TÁMOP-ProgramTémavezető: prof. Dr Zelles TivadarRésztvevők: prof. Dr Nagy György

prof. Dr Fehér Erzsébet Offenmüller Katalin

Időszaki beszámoló – 2011.03.30.

I.Az agyalapi mirigy elülső lebenyének prolaktin (PRL) elválasztása a hypothalamus dopamine (DA) tónusos gátló befolyás alatt áll, mely feltételezi a jelátvivő molekula folyamatos (tónusos) jelenlétét. A ligand-receptor kölcsönhatás erősségének vizsgálata előtt tisztázni kívántuk e tónusos gátló befolyás pontos mechanizmusát. Eredményeinket a következőkben összegezzük:

A közelmúltban, a D2 DA receptor (D2R) jelátvivő mechanizmusát vizsgálva, egy b-arrestin függő (ugyanakkor G-fehérje független) mechanizmust írtak le a corpus striatumban.Ebben a jelátvivő útvonalban a b-arrestinhez kapcsolódó phosphatase 2A dephosphorilálja, ennélfogva inaktiválja, az előbbi két fehérjével közös komplexben lévő protein kinnase B-t (Akt). Az agyalapi mirigy elülső lebeny Akt phosphorylációjának részletes vizsgálatával megállapítottuk, hogy hypophyseotroh DAerg rendszer mind farmakológiás (DA bioszintézis ill. D2R gátlása) mind fiziológiás (szopási inger alkalmazása laktáló anyákban) befolyásolása a corpus striátumhoz hasonlóan inaktiválja (dephosphorylálja) az Akt-ot, mely felelőssé tehető a mammotrop sejtek tónusos DAerg gátlásáért. Következésképpen, a PRL elválasztás gátlásáért nem a korábban felvetett un. G- függő, adenylat cyclase (AC) gátlás és cAMP csökkenéssel járó mechanizmus a felelős.

K+

D2RGα0 Gαi

β γ AC

cAMPD2R

PLCPLC

PIP2

IP3 DAGPKC

ER

Ca2+

Ca2+

Ca2+

K+βArr

PP2AAkt

PRL

PRL

PKAPKA

CREB

P P

PP

P-Ser473

P-Thr308

Anti-apoptosis

α-MPT, HAL, RAC,Suckling

Diagram of the mechanisms by which DA affects the pituitary mammotropes.

Docking of dopamine (DA, top) and salsolinol (SAL, bottom) to the tyrosine hydroxylase (TH) crystal structure.

Both DA and SAL bound to the active site near the iron (shown as red sphere), with the catechol groups in close proximity to the iron. The high affinity site is known to involve direct coordination of the catechol groups with the iron atom. Whether this occurs in the low affinity site is unknown, but likely. Such a conformation of SAL could also involve coordination with iron. The more rigid, ring structure of SAL is likely to occupy the cofactor binding site (shaded blue) to a greater extent. This may explain why it has a greater effect on cofactor binding than DA.

II. A kötés-erősség vizsgálatához fluoreszcens beadek-et kívánunk felhasználni, úgy, hogy a bead-ekhez kötött molekulák a szubsztráton megkötve adott értékű fluoreszcens jelet szolgáltatnak. A fluoreszcencia-jel időbeli változását figyelve és a szakító-erőt időben lassan növelve várhatóan a fluoreszcens jelben bekövetkező csökkenéssel tudjuk kimutatni a kötő (szakító) erő nagyságát. Ehhez kialakítottunk egy mintakamrát és átalakítpottunk egy fluoreszcens spektrométert úgy, hogy a minta fluopreszcencai spektrumát real-time felvenno tudjuk. A fluoreszcens jelet optikai szálkötegen keresztül vezetjük a spektrométerbe, a gerjesztő fényt pedig ugyanezen szákötegl (Y alakú) másik ágán vezetjük a tárgylemezen levő mintához. A szálköteg vége és a mibta között levő távolságot optimalizáltuk. Alapelrendezésben a gerjesztő fényt a spektrofotométer gerjesztő oldali fényforrásából vezetjük ki, a szálköteg segítségével. Ez egy szélessávó Xe-lámpa, amely az eléje helyezett prizmával és kiválasztó réssel hangolható.

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

540 560 580 600 620 640

Hullámhossz (nm)

Mér

t je

l (t

.e.)

1 mikg/ml

Fluoreszcencia mérések a szálbecsatolású reflexiós elrendezésben, prizmás fluoreszcencia-spektrométerrel . 1. ábra

Az 1. ábrán található méréshez tartozó elrendezésben a gerjesztés 520 nm-re hangolt bemeneti prizma 10 nm réssel, a fluoreszcencia-spektrumot szintén 10 nm réssel vettük fel. Hasonló eredményeket kaptunk más rés-kombinációban is. A spektrométer – Y-szál kombinációval jelenleg elérhető legnagyobb érzékenység az 1 mikrogramm/ml koncentráció. Javítására mind LED-es (520nm), mind lézeres(532 nm) gerjesztést tervezünk. Az első kísérletek megtörténtek. A LED sávszélessége nagy, szükséges a szűrés. A jelenlegi szűrőnk 520 nm középhullámhosszú, de csak maximum 155 trabszmissziójú (kb. 14 nm sávszélességgel). A LED esetében ezt kell egy jobb szűrővel helyettesíteni az érzékenység növelésére. A kimeneten is szűrőt alkalmaztunk (580 nm)a gerjesztés és a fluoreszcencia szétválasztására.

III. NANOSPECT-vizsgálatok

A Technecium-99 (Tc-99) felvétele és leadása elfogadott módszer a nyálmirigyek funkcionális állapotának vizsgálatára. Egy az irodalomban jól ismert és egy általunk elsőként felismert hipertrófia/hiperplázia (Ht/Hp) állatmodellben vizsgáltuk a Tc-99 felvételét és leadását nyugalmi állapotban, alacsony szintű szekréciós tevékenység mellett patkányokban.. Az Isoproterenol mind a parotisban, mind a submandibuláris nyálmirigyben létrehoz Ht/Hp-t.. A Tc-99 felvétel itt mindkét vizsgált mirigyben jelentősen növekedik a kezelés 5. és 10. napjában.

Isoproterenol kezelésTc-99 felvétel a kezelés 0.– 5.- 10. napjában

Parotis Gl.submandibularis

Hőkezelt szójababbal történő táplálás csak a parotis Ht/Hp-t hozza létre. A parotisban a jól ismert Isoproterenol hatáshoz hasonlóan jelentősen növekedik a Tc-99 felvétel a táplálás 5. és 10. napjában. A submandibularis nyálmirigyben nem jön létre a Ht/Hp. Ebben a mirigyben nem változik a Tc-99 felvétel a táplálás 5. és 10. napjában. Az eredmények arra utalnak, hogy összefüggés található a teljes mirigyek és a Tc-99 felvétel között. További vizsgálatok szükségesek a Tc-99 felvétel alakulására a Ht/Hp-mirigyek stimulált állapotában.

Hőkezelt szójababbal történő táplálásTc-99 felvétel a kezelés 0.– 5.- 10. napjában

Parotis Gl.submandibularis