tesis: desarrollo de una prueba de inmunoensayo …
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA SALUD
Y DE LA PRODUCCIÓN ANIMAL
“DESARROLLO DE UNA PRUEBA DE INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA CLAMIDIOSIS EN CAPRINOS”
T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS
P R E S E N T A:
MARÍA GUADALUPE MARTÍNEZ SERRANO
TUTOR PRINCIPAL: DR. EFRÉN DÍAZ APARICIO INIFAP CENID Microbiología Animal
COMITÉ TUTORAL:
DRA. BEATRIZ ARELLANO REYNOSO Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM
DR. JORGE LUIS TÓRTORA PÉREZ Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM
DR. JOSÉ FRANCISCO MORALES ÁLVAREZ Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM
MÉXICO D.F. SEPTIEMBRE DE 2013
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
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I
CONTENIDO
Dedicatorias……………………………………………………… I
Agradecimientos………………………………………………….…... II
Resumen…………………………………………………………..…… IV
Abstract………………………………………………………………... VI
1 Introducción…………………………………………………………… 1
2 Justificación…………………………………………………………… 40
3 Hipótesis………………………………………………………………. 40
4 Objetivo general………………………………………………….…… 41
5 Material y métodos…………………………………………………… 42
5.1 Material biológico…………………………………………………..… 42
5.1.1 Sueros……………………………………………………………….…. 42
5.1.2 Microorganismos………………………………………………………. 42
5.2 Cultivo y producción de Chlamydia abortus en saco vitelino
de embrión de pollo………………………………………………… 43
5.3 Determinación de la presencia de Chlamydia abortus en los sacos vitelinos infectados…………………………………………
44
5.4 Cultivo y multiplicaicón de Chlamydia abortus en la línea celular L-929…………………………………………………………
45
5.4.1 Cultivo de la línea celular L-929………………………………… 45
5.4.2 Infección de la monocapa celular………………………………. 47
5.4.3 Determinación de la presencia de Chlamydia abortus en cultivo celular infectado……………………………………………
47
5.5 Purificación de Chlamydia abortus para la obtención de un antígeno a partir de cuerpos elementales (CE)……………...
48
5.5.1 Purificación parcial de Chlamydia abortus…………………… 50
5.5.2 Inactivación del antígeno………………………………………. 51
5.5.3 Antigenicidad y pureza del extracto crudo obtenido………… 51
II
5.6 Estandarización de la técnica de inmunoensayo enzimático
Indirecto. (ELISA-I) …………………………………………………
52
5.7 Adsorción de sueros para descartar posibles reacciones
cruzadas………………………………………………………………. 55
5.8 Análisis estadístico………………………………………………… 57
6 Resultados…………………………………………………………… 58
6.1 Multiplicación de Chlamydia abortus en saco vitelino de embrión de pollo y en cultivos celulares………………….
58
6.2 Determinación de la presencia de Chlamydia abortus en saco vitelino de embrión de pollo y cultivos celulares………
58
6.3 Antigenicidad y pureza del extracto crudo obtenido a partir de Chlamydia abortus……………………………………………….
59
6.4 Estandarización de la prueba de ELISA-I……………………. 60
6.4.1 Determinación de la concentración del antígeno por la microtécnica de Bradford…………………………………………..
60
6.4.2 Titulación del antígeno……………………………………………. 60
6.4.3 Titulación del suero………………………………………………… 61
6.4.4 Resultados obtenidos a partir de las muestras de diferentes rebaños……………………………………………………………….
64
6.4.5 Adsorción de muestras control………………………………... 68
7 Discusión……………………………………………………………… 70
8 Conclusiones………………………………………………………… 77
9 Apéndice……………………………………………………………… 78
10 Literatura citada……………………………………………………… 82
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Patógenos de la familia Chlamydiaceae potencialmente
zoonóticos………………………………………………….. 4
Figura 2 Fotografía electrónica de las diferentes formas evolutivas
Clamidiales………………………………………………… 9
Figura 3 Ciclo de desarrollo de Chlamydia spp…………………………... 11
Figura 4 Representación esquemática de la membrana externa clamidial, mostrando la localización de las tres principales proteínas: MOMP, Omp2 y Omp3…….………………………….. 15
Figura 5 Esquema de la respuesta inmune Th1 contra C. abortus 20
Figura 6 Restos celulares (fondo del tubo), suspensión rica en clamidias (porción media del tubo) y fracción lipídica (parte superior del contenido en el tubo)..……………………………… 44
Figura 7 Línea celular L-929 de fibroblastos de ratón en cultivo con medio D-MEM……………………………………………………... 46
Figura 8 Inmunofluorescencia (IFD) directa de células L-929 infectadas con la cepa A22 de C. abortus……………………… 48
Figura 9 Diferenciación de fases previos a ultracentrifugación………... 49
Figura 10 Sedimento de clamidias formado después de la segunda ultracentrifugación…………….…………………………………… 49
Figura 11 Tubos con Ioditrast y sobrenadante de sacos vitelinos………. 51
Figura 12 Frotis de células L-929 infectadas con C. abortus y teñidas con la técnica de Stamp……………………….…………………. 59
Figura 13 Frotis de células infectadas. Técnica de IFD…………………... 59
Figura 14 Membrana de nitrocelulosa negativa (a) y positiva (b) a la 59
IV
prueba de Dot blot…….…………………………………………...
Figura 15 Densidad óptica (D.O.) de las diferentes diluciones del antígeno…….………………………………………………………. 61
Figura 16 Lectura de las diluciones de los sueros………………………… 62
Figura 17 . Comparativo entre muestras adsorbidas y sin adsorber en sueros de animales con aislamiento y PCR positivo……………………………………………………………... 67
Figura 18 Comparativo entre muestras adsorbidas y sin adsorber en sueros de animales con aislamiento y PCR negativo………………………………………..…………………… 67
V
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1 Taxonomía del orden de las Chlamydiales…………..…………... 3
Cuadro 2. Familia Chlamydiaceae………………………………………..…… 5
Cuadro 3. Componentes de la pared celular clamidial que interactúan con la célula hospedera………………………………………………… 8
Cuadro 4. Distribución de albúmina sérica bovina (ASB) y reactivo de
Bradford (RBF) en placa de 96 pozos para la microtécnica de Bradford……………………………………………………………... 50
Cuadro 5. Distribución del antígeno (µg/µl) en placa de 90 pozos para su titulación…………………………………………………………......... 53
Cuadro 6. Distribución de los sueros control en la placa para el
ELISA…………………………………………………………….…... 54
Cuadro 7. Microorganismos utilizados para realizar las adsorciones de los
sueros………………………………………………………………… 56
Cuadro 8. Resultados obtenidos para el cálculo del punto de corte para
sueros positivos y negativos……………………………………….. 63
Cuadro 9. Resultados obtenidos en base al diseño de Cohen………………. 64
Cuadro10 Resultados obtenidos con el ELISA-I desarrollado y el estuche
comercial……………………………………………………………... 66
I
DEDICATORIAS
A Dios: por concederme ese don tan maravilloso que es la vida y permitirme tener logros como este, en ella.
A mi madre biológica: por haberme dado esta oportunidad tan
fantástica: vivir!
A mi Papá Cabralϯ y a mis mamás Magoϯ y Chofiϯ: por enseñarme lo maravillosa que es la vida, alimentándome siempre con su sabiduría y amor; por contribuir en mi formación como persona y darme las armas
para poder enfrentarme a la vida misma.
A mi familia: mi tía Joaquinaϯ, tía Paquis, mis primos-hermanos Estela, Ángel, Monyn y a Marco; por su apoyo, su amor y comprensión, por
forjar en mí ese gran espíritu de superación y de búsqueda por la vida.
A mis tíos en general: Nico y Adela, Miguel y Chela, Geras y Lupita, Lalo y Lupita, Lourdes y Pancho, y a todos mis primos por su apoyo
brindado, gracias por impulsar mis sueños.
A “Pátaro”: por tu apoyo y comprensión, por tu tiempo y dedicación, por formar parte de la continuidad en este camino; pero sobre todo,
gracias por tu AMISTAD.
A Ricky: porque siempre estuviste a mi lado, por el apoyo brindado durante estos tres años llenos de cambios y por lo que has significado en
mi vida.
GRACIAS Y QUE DIOS LOS BENDIGA HOY Y SIEMPRE
II
AGRADECIMIENTOS
A Pancho, por todo tu tiempo y dedicación en la realización de este trabajo y por el apoyo brindado a través de todos estos años, que si bien no han sido fáciles, ésta es la prueba, de que cuando se quiere, se puede. A mis amigos y amigas que en el trayecto de todos estos años han contribuido con una sonrisa, una palmada en la espalda y palabras de aliento que si bien, en su momento fueron las más oportunas para salir de las adversidades y juntos alcanzar grandes logros como éste. Marlene, Gladys, José, Paco Baños, Carlos, Osvaldo Sánchez, Miryi, Angel, Juanito, Marianoϯ, Humberto, Jehieli, Adrianita, Ángeles, Oscar Molina, Dey, Delman, Marisol Morales, Elizabeth Urbina “Pekas”, Armando, Edencita, Selenita y Gaby Navarro, Ricky, Raquel, Coral, José Luis, Sara, Rosy, Polo, Marce, Lauris, Eri, Seño Silvia, Cristi, Teresita, Josefina Álvarez, Ernesto Pedro, Familia Gaona Cerna, y a todos aquellos que me han brindado ese tesoro tan maravilloso que es su AMISTAD. Y porque la vida sigue y aún hay mucho que recorrer en ella, gracias Ricky por todo y por ser alguien maravilloso en mi vida. A la FES-C, porque fue en ella donde me formé como MVZ y a la FMVZ, por darme la oportunidad de continuar en este crecimiento. A los doctores que han contribuido en mi formación académica; particularmente a los Drs. Gerardo García Tovar, Pablo Martínez Labat, Alfredo Cuéllar, Oscar Molina, Francisco Morales, Juan Carlos del Río, Patricia Mora, Jaime Orozcoϯ, García Alcaráz, Guillermo Oviedoϯ, Citlali Hernández, Humberto Ramírez, Adriana Ducoing y Víctor Tenorio. A mi comié tutor integrado por los doctores Bety Arellano, Jorge Tórtora, Efrén Díaz y Francisco Morales; así como también a mi jurado evaluador, los doctores Javier Gutiérrez, Andrés Ducoing, Alfredo Cuéllar, Efrén Díaz y Francisco Morales, por su tiempo y dedicación
III
para leer y hacer las correcciones y los comentarios oportunos para la mejora de este trabajo. A los Drs. y amigos que me apoyaron en mi proceso de formación, en la práctica y en la teoría externos a la FES-C: Dra. Rosaura Romero, a mis primos los Drs. Estela y Marco que son un gran ejemplo a seguir como personas y como profesionistas. Al INIFAP-CENID Microbiología, por abrirme las puertas al conocimiento y a la ciencia, a los Drs. Que han estado también a mi lado brindándome su apoyo y su amistad, su tiempo, su dinamismo y comprensión, GRACIAS Drs. Beatriz Arellano, Efrén Díaz, Lucy Favila, Gaby Palomares, Víctor Tenorio, Francisco Aguilar, Dionicio Córdoba, Enrique Herrera. A la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, España y a los doctores Jesús Salinas, Mary Carmen, Rosa Caro, Nieves Ortega, Paco cuello, por sus enseñanzas y apoyo en la realización del presente trabajo y gracias por su amistad y por cobijarme durante mi estancia en su país. A la Dra. Cristina Rodríguez, por contribuir en la donación de la cepa Salmonella cholerasuis. Y a las personas que me han dado el regalo más maravilloso que he recibido en la vida; a los Pbros. Agustín Reyes, Tonatiuh Montenegro, Daniel Navarrete, Pedro Reyes, Francisco Merinoϯ, Tomás Montesinos, Rubén Darío, Manuel, Juan, Josafat, Gustavo Mendieta y Oscar Camacho; a las Hnas. Lauraϯ y Gaby, y a todos aquellos que me han acercado a Dios. Gracias por ese regalo tan maravilloso y por su linda AMISTAD, son una bendición en mi vida. A mis enanos Nabikyϯ, Mouglyϯ, Katyϯ, Negraϯ, Tamarindoϯ, Clavesinaϯ y Clavesínϯ, Daisy, Apocaliptoϯ, Nacha, Isis, Osiris, Copo de Nieve, Rayita y a todos aquellos animalitos que contribuyeron con un poco de sí para mi formación profesional y en la realización de éste trabajo. GRACIAS Y QUE DIOS LOS BENDIGA HOY Y SIEMPRE
IV
“JUNTO A TI, BAJO EL COBIJO DE TUS BRAZOS SE ENCUENTRA MI
VIDA, Y ES ESTO, LO QUE ME DA FORTALEZA Y ME LLENA DE
ALEGRÍA, LO QUE ME HACE SENTIR CAPAZ DE TODO. QUIZÁ EL
PASO POR ESTE MUNDO, NO ES MÁS QUE UNA PERPETUA
LUCHA POR LA SUPERVIVENCIA. SUPERVIVENCIA A LOS
PROPIOS FRACASOS, A LOS AMORES, A LAS PÉRDIDAS, AL
MIEDO A SER ARRASADOS POR LOS VOLCANES QUE SE DESATAN
EN NUESTRO INTERIROR Y TENER LA VALENTÍA DE
LEVANTARNOS PARA COMENZAR DE CERO. RECONSTRUIRNOS
A NOSOTROS MISMOS UNA Y OTRA VEZ, FORTALECIÉNDONOS
DESPUÉS DE CADA CAÍDA, DE CADA TRIUNFO, DE CADA
DERROTA. SER MÁS FUERTES Y HUMILDES, PARA
CONVERTIRNOS EN INDIVIDUOS MÁS SABIOS, PERO CON LA
CANDIDEZ DEL INGENUO QUE NO PIERDE LA CAPACIDAD DE
ASOMBRO. PORQUE TODO SE PUEDE CUANDO SE PIERDE EL
TEMOR A NO LOGRARLO Y SE DESCUBRE, COMO EN UNA
REVELACIÓN QUE NO HAY PODER MÁS GRANDE QUE LAS
GANAS DE VIVIR Y DE SABER QUE LA VOLUNTAD ES LA
FUERZA MOTRIZ QUE TODO LO PUEDE”.
GRACIAS DIOS POR TODO
V
Resumen
MVZ Martínez Serrano María Guadalupe. Desarrollo de una prueba de inmunoensayo enzimático para el diagnóstico de la clamidiosis en caprinos. Tutor principal: Dr. Efrén Díaz Aparicio. Comité Tutor. Dra. Beatriz Arellano Reynoso, Dr. Jorge Luis Tórtora Pérez y Dr. José Francisco Morales Álvarez. Proyecto financiado por proyecto SAGARPA-CONACYT 48599, “Estudio epidemiológico de enfermedades que afectan la producción caprina en México”.
Chlamydia abortus es una bacteria intracelular obligada que además de ser una
zoonosis causa aborto en el último tercio de la gestación en cabras, ovejas y otros
rumiantes; es exótica en México, por lo que el ingreso de estuches y antígenos
comerciales para su diagnóstico se encuentra limitado. El objetivo de este estudio
fue desarrollar un ELISA-I capaz de detectar la presencia de anticuerpos en
animales infectados por C.abortus y a su vez compararla con un estuche
comercial para diagnóstico de esta enfermedad. La bacteria se reactivó en
embriones de pollo para posteriormente ser multiplicarla en cultivos celulares; la
presencia de la bacteria tanto en embriones como en cultivos se comprobó con la
tinción de Stamp y con las pruebas inmunológicas de dot blot e
inmunofluorescencia directa. A partir de los cultivos infectados, se purificaron los
cuerpos elementales por ultracentrifugación diferencial. El paquete celular
obtenido tras este proceso, fue utilizado como antígeno para el desarrollo del
ELISA-I; la concentración utilizada fue de 0.2 μg/μL; la dilución óptima de los
sueros testigos fue de 1:50. El punto de corte se estableció sumando y restando
una desviación estándar a los controles positivo y negativo respectivamente;
siendo positivas las muestras con una D.O. superior a 0.741, negativas las
inferiores a 0.695 y sospechosas las que estaban entre estos dos valores. La
sensibilidad de la prueba fue del 75%, con una especificidad del 66.6%; el índice
de concordancia entre el estuche comercial y el ELISA-I desarrollado fue de 0.4,
valor que se considera como moderado; finalmente, la prueba tuvo una validez
calculada del 70%. La ELISA-I aquí desarrollada, puede ser una alternativa que
coadyuve a determinar el estatus de la enfermedad en el país y de este modo
VI
establecer medidas de control o bien, medidas preventivas para evitar su
propagación en el territorio nacional.
Palabras clave: Clamidiosis caprina, Chlamydia abortus, ELISA-I.
Summary
Maria Guadalupe Martinez Serrano. Developement of an immunoassay enzyme
test for the diagnosis of chlamydiosis in goats. Thesis Director: Dr. Efren Diaz
Aparicio. Tutor Committee. Dra. Beatriz Arellano Reynoso, Jorge Luis Tórtora
Perez and Dr. José Francisco Morales Alvarez. Project funded by SAGARPA-
CONACYT project 48599, "Epidemiological study of diseases affecting goat
production in Mexico".
Chlamydia abortus is an obligate intracellular bacterium that besides being a
zoonosis causes abortion in the last third of gestation in goats, sheep and other
ruminants. It is considered exotic in Mexico, so that the entry of kits and
commercial antigens for diagnosis is limited. The aim of this study was to develop
an ELISA-I capable of detecting the presence of antibodies in infected animals with
C.abortus compared with a commercial kit for diagnosis of this disease. The
bacterium was cultured in chicken embryos and then it was multiplied in cell
culture, the presence of the bacterium in both embryos and cell cultures was
verified by Stamp staining, and immunologic tests as dot blot as well as direct
immunofluorescence. Elementary bodies were purified from the infected cultures
by Differential centrifugation and ultracentrifugation. The cell pellet obtained after
this process was used as antigen for the ELISA-I, the antigen concentration used
was 0.2 μg / μl, the optimal dilution of control serum was 1:50. It was considerate;
positive samples with an OD greater than 0.741, the negative below 0.695 and
suspected sera between these two values. The test sensitivity was 75%, with a
specificity of 66.6%, the rate of agreement between the commercial kit and ELISA-I
developed was 0.4, which is considered as moderate and finally, the test had a
VII
validity calculated 70%. The I-ELISA developed here may be an alternative that
contributes to determine the status of the disease in the country and thus
establishing control measures or preventive measures to prevent its spread
throughout the country.
Keywords: caprine chlamydiosis, Chlamydia abortus, ELISA-I.
1
1 Introducción
1.1 Aborto Enzoótico de los Pequeños Rumiantes (generalidades)
El aborto enzoótico de los pequeños rumiantes (AEPR) provoca importantes
pérdidas en muchas áreas del mundo dedicadas a la cría ovina y caprina,
particularmente cuando los rebaños se juntan durante el periodo de partos. Es una
enfermedad infecciosa causada por bacterias Gram negativas pertenecientes a la
familia Chlamydiaceae que producen aborto en el último tercio de la gestación y
que afecta principalmente a ovinos, caprinos, bovinos y humanos.1,2
Aunque la mayoría de los reportes sobre el AEPR están basados en ovejas, la
enfermedad tiene un gran impacto económico y de salud pública en un gran
número de explotaciones caprinas en el mundo.3
La clamidiosis o AEPR fue reportada por primera vez en Escocia en 1936 por
Greig, denominándola Aborto Enzoótico Ovino (AEO), quien sugirió que los
abortos eran resultado de factores medioambientales como deficiencias
nutricionales de los animales las que impedían llevar a término la gestación; sin
embargo, en 1950, Stamp et. al. demostraron que esta enfermedad era causada
por un agente infeccioso perteneciente al grupo de “psitacosis – linfogranuloma
venéreo” (psitacosis-LGV). 1, 4
Debido a su morfología e incapacidad de multiplicarse en medios inertes, durante
éste periodo fue discutida la naturaleza de las clamidias, que hasta entonces
habían sido consideradas como virus. Fue en 1966 cuando Page, determinó su
naturaleza bacteriana y dos años más tarde Weiss las define como bacterias
intracelulares obligadas.4, 1
La clasificación de los miembros de la familia Chlamydiaceae, se basa en el
análisis filogenético de las secuencias 16S ARN-r, separando así, sus miembros
de las demás bacterias. En 1999 Everett et. al. hicieron una nueva clasificación de
la familia Chlamydiaceae, basándose en el análisis genético de las subunidades
2
16S y 23S del ARN-r; demostrando así, que dicha familia agrupaba dos géneros:
Chlamydia y Chlamydophila y la existencia de nueve especies diferentes (Cuadro
1) confirmadas por análisis de fenotipo, antigenicidad, restricción de
endonucleasas y un conjunto distintivo de rasgos de virulencia, por ejemplo, C.
pecorum afecta principalmente a Bovinos, ovinos, caprinos, cerdos y coalas,
siendo sus órganos diana cerebro, ojo, intestino, linfonodos, articulaciones, etc;
mientras que C. abortus afecta principalmente a ovinos y caprinos y sus órganos
blanco son intestino, placenta, bazo e hígado fetal.4, 5, 6
La notificación de un nuevo género para la familia Chlamydiaceae fue aceptada;
sin embargo, la comunidad científica no ha adoptado de manera uniforme el uso
del nuevo nombre; por ésta razón, en 2011, se retomó la clasificación inicial
quedando nuevamente un solo género: Chlamydia con nueve especies
establecidas. 4, 6,7
3
Cuadro 1. Taxonomía del orden de las Chlamydiales propuesta por Everett et al. (1999) comparada con la taxonomía clásica y con el reajuste de nomenclatura propuesto en 2011.
ANTIGUA TAXONOMÍA RECLASIFICACIÓN (Everett, et. al. 1999)
Nueva clasificación
(Krieg, et. al. 2011, Manual Bergey´s)
Orden Familia Género-Especie Género Especie Hospedador
Chlamydia
Chlamydiales
Chlamydiaceae
Chlamydia psittaci
Chlamydophila
abortus Rumiantes psittaci Aves
felis Gato caviae Cobayas
Chlamydia pecorum pecorum Rumiantes
Chlamydia
pneumoniae pneumoniae Humanos
Chlamydia trachomatis Chlamydia
trachomatis Humanos suis Cerdos
muridarum Ratones
Parachlamydiaceae acanthamoebae Waddiaceae chondrophila
Simkaniaceae negevensis
4
Los miembros de la familia Chlamydiaceae producen infecciones oculares,
pulmonares, genitales, articulares e intestinales tanto en aves como en humanos y
otros mamíferos (Fig. 1); sin embargo, Chlamydia abortus y C. psittaci son las
especies de mayor importancia debido a su alto potencial zoonótico.5
Aun cuando el AEPR no se describe con frecuencia en humanos, existe un riesgo
considerable de infección en mujeres gestantes, asociado en la mayoría de los
casos a un contacto directo con ovejas o cabras infectadas. 8,9, 5. Si el contagio se
produce durante el primer tercio de la gestación sobreviene el aborto, mientras
que si tiene lugar al final, puede producir septicemia y mortalidad perinatal10
(Cuadro 2).
Figura 1. Patógenos de la familia Chlamydiaceae potencialmente zoonóticos.
Favorecen la transmisión zoonótica
Evidencia de transmisión zoonótica limitada
Potencial zoonótico desconocido
5
Cuadro 2. Familia Chlamydiaceae
Adaptado de Kerr et al., 200559
Especies Hospedero Enfermedad/Síntomas
C. trachomatis Humanos Conjuntivitis crónica (tracoma), enfermedades de
transmisión sexual, enfermedad inflamatoria pélvica,
infertilidad
C. muridarum Ratón, hamster Infección en tractos respiratorio y genital
C. suis Cerdos Enfermedad intestinal, respiratoria y reproductiva
C.
pneumoniae
Humanos Neumonía, bronquitis, faringitis, se le relaciona con
aterosclerosis, artritis reactiva y asma
C. psittaci Aves silvestres
y de corral
Enfermedad respiratoria (zoonosis)
C. abortus Rumiantes y
cerdos
Aborto (zoonosis)
C. pecorum Rumiantes y
cerdos
Enfermedad entérica, neumonía, conjuntivitis, poliartritis,
metritis y encefalomielitis
C. felis Gatos Conjuntivitis (probable zoonosis)
C. caviae Cerdo de guinea Infección ocular y en tracto genital
1.1.1 Antecedentes
En 1936, Greig, descrubre por primera vez el aborto clamidial, denominándolo
aborto enzoótico ovino. La enfermedad fue asociada a deficiencias nutricionales
en los animales y a factores medioambientales. Sin embargo, en 1950, Stamp et
6
al. demostraron que la enfermedad era ocasionada por un agente infeccioso
perteneciente al grupo “ psitacosis - linfogranuloma venérreo”.4 En Alemania en
1959, se informó por primera vez sobre abortos por Chlamydia; después, la
enfermedad fue diagnosticada en Bulgaria, España, USA, Francia, India, Japón,
Reino Unido, Chad, Grecia y Túnez. Con excepción de Australia y Nueva Zelanda
en muchas partes del mundo el AEPR es la segunda causa de abortos infecciosos
después de brucelosis y la principal en países donde la brucelosis está controlada
o erradicada. 3, 8, 10, 11, 12
En México, el AEPR se encuentra clasificado dentro del grupo 1 de enfermedades
exóticas de la ganadería nacional de notificación obligatoria (DOF, 05 marzo
1999)13; sin embargo, existen evidencias serológicas y de aislamiento (1997) que
indican la presencia de la enfermedad en el territorio nacional y el riesgo de
ingreso al país es muy alto debido a la importación de ganado.14
En 2005, se realizaron estudios de ésta enfermedad en rebaños caprinos,
demostrando la presencia de la bacteria en el estado de Michoacán a partir de una
muestra de heces. 15 En 2008, se hizo un estudio serológico en rebaños caprinos
lecheros de seis estados del país, encontrando anticuerpos contra el agente;16 en
2010, nuestro grupo de investigación determinó también la presencia de
anticuerpos en cabras del Estado de Guanajuato y el aislamiento del
microorganismo se confirmó con la prueba de PCR a partir de hisopos vaginales;17
en 2011, Soriano et. al. identificaron mediante inmunofluorescencia, la presencia
de C. abortus en un aborto ovino procedente de Amoloya de Juárez, México,
mismo que fue confirmado con una PCR.18
1.2 Etiología
Chlamydia abortus es el agente etiológico del AEPR, es una bacteria pequeña que
tiene una pared celular con características similares a la pared de las Gram
negativas; sin embargo, carecen de la presencia de una capa rígida de
7
péptidoglicano, probablemente como consecuencia de la adaptación al medio
intracelular; aunque se ha descrito la presencia de ácido murámico, 19 (Cuadro
3). A causa de su aparente inhabilidad para producir ATP, estos microorganismos
dependen del metabolismo de las células hospederas para su multiplicación,
privándolas de nutrientes y fuentes de energía, por esta razón, C. abortus
necesariamente crece en el citoplasma de las células eucariótas en un ciclo de
desarrollo único en donde una forma infecciosa resistente, los cuerpos
elementales (CE), se alterna con una forma metabólicamente activa no infecciosa,
los cuerpos reticulares (CR) 19, 20, 21
1.2.1 Cuerpos elementales
Los CE son la forma infecciosa de C. abortus, son electro-densos, miden entre 0.2
– 0.3 µm de diámetro y están rodeados por una doble envoltura trilaminar:
membrana interna o citoplasmática y membrana externa, que es propiamente la
pared celular bacteriana que se caracteriza por tener gran cantidad de proteínas
ricas en aminoácidos azufrados, tal es el caso de la proteína principal de
membrana externa (MOMP) y las proteínas de membrana externa 2 y 3 (Omp2 y
Omp3 respectivamente) formadas por una fuerte unión de puentes disulfuro que le
dan rigidez y escasa permeabilidad.5, 19, 22, 23 Los CE son muy resistentes a las
condiciones ambientales estando fuera de la célula del hospedero; además,
cuando se encuentran en el medio extracelular, son metabólicamente inactivos, lo
que les facilita se transmitan de célula a célula y de hospedero a hospedero; de
tal forma que al ingresar nuevamente a una eucariota, inician inmediatamente su
síntesis de RNA y de proteínas.19, 23, 24, 25
8
Cuadro 3. Componentes de la pared celular clamidial que interactúan
con la célula hospedera. Escalante, et al. 1998
Componente de
la pared celular
Función Efecto
Lipopolisacárido
(LPS)
Estimula la
fagocitosis
celular, disminuye
el flujo en la
membrana celular
perturba la respuesta inmune
mediada
Proyecciones de
los RB
Perforación de la
membrana de la
inclusión clamidial
Facilita la adquisición de nutrientes
Proteínas ricas en cisteína (CRP):
a) Proteína
Principal
de
Membrana
Externa
(MOMP)
Porina Difusión pasiva de compuestos
hidrofílicos dentro de la bacteria
b) CRP
pequeña o
EnvA
Adhesina,
lipoproteína
Adhesión y entrada a la célula
hospedera
c) CRP
grande o
EnvB
Proteína principal
estructural
Función equivalente a la del
péptidoglicano
9
1.2.2 Cuerpos reticulares
Los CR miden entre 0.5 - 1.3 µm de diámetro, obtienen nutrientes e la célula
hospedadora y son la forma metabólicamente activa no infecciosa que se
multiplica por fisión binaria dentro de la célula; 5, 22,23, 4
En comparación con el CE, su pared es más fina y frágil, tiene una membrana
citoplasmática mal definida. Su interior es de aspecto granular y con mayor
número de ribosomas presentes. Se ha demostrado que los CR pueden sintetizar
en forma independiente ciertas proteínas de la célula hospedadora e incluso fuera
de la célula, si se les asegura un aporte adecuado de ATP exógeno.25, 26
Entre los CE y CR, aparecen unas estructuras denominadas corpúsculos
intermedios (CI) que constituyen tanto morfológica como estructuralmente una
etapa de transición en la condensación del CR para originar el CE. 8, 4 (Fig. 2).
Figura 2. Fotografía electrónica de las diferentes formas evolutivas clamidiales. Cuerpo elemental (CE), cuerpo intermedio (CI) y
cuerpos reticulares (CR), uno de ellos en fisión binaria (flecha). Barra: 0,25 m. Tomado de Nieves, 2005.
10
1.2.3 Ciclo de desarrollo
El ciclo evolutivo de las clamidias inicia cuando la forma extracelular del
microorganismo, el CE, infecta a una célula susceptible induciendo su propia
internación por endocitosis. La familia de las Chlamydiaceae presenta un ciclo de
desarrollo único, bifásico que dura entre 48 y 72 horas aproximadamente y consta
de cinco etapas, dando inicio cuando los CE se adhieren a las células epiteliales4,
27, 28 y continuando con los pasos que a continuación se describen:
1) Penetración de la forma infecciosa o cuerpo elemental en la célula
hospedera, con la inmediata transformación en la forma metabólicamente
activa o cuerpo reticular.
2) Multiplicación por fisión binaria del CR para dar lugar a una microcolonia o
inclusión citoplasmática.
3) Conversión de los CR en CE, seguida de la liberación bacteriana mediante
lisis o por exocitosis.4, 25,
Además del ciclo de desarrollo típico con sus dos fases, una de cuerpos
elementales y otra de cuerpos reticulares, se ha descrito también una tercer forma
persistente in vitro (en cultivo celular), donde los cuerpos reticulares tras diversos
estímulos son capaces de mantenerse por más tiempo dentro de la célula
hospedera; estas estructuras son conocidas como “formas aberrantes o de
persistencia”. 4, 25, 27, 28 (Fig. 3).
11
Figura 3. Ciclo de desarrollo de Chlamydia spp. Tomado de Martínez, 2006.
1.2.4 Establecimiento de C. abortus al interior de la célula hospedera
En el ciclo evolutivo de las clamidias, las formas infecciosas o CE, son los que tras
adherirse a la célula hospedera, ingresan en una vacuola cuya pared parece
originarse por una invaginación de la célula citoplasmática, esta vesícula formada
retrasa su maduración, manteniéndose en etapas tempranas de la vía endocítica,
evitando de este modo la fusión con los lisosomas, 20, 21 lo que les da la
característica propia de los microorganismos intracelulares obligados, es decir,
tienen la capacidad de promover su propia ingestión por los fagocitos no
profesionales, permitiéndoles mantenerse al interior de las células y evitar así la
interacción con las defensas del hospedero.23 Se ha sugerido que el responsable
de la inhibición de esta fusión es un factor termolábil, presente exclusivamente en
la superficie de los cuerpos elementales;29 este proceso resulta diferente cuando
se trata de un macrófago infectado, pues las vesículas infectadas forman parte del
sistema endosómico. En cuanto a los polimorfonucleares (PMN) sí se ha
demostrado la presencia de fagolisosomas; sin embargo, la mayor parte de las
bacterias son capaces de evadir la acción de los PMN al introducirse de manera
inmediata en otras células, quedando limitada su acción a las primeras fases de la
12
infección; incluso, se les considera incapaces de resolver la infección por sí solas. 4
Además de este ciclo de desarrollo típico, existe una tercer forma persistente que
ha sido estudiada in vitro, donde se ha inducido mediante una gran variedad de
estímulos una forma aberrante de los cuerpos reticulares, tal es el caso de la
presencia de INF-γ y antibióticos en el medio o bien de la privación de nutrientes
en el mismo, lo que puede alterar el crecimiento de las clamidias y facilitar de este
modo una infección crónica o persistente, particularmente cuando se estimula la
producción de INF-γ. 25
1.3 Estructura antigénica
Los agentes pertenecientes al orden de las Chlamydiales, comprenden un gran
número de microorganismos relacionados tanto estructural como
antigénicamente.30
Los antígenos presentes en las bacterias de la familia Chlamydiaceae, son
complejos y sólo parcialmente conocidos. Se localizan en la pared celular y se han
agrupado de acuerdo a su naturaleza en antígenos glicolipídicos y antígenos
proteícos4, 30, 31 (Fig. 4).
1.3.1 Antígenos glicolipídicos
1.3.1.1 Lipopolisacárido
De acuerdo a su estructura química, el Lipolisacárido (LPS) se encuentra
localizado en la membrana externa, es el segundo antígeno de mayor importancia
y se compone de un glicolípido que es compartido por todas las especies de
clamidias; por lo tanto, constituye un epítopo específico de género.19 Su presencia
se ha demostrado mediante las pruebas de fijación del complemento,
inmunofluorescencia y ELISA.31
13
El LPS clamidial es estable al calor; se le considera como un epítope específico de
grupo con estructuras parecidas a las encontradas en bacterias Gram negativas y
está formado por tres componentes principales: una porción lipídica (Lípido A), un
núcleo oligosacárido compuesto de heptulosa, glucosa, galactosa, glucosamina y
ácido ceto-3-desoxi-2octulosónico (KDO) y una parte final polisacárida denominda
antígeno “O” muy variable.29 Salinas et. al. (1994) caracterizaron la localización y
distribución de los epítopos de LPS de la cepa AB7 de C. abortus, localizándolos
en la zona externa de los CR e interna de los CE; esta localización, distinta a la
descrita para el género Brucella, explicaría la falta de eficacia protectora de los
anticuerpos (Ac) dirigidos contra el LPS de C. abortus. 29, 32
1.3.1.2 Glicolípido soluble
Es un antígeno específico de género, de naturaleza glicolipídica conocido como
GLXA o “exoantígeno glicolipídico”. Stuart et. al., lo aislaron en 1987 a partir de
sobrenadantes de cultivos infectados por Chlamydia trachomatis, demostrando
así, que es un glicolípido secretado durante el ciclo infectivo, puede ser hidrolizado
y fraccionado en componentes polisacáridos y lipídicos, ambas fracciones le
confieren una actividad antigénica; sin embargo, en sus análisis fisicoquímicos y
estructurales, se le atribuyeron características bioquímicas, inmunológicas y de
composición que la hacen marcadamente diferente al LPS, ya que no posee KDO
ni los ácidos grasos asociados al lípido A.19, 33, 34, 35
Actualmente se ha demostrado que el GLXA clamidial, se encuentra tanto en la
membrana de los CE como en la membrana de la inclusión intracelular formada
por los CR; también se comprobado su presencia durante la mitad y fin del ciclo
infectivo, así como en el citoplasma de la célula huésped; todo esto, le ha
conferido importancia en el inicio de la infección clamidial. 35, 36
14
1.3.2 Antígenos Proteicos
1.3.2.1 Proteínas de la membrana externa
1.3.2.1.1 Proteína principal de la membrana externa (MOMP)
Se han estudiado extensamente dos antígenos principales: uno de ellos, el mejor
caracterizado en las especies de Chlamydia, es la proteína principal de membrana
externa (MOMP), se encuentra en mayor proporción (60%) tanto en los cuerpos
elementales como en los reticulares; su peso varía entre 38 y 43 kDa y tiene
funciones de porina. Esta proteína es común a todos los miembros de la familia
Chlamydiaceae, aunque presenta diferencias estructurales y de inmunogenicidad
en cada una de las especies. También se le ha implicado en la entrada de las
clamidias a las células hospederas, ya que promueve las interacciones
electrostáticas no específicas con la célula, así como las interacciones
hidrofóbicas específicas, actuando también como adhesina.23, 28, 31 La MOMP, al
igual que el resto de las proteínas principales de la membrana externa de las
Gram negativas, se caracteriza también por ser insoluble al sarcosil, detergente no
iónico que solubiliza la membrana plasmática y el citoplasma de las bacterias,
dejando un resto insoluble denominado COMP (complejo de la membrana
externa).4, 29
1.3.2.1.2 Proteína polimórfica de la membrana externa (POMP)
El segundo antígeno es la proteína polimórfica de membrana externa (POMP), que
se expresa con masas moleculares entre 85, 90 y 105 kDa. Su superficialidad e
inmunogenicidad justifican el interés por estas proteínas. Son ricas en serina y
fenilalanina; son polimórficas debido a que sus genes sufren mutaciones que
originan variaciones en su estructura.
Actúan como citolisinas, que contribuyen a la rotura de la célula hospedadora y a
la salida del cuerpo elemental. 28, 31
15
La expresión de las POMP no está limitada a C. abortus, ya que los genes que la
codifican han sido identificados en todos los miembros de la familia
Chlamydiaceae; 37, 38 su síntesis se lleva a cabo en las últimas fases del ciclo de
desarrollo de las bacterias de la familia Chlamydiaceae, al mismo tiempo que las
proteínas periplásmicas ricas en cisteína. 4, 29
Inmunológicamente, la variación en la expresión de las POMP, puede desempeñar
un papel en la evasión de la respuesta inmune al momento de su ingreso a la
célula hospedadora. Las proteínas polimórficas, pueden inducir respuestas de tipo
celular y humoral, ambas específicas, haciéndolas de este modo, potenciales
candidatas como antígenos para vacunas, por otra parte, debido a su
especificidad y a la fuerte reacción que contra estas proteínas muestran los sueros
policlonales de ovejas infectadas experimental o naturalmente con C. abortus, se
han usado como antígeno de diagnóstico para diferenciar aquellas infecciones
provocadas por C. abortus de las provocadas por C. pecorum en rumiantes. 31, 29,
39
Figura 4. Representación esquemática de la membrana externa clamidial, mostrando la localización de las tres principales
proteínas: MOMP, Omp2 y Omp3. Adaptado de Hatch (1996)40.
1.3.2.1.3 Omp 2
Otro tipo de proteínas antigénicas identificadas utilizando suero de ratones
infectados son las conocidas como “pequeñas” y “grandes” proteínas ricas en
cisteína de 12 y 60 kDa, respectivamente.28, 41
Membranaplasmática
Membranaexterna
LPS
Omp2
MOMP
Omp3
16
Las Omp 2, también son conocidas como “EnvB” o “Large CRP” (proteína grande
rica en cisteína); forma parte del “COMC” en una proporción de 1:5 respecto de la
MOMP. Es codificada por el gen omp2 y su transcripción depende del ciclo de
desarrollo de las bacterias, ya que tiene lugar en el momento de la condensación
de los CR en CE. 29 Tiene dos cualidades principales; por una parte su elevado
contenido en aminoácidos azufrados, su transcripción es conjunta con la otra
proteína rica en cisteína (Omp 3) y por estar únicamente en los cuerpos
elementales se le confiere una función estructural. Es una proteína muy
inmunogénica, tanto en C. trachomatis como en C. psittaci; es sensible a la
tripsina y es capaz de unirse a las células epiteliales, lo que hace suponer que se
encuentra expuesta en la superficie de la bacteria; por lo que se piensa que puede
actuar como adhesina. 29, 41
1.3.2.1.4 Omp 3
Pertenece al grupo de las proteínas “pequeñas” ricas en cisteína y se le conoce
también como EnvA o “Small CRP” (proteína menor, rica en cisteína); es el tercer
componente de la COMC; pesa 12 kDa y el gen que la codifica es el omp3, que al
igual que el gen omp2, transcribe durante la condensación de los CR a CE. 4, 41
1.3.2.1.5 Proteínas del proceso celular
1.3.2.1.5.1 Proteínas de inclusión (Inc)
Se encuentran en la membrana de los cuerpos de inclusión de las bacterias
pertenecientes al orden Chlamydiales. Posee cada una de ellas un dominio
hidrofóbico único de 50 a 80 aminoácidos. Constituyen una familia de proteínas
que tienen un importante papel en la infección, el crecimiento y la supervivencia en
la célula. Su principal función es la evasión del sistema inmune, se les ha
relacionado con el desarrollo de la inclusión, la adquisición de nutrientes e incluso
se les ha asociado en los procesos de transición de cuerpos reticulares a
elementales y viceversa.4
17
1.3.2.1.5.2 Chaperonas o proteínas de choque térmico (HSP)
Sus siglas provienen del inglés Heat shock proteins, se encuentran en todos los
organismos y aparecen, principalmente en respuesta a un incremento de la
temperatura. 42
Fueron descubiertas en 1962 por Ritossa et. al.y aisladas en 1974 por Tissieres y
et. al.; las HSP, fueron descritas como un grupo de proteínas altamente
conservadas e involucradas en la homeostasis celular por mostrar los efectos
citoprotectores en diferentes formas de estrés. Se les atribuye el papel de
chaperonas moleculares y actúan tanto en el plegado y en la agregación de
proteínas, así como en el ensamblaje de las mismas; en el transporte intracelular y
la degradación de sustancias dañadas; además, tienen un papel protector en la
lesión de isquemia/perfusión mediante la reparación de proteínas dañadas,
eliminando de éste modo el estímulo para la apoptosis. Las proteínas de choque
térmico se encuentran numeradas en base a su masa molecular aproximada en
kDa 42, 43, 44 y se clasifican en cuatro familias: HSP 27, HSP 60, HSP 70 y HSP 90
kDa. La familia más estudiada dentro de las especies clamidiales es la HSP 70 o
Dnak-like, con un peso molecular de 75 kDa, localizada en la membrana
externa de los CE, por lo que se le atribuye un papel mediador en la adhesión de
C. trachomatis a la célula hospedadora; papel que aún no ha sido comprobado en
las demás especies; sin embargo, sí se ha demostrado que estas proteínas son
capaces de inducir una respuesta inmune humoral frente a la infección clamidial
tanto en el humano como en la oveja.4, 29 La HSP 60 ó Gro-EL-like de Chlamydia
pneumoniae, tiene un peso de 58 kDa y parece estar implicada en los daños
ocasionados en las arterias de los sujetos infectados debido a la hiperestimulación
de autoanticuerpos, por lo que se le relaciona con la arterioesclerosis, por inducir
un ataque a la pared endotelial, mediante una reacción de hipersensibilidad
retardada, propia de las infecciones crónicas. Por otra parte, la HSP 70, se
18
encuentra presente de forma temprana en la infección y tiene un importante papel
en el transporte de proteínas a través de las membranas. 28, 31, 29
1.3.2.1.5.3 Sistema de secreción tipo III (TTSS)
El sistema de secreción tipo III (T3SS ó TTSS) se considera como uno de los
principales factores de virulencia de las bacterias Gram negativas y actualmente,
ha surgido como un mecanismo capaz de promover la virulencia clamidial. La
presencia de esta estructura es esencial para el desarrollo de una infección aguda,
mientras que la cronicidad de la infección depende fundamentalmente de su
funcionamiento. 45 La secreción de tipo III, es el proceso principal por el cual las
bacterias translocan sus proteínas efectoras de la membrana de inclusión hacia el
interior del citoplasma de la célula hospedera, 46, 47 por lo que el TTSS es
requerido en cada fase del ciclo de vida de clamidia, ya que ofrece la posibilidad
de su multiplicación intracelular. 45
Ha sido bien establecida la capacidad de las clamidias para secretar proteínas
efectoras por el sistema de secreción tipo III y manipular la actina en las etapas
tempranas de la infección. La proteína efectora CT456 (TARP) es secretada
durante la entrada de las bacterias a la célula hospedera, iniciando la
polimerización de actina; este fenómeno se ha reportado en la etapa inicial de la
infección, sin embargo, se cree que no desempeñe un papel importante en los
reordenamientos de actina que median la extrusión que se produce casi 40 horas
más tarde. 48 Los principales efectores reportados para Chlamydia spp. son CrpA,
que activa los linfocitos T CD8+ y confiere una protección parcial en ratones
infectados con C. trachomatis. Otra proteína es la CPAF (Chlamydial Protease-like
Activity Factor) secretada al interior de la célula hospedadora y que puede
degradar factores implicados en la transcripción, necesarios para la presentación
de los antígenos por parte del complejo principal de histocompatibilidad tipo I
(CMG I) y tipo II (CMH II), lo que interfiere en la habilidad del hospedador a la hora
19
de responder frente a la infección clamidial, otras proteínas reportadas son CADD,
CT847, tarp, IncA, IncG, CT229, CT813, Cpn0585, Cpn0909 y Cpn1020. 29, 39
1.4 Inmunidad frente a las bacterias intracelulares
1.4.1 Generalidades
Algunas bacterias, sobreviven y se multiplican dentro de las células del
hospedador, tal es el caso de algunos microorganismos como Chlamydia spp.,
que es capaz de sobrevivir y multiplicarse dentro de fagocitos no profesionales
como las células endoteliales, esto debido a la presencia de moléculas de invasión
que les facilitan su entrada a estas células donde les es más fácil sobrevivir: ya
que estas bacterias se encuentran en un lugar inaccesible a los anticuerpos
circulantes, su eliminación requiere mecanismos inmunes distintos a los
establecidos para las bacterias extracelulares; sin embargo, el sistema inmunitario
del hospedador, debe intentar destruirlas, por lo que el éxito o fracaso de la
infección, dependerá de la eficiencia de la respuesta inmune del individuo
afectado. 49
La protección contra este tipo de infecciones se lleva a cabo por la activación de
macrófagos, después de la activación de células Th1. Aunque los macrófagos de
los animales no inmunizados suelen ser incapaces de destruir a estos
microorganismos, adquieren esta capacidad unos 10 días después de establecida
la infección. Esta activación es inducida por células Th1 y citocinas como el IFN-γ
y la IL-2. El IFN-γ es el activador más poderoso de macrófagos, y su eficacia
aumenta cuando se combina por contacto con algunos productos microbianos
como endotoxinas, dipéptido de muramilo y carbohidratos de la pared celular
(glucanos y mananos). La IL-2 también puede activar a los macrófagos; la
activación a través de esta interleucina es suprimida por IFN-γ, TGF-β e IL-4. Por
el contrario, la activación de macrófagos por INF-γ aumenta con las células Th1 y
NK y se suprime con las Th2. 50
20
Para la eliminación de microorganismos intracelulares, particularmente de la
familia Chlamydiaceae, es necesaria una respuesta inmune que se caracteriza por
el establecimiento de una potente respuesta Th1 que conlleva a la producción de
citocinas proinflamatorias, especialmente IFN-γ y la activación de linfocitos T.25, 50,
51
Las células T, juegan un papel crítico en la inmunidad protectora contra la
infección clamidial y diversos estudios han demostrado que la infección por
Chlamydia spp. no se resuelve en ausencia de células T; sin embargo, mientras
que la población de linfoctios T CD4+ resulta esencial en la resolución de la
infección de otras especies de la familia Chlamydiaceae, para el caso de C.
abortus, esta población, si bien es importante en la resolución de la infección, lo es
en menor grado que la población CD8+, que resultan esenciales para la
eliminación del microorganismo en una infección primaria. 51, 52, 53 (Fig. 5).
Fig. 5. Esquema de la respuesta inmune Th1 contra C. abortus. Adaptado de Rank y Bavoil (1996).54
NK
IL-12
TNF-
IFN-
lisis
IL-2CD8
Th1 ThIFN-
Macrófago
fagocitosis
B
IgG2aIgA
21
1.4.2 Respuesta inmune temprana o innata
El sistema inmune innato se caracteriza por actuar como la primera barrera frente
agentes extraños. Diversos estudios han demostrados que en una infección
primaria contra C. abortus, actúan principalmente los neutrófilos
polimorfonucleares (PMNs), que impiden la multiplicación incontrolada de
bacterias en órganos “diana”, como hígado y bazo. Estas células se han descrito
como necesarias para el reclutamiento adecuado de células TCD8+ en los focos
inflamatorios, siendo necesarias en la resolución de la infección por C. abortus.
Otras células importantes en la respuesta inmune innata, son las células “asesinas
naturales” (NK) que juegan también un papel importante en la resolución de
infecciones por microorganismos intracelulares. Se sabe que la presencia de
células NK en los focos inflamatorios, es crítica para la resolución de la infección
primaria por C. abortus.55, 56 Otro tipo de células presentes en sitios de infección
son macrófagos y linfocitos T gamma/delta (T γ/δ ), que actúan como puente
intermedio entre la respuesta inmune específica e inespecífica y en menor
proporción las células B; además, las células epiteliales producen diversos
mediadores pro-inflamatorios como CCL5, CXCL16, CXCL10, CXCL 1α, IL 8, IL-
12, IL-6, GM-CSF (factor estimulante de granulocitos y macrófagos) y factor de
necrosis tumoral (TNF), que inducen y aumentan la respuesta inflamatoria celular,
estimulando el daño directo a los tejidos y produciendo un aumento en la
expresión de moléculas de adhesión endotelial, que ayudan a la atracción de
células inmunes. 25, 29, 56
1.4.3 Respuesta inmune específica o adquirida
El sistema inmune adquirido o adaptativo, es un sistema específico que se
desarrolla después del primer contacto con un patógeno y su capacidad e
intensidad defensiva aumenta después de cada exposición subsiguiente a un
determinado microorganismo. Se le divide en inmunidad celular e inmunidad
humoral y se caracteriza por su diversidad, ya que responde a una gran variedad
22
de antígenos extraños; por su especificidad pues cada microorganismo genera
una respuesta específica; por establecer memoria, lo que la hace más rápida y
eficiente; finalmente por la ausencia de autoreactividad, ya que brinda al
organismo la capacidad de diferenciar entre lo propio y lo extraño (esta propiedad,
la comparte con la inmunidad innata). 49, 56
Sus principales componentes son los linfocitos, tanto B, como T alfa/beta (Tα/β),
de los que se diferencían dos subpoblaciones: linfocitos T colaboradores, que
presentan en su membrana el grupo o “Cluster” de diferenciación 4 (CD4) y los
linfocitos T citotóxicos, que presentan en su membrana el “Cluster” de
diferenciación 8 (CD8). 29
Por otra parte, los macrófagos y las células dendríticas son capaces de expresar
en su superficie antígenos unidos al complejo principal de histocompatibilidad tipo
II (MHC) y servir como células presentadoras de antígeno (APC), mismas que
resultan importantes en la activación del sistema inmune adaptativo.56
1.4.4 Respuesta humoral
Los principales componentes en la infección por clamidia, que inducen la aparición
de la respuesta inmune humoral, son el LPS y la MOMP (Omp 1). Ambas
sustancias inducen la aparición de anticuerpos neutralizantes, de los cuales,
algunos bloquearán el efecto tóxico del LPS y otros, la adhesión de la bacteria a
su célula blanco (anticuerpos anti MOMP). El LPS, es considerado como un
antígeno tóxico debido a que induce la producción de citocinas proinflamatorias
como IL-1 y TNF, también se le considera como timoindependiente, pues estimula
directamente a los linfocitos B, induciendo su diferenciación y producción de
anticuerpos.56, 57
23
1.4.5 Respuesta celular
Las respuestas de tipo Th1 (producción de IFN-γ), juegan un papel importante en
la resolución de la infección por clamidias, además, estudios en modelos murinos,
apoyan la hipótesis de que estas células se encuentran involucradas en la
protección contra la enfermedad; mientras que la respuesta Th2, relacionada en la
inmunidad humoral, participan de forma crucial en la persistencia de la
enfermedad. 49, 56 Una vez que las células presentadoras de antígeno han
reconocido y procesado a las clamidias, lo presentan a las células CD4+, que se
activan y estimulan la respuesta inmune Th1, en esta respuesta los linfocitos
CD8+ son capaces de lisar específicamente células infectadas.8 La producción de
IFN-γ por las células NK, favorece la activación de las células CD4+, facilitando de
este modo la protección de la infección y se cree que puede inhibir la
multiplicación intracelular de las clamidias, induciendo, posiblemente una infección
persistente. Las células NK, constituyen una importante fuente de IFN-γ durante
las infecciones virales y bacterianas y tienen una función citotóxica contra las
células infectadas.58 Se ha demostrado también, que la presencia de IFN-γ, puede
retrasar el ciclo de Chlamydia spp. de modo que los cuerpos reticulados
permanecen por más tiempo, resultando así en una infección persistente e
inaparente. 49, 56
1.5 Inmunopatología de la infección por clamidias
Las bacterias de la familia Chlamydiae comprenden un grupo diverso de
organismos e infectan gran variedad de hospederos, causando un amplio número
de enfermedades, 59 además de tener el potencial para establecer infecciones
persistentes por periodos prolongados, a menudo sin signos evidentes de
enfermedad y sin inducir respuesta inmune protectora; sin embargo las infecciones
crónicas pueden estimular el sistema inmune del hospedero.60, 21
24
En rebaños infectados, los animales se contagian mediante la ingestión de
cuerpos elementales contenidos en secreciones vaginales y membranas
placentarias al momento del parto o del aborto, o bien, a través de aerosoles; es
importante señalar que la permanencia del microorganismo en el medio se debe
principalmente a la rigidez de la envoltura celular, que a su vez es estable y
permeable osmóticamente, lo que facilita que los CE permanezcan viables en el
medio ambiente durante varios días. Algunos estudios, demuestran la
susceptibilidad del epitelio vaginal a la infección experimental con C. abortus, lo
que sugiere que la transmisión venérea es posible. Por último, la infección directa
del feto a través de la placenta se considera una vía de transmisión. 25, 59, 61
Una vez que la bacteria ingresa al organismo, el principal sitio de infección y
multiplicación son las tonsilas; también pueden alojarse en epitelio intestinal
causando una infección subclínica y a partir de estos sitios se diseminan por
sangre o linfa, ocasionando una primera clamidemia, a órganos de colonización
secundaria como hígado, bazo y pulmón, en donde permanecen en estado latente. 16, 59, 62
Se ha reportado que tanto ovejas como cabras, pueden excretar C. abortus hasta
dos semanas después de un aborto y que los CE pueden seguir siendo
infecciosos durante varias semanas a partir de este momento, situación que
aumenta la propagación del microorganismo.25
Una vez establecida la infección, C. abortus no puede ser detectada sino hasta el
día 90 de la siguiente gestación, que es cuando el microorganismo invade la
placenta. Cuando una oveja no está gestante y es infectada, se establece una
infección persistente bajo el control de IFN-γ hasta que en algún momento,
durante la futura gestación la infección se reactiva, es entonces cuando el
microorganismo invade la placenta y se multiplica en ella provocando una
placentitis; 63 además, C. abortus, se replica en las células trofoblásticas, lo que
25
conduce a su destrucción y al estímulo de una respuesta inflamatoria.28 Los
cambios fisiológicos que se producen durante la gestación, inducen una segunda
clamidemia y a partir de los órganos de colonización secundaria, el
microorganismo llega a células epiteliales del trofoblasto, extendiéndose la
infección a cotiledones y espacios intercotiledonarios entre los días 40 y 50 de
gestación, resultando en daño epitelial, edema e inflamación; 25, 28, 60, 62 esta
inflamación es el resultado de la infiltración de neutrófilos, macrófagos, linfocitos y
células plasmáticas; sin embargo, no todos los placentomas se infectan y el nivel
de inflamación y necrosis en los cotiledones y las membranas es variable. 59 Entre
los días 60 y 90, el daño causado por C. abortus en los placentomas compromete
el intercambio materno-fetal de nutrientes y oxígeno, lo que contribuye a la muerte
del feto y al aborto en las últimas dos o tres semanas de gestación o bien, al
nacimiento de crías débiles que mueren en los primeros días de vida. 25, 28, 59, 60, 62
Las lesiones fetales incluyen, necrosis focal en hígado y pequeños focos de
necrosis en pulmón, bazo, cerebro y linfonodos.59 La presencia de anticuerpos en
sangre de corderos recién nacidos, antes de la ingestión del calostro, es indicativa
de infección intrauterina. Marques et. al. (2010) demostraron en ovejas que al día
30, posinfección, se puede detectar en líquidos amniótico y alantoideo la presencia
de inmunoglobulinas G y M y que la concentración de estas inmunoglobulinas se
incrementa de forma gradual y proporcional al avance de la gestación. 28, 59
1.5.1 Mecanismos de persistencia
La persistencia clamidial ha sido descrita como una etapa de crecimiento viable
pero no infecciosa, que resulta de una relación a largo plazo con la célula
hospedera infectada. Estas relaciones se han establecido in vitro, generalmente a
través de las variaciones en las condiciones convencionales de cultivo de células
para el crecimiento de clamidias.64, 65
Muchos estudios han descrito cuerpos reticulares de mayor tamaño, cuya
multiplicación por fisión binaria de desacelera y por consecuencia disminuye su
26
diferenciación a cuerpos elementales, lo que estimula la formación de “cuerpos o
formas aberrantes clamidiales”. Estos cambios resultan reversibles tras la
eliminación del factor inhibidor del crecimiento. Por lo tanto, la persistencia parece
ser un mecanismo que permite a las clamidias “sobrellevar” condiciones hostiles y
mantener a largo plazo la infección dentro de una célula hospedera. 64, 65
Estudios in vitro han descrito diferentes mecanismos de inducción de estas formas
aberrantes, tales como la presencia de antibióticos en el medio, disminución de
nutrientes esenciales como aminoácidos, glucosa y privación de hierro, la
multiplicación en presencia de monocitos, infección por clamidiófagos, inducción
de choque térmico, el mantenimiento de manera prolongada de un cultivo
infectado y producción de citosinas, todos pueden inducir la modificación del
metabolismo y limitar la multiplicación de las clamidias; 4, 60, 64, 65 Desde 2004, se
han descrito nuevos modelos inductores de persistencia clamidial, como la
exposición a los componentes del humo de cigarro, la adenosina extracelular y a
la co-infección con el virus del herpes simple (HSV) en humanos o el virus de la
diarrea epidémica porcina. 65
1.5.2 INF-γ, Enzima IDO y Triptófano
La producción de IFN-γ induce la expresión de la enzima indolamina 2,3-
dioxigenasa (IDO), resultando en la degradación de triptófano intracelular, lo que
genera la privación de este nutriente esencial para el crecimiento de las clamidias;
sin embargo, los efectos anti-Chlamydia del IFN-γ se pueden revertir mediante la
adición de triptófano exógeno, lo que resulta consistente con los estudios de la
secuencia del genoma de C. abortus que han puesto de manifiesto que esta
bacteria carece de la capacidad para sintetizar triptófano por sí misma, haciéndola
dependiente de la célula hospedera. Esto plantea una paradoja interesante, la
placenta es un sitio favorable para el crecimiento de C. abortus debido a que la
expresión de citocinas tales como el IFN-γ es muy restringida en la interfase
27
materno fetal y por otro lado, resulta ser un sitio desfavorable, ya que las células
trofoblásticas en humanos y ratones expresan la enzima IDO, lo que perjudica al
microorganismo que requiere del triptófano para poder infectar las células. 66, 67
En general, la fase latente de la infección por clamidias, surge durante la primera
infección y la inmunosupresión asociada a la gestación puede ser un factor en la
reactivación de la bacteria. 68 El control inmunológico del microorganismo depende
de la habilidad del hospedero para montar una respuesta inmune mediada por
células y la protección se encuentra relacionada fuertemente con la producción de
INF-γ, situación demostrada para las infecciones por de C. trachomatis y C.
pneumoniae. Sin embargo, el control del crecimiento de C. abortus por IFN-γ en
células ovinas se encuentra relacionado con el catabolismo del triptófano, la
adición de éste último a los medios de cultivo revierte los efectos del INF-γ,
disminuyendo la síntesis de IDO, mediador de la persistencia en cultivos celulares.
Cualquier relación entre el INF-γ, el catabolismo del triptófano y el control del
crecimiento de Chlamydiaceae resulta compleja y es dependiente tanto del
hospedero como de factores del patógeno, tales como la sensibilidad al IFN-γ,
disponibilidad de triptófano intracelular y ausencia de genes que codifican la
producción del aminoácido en el genoma clamidial.69
1.6 Lesiones y cuadro clínico
La infección por C. abortus en cabras y ovejas infectadas induce aborto, muerte
fetal o el nacimiento de corderos débiles. El aborto se da principalmente en el
último tercio de la gestación, sin signos clínicos previos a que éste suceda; en
ocasiones, se observan descargas vaginales días previos al aborto, siendo más
frecuentes en cabras que en ovejas.
En bovinos, tampoco se observan signos clínicos hasta momentos previos al
aborto clamidial, que a lo igual que en pequeños rumiantes, se produce en el
último tercio de la gestación, aunque, puede tener lugar en el cuarto mes de la
misma.
28
La retención placentaria es más común en cabras y vacas, lo que pude producir
metritis. En terneros y corderos nacidos de hembras infectadas, puede haber un
cuadro de conjuntivitis y neumonía. El feto, no presenta lesiones macroscópicas
específicas. 70 tras el aborto, las lesiones características del AEPR son,
membranas placentarias necróticas, engrosadas y exudado placentario. Los fetos
abortados son generalmente bien desarrollados y no tienen anormalidades
anatómicas, lo que sugiere que la placentitis es un elemento clave en la
patogénesis del aborto enzoótico de los ovinos (AEO). 60
Los machos adultos, pueden contagiarse al momento de la monta con hembras
infectadas, la infección puede llegar a vesículas seminales y causar epididimitis y
orquitis, disminuyendo la calidad del semen.70
1.7 Diagnóstico
Existen diversas formas de establecer medidas para el control de la enfermedad,
una de ellas es su detección mediante pruebas diagnósticas que resulten efectivas
y permitan determinar el estatus del rebaño; sin embargo, cabe señalar que
actualmente no existe una técnica de diagnóstico capaz de detectar aquellos
animales con infección latente hasta el parto. El control del AEPR considera el uso
racional de antibióticos y la vacunación, teniendo cuidado al combinarlos, ya que
los animales vacunados pueden generar una respuesta de anticuerpos que puede
resultar en falsos positivos en las pruebas de diagnóstico serológico. 71
Un diagnóstico temprano y preciso de la causa de aborto es muy importante, ya
que con éste se pueden establecer las medidas de control apropiadas para limitar
o prevenir la propagación de la enfermedad. Cuando el aborto ocurre entre las dos
o tres últimas semanas de gestación, con una severa placentitis, se puede
sospechar de infección por clamidias, sin embargo, otros microorganismos como
Coxiella burnetii, Campylobacter fetus sp fetus, Toxoplasma gondii y brucelas
29
lisas, pueden causar lesiones placentarias, 1, 2 lo que hace que el diagnóstico de la
enfermedad sea complicado requiera la intervención del laboratorio. 72
En el diagnóstico de la clamidiosis, más importante que el aislamiento e
identificación del microorganismo a partir de los abortos, es la detección de la
bacteria en aquellos animales aparentemente sanos que han estado en contacto
con animales ya enfermos y que pueden ser portadores del agente. Por esta
razón, el diagnóstico individual es de menor valor que el colectivo, de todo el
rebaño. Actualmente existen diferentes procedimientos que se pueden realizar en
el laboratorio y se agrupan en métodos directos y métodos indirectos; con los
primeros se busca la identificación del agente etiológico, C. abortus, en las
muestras recibidas, mientras que en los indirectos, se detecta la respuesta inmune
generada por el animal como consecuencia de la infección. 8
Según la OIE, el método más comúnmente usado para el serodiagnóstico de la
clamidiosis es la prueba de fijación del complemento (CFT); sin embargo, además
de ser una técnica laboriosa, es de sensibilidad limitada y a menudo afectada por
reacciones cruzadas entre especies de clamidias. 73
1.7.1 Diagnóstico directo no basado en cultivo
1.7.1.1 Microscopia mediante tinción
Se realiza en extensiones y frotis de exudados y secreciones de órganos o tejidos
afectados. La placenta fresca y corderos muertos son las muestras de elección,
deben colocarse en bolsas de plástico herméticamente cerradas; de manera
alternativa, cuando no se dispone de un laboratorio cercano, se puede colocar un
trozo del tejido afectado (placenta o cotiledón) en medio de transporte para
clamidias, elaborado a base de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG), suplementado
con suero fetal bovino y antibióticos como gentamicina y estreptomicina, mas no
penicilina y un inhibidor fúngico; las tinciones utilizadas pueden ser la técnica
modificada de Ziehl-Neelsen o Stamp, Macchiavello o Giménez, donde el principal
30
colorante es la fucsina fenicada y como contraste se emplea el verde de malaquita
o el azul de metileno, realizándose la decoloración con un ácido débil diluido
(ácido acético o cítrico). En casos positivos, con la técnica de Stamp, se pueden
ver mediante el examen microscópico gran número de pequeños cuerpos
elementales cocoides (300 nm) aislados o en grupo, resaltados sobre un fondo
azul o verde de restos celulares, en campo oscuro, los cuerpos elementales son
de color verde pálido. 1, 2, 8, 74
Cuando no se dispone de material placentario, se pueden realizar frotis de
exudados vaginales con un periodo de tiempo no mayor a las 24 horas después
del aborto, o bien, a partir de lana húmeda del feto recién abortado o del cordero
nacido muerto. 2, 74
Debido a su morfología y propiedades tintoriales C. abortus se parece a la
rickettsia Coxiella burnetti que también puede provocar abortos y que origina la
fiebre de Q en humanos; sin embargo, las diferencias antigénicas entre C.
abortus y Coxiella burnetti se pueden detectar mediante pruebas serológicas. 2, 74
Es importante señalar que ante una tinción positiva, el diagnóstico presuntivo,
debe ser confirmado mediante el aislamiento. 8
1.7.1.2 Detección del antígeno
Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para la detección de los
antígenos de Chlamydia spp. a partir de órganos, tejidos o exudados. La reacción
inmunológica se revela mediante la utilización de compuestos fluorescentes o
mediante una enzima y su sustrato. Se disponen de varias pruebas comerciales
para detectar antígenos clamidiales a nivel de género. 74 Una de ellas es la
inmunofluorescencia directa; esta técnica es más sensible que los métodos de
tinciones específicas o los empleados para el aislamiento y cultivo. En un principio,
se utilizaban anticuerpos contra el LPS de la membrana clamidial, con
especificidad de género, pero la técnica ha mejorado al introducir anticuerpos
31
monoclonales, que actualmente permiten la diferenciación entre las diferentes
serovariedades; sin embargo, no se encuentran disponibles comercialmente. 8, 74
Por otra parte, la técnica de inmunocaptura, que es una variante de las pruebas de
ELISA utilizadas en serología, donde las placas se tapizan con anticuerpos
policlonales o monoclonales para C. abortus. Existen métodos comerciales para el
diagnóstico de C. trachomatis en humanos, que emplean anticuerpos
monoclonales contra el LPS; esta molécula es específica de la familia
Chlamydiaceae y también se puede recurrir a ellos para la detección de
Chlamydia abortus, con resultados aceptables.74
Finalmente, la inmunohistoquímica, que se aplica en cortes de órganos y tejidos
fijados en formol e incluidos en parafina, utilizando anticuerpos secundarios
conjugados con enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, añadiendo
posteriormente el sustrato adecuado que, al entrar en contacto con la enzima,
precipita y colorea el área donde se localiza el antígeno. 74
1.7.2 Diagnóstico directo en cultivos
Debido a que C. abortus es un microorganismo intracelular obligado,
necesariamente debe aislarse en huevos embrionados de gallina o en cultivos
celulares, siendo este último el método de elección para el aislamiento de cepas
nuevas. 2, 74
Las muestras de tejido, como los cotiledones infectados, las membranas
placentarias, el pulmón o el hígado fetal, o exudados vaginales que tengan que
esperar el comienzo de los procedimientos de aislamiento, deben mantenerse en
medio SPG, utilizando una proporción de tejido:medio de 1:10. 2, 74
1.7.2.1 Inoculación de embriones de pollo
Es el método más antiguo para el aislamiento de clamidias que se reproducen en
saco vitelino de embriones de pollo de 6 a 7 días de edad. Los embriones mueren
32
entre los días 4 y 13 posinoculación. Las improntas preparadas a partir de los
sacos vitelinos congestionados revelan la presencia de gran cantidad de cuerpos
elementales; también se pueden apreciar hemorragias en las membranas y piel
del embrión. 2, 8
1.7.2.2 Infección en cultivos celulares
Chlamydia abortus puede ser cultivada en gran variedad de líneas celulares,
siendo Mc Coy, L929 y las de riñón de hámster neonato (BHK) las más utilizadas. 1
Los cultivos celulares han sido considerados durante mucho tiempo como la
“prueba de oro” para el diagnóstico de esta infección y son utilizados porque
además de permitir el seguimiento de la evolución de la infección, con
identificación del efecto citopático, permiten la observación de inclusiones
intracitoplasmáticas en células teñidas con anticuerpos monoclonales
fluorescentes o bien, la titulación del número de unidades formadoras de
inclusiones (UFI). 8, 74, 75
La actividad de las clamidias puede incrementarse mediante el tratamiento
químico de las células cultivadas, antes o durante la infección, favoreciendo de
este modo su crecimiento. Dentro de las sustancias que se han descrito para
incorporar al inóculo infectivo al que se exponen las monocapas están:
cicloheximida (0.5 µg/mL), que es un antibiótico glutarimídico que inhibe la síntesis
de proteínas de las células eucariotas sin afectar a las clamidias; la citocalasina B,
que interfiere en la división citoplasmática; 5-yodo-2-deoxiuridina (80 µg/mL), que
se incorpora al ADN en sustitución de la timidina y se aplica durante los tres días
preinfección y la emetina (1 µg/mL) 5 minutos antes de infectar las células. Siendo
la cicloheximida la más utilizada y la deoxiuridina la que menos se emplea, ya que
requiere mucho tiempo para el aislamiento del agente. 2, 74
33
Dentro de los procedimientos utilizados para favorecer la penetración de las
bacterias a las células, se puede emplear la centrifugación, el tratamiento con
dietil-amino-etil dextrano (DEAE-D), que es un policatión hidrosoluble que actúa de
puente entre las membranas del microorganismo y la de las células eucariotas
cargadas negativamente; también se tratan con polietilenglicol; finalmente, el uso
de la cicloheximida puede combinarse con los procedimientos de centrifugación o
con el uso del DEAE-dextrano para incrementar la infectividad de las clamidias in
vitro. 74, 76
1.7.3 Diagnóstico indirecto por serología
En general, las pruebas serológicas son consideradas como métodos de
diagnóstico indirecto y su objetivo es determinar si el animal en cuestión ha
padecido la infección, utilizando para ello la detección y cuantificación de
anticuerpos específicos en suero (respuesta humoral), o poniendo de manifiesto
una reacción de base célular. El diagnóstico serológico es el que más se emplea
de forma rutinaria en la clamidiosis de los pequeños rumiantes, debido a que es
más importante la inmunidad y el conocimiento del estado sanitario del rebaño,
que el que corresponde a un individuo en particular. 2, 8
Dentro de los métodos más utilizados para la detección de anticuerpos anti-
clamidias en sueros de animales, se encuentran las pruebas de
inmunofluorescencia indirecta, los inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y la
fijación del complemento, que detectan la respuesta inmune humoral,
principalmente al LPS, común a todas las clamidias y los antígenos proteicos
específicos de género, especie o serotipo. 8, 77
34
Fijación del complemento
Según la OIE, es éste el método más usado para el serodiagnóstico de la
clamidiosis en animales, aún cuando esta prueba resulta complicada y no es
capaz de diferenciar entre especies, ya que utiliza como antígeno el LPS o bien la
proteína de choque térmico presente en todas ellas. 2, 73, 77
Los títulos de anticuerpos a C. abortus generalmente se mantienen negativos o en
niveles muy bajos hasta la finalización de la gestación, que es cuando sufren una
elevación importante, con un máximo entre los 14-21 días posparto, alcanzando
en los animales que han abortado valores superiores a 1:80; sin embargo, como la
infección se observa sobre todo durante la invasión placentaria activa en el último
mes de la gestación y después de la bacteremia que a menudo acompaña al
aborto, se pueden obtener sueros pareados, los primeros tomados al momento del
aborto y el segundo muestreo, después de al menos tres semanas, ya que pueden
revelar un título de anticuerpos para FC que permita establecer un diagnóstico
restrospectivo. 2, 8, 77
Esta técnica tiene el inconveniente de ser laboriosa, de sensibilidad limitada,
especialmente cuando se trabaja con animales cuyos títulos son bajos o bien,
están vacunados, además de verse afectada por reacciones cruzadas entre
especies de clamidias. 2, 8, 73
1.7.3.2 Inmunofluorescencia indirecta
También llamada Microinmunofluorescencia indirecta (MIF), es probablemente la
prueba más sensible para el diagnóstico de la clamidiosis debido a que los
antígenos dirigidos a las proteínas de membrana externa son detectados en las
células obtenidas del sitio de lesión con el empleo de un anticuerpo monoclonal
conjugado con fluorocromo. 72, 75
35
En el Reino Unido, esta prueba se utiliza para la confirmación de los casos
positivos a la FC, comparando la respuesta serológica a C. abortus y C. pecorum.
Esta técnica es compleja y subjetiva al leer los resultados, ya que requiere de
personal especializado, a lo que se agrega la dificultad para disponer de antígenos
estandarizados. 8
1.7.3.3 ELISA
Las respuestas serológicas a C. abortus y C. pecorum se pueden evidenciar con
microinmunofluorescencia, pero el procedimiento es largo a los efectos de un
diagnóstico rutinario, por lo que se han desarrollado pruebas de ELISA por varios
grupos de investigación, sin embargo, aún no se emplean en el trabajo de
diagnóstico general, debido a las dificultades asociadas con el uso de antígenos
particulados. Sin embargo, se han desarrollado y utilizado con muestras
experimentales y de campo un sin número de ELISA´s que incorporan diversos
antígenos clamidiales como el LPS purificado, la MOMP y la POMP de forma
soluble y estable y han dado resultado, aunque carecen de especificidad de
especie en algunos casos, pero presentan una mayor sensibilidad que la prueba
de FC. A esto, se pueden agregar otras ventajas, como su automatización, que
facilita el diagnóstico serológico de rebaños completos, y la objetividad de
interpretación al utilizar un espectrofotómetro.2, 77, 78
Recientemente se ha desarrollado un ELISA competitivo (ELISAc) con un
anticuerpo monoclonal específico dirigido a dominios de la MOMP. Sin embargo,
estas proteínas son potenciales candidatos para la elaboración de vacunas de
subunidades, lo que dificultaría el diagnóstico, ya que no se podría diferenciar
entre animales vacunados e infectados. También se ha desarrollado un ELISA
indirecto (ELISAi) basado en un fragmento de la proteína polimórfica de
membrana externa, una proteína recombinante de C. abortus POMP91B
(rONP91B iELISA), a la que se ha demostrado mayor especificidad en
comparación con FC. Se ha sugerido a estas proteínas como candidatos para el
36
serodiagnóstico de la clamidiosis, ya que reaccionan fuertemente en
inmunotransferencia con sueros de ovejas infectadas con C. abortus pero no con
sueros de infectadas con C. pecorum y no se han propuesto como posibles
candidatos para antígenos vacunales. 1, 77
1.7.4 Amplificación de ADN clamidial
Las posibilidades para la detección de clamidias, han mejorado considerablemente
después de la introducción de métodos genómicos, particularmente la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que permite la identificación directa en muestras
clínicas y la diferenciación de especies. Se han publicado una serie de pruebas
como los ensayos TETR-PCr (touchdown enzyme time release) que amplifican
regiones del gen 16S y los espaciadores 16S-23S ADNr para detectar de forma
sensible y específica las diferentes especies del género Chlamydia. El método de
detección de C. psittaci por PCR de tiempo real del gen envB utilizando SYBR-
Green, es rápido y sensible, aunque sólo se ha utilizado para detectar el
microorganismo en muestras de heces de aves y su especificidad es relativa ya
que detecta otras especies del género. Ninguna de estas pruebas ha sido validada
en laboratorios de diagnóstico veterinario y no estan disponibles comercialmente
.17, 73, 74
1.8 Control y profilaxis
El control de esta enfermedad no sólo es importante desde el punto de vista de la
sanidad animal, sino también para prevenir su contagio al hombre. La medida de
control más aconsejada en esta enfermedad es la vacunación, 79 sin embargo, se
pueden establecer medidas de control y prevención del AEPR en base a tres
aspectos: medidas de manejo o no específicas, tratamiento con antimicrobianos y
con la inmunización.8
Las medidas de manejo consisten en el aislamiento de animales enfermos y su
progenie, todos los corderos muertos, placentas y ropa de cama, deben
desecharse de forma segura; los corrales de parición, comederos y bebederos,
37
deben ser desinfectados para evitar se propague la contaminación a otros lugares
de las instalaciones. Es importante lavarse bien las manos y de ser posible,
cambiar la ropa del médico o trabajadores antes de atender otros animales.80, 1
Chlamydia es susceptible a la mayoría de los desinfectantes y detergentes,
incluyendo una dilución de 1:1000 de compuestos de cuaternario de amonio, 1 %
de hipoclorito de sodio, etanol al 70 %, entre otros. También puede ser destruida
por calor húmedo a 121° C durante 15 min., o calor seco entre 160 y 170° C
durante una hora.81
La clamidiosis usualmente es tratada con tetraciclinas, las ovejas gestantes deben
tratarse con oxitetraciclina de acción prolongada a razón de 20 mg/kg vía
intramuscular; se recomienda se administre entre el día 95 y 100 de gestación, ya
que es cuando se empiezan a dar los cambios ocasionados por las clamidias en
placenta. Como el efecto del tratamiento es suprimir la multiplicación de la
bacteria, se deben administrar más dosis de antibiótico a intervalos de dos
semanas hasta el parto. Es importante mencionar que aunque el medicamento
reduce las pérdidas y la cantidad de microorganismos excretados al parto, no
erradica la infección y los daños que se pudieran ocurrir en placenta no son
reversibles, por lo que algunas ovejas sí abortan; también se recomienda el
tratamiento con eritromicina y otros macrólidos, tilosina, quinolonas y cloranfenicol
pueden ser usados.1, 81
Finamente, la vacunación es considerada como la única solución eficaz para
controlar la infección por Chlamydia en los rebaños.1, 81
Cuando ingresan animales al rebaño y se tiene duda sobre su procedencia,
deberán ser vacunados antes de ingresar al mismo, si la infección ya ha sido
diagnosticada, las ovejas deben ser vacunadas antes de la época reproductiva,
repitiendo la vacunación en tres años cuando el rebaño se encuentra muy
infectado.1
Las vacunas inactivadas fueron las primeras en utilizarse, son inactivadas con
formalina y tienen como desventaja conferir protección limitada e impedir la
38
eliminación del microorganismo durante el parto, pero pueden conferir cierta
protección residual, que puede ser adecuada en rebaños donde la carga clamidial
aún es baja. Las vacunas atenuadas mejoran el nivel de protección, pero al
tratarse de una vacuna viva, el daño potencial la hace menos atractiva como
alternativa. Del mismo modo, el uso de vacunas subcelulares no ha dado buenos
resultados, así como tampoco los ensayos realizados con vacunas basadas en
ADN. 70, 80
En los 80´s, se desarrolló una vacuna viva termosensible que crece a 38 ºC, pero
a 39 ºC se restringe su crecimiento; ésta, se encuentra constituida por la cepa 1B,
que es una mutante nitrosoguanina, procedente de la cepa de campo AB7 de C.
abortus.80, 82 Esta vacuna ha resultado ser más eficiente, ya que disminuye la
presentación de signos clínicos y previene la infección en ovejas y cabras
desafiadas,70 pero, el uso de este tipo de vacunas interfiere en la interpretación de
un diagnóstico serológico rutinario y puede causar estados temporales de
inmunosupresión acompañados de un aumento de susceptibilidad a otras
infecciones.4
En general, una vacuna debe cumplir con una serie de características para tener
éxito, idealmente, una vacuna debería ser eficaz, segura, económica para su
producción y estable, teniendo en cuenta los múltiples factores que influyen en
cada uno de estos criterios, sin embargo, una vacuna eficaz necesita provocar una
respuesta inmune protectora y al hacerlo no debe causar la enfermedad. En
consecuencia, los retos para el desarrollo de una nueva vacuna contra el AEPR
son:
1.- La identificación y combinación óptima de componentes del patógeno, que
provocan una respuesta protectora de IFN-γ.
2.- La integración de estos componentes en una formulación adecuada y
3.- La producción de los componentes de forma rentable y que cumpla las
necesidades de las partes interesadas.
39
La capacidad de C. abortus para establecer una infección persistente en ovejas es
reflejo de una adaptación compleja entre el hospedero y el patógeno. La respuesta
inmune que se genera durante esta etapa de la infección aún no es del todo clara,
sin embargo, la inmunidad que se genera después del aborto, se sabe que es
protectora; por lo que el objetivo de una nueva vacuna contra el AEPR debe ser el
imitar o mejorar esta respuesta protectora.82
1.9 Diagnóstico en México
En México, el Aborto Enzoótico Ovino (AEO) se encuentra clasificado dentro de
las enfermedades exóticas de la ganadería nacional y de notificación obligatoria13;
sin embargo, existen evidencias serológicas y de aislamiento que indican la
presencia de la enfermedad en el territorio nacional.14
Mientras la enfermedad se considere exótica, no es factible realizar pruebas
diagnósticas dentro del territorio nacional, así como tampoco es posible la
introducción de material para diagnóstico ni de vacunas, lo que dificulta determinar
la situación de la enfermedad en el país y establecer medidas de prevención y
control para la misma.
40
Justificación
La clamidiosis es considerada una enfermedad exótica en México; 2 sin embargo,
en 1997, se reportó el agente a partir de muestras de cabras que abortaron14, lo
que generó interés por realizar estudios epidemiológicos, que permitieran conocer
la situación de la enfermedad, pero, por su situación de exótica, resulta
complicado el diagnóstico de la enfermedad ya que únicamente se pueden
emplear estuches de ELISA importados, de costo elevado, y con dificultad de
importación. Lo que genera la necesidad de desarrollar técnicas diagnósticas
propias y eficaces, que sean capaces de determinar el estatus de los rebaños y de
cada uno de los individuos que los conforman, con el objetivo de establecer
medidas de control para el AEPR; desafortunadamente, el comportamiento y las
características tanto de la enfermedad como del agente etiológico dificultan aún
más el desarrollo de éstas pruebas que además, deberán ser de fácil acceso a los
productores.
2 Hipótesis
Un extracto crudo de C. abortus, puede usarse en el diseño un ELISA-Indirecto
para el diagnóstico del AEPR; éste deberá tener al menos 80% de sensibilidad y
especificidad.
41
3 Objetivo general
Desarrollar y estandarizar un ELISA Indirecto (ELISA-I) que sea útil para el
diagnóstico de clamidiosis en caprinos
4.1 Objetivos particulares
Reproducir C. abortus en saco vitelino de embriones de pollo y en la línea
celular L929 de fibroblastos de ratón para la obtención del paquete celular y
del antígeno12.
Determinar la sensibilidad del ELISA usando sueros de caprinos con
aislamiento y PCR positivos de C. abortus,
Establecer la especificidad del ELISA-I utilizando sueros de caprinos sin
historia de abortos y de un rebaño sin antecedentes de clamidiosis,
Realizar un perfil comparativo con sueros positivos y negativos a diferentes
enfermedades que afectan a los caprinos y establecer la concordancia
entre los resultados obtenidos con el ELISA comercial y el ELISA diseñado.
42
4 Material y métodos
5.1 Material biológico
5.1.1 Sueros
Se trabajó con un total de 397 sueros de caprinos provenientes de diferentes
estados de la república mexicana, particularmente se emplearon aquellos con
historial de abortos, Guanajuato, Tlaxcala, Guerrero, Coahuila y San Luis Potosí
(SLP).
Para el caso del estado de Guanajuato, las muestras provenían de hembras de
primer parto y de aquellas que estuvieran próximas a parir (2 semanas) o bien,
recién paridas (4 semanas); de éste grupo se seleccionaron 10 sueros de
animales con historia de aborto y con seropositividad al ELISA comercial para
diagnóstico de clamidiosis, además eran aislamiento y PCR positivos. 17
El grupo control negativo fue del mismo tamaño, 10 sueros de animales sin
historia de aborto y con resultado negativo al estuche comercial; estos, fueron
tomados del estado de Guerrero. Las muestras se seleccionaron de un banco de
sueros ya existente en el CENID Microbiología Animal, INIFAP, de las cuales 30
eran seropositivas y 30 seronegativas a brucelosis y leptospirosis.
5.1.2 Microorganismos
Para la obtención del antígeno se utilizó la cepa de referencia A22 de Chlamydia
abortus. (Propiedad de la FMVZ-UNAM, Proveniente del Central Veterinary
Laboratory, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB United Kigndom, donada
por Petter C. Griffiths, en 1993.
Permiso de importación , Depto de Autorizaciones Zoosanitarias. Dirección
General de Salud Animal m NO, 0012839, agosto 23, de 1993, otorgado a la MVZ
Cristina Escalante Ochoa. Certificado Zoosanitario de importación No. 27491).
43
La bacteria fue multiplicada en saco vitelino de embrión de pollo y en la línea
celular L-929 para ser titulada, alicuotada y almacenada a -70° C para
posteriormente ser usada como antígeno.
5.2 Cultivo y producción de C. abortus en saco vitelino de embrión de
pollo
Se inocularon 0.2 ml de una suspensión de la cepa A22 de C. abortus en los
embriones de pollo de 7 días de edad. Algunos huevos embrionados se inocularon
únicamente con solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.2 estéril como
controles negativos.
Con ayuda de un ovoscopio se localizaron y marcaron tanto la cámara de aire
como la posición del embrión, también se determinó si los embriones estaban
vivos o muertos.
La inoculación se realizó usando una jeringa insulínica (BD Ultra-fine®) con aguja
desmontable de 0.9x40 mm a través de la cámara de aire en el saco vitelino, al
lado opuesto del embrión.
Los huevos inoculados se mantuvieron en incubación a 37° C durante 7 a 8 días;
durante este tiempo, se observaron diariamente para detectar y eliminar aquellos
que murieran dentro de los 3 primeros días posinoculación, por traumatismos, por
problemas tóxicos o de contaminación.
Chlamydia abortus ocasiona la muerte del embrión entre los días 4 y 13 pos-
infección; 2, 8 a partir de este momento, se pueden obtener y juntar los sacos
vitelinos para ser macerados en PBS estéril a una proporción de 1:3 p/v con arena
de mar lavada estéril y con ayuda de un mortero; todo bajo estrictas condiciones
de esterilidad.
44
Una vez macerados, los sacos vitelinos fueron centrifugados durante 10 minutos a
175 xg para eliminar restos celulares y la fracción lipídica. (Fig. 6).
Figura 6. Restos celulares (fondo del tubo), suspensión rica en clamidias
(porción media del tubo) y fracción lipídica (parte superior del contenido en
el tubo).
Para descartar el crecimiento de contaminantes en las muestras obtenidas, éstas
se sembraron en agar sangre al 5% y se incubaron durante 24 horas a 37° C. De
los huevos embrionados, que fueron inoculados con PBS estéril, también se
obtuvieron bajo el mismo procedimiento los sacos vitelinos que fueron utilizados
como controles negativos.
5.3 Determinación de la presencia de C. abortus en los sacos
vitelinos infectados
Para determinar la presencia de clamidias en los sacos vitelinos infectados, se
hicieron frotis de cada macerado, se secaron por calor, se fijaron con metanol y se
tiñeron por el método de Stamp et. al. 1950 12:
Fucsina fenicada diluída a 1/5 en PBS y filtrada, por 15 min.
Decoloración con ácido acético al 0.05% en PBS, por 20 seg.
Contraste con verde de malaquita al 4% en agua destilada, por un
minuto.
Tanto la selección de los sacos vitelinos y sus macerados, como la valoración de
las clamidias se realizaron mediante observación subjetiva, utilizando una escala
45
que comprendía de 0 a 5 puntos y teniendo en cuenta las lesiones presentes tales
como el grado de congestión2; las muestras seleccionadas fueron aquellas que
tuvieron entre 4 y 5 puntos.
Para determinar la presencia de antígeno clamidial, se realizó la técnica de
inmunofluorescencia directa, utilizando un estuche comercial (ImagenTM
Chlamydia, Oxoid). Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal específico de
género para el LPS clamidial marcado con fluoresceína, dicho antígeno se
encuentra presente en todas las cepas de Chlamydiae. La técnica se realizó
conforme las indicaciones del fabricante:
Los frotis fueron fijados con acetona fría (4° C) y secados a temperatura ambiente,
a cada uno se le agregaron 25 µL del anticuerpo monoclonal teñido con
isotiocianato de fluoresceína (FITC), los portaobjetos se incubaron durante 30
min. a 37° C en cámara húmeda. Se utilizaron 2 µL azul de Evans como colorante
de contraste; transcurrido el tiempo, se hicieron tres lavados de 5 minutos cada
uno con PBS, las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente y se
observaron en un microscopio de epifluorescenencia, utilizando el objetivo 40X.
Los macerados considerados como óptimos, fueron alicuotados y congelados a -
80° C hasta el momento de su uso.
5.4 Cultivo y multiplicación de C. abortus en línea celular L-929.
5.4.1 Cultivo de la línea celular L-929
Esta línea celular proviene de tejido conectivo de ratón y se mantiene congelada
en nitrógeno líquido.
Las células fueron descongeladas y puestas en cultivo; para ello, el criotubo donde
se encontraban se puso en baño María a 37° C en agitación suave; éste
procedimiento debe ser lo más rápido posible para evitar la formación de cristales
intracelulares que dañen la estructura. Una vez descongeladas, se resuspendieron
46
en 5 mL de medio D-MEM (Invitro®) enriquecido con 2 mM de L-Glutamina. 10 %
de suero fetal bocino (SFB), aminoácidos no esenciales (aane) al 1 % y piruvato
de sodio 1 mM; se centrifugaron durante 10 minutos a 214 xg; el sobrenadante
que contenía el crioprotector dimetil sulfóxido (Dmso, Sigma) fue retirado y el
botón de células resuspendido en medio D-MEM enriquecido (Fig. 7).
Figura 7. Fibroblastos de ratón. Línea celular L-929 en cultivo
con medio D-MEM.
La concentración de células viables fue determinada con el método del azul tripán
bajo el siguiente esquema:
A 100 µl de azul tripán (HYCEL ®) al 1 % en PBS, se añadió la misma cantidad de
suspensión celular en un tubo Eppendorf® y se agitó ligeramente; la mezcla se
observó en cámara de Neubauer. Las células vivas se observan refringentes,
porque conservan íntegra su membrana, mientras que las muertas favorecen el
paso del colorante a su interior y se observan de color azul. La concentración de
células vivas se determinó en base a la siguiente fórmula:
N° de células viables/ml= N° de células vivas en 16 cuadros x 2 x 10,000
47
Las células se distribuyeron en botellas para cultivo celular (nunc®) de 75 cm a
una proporción de 2X105 células en 5-6 ml de D-MEM enriquecido, se incubaron
durante 24 horas a 37° C en una estufa con 5 % de dióxido de carbono (CO2). El
medio de las células fue sustituido por medio nuevo para eliminar células muertas
y restos celulares en suspensión.
5.4.2 Infección de la monocapa celular
La técnica que se ha utilizado es una modificación de la descrita por Salinas y et.
al., 1994,83 que consiste en la preparación del inóculo en medio D-MEM
enriquecido con 10% de SFB y 100 µg/mL de dietilaminoetil dextrano (DEAE-D)
que se añade a un cultivo de células L929 con 80% de confluencia; este cultivo se
incubó durante 90 min. a 37° C en atmósfera de CO2 al 5%, posteriormente se
incubaron durante 10 min. en agitación (50 xg) a 37° C; transcurrido el tiempo, el
inóculo fue eliminado, se hicieron tres lavados de 5 minutos cada uno con medio
D-MEM, enseguida se les agregaron nuevamente 15 mL del mismo medio de
cultivo para mantenimiento, las botellas con las células ya infectadas se incubaron
nuevamente durante 3 días bajo las condiciones descritas anteriormente.
A las 48 h. se añadió ciclohexamida que inhibe la multiplicación celular (2
µL/µL de D-MEM enriquecido). El cultivo se mantuvo durante 7 días a 37° C en
una atmósfera de CO2 al 5 % hasta el momento de la purificación. 83, 84, 85
5.4.3 Determinación de la presencia de C. abortus en cultivo
celular infectado
Del mismo modo que los sacos vitelinos de embriones de pollo infectados, la
presencia del microorganismo en los cultivos infectados se determinó mediante
frotis que fueron teñidos con las tinciones de Stamp y Giménez; también se corrió
la prueba de inmunofluorescencia directa (IFD) a partir de frotis de cultivos
infectados, siguiendo instrucciones del fabricante del estuche comercial Imagen®
(Oxoid), (Fig. 8).
48
Figura 8. IFD de células L-929 de fibrosblastos de ratón infectadas con la cepa A22 de C. abortus. (Flecha)
5.5 Purificación de C. abortus para la obtención de un antígeno a
partir de cuerpos elementales (CE)
C. abortus se purificó mediante la técnica modificada por Salinas et. al., (1994)86
originalmente descrita por Caldwell et. al. y col. (1981)86 basada en la
ultracentrifugación diferencial.
Las botellas que contenían las células infectadas se congelaron y descongelaron a
-20° C durante 15 min. por cuatro ocasiones. Con el objetivo de romper las
membranas celulares, la descongelación fue lenta a temperatura ambiente (24°
C). Enseguida se centrifugaron a 170 xg a 20° C durante 10 min. para eliminar los
restos celulares. El sobrenadante se recuperó y se depositó sobre 8 mL de una
solución de amidotrizoato de sodio (Ioditrast®) al 35 %, en un amortiguador de Tris
- 0.15 M – KCl, pH 7.5 y se ultracentrifugó durante 60 min. a 50,000 xg a 4° C. El
sobrenadante se eliminó cuidadosamente para no desprender el sedimento
formado, ya que en éste último se encuentran las clamidias que se resuspendieron
(Figuras 9 y 10) en el amortiguador Tris-KCl y se ultracentrifugaron nuevamente
bajo las mismas condiciones (50,000 x g, 4° C, por una hora). El sedimento
obtenido en esta segunda ultracentrifugación se resuspendió en PBS o bien en
una solución de PBS-sacarosa al 5% y se conservó a -80° C hasta su uso. 4, 87
49
Figura 9. Diferenciación de fases previos a
ultracentrifugación. (Las flechas muestran ambas fases).
Figura 10. Sedimento de clamidias (flecha) formado
después de la segunda ultracentrifugación.
Para determinar la cantidad de antígeno en la muestra purificada se realizó una valoración proteica utilizando la microtécnica de Bradford.
Para crear la curva estándar y poder determinar la cantidad de proteína contenida
en las soluciones a valorar, se prepararon dos soluciones de albúmina sérica
bovina (BSA) a una concentración de 1 µg / µL de PBS y a 10 µg / µL de PBS,
(Cuadro 4); también se prepararon por duplicado 10 µL del extracto crudo de C.
abortus.
Se agregaron 190 µL del reactivo de Bradford tanto a los pocillos que contenían la
BSA como a aquellos con extracto crudo, se dejaron reposar durante 10 minutos
en obscuridad y posteriormente se leyeron en un lector para placas de ELISA
(BioTek®, mod. ELx800) a una longitud de onda de 630 nm.
50
5.5.1 Purificación parcial de C. abortus
Por maceración del saco vitelino y mediante centrifugación por diferenciación se
recuperó la cepa inoculada en los embriones de pollo; para ello se depositaron
200 µL del sobrenadante obtenido a partir de las membranas vitelinas sobre 1 mL
de de solución de Ioditrast ® al 30% en PBS v/v en tubos para ultracentrífuga, se
ultracentrifugó durante 30 minutos a 50,000 xg; el sobrenadante fue eliminado y el
sedimento resuspendido en 50 µL de PBS estéril enriquecido con 5% de sacarosa
la cual se mantuvo a -80° C hasta su uso. 4,84, 86 (Fig. 11).
Cuadro 4. Distribución de BSA y reactivo de Bradford (RBF) en una placa de 96 pozos para la microtécnica de
Bradford.
51
Figura 11. Tubos con Ioditrast® y sobrenadante de sacos vitelinos
La presencia de C. abortus se determinó a partir de un frotis de cada uno de los
sacos vitelinos fijados por calor y teñidos con el método descrito por Stamp et. al.,
(1950) 12, 58; además, se realizó como control de esterilidad la siembra de cada
saco vitelino en agar sangre, incubándolo a 37° C durante 24 horas. 4
5.5.2 Inactivación del antígeno
El antígeno se inactivó mediante la adición de 2-hidrobromuro de bromoetilamina
(BEI) a una concentración del 30% en PBS, dejándolo en agitación constante a
37° C durante 48 horas; posteriormente se detuvo la reacción con tiosulfato de
sodio al 30% en PBS, en proporción de 0.5 mL de BEI por cada 100 mL de
suspensión clamidial inactivada, la concentración final de tiosulfato de sodio fue de
0.15%. 4
5.5.3 Antigenicidad y pureza del extracto crudo obtenido a partir de C.
abortus.
La presencia de las clamidias en el extracto crudo se comprobó mediante la
técnica de Dot blot, para ello, se utilizó una membrana de nitrocelulosa (Millipore,
immobilonTM-P transfer membrane) activada en metanol; fue sensibilizada con el
extracto crudo clamidial, se dejó secar a temperatura ambiente y se bloqueó con
leche descremada al 2%, incubándose después durante dos horas a 37° C en
agitación constante, posteriormente se hicieron tres lavados de cinco minutos
cada uno en agitación con Tris NaCl pH 7.4. La membrana fue puesta en
contacto con el anticuerpo primario, los sueros que se emplearon fueron el control
52
positivo y negativo del estuche comercial de ELISA (Pourquier®); se incubó
durante una hora a 37° C; posteriormente se hicieron nuevamente tres lavados
bajo las condiciones antes descritas; como anticuerpo secundario se utilizó una
anti-IgG ovina conjugada con peroxidasa (Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit
AntiSheep IgG (H+L) code: 313-035-003) a una dilución de 1:2000, se incubó una
hora a 37° C y nuevamente se hicieron los tres lavados con Tris- NaCl. Finalmente
la membrana se reveló con 4-cloro-1-naftol (Sigma) a razón de 30 mg/10 mL de
metanol y aforados a 50 mL de Tris-NaCl; durante 10-15 minutos en total
obscuridad, la reacción se detuvo con agua corriente de la llave hasta que
aparecieron los puntos que indicaban el reconocimiento del antígeno por los
anticuerpos.
5.6 Estandarización de la técnica de inmunoensayo enzimático
indirecto. (ELISA-I)
Se sensibilizaron las microplacas de 96 pocillos con diferentes diluciones del
extracto crudo purificado e inactivado en solución de carbonato bicarbonato pH
9.6: para ello se utilizó el método de estandarización conocido como “Chessboard
titrations” (CBT). 88 (Cuadro 5).
La placa se dejó incubando a 4° C durante toda la noche; posteriormente fue
lavada 4 veces con 300 µL de PBS-Tween 20.
53
La prueba se realizó utilizando para cada dilución del antígeno los sueros control
positivo y negativo contenidos en el estuche comercial y los sueros de campo con
asilamiento positivo y negativo; se hicieron diluciones quíntuples por duplicado
hasta completar una placa (Cuadro 6).
Cuadro 5. Distribución del antígeno (µg/µL) en placa de 90 pozos para su titulación.
54
Como conjugado se utilizó una anti-IgG ovina (Peroxidase-conjugated AffiniPure
Rabbit AntiSheep IgG (H+L) code: 313-035-003) a una dilución de 1:1000;
finalmente y con el objetivo de tener una mejor lectura, se realizó la lectura con el
sustrato Orto-Fenilenediamina (OPD) (Sigmafast OPD cat. No. P9187-50SET),
realizando la lectura con un filtro 450 nm.
Para determinar la sensibilidad y el punto de corte se realizó la prueba de ELISA a
10 sueros de cabras con aislamiento positivo y a 10 sin historia de aborto,
serología y aislamiento negativos.
El punto de corte se determinó sumando una desviación estándar al promedio de
los sueros control negativo y restando una desviación a los controles positivos.
Para determinar la especificidad de la prueba, se realizó un perfil comparativo con
sueros positivos y negativos a enfermedades que afectan a los caprinos:
brucelosis, leptospirosis y pasteurelosis; estos sueros forman parte de un banco
de muestras del CENID-Microbiología Animal, INIFAP del Departamento de
Bacteriología.
Cuadro 6. Distribución de los sueros control en la placa para la prueba de ELISA.
55
Una vez encontrada la dilución óptima tanto de antígeno como de suero a utilizar,
fueron sensibilizadas diez placas para trabajar las muestras de campo
previamente analizadas con el estuche comercial utilizado para el diagnóstico de
C. abortus.
5.7 Adsorción de sueros para descartar posibles reacciones cruzadas
Con la finalidad de eliminar la presencia de anticuerpos inespecíficos y su vez
detectar posibles reacciones cruzadas en los sueros utilizados para la prueba de
ELISA, una muestra de éstos fue adsorbida con cepas bacterianas heterólogas y
con modificaciones, en base a lo descrito por Lancefield. 89, 90
En base a los requerimientos, fueron sembradas en medios de cultivo diferentes
cepas de microorganismos; el Cuadro 7, describe cada una de ellas y el origen de
las mismas.
56
Cuadro 7. Microorganismos utilizados para realizar las adsorciones de los sueros.
Microorganismo Cepa Origen Medio de cultivo
empleado
Salmonella
enterica
Serovariedad
Cholerasuis
FMVZ, Depto.
De
Bacteriología
Agar sangre
Brucella
melitensis
16M
CENID-
Mirobiología
Animal,
INIFAP
Agar Tripticasa Soya
Mannheimia
haemolytica
Serotipo A2
CENID-
Mirobiología
Animal,
INIFAP
Agar sangre
Leptospira Serovariedad
Hardjo
UAM-
Xochimilco
Medio EMJH
suplementado(DIFCOTM)
Cada una de las bacterias se dejó el tiempo necesario para su crecimiento,
Salmonella entérica cholerasuis y Mannheimia haemolytica, 24 horas a 37° C,
Brucella 5 días a 37° C con atmósfera de CO2 al 5% y Leptospira 3 días a
37° C.
Una vez crecidas, fueron cosechadas en solución salina fisiológica (SSF) e
inactivadas durante una hora a 56° C; posteriormente se mezclaron dos partes de
suero sin diluir con una solución de bacterias suspendidas en 1mL de PBS 1 x y
57
se incubaron a 37° C durante media hora en agitación constante. Transcurrido el
tiempo, los sueros fueron centrifugados a 3000 x g durante 10 minutos, 17 la
pastilla que contenía las bacterias fue eliminada y el suero sobrenadante se diluyó
a la concentración óptima para correr nuevamente el ELISA; los resultados
obtenidos, fueron comparados con los que se obtuvieron para titular la prueba.
5.8 Análisis estadístico
Para determinar la validez de la prueba, fue utilizado el cálculo de índice de
concordancia de Kappa, esto, mediante el grado de acuerdo encontrado entre los
resultados obtenidos con la prueba de ELISA evaluada y los resultados obtenidos
con la comercial.72
Para determinar si existía o no diferencia significativa entre las muestras al ser
adsorbidas con diferentes cepas bacterianas de cuando no lo eran, se hizo la
prueba ANOVA (por sus iniciales en inglés) o de varianza, con un nivel de
significancia α del 5 % (p<0.05).
58
6 RESULTADOS
6.1 Multiplicación de Chlamydia abortus en saco vitelino de embrión de
pollo y en cultivos celulares
Con la infección del saco vitelino de embriones de pollo, se logró la reactivación de
la cepa A22 de C. abortus, que fue almacenada a -80° C en una solución de
sacarosa al 5% hasta su uso; el paquete de bacterias que se obtuvo, se utilizó
posteriormente para infectar la línea celular L929 de fibroblastos de ratón; esto con
el objetivo de producir un extracto crudo que fue utilizado como antígeno en el
ELISA-I.
6.2 Determinación de la presencia de C. abortus en saco vitelino de
embrión de pollo y cultivos celulares.
Se determinó la presencia de la bacteria tanto en los sacos vitelinos como en los
cultivos infectados mediante frotis; en la Figura 12 se muestra un extendido de
células infectadas y teñidas con la técnica de Stamp12; también se utilizó la prueba
de IFD para comprobar la presencia de antígeno clamidial en ambos casos; en la
Figura 13 se muestra un cultivo positivo a esta prueba.
La elección de sacos vitelinos infectados se realizó en base a los cambios
vasculares presentes y mediante la valoración de los frotis según la cantidad de
bacterias observadas, seleccionando aquellos que obtuvieran un puntaje entre 4 y
5, estas muestras fueron purificadas y utilizadas como cepa viable para infección
de cultivos celulares.
Se obtuvo la cosecha de un total de 10 botellas infectadas con la cepa A22 de
C. abortus; su presencia en los cultivos celulares fue determinada mediante frotis y
la prueba de IFD, resultando positiva la infección. Los cultivos se procesaron para
purificar e inactivar el microorganismo, obteniendo a partir de éste, el extracto
crudo que fue titulado y utilizado como antígeno para el ELISA-I.
59
Figura 12. Frotis de células L-929 infectadas con C.
abortus y teñidas con la técnica de Stamp.
Figura 13. Frotis de células L929 infectadas. Técnica de
IFD.
6.3 Antigenicidad y pureza del extracto crudo obtenido a partir de C.
abortus.
El resultado a la prueba de Dot Blot se muestra en la Figura 14, donde se
observan dos membranas que fueron impregnadas con el extracto crudo
purificado y con sueros control positivo y negativo a clamidiosis, ambos, del
estuche comercial.
Con respecto a la pureza del extracto crudo, resultó negativo al crecimiento de
contaminantes.
Figura 14. Membranas de nitrocelulosa negativa (a) y positiva (b) a la prueba de Dot Blot; la membrana señalada con la
letra “a”, se trató con suero control negativo mientras que la señalada con la letra “b”, con suero control positivo; las
flechas muestran el reconocimiento de los anticuerpos hacia el antígeno.
a
b
60
6.4 Estandarización de la prueba de ELISA-I
6.4.1 Determinación de la concentración del antígeno por la
microtécnica de Bradford.
El extracto crudo obtenido, con la técnica de Bradford, presentó una concentración
proteica de 0.5 µg/µL.
6.4.2 Titulación del antígeno
Se hicieron diferentes diluciones del antígeno y los resultados de las lecturas
obtenidas se muestran en la Figura 15. Se obtuvo una buena respuesta a todas
las concentraciones, con el suero diluídos a 1:20, sin embargo, como el
rendimiento final del antígeno obtenido fue de 3.0 mL, se optó por trabajar con la
concentración de 0.2 µg/μL, esto con el objetivo de hacer rendir el extracto crudo
obtenido.
61
Figura 15. Densidad óptica (D.O.) de las diferentes diluciones del antígeno, enfrentadas a tres concentraciones diferentes de
sueros control positivo y negativo; se puede observar buen comportamiento para las diferentes diluciones, sin embargo, la
dilución seleccionada fue de 0.2 µg/µL.
6.4.3 Titulación del suero
Se hicieron 4 diluciones quíntuples a partir de 1:50 hasta 1:6250, tanto de los
sueros control positivo y negativo del estuche comercial como de 9 sueros de
campo, también positivos y negativos al estuche, los resultados obtenidos se
muestran en el Figura 16, la concentración que se consideró como óptima fue la
de 1:50, esto debido a que las demás diluciones no muestran diferencias entre los
sueros control positivo y aquellos que fueron negativos al estuche comercial. La
concentración del antígeno utilizada fue la que se consideró como óptima (0.2
µg/µL) en la prueba anterior.
62
Figura 16. Lectura de las diluciones de los sueros; la dilución utilizada fue de 1:50, debido a que en las siguientes no se
observa diferencia entre los sueros control positivo y negativo.
Para determinar el punto de corte se utilizaron como sueros control positivo, 10
sueros que resultaron positivos al estuche comercial y que además provenían de
animales con aislamiento y PCR positivos a Chlamydia abortus 17; para ello se
restó al promedio de los sueros control positivo una desviación estándar, de este
modo, aquellas muestras cuya lectura de D.O estuviera por encima de 0.741,
fueron consideradas como positivas y el punto de corte para los negativos, se
determinó sumando una desviación estándar al promedio de los sueros control
negativo, así, aquellas muestras que tenían lecturas en D.O. inferiores a 0.695
fueron consideradas como negativas; cabe señalar que aquellas muestras que
quedaban entre 0.695 y 0.741 D.O. fueron consideradas como sospechosas. El
Cuadro 8, muestra un resumen de los resultados obtenidos para calcular el punto
de corte.
63
Cuadro 8. Resultados obtenidos para el cálculo del punto de corte
tanto para sueros positivos como para negativos.
Resultado del
estuche
comercial
Total de
muestras
Promedio
D.O.
Desviación
estándar
Resultado
más/menos una
desviación estándar
(nm)
Positivo 10 0.9052 0.1642 0.741
Negativo 10 0.5046 0.1909 0.695
Para el cálculo de la sensibilidad, se realizó una prueba de concordancia entre el
estuche comercial y el ELISA-I desarrollado y se incluyeron los resultados
obtenidos con las 20 muestras control (10 positivas y 10 negativas).
La sensibilidad de la prueba fue de 75%, mientras que la especificidad calculada
considerando las mismas muestras fue de 66.6%.
El índice de concordancia entre el estuche comercial y el ELISA diseñado, fue de
0.4, valor que se interpreta como moderado.
De un total de 20 muestras, 7 fueron verdaderas positivas, 3 falsas positivas,
mientras que 2 fueron falsas negativas y 8 verdaderas negativas. La prueba tiene
una validez calculada del 70%. En la Cuadro 9 se muestran los resultados
obtenidos de acuerdo a la tabla de concordancia.
64
Cuadro 9. Resultados obtenidos en base al diseño de Cohen y a partir de los cuales
se calcularon la sensibilidad, especificidad y validez de la prueba diseñada.
ESTUCHE COMERCIAL TOT
ELISA-I DESARROLLADA
POS NEG
POS 7 3 10
NEG 2 8 10
TOT 9 11 20
6.4.4 Resultados obtenidos a partir de las muestras de diferentes
rebaños (estudio de campo).
A partir del punto de corte obtenido con las muestras consideradas como control
positivo y negativo, se determinaron los resultados para los sueros obtenidos de
animales de diferentes rebaños de cuatro estados de la república (Guanajuato,
Guerrero, San Luis Potosí y Tlaxcala); estas muestras ya habían sido evaluadas
con el estuche comercial; también se les hizo la prueba de tarjeta al 3% para
diagnóstico de brucelosis, resultando negativas las pertenecientes a los estados
de Guanajuato, Guerrero y San Luis Potosí, mientras que en las de Tlaxcala, se
encontró un 84% de seropositividad (Tarjeta al 3%), de los cuales solo el 1.85%
resultó positivo a la prueba de inmunodifusión radial, prueba que permite detectar
animales infectados a Brucella.
El Cuadro 10, muestra un comparativo entre los resultados obtenidos con el
ELISA-I desarrollado y el estuche comercial. Las lecturas están expresadas en
D.O. y la proporción de positivos, negativos y sospechosos en porcentaje.
Las muestras provenían de diferentes estados de la república y se trabajaron
previamente con el estuche comercial; de 129 muestras originarias del estado de
Guanajuato, 55 resultaron positivas al ELISA-I desarrollado, 66 muestras
65
negativas y 11 sospechosas; en comparación con el estuche comercial, hubo una
diferencia de 28 sueros positivos, es decir, el 21.7% de los sueros de Tlaxcala,
67.5% de las muestras resultó positiva a la prueba desarrollada y solamente el
11.9% al estuche comercial; para el caso de los estados de San Luis Potosí y
Guerrero, únicamente se contaba con muestras positivas y negativas a la prueba
comercial respectivamente, por lo que se compararon únicamente los positivos
para SLP resultando en un 61% de las 34 muestras trabajadas, mientras que para
Guerrero, sólo el 6.6% de las 30 muestras, resultaron negativas al ELISA-I
estandarizado; del total de las sueros trabajados (344), el 31.10% resultaron
positivos al estuche comercial y el 50.87% a la prueba desarrollada; 70.63%
fueron negativas a la prueba comercial y 34.30% a la desarrollada.
66
*Muestras obtenidas de un banco de sueros y procesadas en trabajos previos.
** Todos los sueros eran negativos al estuche comercial.
*** Todos los sueros eran positivos al estuche comercial.
Cuadro 10. Resultados obtenidos con el ELISA-I desarrollado y el estuche comercial
Procedencia de las
muestras (Estado)
No. de muestras
Promedio positivos a
ELISA-I desarrollado
(D.O.)
Promedio sospechosos
a ELISA-I desarrollado
(D.O.)
Promedio Negativos a ELISA-I
desarrollado (D.O.)
% Positivos ELISA-I
% Positivos estuche
comercial
% Sospechosos
ELISA-I
% Sospechosos
estuche comercial
% Negativos
ELISA-I
% Negativos estuche
comercial
Guanajuato 129 0.895 0.730 0.523 42.6 20.9 6.2 8.5 51.1 70.5
Guerrero* 30 0.954 0.711 0.441 83.3 0** 10 0 6.6 100
SLP* 34 0.843 0.712 .595 61.7 100 8.8 0 29.4 0**
Tlaxcala 151 0.903 0.688 0.502 67.5 11.9 5.9 7.2 26.4 80.7
67
6.4.5 Adsorción de muestras control
No se observó una diferencia significativa entre los sueros que se trabajaron antes
de la adsorción como aquellos que fueron adsorbidos con diferentes bacterias
Gram negativas.
La barra naranja muestra un comparativo de la D.O. obtenida en los sueros
cuando se trabajaron junto con el resto de las muestras procesadas, mientras que
la barra azul, muestra el resultado obtenido de las mismas muestras sin adsorber
y trabajadas a la par con los sueros que fueron adsorbidos; no hubo diferencia
significativa entre ambos; por lo que se descarta la posible reacción cruzada con
otros microorganismos, (Fig. 17).
Figura 17. Comparativo entre muestras adrsorbidas y sin adsorber; estos sueros eran de animales con
aislamiento y PCR positivos a C. abortus, así como también a la serología tanto del estuche comercial como de
la prueba desarrollada.
68
Figura 18. Comparativo entre muestras adrsorbidas y sin adsorber; los animales de estos sueros eran negativos
al aislamiento y PCR, así como también a la serología tanto del estuche comercial como de la prueba
desarrollada.
La Figura 18, muestra el promedio en D.O. de las lecturas realizadas para los
sueros control negativo que fueron adsorbidos y su comparativo con las mismas
muestras antes de ser adsorbidas; el resultado del análisis de ANOVA, demostró
que no existe variación siginifcativa en el promedio de las medias de las muestras
al ser adsorbidas que cuando no lo eran, por lo que se descarta posible reacción
cruzada con otras bacterias Gram negativas.
69
7 DISCUSIÓN
El antígeno que se utilizó en este trabajo fue un extracto crudo de la bacteria
obtenida de cuerpos elementales de la cepa A22 de C. abortus, propagada en
embriones de pollo y cultivos celulares; estos métodos son similares a los
utilizados por Buendía (2001), Rekiki (2003) y Ortega (2005), que se valieron de
estos medios para crecer a la bacteria utilizándola como antígeno en sus pruebas
o bien para el desarrollo de sus diseños vacunales. 8, 72, 91 Para ser aislada y/o
propagada la bacteria, se requiere de técnicas de cultivo en medios biológicos
como los embriones de pollo o bien líneas celulares; 92
Para determinar la presencia de la bacteria a partir de saco vitelino y cultivos
infectados, se utilizaron las tinciones de Stamp y Giménez estas técnicas fueron
empleadas por Szeredi et al. (2003); Rodolakis, (2001); Buendía (2001); Marques
et al. (2010) y están descritas en el Manual de pruebas de diagnóstico de la OIE
(2004), en éste último, se describen las características para la identificación
adecuada del microorganismo. 2, 3, 28, 72, 93, 94
La presencia del antígeno clamidial, fue determinada por IFD y dot blot; lo que
coincide con lo señalado en el Manual de Pruebas de Diagnóstico Estandarizadas
y Vacunas de la OIE (2004), que recomienda el uso de pruebas con anticuerpos
fluorescentes.2 Por otro lado, la técnica de Dot blot se ha evaluado en diferentes
trabajos como alternativa diagnóstica y como prueba complementaria en
investigación, principalmente para determinar la presencia del LPS clamidial, en
particular de C. trachomatis; en la mayoría de estos trabajos ha resultado ser una
prueba altamente sensible para detectar el antígeno clamidial en muestras
clínicas.95, 96, 97
Para poder utilizar de forma segura el antígeno elaborado, fue necesario
inactivarlo con 2-Bromoethylamine-hydrobromide (BEI), que actúa sobre ácidos
nucleicos, sin afectar las proteínas antigénicas; Ortega en (2005), evaluó tres
70
protocolos de inactivación de antígeno clamidial, obteniendo mejores resultados
con el uso de este reactivo ya que favorecía la conservación de gran número de
epítopos protectores así, lo cual fue demostrado en ratones que presentaron
menos carga bacteriana en bazo al ser inmunizados y posteriormente infectados
con C. abortus.4
En este trabajo se utilizó la cepa A22 para obtener el extracto crudo que
posteriormente fue empleado como antígeno, esta cepa es considerada como
altamente invasiva y originalmente aislada a partir de un aborto ovino;98 Layanchi
et al., determinaron en su estudio que los antígenos específicos encontrados en
cepas invasoras, podrían ser utilizados para el diagnóstico de la clamidiosis
abortiva, esto al confirmar la ausencia de antígenos específicos como familia de
proteínas de 80-90 kDa, en cepas no invasoras y su presencia en las invasoras.98
La cantidad de masa antigénica obtenida fue baja y se debe básicamente a las
características de desarrollo de bacterias del género Chlamydia, que requieren
forzosamente de medios biológicos para multiplicarse. El factor que normalmente
influye en la producción baja de masa antigénica, es el procedimiento de
purificación de la bacteria descrito por varios autores como Salinas et al. (2009),
ya que al emplear métodos como la ultracentrifugación diferencial, se puede
perder una cantidad considerable de antígeno cuando no se alcanzan las
velocidades indicadas en estos protocolos ya estandarizados, en este caso, sí se
disponía de una ultracentrífuga que llegaba a la velocidad requerida, pero, no se
contaba con el producto comercial “Urografin®” utilizado por Nieves (2005) donde
los rendimientos en masa antigénica fueron altos. El principio activo del
“Urografin®” es el amidotrizoato sódico y meglumínico, solución que, debido a su
densidad, favorece la formación de dos fases; el Ioditrast®, que es el reactivo con
el que se contaba, pese a que el principio activo era el mismo, variaba en sus
concentraciones, situación que pudo influir al hacer la purificación o concentración
del extracto crudo.
71
Otro factor que pudo estar involucrado en la producción y concentración de masa
antigénica fue el proceso de liberación de las bacterias de las células; diversos
autores mencionan la sonicación de los cultivos para lograr la ruptura celular y de
este modo liberar las bacterias contenidas al interior de las células, sin embargo,
dada las características de la enfermedad en el país y el potencial riesgo
zoonótico, no se pudo realizar este procedimiento y se suplió por la congelación y
descongelación de los cultivos infectados donde muchas células, pudieron
perderse sin haber sido rotas al momento de la primer centrifugación.
El objetivo principal, fue el desarrollo de un ELISA-I y comparar sus resultados,
con los obtenidos a partir de un estuche comercial, mismo que se usó como
prueba de referencia; del mismo modo, Buendía et al. (2002), evaluaron una
prueba de ELISA disponible comercialmente; ellos usaron como prueba de
referencia la técnica de microinmunofluorescencia (MIF) y compararon los
resultados obtenidos con el estuche comercial, las pruebas de FC y un ELISA
estandarizada por ellos. Para el caso de la MIF, usaron un antígeno obtenido a
partir de las cepas AB7 de C. abortus y la iB1 de C. pecorum; para la prueba de
FC el antígeno usado fue un LPS obtenido a partir de suspensiones no purificadas
de clamidias; mientras que para la prueba de ELISA se utilizó un antígeno a base
de CE purificados por la técnica de centrifugación diferencial con amidotrizoato
sódico y meglumínico; 72 en este estudio, se utilizó dicha técnica para la
elaboración del antígeno.
En otros trabajos donde se hicieron comparaciones de pruebas diagnósticas
donde se utilizaron también CE como antígeno en las técnicas de ELISA
(competitivas o indirectas) que fueron estandarizadas en los diferentes
laboratorios, tal es el caso de Salinas et al. (2009), Buendía et al. (2001),
Longbottom et al. (2001), Wilson et al. (2009), entre otros; lo que coincide con el
tipo de antígeno (CE purificados) que se utilizó en la prueba de ELISA-I que se
diseñó en este trabajo.
72
Para el desarrollo del ELISA-I, se siguió la metodología descrita por Salinas y
Wilson et al.; 78 la concentración que se utilizó para el antígeno utilizado fue de 2
μg/mL; esta concentración ya había sido utilizada por Salinas et al. (2009) en
trabajos previos 99; en otros estudios donde también se diseñaron pruebas de
ELISA, utilizaron concentraciones diferentes, tal es el caso de Buendía et al., cuya
concentración de antígeno fue de 8 μg/mL72; Ortega (2005) en su trabajo empleó
una concentración de 5 μg/mL4 y Longbottom que estandarizó un ELISA de tipo
competitivo, sensibilizando sus placas de poliestireno con 0.1 μg/μL; sin embargo
y dado que la producción de antígeno es un proceso relativamente complejo, se
optó por trabajar con la dilución de 0.2 μg/μL, 99, 100 no obstante, se obtuvieron
buenas lecturas de D.O. con concentraciones más elevadas. Donn et al. (1997),
en su proceso de estandarización, aumentaron la dilución de los sueros positivos,
ya que las densidades ópticas obtenidas en los sueros de los rebaños negativos,
eran aproximadamente 4 veces superiores a las obtenidas en los sueros negativos
estándar;94 dado que los resultados obtenidos de los sueros en un primer ensayo
en este trabajo, no diferían mucho entre el control positivo y el negativo, también
se aumentó la dilución de éstos para obtener mejores lecturas y facilitar de este
modo el establecimiento del punto de corte.
Para determinar el punto de corte, se utilizaron como controles positivo y negativo
los sueros contenidos en el estuche comercial y 20 muestras de campo que
resultaron tanto positivas como negativas a la prueba comercial; lo que concuerda
con el trabajo de Wilson et al., quienes emplearon como controles positivos y
negativos los sueros contenidos en los estuches comerciales que estudiaron, así
como también muestras de animales cuyo origen era de rebaños con historia de
aborto y/o sin problemas de tipo reproductivo (positivos y negativos
respectivamente); 72, 78 el cálculo del punto de corte se estableció restando y
sumando una desviación estándar al promedio de las densidades ópticas
obtenidas con los sueros control positivo y negativo respectivamente; la razón, es
73
que esto permitía el establecimiento de un rango intermedio para obtener así
resultados considerados como sospechosos y de este modo, aumentar la
sensibilidad y especificidad de la prueba. En otros trabajos, se ha establecido el
punto de corte sumando hasta tres desviaciones estándar al promedio de las
densidades ópticas obtenidas de los sueros control positivo y negativo.72, 100
La sensibilidad obtenida en este estudio fue del 75%; Salinas et. al (2009),
obtuvieron una sensibilidad del 93.7% en su prueba, donde utilizan CE purificados
como antígeno, mientras que Buendía et al. obtuvieron una sensibilidad del 95%
en la misma técnica. Con lo que respecta a la especificidad de la prueba, en el
caso de Salinas, fue del 100%; para Buendía del 54.2%, similar a lo ocurrido en
este trabajo, donde disminuyó considerablemente (66.6%) con respecto a la
obtenida por Salinas, 72, 99 esto puede deberse a la naturaleza del antígeno
utilizado, como es a base de CE, cuenta con gran cantidad de LPS que, es común
a todas las especies de clamidias, pudiendo ser fuente de reacciones cruzadas
entre éstas; además, el uso de antígenos homólogos y heterólogos influye en los
resultados de estas pruebas, no obstante y muy a pesar de esta característica
indeseable del LPS, éste, ha sido el antígeno más utilizado en la mayoría de las
pruebas para la detección de anticuerpos contra C. abortus.
La prueba que se utilizó como referencia y con la que se compararon los
resultados obtenidos del ELISA-I desarrollado fue un ELISA-I comercial que se
basa en un antígeno recombinante, proteína que pertenece a la familia de
proteínas de 80-90 kDa, es altamente inmunógena y contiene determinantes
antigénicos con especificidad de C. abortus,16, 4, 72 lo que permite distinguir
animales infectados con C. abortus de aquellos que puedan estar infectados por
C. pecorum, además de descartar también toda posibilidad de detectar animales
infectados con otro tipo de bacterias; por lo que la sensibilidad y especificidad de
estas pruebas resulta ser muy alta, en comparación con la obtenida en este
estudio.
74
Buendía et al. compararon este mismo estuche con tres pruebas más:
microinmunofluorescencia (MIF) como referencia, ya que es capaz de diferenciar
entre C. abortus de C. pecorum; FC, cuyo antígeno es a base de LPS y es la
recomendada por la OIE y la prueba de ELISA-I cuyo antígeno es a base de CE
purificados, obteniendo una concordancia del 78.2% entre la prueba de ELISAr-
Chlamydia con ELISA-EB (cuerpos elementales por su nombre en inglés),
mientras que el valor obtenido en la prueba diseñada en este trabajo fue de 0.4,
valor considerado moderado de acuerdo al índice de Kappa, lo que coincide con el
estudio realizado por Trávniček et al. en 2002, quienes del mismo modo,
compararon un ELISA-I con la prueba de FC, obteniendo un índice de Kappa de
0.426;72, 99, 101 la ventaja de estas pruebas, es precisamente la naturaleza de sus
antígenos, ya que al ser proteínas específicas y recombinantes, facilitan su
producción en gran escala, situación que se complica con aquellos antígenos
producidos a partir de medios de cultivos rutinarios y que son a base de CE.
El uso de un extracto crudo de C. abortus, resulta ser de utilidad para determinar
la presencia de anticuerpos anticlamidiales; sin embargo, es recomendable hacer
estudios en conjunto del estatus reproductivo de los rebaños y la asociación que
pueda darse a la presencia de abortos dentro de las unidades de producción, ya
que la presencia de otras especies del mismo género, como C. pecorum, pueden
interferir con el diagnóstico.
La especificidad de la prueba del ELISA desarrollado en el presente trabajo
considerando la reactividad cruzada a diferentes microorganismos fue buena
debido a que en las adsorciones realizadas de sueros positivos y negativos a
Chlamydia con bacterias Gram negativas, no se observó diferencia significativa
entre los resultados obtenidos con los sueros que fueron adsorbidos con aquellos
que no lo fueron. En el manual de Pruebas de Diagnóstico Estandarizadas y
Vacunas de la OIE, se enlistan una serie de microorganismos que pudieran
interferir en el diagnóstico de la clamidiosis, tal es el caso de Toxoplama gondii
75
(por el tipo de lesiones en cotiledones), brucelosis, coxielosis, campilobacteriosis,
listeriosis y salmonelosis2; la presencia de diferentes reacciones cruzadas y sitios
antigénicos específicos dentro de los epítopes de Chlamydia han sido
demostrados mediante las pruebas de hemólisis pasiva, inhibición de la hemólisis
pasiva y experimentos de adsorción con un antisuero producido contra el LPS de
los CE de C. trachomatis L2. Estos estudios demostraron que la reacción cruzada
de anticuerpos podría ser absorbida con el LPS de la cepa de Salmonella entérica
serovar Minnesota Re595, mientras que la especificidad de Chlamydia se
mantenía sin afección alguna19;
Teniendo en cuenta que la enfermedad es considerada como exótica y que en
México no existen pruebas para su diagnóstico rutinario, la técnica aquí diseñada,
puede ser una alternativa que coadyuve a determinar el estatus de la enfermedad;
también resulta importante, ya que al contar con una prueba sencilla de realizar,
además de que podría montarse en los laboratorios de diagnóstico, también se
podría contribuir de manera eficaz a un diagnóstico oportuno de las infecciones
por Chlamydia, lo que ayudará a prevenir y limitar la propagación de la
enfermedad99 mediante la detección de los rebaños infectados.
76
8 CONCLUSIONES
La cepa A22 de Chlamydia abortus fue reactivada de forma satisfactoria en
embriones de pollo y posteriormente, para la producción de un extracto
crudo, fue propagada en cultivos celulares.
La técnica empleada para purificar los cuerpos elementales, resultó
eficiente para el desarrollo de este trabajo, por lo que se recomienda para la
purificación de cultivos y embriones de pollo infectados con este
microorganismo.
La presencia de la bacteria en cultivos y embriones de pollo infectados, fue
demostrada mediante las tinciones de Stamp y Gimenez, así como por
pruebas inmunológicas como Dot blot e inmunofluorescencia directa.
Se logró desarrollar una prueba de ELISA-I a partir de un extracto crudo
producido en la línea celular L929 de fibroblastos de ratón, mismo que fue
utilizado como antígeno; esta prueba tuvo un índice de concordancia de
0.4, valor considerado como moderado.
La sensibilidad calculada para esta prueba fue del 75% y la especificidad
del 66.6%, por lo que la prueba puede ser utilizada como herramienta
“tamiz” para determinar la presencia de anticuerpos en los rebaños con
problemas reproductivos así como el comportamiento de la enfermedad.
Mediante una prueba de adsorción con un grupo de sueros, se descartaron
posibles reacciones cruzadas con otros microorganismos como Brucella
melitensis, Leptospira hardjo, Mannheimia haemolytica y Salmonella
cholerae suis.
77
9 APÉNDICE
9.1 Medio de cultivo para células L929.
Se utilizó medio D-MEM suplentado con:
Suero fetal bovino 10 %
L-Glutamina 2 mM
Piruvato de Sodio 1 mM
La mezcla se hizo en condiciones estrictas de esterilidad.
9.2 Solución de Tripán azul
NaCl 0.81 g
KH2PO4 0.66 g
Azul tripán 0.4 g
Agua destilada 100 mL
Los reactivos se calientan hasta que empiecen a hervir, se deja enfriar, se justa
el pH a 7.2 y se filtra con 0.45 μm
9.3 Amortiguador PBS-Dextrano (PBS-DEAE-D)
Solución concentrada a 100 x:
PBS 100 mL
DEAE-dextrano 1 g
Ajustar pH a 7.2 y esterilizar por filtración (0.22 μm).
9.4 Solución de Carbonato-bicarbonato
Na2CO3 1.59 g
NaCO3H 3.93 g
NaN3 200 mg
Agua destilada 1 L
El pH se ajusta a 9.6 y se esteriliza a 120° C, 15 min. 15 lb.
78
9.5 Solución de bloqueo
Leche descremada 50 g
Diluir en 1 litro de agua PBS 1 x estéril.
9.6 Solución de lavado PBS Tween-20 (0.05 %)
PBS 1x 1 L
Tween 20 (Sigma) 0.5 mL
9.7 Solución de Tris-KCL
Tris (Trisma base, sigma) 20 mM 2.42 g
KCl(Sigma) 0.15 M 11.18 g
Aua destilada 1 L
Ajustar pH a 7.5 con HCl 1 N.
9.8 Cicloheximida
Cicloheximida 2 μg
Aua destilada estéril 2 mL
En promedio se utilizan 30 μg/ 15 mL de medio con células infectadas, es decir,
150 μL para 15 mL de medio, cantidad suficiente para 2-3 botellas de 75 cm,
disponiendo en cada una 5 mL de solución.
9.9 Ioditrast®
Tris KCl
Solución de Ioditrast
9.10 2 Bromoethylamine-hdrobromide (BEI) 30 %
79
BEI 0.3 g
Agua destilada estéril 1 mL
Se agregan 30 μL de BEI por cada 2 mL de Ag.
9.11 Solución de Tris NaCl
Tris base 1.2 g
NaCl 8.7 g
Aua destilada estéril cbp 1000 mL
9.12 4-cloro-1 naftol
4-cloro-1 naftol 0.03 g
Metanol 10 mL
Tris NaCl cbp 50 mL
Agregar 25 μL de H2O2 al momento de utilizarse.
9.13 Solución madre para tinción de Stamp
Fucsina básica 10 g
Etanol 96 ° 100 mL
9.14 Solución de trabajo (solución hija) para tinción de Stamp
Solución madre 10 mL
Ácido fénico 5 g
Agua destilada 90 mL
9.15 Solución ácido acético al 0.05 %
Ácido acético 0.005 mL
Agua destilada estéril cbp 100 mL
80
9.16 Verde de malaquita al 3 %
Verde de malaquita 3 g
Agua destilada estéril cbp 100 mL
Diluir bien el colorante y filtrar.
9.17 Amortiguador de fosfatos (PBS 2 x)
NaCl 16 g
K2HPO4 2.2 g
KH2PO4 0.68 g
H2O cbp 1000 mL
9.18 Tiosulfato de sodio al 30 %
Tiosulfato de sodio 0.3 g
PBS 1 x 1 mL
81
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