transformare
A. Hershey, M. Chase - genetica bacteriofagelor
Reconfirmarea: ADN-ul este purtatorul informatiei genetice
Structura ADNului
Structura ADNului
Polimer - 2 lanţuri de deoxinucleotide
B-ADN-ului - trăsăturile structurale:
lanţuri antiparalele
rotite spre dreapta
D = 20 Å
bazele nucleotidice– leg. de H (interior)
legacy.hopkinsville.kctcs.edu
10 bp / rotaţie completă
pasul de 34 Å
Watson şi Crick structura B ADN-lui
dublu helix
vs Paulingstructura B ADN-lui
tripluhelix
bert1293.glogster.com
blo
g.w
orld
agro
forestry.o
rg
Tipuri de ADN - difractograme
A-ADN
B-ADN
Z-ADN
Arnott, TRENDS in Biochemical Sciences, 3(6), 349-354, 2006
Tipuri de ADN
12 bp / rotaţie
pasul 44 Å
orientare spre stânga
11,6 bp / rotaţie
pasul 34 Å
orientare spre dreapta
10 bp / rotaţie
pasul 34 Å
orientare spre dreapta
ARNul
http://biology.stackexchange.com11 bp / rotaţie
pasul de 30,9 Å
Sinteza lantului polipeptidic
1. Activarea (esterificarea) - citoplasma
2. Initierea ARNm + AAactivat + 30Sribozom
complex
+ 50Sribozom
3 proteinesi GTP
4. Terminarea - oprirea sintezei proteinei
3. Elongarea - adaugarea a noi aminoacizi
- nou aminoacil-ARNt + ARNm
- formarea legaturii peptidice
5. Prelucrarea postranslationala
Reactia de activare
fiecare molecula ARNt
un aminoacid
Aminoacil-adenilat (anhidrida mixta)
Aminoacil-ARNt
Elemente structurale ale ARNt-ului
Anticodon(triplet)
3ACCACGCUUAA
GACACCU
GC
*G U G U
CUGAG
GU
A
AA G
UC
AGACC
C G A GA G G
G
GACUCAU
UUAGGCG5
Capat la care se afla o grupareaminoacil
Legaturi dehidrogen
Anticodon
*
*
**
*
**
*
***
ARNt-ul
Molecula ARNt contine:
- base normale A, U, G si C
- derivati metilati ai A, U, G si C
Bazele ARNt-ului:
Impiedica formarea legaturilor
intramoleculare
Nu permit formarea legaturilor
intermoleculare (ARNt-ARNt)
Reduc actiunea nucleazelor
asupra ARNt
Reactia de initiere
formil-metionil-ARNt
Metionil-ARNt
(AUG codon)
Compozitia si masa ribozomilor
70S Mr 2.7 x 106
50S 30S
Mr 1.8 x 106
5S ARNr23S ARNr36 proteine
Mr 0.9 x 106
16S ARNr21 proteine
S - unitati Svedberg
30S, 50S si 70S - vsed la ultracentrifugare
vsed = f (forma, masa)
Densitatea si coeficientii de sedimentare ai componentelor celulareL.K. Kleinsmith & V.M. Kish, Principles of Cell
and Molecular Biology, ed. 2 (H. Collins, 1995)
30S P A
Etapele initierii
FI3 FI1
ARNm A U G5‘ 3‘
A U G - codon de initiere
FI2
U A C
GTP
U A C - anticodon
A - catalitic site pentru formarea noului aminoacil-ARNt
P - catalitic site pentru formarea legaturii peptidiceE - catalitic site unde ARNtasele parasesc ribozomul
50S
E
Ciclul elongatiei1) Legarea noului aminoacil-ARNt
ARNm A U G 5‘ 3‘
U A C
P30S
50S
A
T-GTP
T - factor de elongatieT-GTP-(AA2-ARNt) - complex ternar
tetraciclina
blocheaza centrul activ A
inhiba sinteza peptidei
Situsul E
H
C O
NH
C
C
O
R1
O
H
ARNtMET
Situsul P
NH2
C
C
O
R2
O
H
ARNtAA2
..
Situsul A
ARNm
A U G5‘ 3‘
50S
30S
Atacul nucleofil
Legaturapeptidica
Pep.transf.
Pep. transf. 23S ARNr
Ciclul elongatiei2) Formarea legaturii peptidice
ARNm
A U G codon AA2
5‘ 3‘
Situs E Situs A
3‘ARNm
A U G codon AA2 codon AA3
5‘
Translocaza(FE-G / GTP)
NH2
C
O
R3 H
ARNtAA3
CO
Situs P
OH
ARNtMET
Situs A
NH-CHO
C
C
R1
O
H
NH
C
O
R2 H
ARNtAA2
CO
Situs E
OH
ARNtMET
Situs P
NH-CHO
C
C
R1
O
H
NH
C
O
R2 H
ARNtAA2
CO
Ciclul elongatiei3) Translocatia
Incheierea sintezei
Este semnalata de presenta codonilor terminali(UAA, UAG, UGA)
30S P AARNm | | | | |UGA| 5‘ 3‘
50S
E | |
FD - factori de desprindere
FD
Peptidil transferaseFD1, FD2
Disocierea complexuluiFD3
Inhibitori ai sintezei proteice
Interactiile cloramfenicolului cu nucleotide din cavitatea peptidil transferazei
(D. radiodurans)
G 2484
U 2485
C 2431
A 2430
U 2479
U 2483
G 2044Mg2+
Mg2+2.451
Å
Cloramfenicol
Blocheaza transferul dePeptidil-ARNt
D. Radioduransbacteria gram-positiva
http://www.esrf.eu/
Tirozinil-ARNt-ul
Puromicina se leaga de situsul A al ribozomului
Peptidil-puromicina blocheaza prematur sinteza peptidica
Puromicina
Inhibitori ai sintezei proteice
Streptomicina
• Se leaga de subunitatea 30S
• Produce citirea gresita a Informatiei genetice
• Inhiba la concentratii mariprocesul de initiere
Proteine toxice
Toxina (difteria) inactiveaza factorul 2 al elongatiei
Ricina depurineaza o adenozina a 23S ARNr
Inhibitori ai sintezei proteice
Flexibilitate conformationala a ADN-ului este limitataConformeri ai adenozinei
majoritatea acizilor nucleici – conformatie anti
Z-ADN–conformatie anti/sin
Cromozomii
virusuri
bacterii
molecule circulare (plasmide)
ADNul viral
ADN - eucariote sau procariote - dimensiuni mari
mase medii
modele de studiu
https://ib.bioninja.com.au/
Proprietăţile ADN-ului în soluţie
Proprietaţile acido-bazice (pKa, cationi, amine)
Vâscozitatea - gradul de denaturare al ADNului- gradul de împachetare al duplexului
Coeficientul de sedimentaremasa molecularăa tipurilor de ADN
gradient de zaharoza sau CsCl
Denaturarea si renaturareaMijlocul intervalului de temperatură de topire, Tm (m = eng. melting-topire).
Renaturarea1960, J. Marmur temperatura T < Tm + 25 grade https://uoqasim.edu.iq/e_Learning/
Denaturarea acizilor nucleici
Duplex-helix ADNul si ARNul pot fi denaturate
Stabilitatea ADN - factori
natura solventului
tăria ionică
conţinutul de perechi G-C
pH
Idili A, Vallée-Bélisle A, Ricci F, JACS, 2014, 136 (16), 5836–5839
Reactia PCR (The polymerase chain reaction)
Amestec de componente:
enzima ADN polimeraza
deoxinucleotide
PCR Thermocycler
primeri
solutie tampon
Mg2+
Etapele PCR
1. Denaturarea ADN-ului (95C) – separarea lanturilor
2. Alinierea primerilor (40C- 65C) la ADN-ul monocatenar
3. Reactia de polimerizare a ADN-ului (polimeraza, 72C) extinderea lanturilor de ADN nou la capatul primerilor.
• La baza tehnicii PCR schimbarile de temperatura
modificari ale ADN-ului
• PCR – 20-40 cicli de temperatura
• 20 cicli de temperatura 2 h
amplificarea fragmentului ADN
1.048.576 copii
Kary Mullis (1983)
Regiunea de interes5’
3’ 5’
3’
1) Denaturarea95 ºC
5’ 3’
3’ 5’
2) Alinierea55 ºC5’ 3’
3’ 5’
5’3’
3’5’Primer 2
Primer 1
3) Extinderea72 ºC
5’
3’ 5’
3’
5’
3’ 5’
3’
Repetarea pasilor 1-3
Numar mare de copii ale fragmentului ADN
Doua fragmente
de ADN identice
Reacția PCR (The polymerase chain reaction)
Surse de ADNMcCance,S.R & Leberg,P.L.,
Conservation geneticsIn wildlife management
Construirea primerilor criterii
• continut de baze in jur de 50% GC
• lungimea 15-30 pb
• cei doi primeri trebuie sa nu formeza duplexuri
• sa nu conțină bucle
• capatul 3’ trebuie complementaritate perfectă cu ADNul țintă
• temperatura de aliniere a primerilor 50-64 ºC
Tm (ADN) =2 x (numar de baze A/T) + 4x (numar de baze C/G)
• temperatura de aliniere < 5 ºC față de Tm (ADN)
ADN polimeraze stabile la temperaturi ridicate
PCR implica temperaturi ridicate
ADN polimeraze stabile
Taq ADN polimeraza
Thermus aquaticus
(izvoare termale)
1976
Activitatea maxima75 - 80 0C
Fidelitate scăzută (1 / 9000 pb)
Acuratețea polimerazelor
Pyrococcus furiosus
Pfu polimeraza
Controlul reacției PCR
Shen, C.H,. Amplification of Nucleic Acids,in Diagnostic Molecular Biology, 2019
Electroforeza ADN-ului
Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeza orizontala (de tip submarin)
Aplicații ale reacției PCR
• manipularea genetica
• in criminalistica
• detectia HIV ADNul - celulele rosii primeri corespunzatori secventelor HIV
• diagnosticare prenatala a bolilor genetice
• aneuploidiilor fetale
• detectia alterarilor genetice din plasma
http://www.nature.com/nm/journal/v18/n7/images/nm.2829-F2.jpg
“Balizele”moleculare
1996Tyagi si Kramer
Proba etichetata cu 2 molecule1 fluorofor + 1 stingator
Balizele moleculare
Oligonucleotide cu structura unui ac
25-40 pb
15-30 pb complementare cu secventa
tija 5-10 pb
In absenta secventei complementare – fluorescenta este stinsa
Legarea la secventa complementare – disocierea tijei
Crește distanța F-Q
Crește fluorescenței
Factori care afectează tehnica – T, pH, secventa buclei sau tijei
Aplicații - detectia agentilor patogeni sau determinarea genotipului
“Balizele”moleculare