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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

VERÔNICA CORDEIRO SILVA

INFLUÊNCIA DE FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL EM MENTHA X

PIPERITA L. VAR. CITRATA (EHRH.) BRIQ.

ILHÉUS – BAHIA 2012

ii

VERÔNICA CORDEIRO SILVA

INFLUÊNCIA DE FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL EM MENTHA X

PIPERITA L. VAR. CITRATA (EHRH.) BRIQ.

Dissertação apresentada para obtenção do titulo de Mestre em Produção Vegetal pela Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Gross. Co-orientadora: Profa Dra Larissa Correa do Bomfim Costa.

Ilhéus – Bahia 2012

iv

À minha mãe, o maior e melhor exemplo que tenho na vida. Dedico.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me fazer resistente diante das intempéries.

A minha mãe pelas lições de sabedoria e persistência.

Aos meus irmãos pelo encorajamento, até mesmo no silêncio.

Ao meu orientador Eduardo Gross pela paciência e valiosos ensinamentos de

humildade e profissionalismo.

A minha Co-orientadora Larissa Correa do Bomfim Costa pela confiança e

seriedade.

Aos meus colegas e amigos do Laboratório de Química e Fertilidade do Solo:

Mary, Lidi, Leo, Carol, Caique, Nairane e Gedeon pelos momentos de

descontração e em especial à minha grande parceira e conselheira Paty.

As minhas amigas de cunho acadêmico e pessoal Analine e Lívia pelos

desabafos.

Aos demais amigos e familiares.

Aos professores Rosilene e Raildo pelos valiosos auxílios.

Aos amigos do campo Roberto, Adelino e Marcelo pela simplicidade.

A Universidade Estadual de Santa Cruz e a CAPES pelo auxílio financeiro e

material.

Agradeço.

vi

“Plantas não tem raízes, elas tem micorrizas”

J. L. Harley

vii

LISTA DE FIGURAS

Revisão de literatura

Figura 1. Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. 4

1. Capítulo I

Figura 1. Imagens de raízes coradas pelo método de Phillips e

Haymann mostrando a morfologia das micorrizas encontradas

em Mentha x piperita var. citrata.

47

viii

LISTA DE TABELAS

1. Capítulo I

Tabela 1. Características químicas iniciais (antes do experimento) do

Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação

Experimental da Almada, localizada no município de

Uruçuca, BA

27

Tabela 2. Características físicas iniciais (antes do experimento) do


Experimental do Almada, localizada no município de

Uruçuca, BA

27

Tabela 3. Descrição dos contrastes ortogonais para a avaliação da

influencia de FMAs em Mentha x piperita var. citrata

submetida a duas doses de fósforo

31

Tabela 4. Resumo da análise de variância para as varáveis biomassa

de raiz, caule, folha e total de Mentha x piperita. var. citrata

inoculada com fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e

submetida a doses de fósforo

32

Tabela 5. Valores médios em g referente à biomassa seca da raiz,

caule, folha e total de Mentha x piperita var. citrata

inoculada com FMA submetida a duas doses de fósforo

32

Tabela 6. Estimativas dos contrastes ortogonais das varáveis

biomassa de raiz, caule, folha e total para Mentha x piperita

var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares

e submetida a duas doses de fósforo

33

ix

Tabela 7. Resumo da análise de variância para o teor dos macro e

micronutrientes das folhas de Mentha x piperita var. citrata

inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e


37

Tabela 8. Valores médios do teor de macro (em g kg-1) e de

micronutrientes (em mg kg-1) das folhas de Mentha x

piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos

arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

37

Tabela 9. Estimativas dos contrastes ortogonais para o teor de macro

e micronutrientes nas folhas de Mentha x piperita var.

citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e


40

Tabela 10. Características químicas finais (depois do experimento) do

Argissolo Amarelo Distrófico típico solo coletado na

Estação Experimental da Almada, localizada no município

de Uruçuca, BA

42

Tabela 11. Resumo da Análise de Variância para o número de esporos

e porcentagem de colonização micorrízica em Mentha x

piperita var. citrata submetida a duas doses de fósforo

43

Tabela 12. Número de esporos no solo e porcentagem de colonização

micorrízica total e por estruturas fúngicas em Mentha x

piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos


44

x

Tabela 13. Estimativas dos contrastes ortogonais para o número de

esporos e para a porcentagem de colonização micorrízica

Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos

micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de

fósforo

45

2. Capítulo II

Tabela 1. Características químicas iniciais (antes do experimento) do


Experimental da Almada, localizada no município de

Uruçuca, BA

57

Tabela 2. Características físicas iniciais (antes do experimento) do


Experimental do Almada, localizada no município de

Uruçuca, BA

57

Tabela 3. Descrição dos contrastes ortogonais para a avaliação da

influencia de FMAs em Mentha x piperita var. citrata


59

Tabela 4. Resumo da Análise de Variância para as variáveis

biomassa, teor e rendimento de óleo de Mentha x piperita

var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e


60

xi

Tabela 5. Valores médios da massa seca das folhas (em g), do teor

(%) e do rendimento (kg planta-1) do óleo essencial extraído

das folhas de Mentha x piperita var. citrata por

hidrodestilação

60

Tabela 6. Estimativas dos contrastes ortogonais para teor e

rendimento do óleo essencial de Mentha x piperita var.

citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e


62

Tabela 7. Índice de Kovats (IK) e concentração relativa em

porcentagem dos constituintes químicos do óleo essencial

da biomassa seca de folhas de Mentha x piperita var. citrata

inoculada com FMA submetida a duas doses de fósforo

65

xii

RESUMO

Os fungos micorrízicos arbusculares em solos de baixa fertilidade natural, geralmente, promovem aumento no crescimento beneficiando a produção de massa seca nas plantas hospedeiras, sendo que em plantas produtoras de óleo essencial podem ainda alterar o rendimento e a composição deste. A depender do tipo de fungo micorrízico e da espécie vegetal em questão os efeitos podem ser diferenciados e, portanto, de tal maneira o micobionte e o fotobionte deve ser testado. O estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos fungos micorrízicos arbusculares (FMAs), Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand., associados com dose de P no crescimento de Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq., e na produção e qualidade do óleo essencial. O experimento foi conduzido em casa de vegetação num fatorial 5x2 com cinco tratamentos micorrízicos (controle não inoculado, A. morrowiae, G. clarum, e S. calospora, e a mistura desses inóculos) e duas doses de P (60 mg e 120 mg de fósforo por dm3 de solo) com dez repetições cada, subdivida em duas partes, metade foi destinada à avaliação do crescimento e outra metade para produtividade do óleo essencial. As plantas foram colhidas após 75 dias para a avaliação da biomassa seca, porcentagem de colonização micorrízica das raízes, número de esporos no solo, conteúdo dos nutrientes nas folhas, teor, rendimento e composição do óleo essencial. Houve interação entre os fungos micorrízicos e as doses de fósforo aplicadas que influenciaram na absorção dos nutrientes e no crescimento (biomassa) das plantas. Para a colonização micorrízica G. clarum apresentou uma maior porcentagem de colonização das raízes na maior dose de P, enquanto S. calospora teve maior percentual de colonização na menor dose de P. O número de esporos presente em 50 g de solo foi significativamente maior para os tratamentos inoculados com os FMAs em comparação com o controle não inoculado, entretanto não houve influência das doses de P na quantidade de esporos encontrada. A inoculação com FMAs aumentou o teor e o rendimento de óleo essencial da planta na menor dose de fósforo. Os inóculos utilizados separadamente foram mais eficientes do que a mistura dos fungos no incremento do teor e do rendimento do óleo essencial na dose maior de fósforo sendo que G. clarum elevou significativamente o rendimento do óleo quando a dose de 120 mg dm-3 de P foi aplicada ao solo. A colonização com FMAs não alterou a composição do óleo essencial, que teve como componentes majoritários o linalol e o acetato de linalol, mas houve alterações quantitativas (percentuais) dos componentes do óleo essencial de Mentha x piperita var. citrata.

Palavras-chave: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Linalol, Acetato de Linalol, Adubação fosfatada.

xiii

ABSTRACT

Arbuscular mycorrhizal fungi in soils of low fertility usually increase growth and production of dry matter on host plants and on essential oil producing plants can also alter the yield and composition of oil. Depending on fungus species and plant species effects can be distinguished and thus both mycobiont as photobiont should be tested. Our study aimed to evaluate the effects of mycorrhizal fungi (AMF), Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand., on growth of Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq., and the production and quality of essential oil. The experiment was conducted in a greenhouse in a 5x2 factorial design with five mycorrhizal treatments (uninoculated control, A. morrowiae, G. clarum, and S. calospora, and the mixture of inocula) and two P levels (60 mg and 120 mg phosphorus per dm3 of soil) with ten replicates each, subdivided on two parts, half to evaluation of plant growth and half to evaluation of essential oil productivity. Plants were harvested after 75 days for evaluation of dry biomass, the percentage of mycorrhizal colonization of roots, the number of spores in soil, content of nutrients in the leaves, content, yield and essential oil composition. There was interaction between mycorrhizal fungi and phosphorus doses that influence the absorption of nutrients and growth (biomass) of plants. For the colonization G. clarum showed a higher percentage of root colonization at the highest dose of P, and S. calospora had a higher percentage of colonization in the lower dose of P. The number of spores present in 50 g of soil was significantly higher for the treatments inoculated with mycorrhizal fungi compared to uninoculated control, however there was no influence of P levels on spore number. Inoculation with AMF increased the content and oil yield at the lowest dose of phosphorus. Inoculum used alone were more effective than the mixture of fungi in increasing the content and yield of essential oil in the higher dose of phosphorus, and G. clarum significantly increased oil yield when 120 mg dm-3 of P was applied to the soil. The mycorrhizal colonization did not alter the essential oil composition, which had as its major components linalool and linalool acetate, but there were quantitative changes (percentages) of essential oil components of Mentha x piperita.

Palavras-chave: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Linalool, Linalool Acetate, Phosphorus fertilization.

xiv

SUMÁRIO

RESUMO xii

ABSTRACT. xiii

INTRODUÇÃO 01

REVISÃO DE LITERATURA 03

1. Capítulo I 22

1.1 Introdução 24

1.2 Material e Métodos 26

1.2.1 Determinação da biomassa 29

1.2.2 Teor de nutrientes 29

1.2.3 Porcentagem de colonização micorrízica 29

1.2.4 Número de esporos de FMAs 30

1.2.5 Análise Estatística 30

1.3 Resultados e Discussão 31

1.3.1 Biomassa 31

1.3.2 Teor dos nutrientes 36

1.3.3 Porcentagem de colonização micorrízica e número de esporos 43

1.4 Conclusões 48

1.5 Referências 48

2. Capítulo II 52

2.1 Introdução 54

2.2 Material e Métodos 55

2.2.1 Determinação da biomassa 58

2.2.2 Determinação do teor, rendimento e composição química do óleo essencial 58

2.2.3 Análise estatística 59

2.3 Resultados e Discussão 60

2.4 Conclusões 66

2.5 Referências 66

Considerações Finais 69

1

INTRODUÇÃO

Os organismos vegetais fornecem à humanidade os mais variados

subsídios para sua permanência e manutenção na terra, seja provendo matéria

prima para indústrias como a de cosméticos, construção civil, e vestuário ou

sendo diretamente consumidas na alimentação. A medicina enquadra-se como

outro segmento em que as plantas são amplamente utilizadas, necessitando

assim de um respaldo científico para corroborar as informações acerca dos

seus benefícios medicinais que na maioria das vezes são transmitidos

culturalmente.

O metabolismo secundário das plantas fornece uma gama de compostos

que são utilizados na confecção de produtos diversos, nas mais variadas

indústrias. Dentre esses compostos os óleos essenciais estão cada vez mais

valorizados devido as suas propriedades aromáticas e terapêuticas que são

conferidas por características físico-químicas tais como volatilidade e

solubilidade em solventes orgânicos apolares.

Dentre as plantas produtoras de óleo essencial destaca-se a família

Lamiacea, com espécies que geralmente sintetizam e armazenam seu

composto volátil em estruturas denominadas tricomas glandulares. Nesta

família, um dos gêneros que desperta amplo interesse é o Mentha. As espécies

pertencentes a esse gênero produzem óleo essencial rico em mentol, mentona,

mentofurano e linalol, que são considerados os principais responsáveis pelo

uso dessas espécies como condimentos e aromatizantes e pelas ações

terapêuticas nos sistemas respiratório e gastrointestinal.

Fatores genéticos, fisiológicos e condições edafoclimáticas podem influir

diretamente sobre a biossíntese, qualidade e quantidade do óleo essencial.

Dentre esses fatores a presença de microrganismos benéficos associados à

raiz pode gerar alterações no biocomposto.

Micorriza é uma associação simbiotrófica mutualista obrigatória entre

plantas e fungos, onde tanto a planta hospedeira quanto o fungo simbionte são

beneficiados. Nesta relação, o fitobionte transloca para o fungo fotoassimilados

que auxiliam na manutenção e desenvolvimento de novas formas de

propágulos infectivos e/ou estruturas morfológicas fúngicas, enquanto o

2

micobionte incrementa a produtividade do vegetal através da melhoria do

estado nutricional da planta, ampliando (com suas hifas extrarradiculares) a

superfície de contato da mesma com o solo e otimizando a absorção de

nutrientes principalmente daqueles considerados pouco móveis. Além disso, a

micorrização pode proporcionar para o vegetal tolerância ao estresse hídrico e

ao ataque de patógeno, sem mencionar a melhoria para a ecologia do solo.

Essa associação mutualista trata-se de uma co-evolução gene a gene

estabelecida por meio de sinais bioquímicos, moleculares e fisiológicos que

permitiu não somente o estabelecimento dos organismos vegetais no solo, mas

também o desenvolvimento e adaptação nos mais diversos biomas terrestres.

Diante do acima exposto que elucida a importância do estudo da

associação entre fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e plantas medicinais,

o objetivo do trabalho foi o de avaliar o efeito desses fungos no crescimento,

composição química e produção de óleo essencial em Mentha x piperita L. var.

citrata (Ehrh.) Briq.

3

REVISÃO DE LITERATURA

Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq.

A família Lamiaceae é uma das mais diversificadas e apresentam

distribuição cosmopolita. Nessa família estão incluídos cerca de 300 gêneros e

7500 espécies (SOUZA; LORENZI, 2005), algumas com grande importância

econômica devido a produção de óleos essenciais (COSTA, 2008).

Um dos principais gêneros dessa família é o Mentha. Comumente são

espécies herbáceas e perenes com altura variável entre 20 e 70 cm de acordo

com o material genético e condições de manejo. Apresentam folhas opostas e

ovaladas com margens serrilhadas, flores hermafroditas e caules subterrâneos

(rizomas). As espécies mais cultivadas mundialmente são Mentha arvensis L. e

Mentha x piperita L. M. arvensis é originária de clima temperado e é cultivada

principalmente no Paraná e em São Paulo. M. x piperita é originária do

cruzamento entre M. aquática e M. viridis, sendo que normalmente apresenta

desenvolvimento rasteiro e grande produção de rizomas (BIASI; DESCHAMPS,

2009).

O uso de plantas do gênero Mentha é amplamente difundido, tendo em

vista sua adaptabilidade a diferentes condições edafo-climáticas, ao ciclo

vegetativo anual e a quantidade de informações já existentes sobre suas

características, desde anatômicas, bioquímicas, taxonômicas e agronômica

(MONTEIRO, 2009).

M. arvensis L. é conhecida popularmente como hortelã-japonesa, vique

ou hortelã, tem como principal componente de seu óleo o mentol, é muito

utilizada como matéria prima em indústrias farmacêutica e de confeitaria, seu

óleo pode conferir sabor e odor a remédios e balas, na indústria de cosméticos

serve para atribuir sensação refrescante a loções e cremes. De acordo com

informações etnobotânicas possui propriedades antidispéptica, antivomitiva,

descongestionante nasal e antigripal, age contra dor de cabeça e coceira na

pele (LORENZI; MATOS, 2002).

A espécie M. x piperita L. apresenta propriedades espamolíticas,

antivomitivas, carminativas, estomáquicas e anti-helmínticas, por via oral,

4

antibacterianas, antifúngicas e antiprurido em uso tópico (LORENZI; MATOS,

2002). A composição do óleo essencial de M. x piperita varia em função da

variedade, do quimiotipo e dos fatores abióticos, não existindo uma definição

exata de sua composição (OLIVEIRA, 2011a). Outras espécies de destaque

são M. pulegium, conhecida como poejo, registra ações contra desordens

digestivas, amenorreia, gota, resfriados e pode aumentar micção e quando em

excesso tem ação abortiva e hepatotóxica e M. x villosa mais utilizada como

condimento de carnes e massas, além de ações espasmolítica, antivomitiva,

carminativa, estomática, anti-helmíntica, antisséptica e antiprurido registrado

pela literatura etnobotânica (LORENZI; MATOS, 2002).

M. x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. (Figura 1) é conhecida como

hortelã-limão, possui óleo essencial rico em linalol e acetato de linalila, em

contraste com outras espécies do gênero Mentha (MURRAY; LINCOLN, 1970).

Portanto a necessidade de estudos fitotécnicos sobre a espécie aumenta para

otimizar a produção dos compostos de interesse para as indústrias.

Figura 1. Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq.

5

Óleo essencial

Metabólitos secundários são compostos orgânicos produzidos pelos

vegetais que parecem não ter função direta no seu crescimento e

desenvolvimento. Muitas vezes são distribuídos de maneira diferente entre

limitados grupos taxonômico dentro do reino vegetal, ou seja, metabólitos

secundários específicos são restritos a uma espécie vegetal ou a um grupo de

espécies relacionadas, sendo assim, esses compostos podem ser utilizados

em estudos taxonômicos (quimiossistemática). Apesar do metabolismo

secundário nem sempre ser necessário para que uma planta complete seu

ciclo de vida, ele desempenha um papel importante na interação das plantas

com o meio ambiente, apresentando funções ecológicas importantes tais como:

proteção contra herbivoria e infecção por organismos patogênicos, atrativos

para animais polinizadores e dispersores de sementes, bem como agentes na

competição planta-planta (PERES, 2004; TAIZ; ZEIGUER, 2004; CROTEAU et

al., 2000).

Os metabólitos secundários podem ser dividos em três grupos principais:

compostos fenólicos, alcalóides e terpenos, sendo, os terpenos os que ocorrem

com maior frequência e abundância (BIASI; DESCHAMPS, 2009; TAIZ;

ZEIGUER, 2004; SANGWAN et al., 2001).

Os compostos fenólicos são produtos secundários que possuem um

grupo fenol, um grupo hidroxila funcional e um anel aromático, são derivados

do ácido chiquímico ou ácido mevalônico. Constituem um grupo quimicamente

heterogêneo, alguns são solúveis apenas em solventes orgânicos, outros são

ácidos carboxílicos e glicosídeos solúveis em água e há, ainda, aqueles que

são grandes polímeros insolúveis. Devido a diversidade química, os compostos

fenólicos apresentam uma variedade de funções, muitos agem como composto

de defesa contra herbívoros e patógenos, outros tem função de suporte

mecânico, como atrativo de polinizadores e dispersores, na proteção da

radiação ultravioleta e ação alelopática (TAIZ; ZEIGUER, 2004).

Os compostos fenólicos são bastante utilizados cotidianamente

conferindo sabor, odor e coloração a diversos produtos, alguns desses

compostos, como o aldeído cinâmico da canela (Cinnamomum zeyllanicum) e a

6

vanilina da baunilha (Vanilla planifolia), são empregados na indústria de

alimentos (PERES, 2004).

Os alcalóides são metabólitos secundários que possuem nitrogênio na

sua estrutura, considerados de interesse devido ao efeito tóxico para humanos

e sua propriedades medicinais. Eles são derivados de aminoácidos aromáticos

(triptofano, tirosina), os quais são derivados do ácido chiquímico, e também de

aminoácidos alifáticos (ornitina, lisina) (PERES, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2004).

Os terpenóides são originados a partir do ácido mevalônico (no

citoplasma) ou do piruvato e 3-fosfoglicerato (no cloroplasto) (PERES, 2004;

TAIZ; ZEIGER, 2004). Eles são sintetizados a partir de cinco unidades de

carbono os isoprenos, dessa união formam-se os demais: monoterpenos (10

carbonos), sesquiterpenos (15 carbonos), diterpenos (20 carbonos) e

triterpenos (30 carbonos) (BIASI; DESCHAMPS, 2009).

Os monoterpenos possuem maior diversidade química e devido ao seu

baixo peso molecular, costumam ser substâncias voláteis, sendo, portanto

denominados óleos essenciais ou essências. Contudo os óleos essenciais

podem ser derivados de qualquer uma das quatro rotas precursoras dos

metabólitos secundários: do ácido chiquímico, do mevalonato, do acetato e dos

aminoácidos, havendo ainda compostos de origem mista, ou seja, provenientes

de mais de uma rotas (CASTRO et al., 2004).

Óleos essenciais são frações líquidas e voláteis que contem as

substâncias responsáveis pelo aroma das plantas, também podem ser

chamados de óleos voláteis, óleos etéreos ou essências, essas denominações

derivam de algumas características físico-químicas tais como: aparência oleosa

à temperatura ambiente; volatilidade; aroma agradável e intenso; solubilidade

em solventes orgânicos apolares; incolores ou amarelados; instáveis em

presença de luz, ar calor umidade e metais (CASTRO et al., 2004).

A biossíntese dos monoterpenos pode ocorrer em células

parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae); canais

oleíferos (Apiaceae) ou em bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae,

Rutaceae). Podem estar estocadas em flores (laranjeira), folhas (capim-limão,

eucalipto, louro) ou nas cascas dos caules (canelas), madeiras (sândalo, pau-

rosa) e frutos (erva-doce) (PERES, 2004). Nas mentas, assim como nas

7

demais lamiáceas os monoterpenos são produzidos e acumulados em

estruturas secretoras especializadas conhecidas como tricomas glandulares

peltados, localizados na parte aérea da planta, principalmente nas folhas e

cálices florais (TURNER et al., 2000).

Diferentes métodos para a extração de óleos essenciais podem ser

usados de acordo principalmente com o valor comercial do produto e órgão da

planta aonde se concentra o óleo. Os métodos mais utilizados incluem a

hidrodestilação e arraste a vapor (BIASI; DESCHAMPS, 2009).

Do ponto de vista biológico a função dos óleos essenciais nas plantas

pode ser tanto para atrair polinizadores (principalmente os noturnos) quanto

para repelir insetos (pragas) (PERES, 2004). No entanto plantas produtoras de

óleo essencial adquiriram importância econômica e tiveram uma ascensão em

seu cultivo, pois são usadas como medicamentos fitoterápicos, alguns

fabricados por conceituados laboratórios e suprem as indústrias de cosméticos,

perfumarias e alimentícias, no preparo dos mais variados produtos

(RUSSOMANO, 2006).

Apesar do alto valor econômico dos óleos das mentas, o papel biológico

ainda é pouco conhecido acredita-se que seus constituintes atuam na defesa

da planta contra perda de água, efeitos alelopáticos, ataques biótico e de

herbívoros (KAROUSOU et al., 1998).

Fatores que afetam a produção de óleo

A produção do óleo essencial em plantas aromáticas é regulada por

diversos fatores, que podem ser genéticos, bioquímicos, fisiológicos e de

origem metabólica. Os processos bioquímicos e metabólicos incluem

mecanismos moleculares regulados por rotas biossintéticas de carbono,

terpenóides e fenilpropanóides, e a regulação fisiológica além de ser exercida

por um padrão de desenvolvimento específico é influenciado por fatores

ambientais (SANGWAN et al., 2001).

Dentre estes fatores, podem-se ressaltar as interações

planta/microrganismos, planta/insetos e planta/planta; idade e estádio de

desenvolvimento, fatores abióticos como luminosidade, temperatura,

8

pluviosidade, nutrição, época e horário de coleta, bem como técnicas de

colheita e pós–colheita (MORAIS, 2009). Alguns desses fatores não atuam

isoladamente, podendo influir em conjunto no metabolismo secundário, como

por exemplo: desenvolvimento e sazonalidade; temperatura e altitude, entre

outros (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Segundo Morais (2009) a alteração dos compostos majoritários nos

óleos essenciais, seja por fatores genéticos, técnicos (coleta, estabilização e

armazenamento), bióticos ou abióticos, pode influenciar diretamente na

qualidade e, consequentemente, nos resultados de tratamentos e de testes

biológicos sobre patógenos humanos ou fitopatógenos.

Fungos Micorrízicos Arbusculares

Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiotróficos mutualistas

obrigatórios, isto é, só se desenvolvem no interior de células radiculares em

hospedeiros vivos, sem prejudicá-los, muito pelo contrário, auxiliando-os.

Raízes fossilizadas evidenciam o surgimento de micorrizas há cerca de 400

milhões de anos, acredita-se que durante a evolução conjunta fungos e plantas

desenvolveram a capacidade de se comunicarem molecularmente, através de

mecanismos de reconhecimento, tropismo e tactismo que permitiram a

interação célula a célula e a integração morfológica e funcional (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006).

Atualmente os fungos micorrízicos estão incluídos em um filo próprio o

Glomeromycota, essa organização foi baseada na convergência filogenética de

características morfológicas, bioquímicas e moleculares (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006), essa classificação é a mais reconhecida e aceita. Outras

classificações também são adotadas, como a do INVAM que apresenta uma

lista completa das espécies de FMAs e divide o filo em uma ordem, duas

subordens, cinco famílias e sete gêneros (MORTON; BENNY, 1990; MORTON;

REDECKER, 2001). Outra classificação é a proposta pela Universidade

Federal de Lavras que subdivide o filo em quatro ordens, nove famílias e doze

gêneros (SCHüBLER et al. 2001; http://www.lrz.de/~schuessler/amphylo/).

9

A colonização tem início com a formação de uma hifa infectiva, a partir

de um esporo germinado, segmento de raiz infectado ou de hifas no solo. As

hifas crescem na rizosfera e, ao entrar em contato com as raízes, formam uma

estrutura de penetração do tipo apressório que por meio de mecanismos

mecânicos e enzimáticos degrada a parede celular. Após penetração, o fungo

forma hifas que de uma maneira geral são asseptadas e que podem ser

classificadas em inter ou intracelulares e intra ou extrarradicular. No apoplasto

as hifas se diferenciam formando arbúsculos para ter acesso ao suprimento de

carbono da planta, em algumas espécies pode haver desenvolvimento de

vesículas que aparentemente possuem função de reserva. O estádio final da

simbiose culmina com a formação de novos esporos que acontece na maioria

das vezes na rizosfera, mas também pode ocorrer no interior das raízes

(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Efeito dos fungos micorrízicos arbusculares no crescimento das

plantas e na absorção de nutrientes

A micorrização é considerada como sendo mutualista nutricional, onde o

fotobionte supre o fungo com fotoassimilados para crescimento e reprodução,

enquanto que o micobionte provê a planta nutrientes e água. Assim, esta

simbiose amplia a capacidade de absorção de nutrientes por parte do

simbionte autotrófico e, conseqüentemente, a sua competitividade inter-

específica e produtividade (BERBARA et al., 2006).

Várias espécies de plantas respondem positivamente à inoculação com

FMAs, dentre elas café, soja, milho, batata-doce, mandioca, cana-de-açúcar,

além de várias espécies florestais e frutíferas. Algumas são consideradas

obrigatórias, isto é, não crescem na ausência de FMAs em níveis normais de

disponibilidade de nutrientes. Esta característica é encontrada com frequência

em espécies nativas de solos de baixa fertilidade natural (SIQUEIRA; SAGGIN-

JUNIOR, 2001). Nestes solos, inúmeras espécies vegetais são incapazes de

absorver fósforo na ausência de micorrização, como mandioca e batata-doce

(BERBARA et al., 2006).

10

A simbiose micorrízica arbuscular tem um importante potencial

biotecnológico e ecológico. Ela causa impactos que vão desde suas relações

com plantas (processos de absorção de nutrientes, principalmente dos

considerados pouco móveis no solo), com comunidades vegetais (influenciando

em sua diversidade e abundância) e com processos relacionados à

estabilidade de ecossistemas, ao participarem de forma ativa e significante na

agregação do solo, incrementos à resistência de plantas frente ao ataque

patogênico (HWANG et al., 1992), à tolerância ao estresse hídrico, à eficiência

fotossintética (BROWN; BETHLENFALVAY, 1987), ao intemperismo de

minerais (VAN BREEMEN et al., 2000).

O efeito dos fungos micorrízicos arbusculares sobre o crescimento das

plantas é especialmente significativo com relação aos nutrientes de baixa

mobilidade no solo,os quais praticamente não se movem por fluxo de massa,

porém chegam à raiz por meio de mecanismos de difusão (MARSCHNER,

1995). Neste grupo situam-se primordialmente o macronutriente fósforo e os

micronutrientes zinco e cobre (CARDOSO et al., 2010). Já o nitrogênio quando

se encontra na forma de amônio (menos móvel que o nitrato) é comum

observar-se o aumento de sua absorção em plantas micorrizadas (GEORGE et

al., 1992).

A melhora da nutrição fosfatada das plantas tem sido reconhecida como

um dos maiores benefícios das micorrizas, as respostas, entretanto, variam

com o nível de fósforo, pH e teor de alumínio, com a espécie de FMA presente

e com a cultivar ou espécie de planta. O mecanismo de atuação da micorriza

mais aceito para explicar o benefício em relação ao fósforo, é que as micorrizas

exploram uma área maior de solo, em relação às raízes, portanto um processo

físico (CARDOSO et al., 2010). Todavia as micorrizas podem ser mais do que

simplesmente uma extensão do sistema radicular, contribuindo na absorção de

nutrientes pela planta em até 80% de fósforo, 60% de cobre, 25% de

nitrogênio, 25% de zinco e 10% de K (MARSCHNER; DELL, 1994).

Além do benefício das micorrizas arbusculares na nutrição de fósforo

para as plantas, a absorção de outros macronutrientes também é influenciada

pela associação simbiótica. A absorção de nitrogênio por plantas micorrizadas

ocorre preferencialmente na forma amoniacal (NH4+) (GEORGE et al., 1992),

11

que pode está relacionado com a mobilidade da forma amoniacal do nitrogênio,

considerada menor qua a do nitrato (CANTARELLA, 2007). Além disso, devido

ao pequeno diâmetro, as hifas penetram mais facilmente em material orgânico

em decomposição, competindo melhor pelo nitrogênio recentemente

mineralizado (HODGE, 2003). Esse padrão é detectado também na absorção

de potássio, as hifas são as mediadoras desse processo (GEORGE et al.,

1992).

Para os micronutrientes a micorrização não só aumentam a

concentração dos elementos, em especial zinco, cobre e ferro, mas também

auxiliam as plantas a suportar condições de excesso, amenizando a toxidez,

podendo reduzir a absorção ou a translocação (CARDOSO et al., 2003;

SOARES; SIQUEIRA, 2008).

Plantas respondem de maneira diferente à micorrização, não somente

com nível de colonização, absorção de nutrientes e crescimento, mas também

ao nível de expressão gênica. Em alguns casos a resposta molecular e

fisiológica da planta ao fungo pode ser explicada pela abilidade do fungo em

suprir o hospedeiro com fosfato inorgânico (BURLEIGH, et al., 2002;

BURLEIGH; BECHMANN, 2002).

Freitas et al. (2006) avaliaram os efeitos de fungos micorrízicos

arbusculares no crescimento e composição mineral de Mentha arvensis L.,

cultivada com diferentes doses de fósforo, seus resultados demonstraram que

houve interações entre as espécies de fungos e doses de fósforo na produção

de matéria seca, nos conteúdos de nitrogênio, fósforo, potássio e de

manganês. Para todos esses parâmetros os resultados nos tratamentos

micorrizados foram superior aos tratamentos sem inoculação. Quando não se

utilizou adubação fosfatada, as plantas inoculadas com FMAs, apresentaram

conteúdos de N, P e K superiores ao tratamento controle, já os conteúdos de

cálcio, magnésio e enxofre foram influenciados pela aplicação de fósforo, mas

não foram afetados pelos tratamentos fúngicos.

Gupta et al. (2002) avaliaram o efeito de um fungo específico o Glomus

fasciculatum em diferentes cultivares de menta e demonstraram que a

inoculação incrementou a absorção de nitrogênio, fósforo e potássio, no

entanto de maneira mais pronunciada na absorção de fósforo.

12

Efeito do fósforo na colonização micorrízica

Micorrizas são sistemas biológicos compartimentalizados e sofrem

enorme influência do ambiente e de inúmeros fatores edáficos que influenciam

de modo direto ou indireto a formação, o funcionamento e a ocorrência dos

FMAs. Os componentes e os fatores controlados apresentam interação

constante e intensa de modo que a alteração em qualquer deles exercerá

influência sobre as micorrizas e os propágulos dos FMAs (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006).

As micorrizas são geralmente inibidas em condições de elevada

fertilidade tendo a taxa de colonização micorrízica intrarradicial uma diminuição

drástica com níveis elevados de fósforo no solo, enquanto adições moderadas

de fósforo podem até favorecer o efeito do fungo micorrízico sobre a nutrição e

crescimento da planta (CARDOSO et al., 2010).

Moreira e Siqueira (2006) propõem que o efeito de fósforo na

colonização não torna as plantas imunes à colonização, apenas reduz a

intensidade da micorrização e que geralmente, em concentrações próximas do

ótimo para o crescimento da planta hospedeira, já ocorre inibição da

colonização micorrízica. Nessas concentrações de fósforo, não há efeito

inibitório sobre os propágulos de fungo na rizosfera, a colonização é reduzida

por mecanismos de auto-regulação da simbiose. Os exsudatos de plantas

deficientes em fósforo estimulam o crescimento assimbiótico do fungo e, assim,

em condições de suprimento ótimo de fósforo, a colonização não será

estimulada.

Freitas et al. (2006) avaliaram os efeitos de fungos micorrízicos

arbusculares no crescimento e composição mineral de Mentha arvensis L.,

cultivada com diferentes doses de fósforo, eles verificaram que houve

interações entre as espécies de fungos e as doses de fósforo para a

porcentagem de colonização micorrízica. Quando não se utilizou adubação

fosfatada, as maiores porcentagens de colonização micorrízica foram com

Glomus clarum (69%) e Gigaspora margarita (81%), que também

proporcionaram maiores produções de matéria seca. Cada fungo micorrízico

apresentou um comportamento diferenciado, G. clarum e G. margarita

13

apresentaram colonização decrescente linearmente com o aumento da dose de

fósforo, já Glomus etunicatum e Acaulospora scrobiculata apresentaram uma

resposta quadrática, com ponto de máximo nas doses de fósforo estimadas em

99,1 e 95,5 mg kg-1 de solo.

Resultados semelhantes foram encontrado por Freitas et al. (2008) para

tanchagem (Plantago major L.), nesse trabalho cada espécie de FMAs também

apresentou comportamento diferente de acordo com a disponibilidade de P no

solo. A maior porcentagem de colonização micorrízica foi observada nas

espécies G. clarum (72,6%) e G. margarita (70,5%), quando não se utilizou

adubação fosfatada sendo que de uma maneira geral a porcentagem de

colonização diminuiu de acordo com o aumento da dose de fósforo.

Os efeitos negativos de alta disponibilidade de fósforo são muito

consistentes, representando quase uma regra na ecologia das micorrizas, mas

o mecanismo exato dessa inibição é ainda assunto não resolvido. Esses

mecanismos são complexos e podem diferir para os tipos de micorrizas e até

combinação fungo-planta, dificultando as generalizações (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006).

Fungos Micorrízicos Arbusculares e Plantas medicinais

Os FMAs têm um papel vital para sustentabilidade da agricultura em

regiões tropicais e apresentam grande potencial biotecnológico, que estão

ligados, justamente aos efeitos benéficos das micorrizas sobre a nutrição e

crescimento das plantas (BERBARA et al., 2006).

De uma forma geral, a maioria dos estudos demonstra a eficiência da

inoculação de fungos micorrízicos arbusculares no aumento do

desenvolvimento das espécies e na concentração dos princípios ativos, o que

incrementa o teor e o rendimento dos mesmos, como foi observado com,

Rosmarinus officinalis L. e Ocimum basilicum L. (RUSSOMANNO et al., 2008),

Mentha arvensis L. (GUPTA et al., 2002), Coriandrum sativum L. (KAPOOR et

al., 2002), Baccharis trimera (Less.) DC. (FREITAS et al., 2004b), Ocimum

basilicum L. var. Genovense (COPETTA et al., 2006), Artemisia umbelliformis

14

Lam (BINET et al., 2011) Inula ensifolia L. (ZUBEK et al., 2010) e Origanum sp.

(KHAOSAAD et al., 2006).

Algumas pesquisas relatam não somente a influência dos FMAs no teor

e no rendimento do óleo essencial, mas também na composição. Copetta et al.

(2007) demonstraram que Ocimum basilicum var. Genovense obteve uma

porcentagem maior de metileugenol e δcadineno quando inoculada com

Gigaspora margarita e Gigaspora rosea. Algo semelhante também foi

observado por Portugal et al. (2006) com Estevia rebaudiana (Bert.). Neste

trabalho os autores constataram que a quantidade de esteviosídeos foi

significativamente superior para Glomus intraradices (51%) em relação ao

tratamento com Acaulospora sp. e ao controle não inoculado. Com Artemisia

annua L., CHAUDHARY et al. (2008) verificaram que a concentração do

composto majoritário e de interesse industrial aumentou em tratamentos

micorrizados.

Determinados experimentos associam a eficiência micorrízica e

adubação fosfatada em busca de resultados que comprovem a eficiência dos

FMAs na absorção do fósforo e até que ponto este nutriente interfere no

desenvolvimento do fitobionte e do micobionte. Nesta linha de pesquisa

destaca-se trabalhos como o desenvolvido por Freitas et al. (2004a e 2006),

eles constataram que, sem adubação fosfatada o teor do óleo essencial de

Mentha arvensis L. e do seu composto majoritário o mentol foram menores em

plantas sem inoculação, e com a presença da adubação não houve diferença

nesses parâmetros entre os tratamentos. Outro trabalho de destaque foi o

publicado por Nell et al. (2009) comprovando que em Salvia officinalis L. o

conteúdo de fósforo foi maior em plantas fertilizadas e inoculadas, e o teor de

ácido rosmarínico foi afetado de maneira diferente na folha e na raiz sendo

incrementado em tratamentos submetidos à fertilização. No entanto, a

composição e concentração deste óleo não foram afetados. Kapoor et al.

(2004) realizaram trabalho semelhante para Foeniculum vulgare Mill,

verificando incremento na absorção de fósforo e no teor de óleo em

tratamentos micorrizados.

Na tentativa de comprovar a eficiência do FMA na absorção de fósforo

alguns estudos analisam o conteúdo de fósforo na planta, mas não realizam

15

adição de adubação fosfatada, como o que foi desenvolvido por Sailo e

Bagyaraj (2005). Nesse trabalho a biomassa, conteúdo de forskolin (diterpeno

presente na raiz da planta) e absorção de fósforo foram superiores em plantas

micorrizadas.

Outros trabalhos vão além e analisam até mesmo o potencial

bioprotetor. Toussaint et al. (2008) perceberam que a concentração de ácidos e

óleo essencial em Ocimum basilicum L. incrementam quando estão

micorrizadas e inoculadas com o fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum. No

entanto o efeito bioprotetor não está relacionado a nutrição suplementar de

fósforo, pois a concentração deste foi similar em todos os tratamentos, mas a

simbiose com FMA diminuiu a concentração de metileugenol em plantas

tratadas com patógeno.

Os resultados apresentados em pesquisas que relacionam plantas

medicinais, FMAs e adição suplementar de fósforo podem em alguns

momentos alterar a composição, mas frequentemente afetam o teor e o

rendimento do óleo, provando que nem sempre os metabólitos secundários são

influenciados pelo fósforo, mas depende da interação planta-FMA (KHAOSAAD

et al., 2006).

16

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22

1. Capítulo I - CRESCIMENTO E COMPOSIÇÃO MINERAL DE MENTHA X PIPERITA L. VAR. CITRATA (EHRH.) BRIQ. INOCULADA COM FUNGOS

MICORRÍZICOS ARBUSCULARES SUBMETIDA A DUAS DOSES DE FÓSFORO

RESUMO

A associação entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes é benéfica para ambos os simbiontes, para a planta hospedeira ela amplia a capacidade de absorção dos nutrientes melhorando o estado nutricional do vegetal e aumentando a sua produtividade. Essa associação recebe influência de fatores edáficos como, por exemplo, a disponibilidade de fósforo no solo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de fungos micorrízicos arbusculares no crescimento e na composição mineral de Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. submetida a duas doses de fósforo no solo. O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Universidade Estadual de Santa Cruz num fatorial 5x2, sendo cinco tratamentos micorrízicos (controle não inoculado, inoculação com Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck, e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand., e a mistura desse inóculos) e duas doses de fósforo (60 mg e 120 mg de fósforo por dm3) com cinco repetições cada. Após 75 dias as plantas foram coletadas e avaliadas quanto à produção de biomassa seca, porcentagem de colonização micorrízica, número de esporos no solo e composição de macro e micronutrientes das folhas. Os FMAs incrementaram a produção de biomassa seca da raiz, caule, folha e total. Para a colonização micorrízica G. clarum apresentou uma maior porcentagem na maior dose de P, enquanto S. calospora obteve maior colonização das raízes na menor dose de P. O número de esporos presente em 50 g de solo foi significativamente maior para os tratamentos inoculados com os FMAs em comparação com o controle não inoculado, entretanto não houve influência das doses de P na quantidade de esporos encontrada. Os tratamentos micorrízicos e as doses de fósforo influenciaram a absorção dos nutrientes e o crescimento (biomassa) das plantas. Palavras-chave: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Conteúdo de nutrientes, Planta Medicinal.

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ABSTRACT

The association between mycorrhizal fungi and roots is beneficial to both symbionts, to the host plant it increases the capacity for absorption of nutrients by improving the nutritional status of the plant and increasing its productivity. This association is influenced by the soil factors such as the availability of phosphorus. This study aimed to evaluate the influence of mycorrhizal fungi on growth and mineral composition of Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. on two phosphorus doses in the soil. The experiment was installed in a greenhouse at the Universidade Estadual de Santa Cruz in a 5x2 factorial design, five mycorrhizal treatments (uninoculated control, inoculation with Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck, e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand., and the mixture of inocula) and two doses of phosphorus (60 mg and 120 mg of phosphorus per dm-3 of soil) with five replicates each. After 75 days the plants were collected and evaluated for biomass dry weight, percentage of mycorrhizal colonization, spore numbers in soil and composition of macro and micronutrients of leaves. The AMF increased the production of dry biomass of root, stem, leaf and total. For the colonization G. clarum showed a higher percentage of colonization at the highest P dose and S. calospora obtained higher mycorrhizal root colonization in the lower dose of P. The number of spores present in 50 g of soil was significantly higher for the treatments inoculated with mycorrhizal fungi compared to uninoculated control, however there was no influence of P levels on spore number. The mycorrhizal treatments and phosphorus dose influenced nutrient content and growth (biomass production) of plants. Keywords: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, nutrient content, Medicinal Plant.

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1.1 INTRODUÇÃO

Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. é conhecida popularmente

como hortelã-limão, pertencente à família Lamiaceae tem como componente

principal do seu óleo essencial o linalol e o acetato de linalila (GARLET, 2007;

MURRAY; LINCOLN, 1970). A presença desses compostos aumenta o

interesse econômico pela espécie, pois são utilizados nas indústrias de

perfumaria, cosmética, de alimentos, medicamentos, fragrâncias e tabaco,

principalmente como aromatizante e flavorizante de alimentos e na confecção

de perfumes (GARLET, 2007). Além disso, estes compostos estão associados

à defesa da planta contra patógenos e herbívoros e a atração de polinizadores

(CROTEAU et al., 2000).

De acordo com Marschner (1995) as plantas necessitam de energia

solar (armazenada sob a forma de ATP, NADPH), CO2, água e nutrientes

minerais para seu desenvolvimento. Atualmente são citados dezessete

nutrientes essenciais, ou seja, que desempenham funções vitais no

desenvolvimento do vegetal, sendo a maioria desses nutrientes absorvidos do

solo.

Os fungos micorrízicos arbusculares otimizam a absorção de nutrientes

do solo, aumentando a superfície de contato entre a planta e o solo por meio

de hifas extrarradiculares que colonizam sítios não possíveis de serem

atingidos pela raízes. Para alguns autores, as micorrizas podem ser mais do

que simplesmente uma extensão do sistema radicular, contribuindo na

absorção de nutrientes pela planta em até 80% de fósforo, 60% de cobre, 25%

de nitrogênio, 25% de zinco e 10% de K (MARSCHNER; DELL, 1994). Freitas

et al. (2006) em experimento com M. arvensis detectaram aumento de

nitrogênio, fósforo, potássio e manganês em função da inoculação com FMA e

adubação fosfatada. Gupta et al. (2002) também com espécies do gênero

Mentha comprovaram o aumento na absorção de nitrogênio, fósforo e potássio

em plantas inoculadas com Glomus fasciculatum. Em experimento em casa de

vegetação Rasouli-Sadaghiani et al. (2010) detectaram o incremento do

conteúdo de nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, cobre, manganês e ferro em

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manjericão (Ocimum basilicum L.) inoculada com três espécies diferentes de

Glomus.



mobilidade no solo como por exemplo fósforo, ferro e zinco (MARSCHNER,

1995). A melhora da nutrição fosfatada tem sido reconhecida como um dos

maiores benefícios das micorrizas, as respostas, entretanto, variam

especialmente com o nível de fósforo, com a espécie de FMA presente e com a

cultivar ou espécie de planta (CARDOSO et al., 2010). Karagiannidis et al.

(2011) em experimento em casa de vegetação observaram que plantas de

orégano e menta não-micorrizadas tiveram níveis menores de macro e micro

nutrientes, e que o orégano inoculado com Glomus etunicatum tiveram

aumento na concentração de fósforo. Com três acessos de Artemisia annua,

sob condições controladas Chaudhary et al. (2008) observaram que houve um

aumento na absorção de fósforo, ferro e zinco quando inoculada com duas

espécies diferentes de Glomus.

As micorrizas são geralmente inibidas em condições de elevada

fertilidade tendo a taxa de colonização micorrízica intrarradical uma diminuição

drástica, com níveis elevados de fósforo no solo. Porém em solos deficientes

ou extremamente fixadores de fósforo, adições moderadas de fósforo podem

favorecer o efeito de fungos micorrízicos sobre a nutrição e crescimento da

planta (CARDOSO et al., 2010). A dependência micorrízica tem estreita relação

com a dose de fósforo. Balota et al. (2010) avaliaram o efeitos de FMA em

culturas de girassol, amendoim e mamona submetidas a diferentes doses de

fósforo e concluíram que o girassol e o amendoim apresentaram moderada

dependência micorrízica, enquanto que a mamona apresentou alta

dependência aos FMA, e que a colonização micorrízica radicular nas

oleaginosas foi inibida significativamente com o aumento da dose de P

adicionada ao solo.

Entre os fatores que interferem no crescimento em plantas, a nutrição

merece destaque, pois a deficiência ou excesso de nutrientes pode intervir na

produção da biomassa e consequentemente na quantidade de óleos essenciais

(MORAIS, 2009). Desta maneira, qualquer fator que possa interferir na

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absorção de nutrientes pela planta, como é o caso das micorrizas, deve ser

estudado com vistas ao aumento da produtividade de massa vegetal.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos fungos micorrízicos

arbusculares no crescimento e composição de macro e micronutriente em

Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. sob duas doses de fósforo.

1.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no campus da

Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – BA, sob condições naturais de

luminosidade e temperatura. O delineamento experimental foi constituído por

um fatorial 5x2, sendo utilizados três inóculos de FMA: Acaulospora morrowiae

(Am) Spain & Schenck (A79 CNPAB 037), Glomus clarum (Gc) Nicol. &

Schenck (A5 CNPAB 005) e Scutellospora calospora (Sc) (Nicol. & Gerd.)

Walk. & Sand. (A80 CNPAB 038), além de um controle formado por plantas

não inoculadas (C) e um tratamento com a mistura de todos os três inóculos

(M), perfazendo um total de cinco tratamentos micorrízicos, e duas doses

diferentes de fósforo 60 mg (P60) e 120 (P120) mg dm-3 sendo cinco repetições

cada. A unidade experimental foi composta por um vaso de plástico contendo

quatro dm3 de solo e uma planta por vaso. Os inóculos foram gentilmente

cedidos pela coleção de fungos micorrízicos da Embrapa Agrobiologia

(Seropédica, RJ).

O solo utilizado no experimento foi um argissolo amarelo distrófico típico,

coletado da camada de 0 a 20 cm em área de pastagem de Brachiaria

humidicola com remanescente de dendê na Estação Experimental do Almada

(39º10’ W e 14º38’ S), localizada em Uruçuca (BA) e pertencente à UESC. O

solo foi seco ao ar e tamisado em peneira com malha de 5 mm e suas

características químicas (Tabelas 1) e físicas (Tabela 2) foram determinadas

segundo Embrapa (1997). Esse solo foi autoclavado por uma hora a 121 °C e

1,5 atm por dois dias consecutivos para esterilização.

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Tabela 1. Características químicas iniciais (antes do início do experimento) do Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação

Experimental da Almada, localizada no município de Uruçuca, BA

Amostra pH M.O. P K Ca Mg Al H + Al SB CTC V B Cu Fe Mn Zn

CaCl2 g dm-3 mg dm-3 ------------------------mmolc dm-3---------------------- % ----------------------mg dm-3--------------------

Solo inicial 4,0 17 ˂ 2 0,4 5 3 5,4 47 7,9 54,8 14 0,49 ˂ 0,3 171 2,0 0,9

P, K, Ca e Mg = Resina trocadora de íons; H + Al = pH SMP; M. O. = dicromato/colorimetria; B = água quente/microndas; Cu, Fe, Mn e Zn = extração DTPA-TEA pH 7,3.

Tabela 2. Características físicas iniciais (antes do início do experimento) do Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação

Experimental do Almada, localizada no município de Uruçuca, BA

Amostra Areia grossa Areia fina Areia total Silte Argila Classificação textural

-------------------------------g kg-1------------------------------

Solo inicial 142 720 861 13 125 Arenosa

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Com o solo coletado foi realizada uma curva de incubação usando cinco

doses de calcário dolomítico com PRNT de 82,02 %. Os resultados foram

analisados por regressão para ajustar o pH em torno de 6,5. Além do calcário,

que também serviu de fonte para o cálcio e o magnésio, o solo contido nos

vasos recebeu uma adubação individual com base na análise do solo, na

produtividade da espécie e no comportamento do fungo, constituída por 100

mg dm-3 de nitrogênio na forma de sulfato de amônio; duas doses de fósforo 60

e 120 mg dm-3 de fósforo como superfosfato simples; 80 mg dm-3 de potássio

sob a forma de cloreto de potássio; 1,55 mg dm-3 de ferro na forma de Ferro

EDTA; 0,75 mg dm-3 de boro na forma de ácido bórico; 1,33 mg dm-3 de cobre

sob a forma de sulfato de cobre; 0,15 mg dm-3 de molibdênio na forma de

molibdato de amônio; 4 mg dm-3 de zinco e de manganês na forma de sulfato

de zinco e sulfato de manganês, respectivamente. A adubação foi subdividida

em duas partes uma anterior a autoclavagem onde foi adicionado ao solo o

calcário, o superfosfato simples, cloreto de potássio em solução e os

micronutrientes (boro, cobre, molibdênio, zinco e manganês) também em

solução e outra posterior a autoclavagem que recebeu a adição do nitrogênio

sob forma de solução preparado com água autoclavada e o ferro também em

solução que foi autoclavada separada. Antes da transferência do solo para os

vasos, estes foram lavados com água e desinfestados superficialmente com

etanol 70 % e com hipoclorito de sódio comercial (2 a 2,5 %).

A propagação da M. x piperita var. citrata foi vegetativa, mudas foram

obtidas junto ao Horto de Plantas Medicinais da Universidade Estadual de

Santa Cruz, Ilhéus-BA, e estacas de aproximadamente 5 cm de comprimento

foram e colocadas para enraizar em bandejas de polipropileno com substrato

areia e vermiculita (2:1) autoclavado por uma hora a 121 °C e 1,5 atm, onde

permaneceram por quatorze dias até a data do transplante.

No transplante, os inóculos de FMAs foram concomitantemente

adicionados ao solo junto das raízes das mudas e por fim pedriscos

autoclavados por 20 minutos a 121 °C e 1,5 atm foram colocados para diminuir

a superfície de contato do solo com o ar e minimizar as possíveis

contaminações. Durante a condução do experimento as plantas foram irrigadas

com água deionizada autoclavada.

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Após 75 dias de crescimento na casa de vegetação, as plantas foram

coletadas, separadas em raiz, caule e folhas, embaladas em sacos de papel

Kraft devidamente identificados para determinação de biomassa e avaliação

nutricional.

1.2.1 Determinação da biomassa

Após a coleta e separação, o material foi seco a 70 °C em estufa de

circulação forçada e em seguida foi efetuada a pesagem em balança semi

analítica até peso constante para a obtenção da biomassa seca da raiz, caule,

folha e total.

1.2.2 Teor de nutrientes

Para a análise da composição de macro e micronutrientes (conforme

Embrapa, 1997, modificado) o material sofreu digestão com ácido nítrico. Após

a determinação da biomassa seca as folhas foram moídas em moinho de bola

por 2 min e armazenados em frascos plásticos em desumidificador, depois

pesadas aproximadamente 0,2010 mg do material em balança analítica dentro

dos tubos digestores previamente descontaminados em ácido nítrico 10 %. Em

seguida os tubos foram transferidos para o bloco digestor onde o processo de

digestão foi realizado, na primeira parte do processo foi adicionado 3 ml de

ácido nítrico nos tubos que permaneceram por 30 min a 50 °C, depois a

temperatura foi elevada para 120 °C por uma hora e meia. Ao final do processo

foi adicionado 1 ml de peróxido de hidrogênio por três vezes consecutivas, a

120 °C por 20 min. Posteriormente o material contido no tubo digestor foi

vertido para tubos falcon e volumado pra 12 ml e armazenado na geladeira até

leitura em espectrofotômetro óptico (ICP AOS) Variant 710-ES do Centro de

Microscopia Eletrônica da UESC.

1.2.3 Porcentagem de colonização micorrízica

A estimativa da porcentagem de colonização micorrízica foi realizada em

triplicata a partir de amostras aleatórias das raízes que foram clarificadas e

coradas de acordo com o método de Phillips e Haymann (1970) modificado.

Durante a coleta as raízes mais finas e claras foram selecionadas e

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armazenadas em álcool 50 %, depois foram lavadas em água corrente e

clareadas, primeiro com a remoção do protoplama utilizando solução de KOH

10 % em banho Maria a aproximadamente 60°C durante 30 min., lavadas com

água em abundância, e depois o clareamento foi finalizado com peróxido de

hidrogênio a 10 % por 20 min em temperatura ambiente. Em seguida as raízes

foram lavadas com água destilada e coradas com corante acidófilo a base de

tinta de caneta preta e ácido acético a 5 % e armazenadas em lactoglicerol na

proporção 1 : 1 : 1 (v/v/v) de ácido láctico, glicerina e água.

A estimativa da colonização foi calculada pelo método de placa riscada

modificado (McGONIGLE et al., 1990). Foram feitas 10 listras verticais em

lâminas e as raízes foram depositadas horizontalmente e na interseção entre a

listra e a raiz foi observado a presença ou a ausência de micorrização bem

como o tipo de estrutura detectada.

1.2.4 Número de esporos de FMAs

A determinação da quantidade de esporos de FMAs também foi

realizada em triplicata, utilizando o método de peneiramento úmido de

Gerdemann e Nicolson (1963) modificado. Amostras de solo dos vasos, ao final

do experimento, foram coletadas e armazenadas em refrigerador. Dessas

amostras foram utilizadas 50 g, que após serem peneiradas foram

centrifugadas por duas vezes, a primeira vez com água destilada por três

minutos a 2.500 rpm depois com sacarose 50 % por um minuto também à

2.500 rpm, e por fim os esporos foram contados utilizando estereomicroscópio

no aumento de 40X.

1.2.5 Análise estatística

Todos os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, os

tratamentos fosfatados foram comparados pelo teste de F a 5% de

probabilidade. Para as médias dos tratamentos fúngicos foi utilizado o teste t

de contrastes ortogonais (Tabela 3) a 5% de probabilidade. No caso de

significância da interação FMA x dose de fósforo foi realizado o seu

desdobramento. As análises estatísticas foram realizadas pelo programa

estatístico SISVAR (Ferreira, 2000).

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Tabela 3. Descrição dos contrastes ortogonais para a avaliação da influencia de FMAs

em Mentha x piperita var. citrata submetida a duas doses de fósforo

Contraste ortogonais Comparação

Ŷ1 = 4 1m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 4m̂ - 5m̂ Controle vs. Demais - contraste um (1)

Ŷ2 = 2m̂ + 3m̂ + 4m̂ - 3 5m̂ A. morrowiae, G. clarum,S. calospora vs.

Mistura dos inóculos - contraste dois (2)

Ŷ3 = 2m̂ + 4m̂ - 2 3m̂ A. morrowiae e S. calospora vs. G. clarum -

contraste três (3)

Ŷ4 = 2m̂ - 4m̂ A. morrowiae vs. S. calospora - contraste

quatro (4)

Ŷ5 = 4 4m̂ - 1m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 5m̂ S. calospora vs. demais – contraste (5)

Ŷ6 = 3 4m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 5m̂ S. calospora vs. A. morrowiae,G. clarum e

mistura dos inóculos – contraste (6)

Ŷ7 = 2m̂ - 3m̂ A. morrowiae vs. G. clarum – contraste (7)

1.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.3.1 Biomassa

Houve interação entre a dose de P e os FMAs inoculados em Mentha x

piperita para as variáveis biomassa seca da raiz, do caule, da folha e total

conforme observado na Tabela 4.

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Tabela 4. Resumo da análise de variância para as variáveis biomassa de raiz, caule,

folha e total de Mentha x piperita. var. citrata inoculada com fungos micorrízicos

arbusculares (FMA) e submetida a doses de fósforo

FV GL Quadrado Médio

Raiz Caule Folha Total

FMA 4 0,12 0,10 0,13 0,98

Dose 1 0,07 0,01 0,22 0,41

FMA*Dose 4 0,13 0,48* 1,84* 4,89*

Erro 20 0,13 0,12 0,16 0,75

Média Geral 0,75 1,69 2,80 5,26

CV (%) 49,22 20,51 14,52 16,5

*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F.

Os valores médios para a biomassa total e de cada compartimento das

plantas de Mentha x piperita inoculadas com FMAs e submetidas as duas

doses de P (60 mg e 120 mg dm-3) podem ser observados na Tabela 5 logo

abaixo.

Tabela 5. Valores médios em g referente à biomassa seca da raiz, caule, folha e total

de Mentha x piperita var. citrata inoculada com FMA e submetida a duas doses de

fósforo

FMA Dose Raiz Caule Folha Total

C P60 0,55 1,35 2,03 3,94

C P120 0,70 1,91 3,52 6,13

Am P60 0,67 1,65 2,66 4,99

Am P120 1,22 1,94 3,26 6,42

Gc P60 0,79 1,51 2,45 4,74

Gc P120 0,57 1,66 2,97 5,20

Sc P60 0,72 2,05 3,37 6,13

Sc P120 0,53 1,1 1,78 3,41

M P60 0,79 2,15 3,30 6,24

M P120 0,92 1,60 2,58 5,10

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm

-3; P120 = 120 mg dm

-3. n = 3.

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De acordo com os resultados dos contrastes ortogonais (Tabela 6),

houve apenas uma estimativa que foi significativa para a raiz, encontrada no

contraste quatro, que compara o inóculo de A. morrowiae com S. calospora,

demonstrando que S. calospora produziu maior biomassa radicular que A.

morrowiae. Para o caule, a diferença significativa aparece nos contraste quatro

(que compara a inoculação com A. morrowiae e a inoculação com S.

calospora), cinco (comparação entre S. calospora e os demais tratamentos) e

seis (que compara S. calospora com os tratamentos micorrizados), ambos com

a maior dose de fósforo (120 mg dm-3). A interpretação é a de que o inóculo A.

morrowiae é mais eficiente em promover o aumento da biomassa quando

comparado ao inóculo S. calospora (contraste quatro) e que FMA S. calospora

obteve a menor biomassa caulinar.

Tabela 6. Estimativas dos contrastes ortogonais das variáveis biomassa de raiz, caule,

folha e total para Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos


Contrastes Raiz Caule Folha Total

P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120

(1) C vs. Demais -0,18 -0,10 -0,49 0,33 -0,91* 0,87* -1,58* 1,09

(2) Am, Gc e Sc vs. M -0,06 -0,13 -0,41 0,03 -0,47 0,08 -0,95 -0,08

(3) Am e Sc vs. Gc -0,09 0,30 0,33 -0,13 0,56 -0,45 0,81 -0,28

(4) Am vs. Sc -0,04 0,69* -0,39 0,83* -0,71 1,48* -1,14 3,00*

(5) Sc vs. demais 0,01 -0,32 0,37 -0,67* 0,76* -1,30* 1,15 - 2,30*

(6) Sc vs. Am, Gc e M -0,03 -0,37 0,27 -0,63* 0,56 -1,15* 0,80 -2,16*

(7) Am vs. Gc -0,11 0,65 0,14 0,28 0,21 0,28 0,24 1,22

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M =

Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3

; P120 = 120 mg dm-3

. *significativo a 5 % de probabilidade do teste t.

34

Para a variável biomassa seca da folha o contraste um (que compara o

controle com os demais tratamentos micorrizados) e cinco (que compara a

inoculação com S. calospora com os demais tratamentos) para menor dose de

fósforo (60 mg dm-3) apresentaram diferença significativa, indicando que os

tratamentos micorrizados foram superiores ao controle e que a inoculação com

S. calospora produziu maior massa seca de folhas que os demais tratamentos

micorrízicos. Para a maior dose de fósforo (120 mg dm-3), os contrastes um,

quatro (comparação entre A. morrowiae e S. calospora), cinco e seis (que

compara S. calospora com os demais tratamentos micorrizados) expressaram

diferenças significativas. Isso indica que a utilização dos FMAs reduziu a

produção da biomassa foliar em comparação ao controle. Além disso

evidencia-se a redução de biomassa foliar no tratamento inoculado com S.

calospora quando comparado aos demais tratamentos inoculados com FMAs.

Na biomassa total a diferença significativa surge quando a comparação

é feita entre o controle e os tratamentos micorrizados (contraste um) na menor

dose de fósforo (60 mg dm-3), evidenciando o incremento na produção da

biomassa provocada pela inoculação dos FMAs.

Na maior dose de fósforo (120 mg dm-3) a significância aparece nos

contrastes quatro, que compara o inóculo A. morrowiae com o S. calospora,

cinco, que realiza comparação entre S. calospora com os demais tratamentos e

seis, que compara o inóculo de S. calospora somente com os tratamentos

micorrizados. A interpretação dessas estimativas é a de que o tratamento

inoculado com S. calospora não provocou aumento na biomassa das plantas

de M. x piperita var. citrata quando comparado aos demais. O conceito de um

contínuo que vai do benefício ao prejuízo para a associação micorrízica

(JOHNSON et al., 1997), é baseado na ausência de resposta do crescimento

causada pelo custo da simbiose que supera os benefícios. Nesse caso, a baixa

absorção de P da solução do solo via hifas do FMA e a alta demanda por

carboidratos do fungo provocaria o reduzido crescimento da planta. Essa é

uma hipótese que poderia explicar a pequena produção de biomassa nas

plantas de M. x piperita var. citrata inoculadas com S. calospora na dose de

fósforo de 120 mg dm-3.

35

Entretanto, vale salientar que o fungo não pode ser taxado simplesmente

de parasita, por que a via fúngica de absorção de P é funcional, embora varie

na quantidade do elemento repassado ao vegetal de acordo com a espécie

fúngica (SMITH et al., 2011) e por que diversos outros benefícios podem ser

provocados pela inoculação micorrízica (SMITH; READ, 2008).

Diversos trabalhos comprovam que a micorrização aumenta a

produtividade da massa vegetal de plantas medicinais, como observado por

Karagiannidis et al. (2011) em condições controladas para plantas de orégano

e menta. Para o gênero estudado, Freitas et al., (2006) observaram que plantas

de Mentha arvensis inoculadas com FMAs na ausência de adubação fosfatada

apresentaram acréscimo na produção de biomassa superior às plantas

inoculadas e adubadas com fósforo. Outra informação importante foi a

publicada por Rasouli-Sadaghiani et al. (2010) em pesquisa com plantas

micorrizadas de Ocimum basilicum L., outra espécie produtora de óleo

essencial, as quais apresentaram não somente incremento na biomassa seca,

mas também aumento na altura da planta e massa seca da raiz quando

comparadas ao controle não micorrizado. O aumento da biomassa é,

provavelmente, consequência da melhoria do estado nutricional da planta

micorrizada, em que hifas extracelulares expandem a superfície de contato da

planta com o solo colonizando sítios antes não atingidos pela raiz e assim

otimizando a absorção de nutrientes (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

36

1.3.2 Teor dos nutrientes

Houve interação entre os FMAs inoculados e as doses de P adicionadas

ao solo para o teor do potássio, cobre e manganês na folha de M. x piperita.

Para o enxofre apenas a inoculação dos fungos micorrízicos influenciou

significativamente. Para o teor de cálcio e de ferro na folha somente a dose de

P propiciou diferenças entre os tratamentos. Já o teor de fósforo na folha

apresentou diferenças significativas para as doses de P e inoculação de FMAs

separadamente não havendo interação entre esses dois fatores. Os teores de

magnésio e zinco na folha não foram significativamente influenciados pela

adubação fosfatada e inoculação dos FMAs (Tabela 7), entretanto nos

desdobramentos das estimativas dos contrastes, foram observadas diferenças

significativas no teor de Zn e Mg foliares entre os tratamentos.

Os valores médios para os teores de macro e micronutrientes nas folhas

de Mentha x piperita var. citrata inoculadas com FMAs e submetidas as duas

doses de P (60 mg e 120 mg dm-3) podem ser observados na Tabela 8.

37

Tabela 7. Resumo da análise de variância para o teor dos macro e micronutrientes das folhas de Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo


K P S Ca Mg Fe Zn Cu Mn

FMA 4 30, 87* 0,40* 15,27* 2,62 1,70 771,88 96,52 3,09 2100,21*

Dose 1 51,05* 1,61* 0,457 5,79* 0,23 1794,1* 98,89 17,52* 396,03

FMA*Dose 4 21,16* 0,07 11,98 3,22* 0,88 746 15,86 7,79* 5028,2*

Erro 20 5,20 0,058 4,52 1,28 0,64 371,6 46,46 1,34 600,36

Média Geral 32,22 2,09 10,03 9,81 5,54 131,6 45,01 8,56 243,23

CV (%) 7,08 11,53 21,19 11,55 14,54 14,65 15,14 13,55 10,07


Tabela 8. Valores médios do teor de macro (em g kg-1) e de micronutrientes (em mg kg-1) das folhas de Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

FMA Dose K P S Ca Mg Fe Zn Cu Mn

C P60 31,53 1,58 11,22 8,62 4,89 111,3 43,6 8,56 229,7

C P120 32,38 1,83 7,24 8,95 5,05 122,6 43,55 7,88 302,7

Am P60 30,28 1,85 11,11 8,70 5,21 132 42,01 8,01 261,3

Am P120 33,09 2,36 12,39 10,56 6,06 126 40,76 7,98 254,7

Gc P60 28,32 1,75 6,31 9,30 5,25 132,6 55,95 7,72 224,67

Gc P120 33,04 2,54 10,07 10,68 4,95 121 47,65 8,68 233

Sc P60 32,08 1,79 8,59 11,46 6,94 171 45,76 10,62 252,67

Sc P120 27,97 2,35 9,50 9,41 5,83 122 40,76 6,66 229,3

M P60 32,57 2,28 11,86 9,41 5,46 149,6 46,86 11,74 266

M P120 39,52 2,59 11,39 11,46 6,37 127,7 43,29 7,82 178,3

C = Controle não inoculado; Am= Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3; P120 = 120 mg dm

-3. n = 3.

38

De acordo com as estimativas do contraste um, que compara o controle

com os demais tratamentos micorrizados (Tabela 9), a utilização dos inóculos

aumentou a absorção de fósforo e de enxofre em comparação ao controle na

maior dose de fósforo (120 mg dm-3). No entanto, o contraste dois (comparação

entre os inóculos separados com a mistura) mostrou que a utilização dos

inóculos em conjunto aumentou a absorção do P e de S na menor dose de

fósforo (60 mg dm-3) comparativamente aos inóculos utilizados em separado.

Na maior dose de P (120 mg dm-3), o contraste dois (comparação entre

os inóculos separados com a mistura) indicou que a utilização dos inóculos em

conjunto aumentou a absorção do K comparativamente aos inóculos aplicados

em separado.

Na menor dose de P (60 mg dm-3) o teor de S nas folhas de M. x piperita

foi maior nos tratamentos inoculados com A. morrowiae e com S. calospora

comparado com o tratamento inoculado com G. clarum, como ilustra o

contraste três.

A absorção de potássio foi significativamente baixa para o tratamento

com S. calospora na maior dose de fósforo (120 mg dm-3) quando comparada

A. morrowiae (contraste quatro), na comparação com os demais tratamentos

(contraste cinco) e quando comparada com os tratamentos que receberam

adição dos inóculos de FMAs (contraste seis). Porém o inóculo de S. calospora

na menor dose de fósforo (60 mg dm-3) aumentou o teor de cálcio e magnésio

na folha de M. x piperita quando comparada com as plantas inoculadas com A.

morrowiae como pode ser observado no contraste quatro, quando comparado

aos demais tratamentos (contraste cinco) e quando comparado somente com

os tratamentos que receberam adição de FMA (contraste seis).

O contraste sete (comparação entre A. morrowiae versus G. clarum) foi

significativo apenas no teor de enxofre na menor dose de P (60 mg dm-3),

evidenciando que o inóculo de A. morrowiae é mais eficiente em promover a

absorção desse nutriente.

39

Com relação aos micronutrientes (Tabela 9) o contraste um (que

compara o controle com os tratamentos micorrizados) mostra que os FMAs

aumentaram a absorção de ferro com a menor dose de fósforo (60 mg dm-3),

comportamento inverso foi observado com relação à absorção de manganês

onde o controle mostrou-se mais eficiente na maior dose de P (120 mg dm-3). A

utilização dos isolados individualmente quando comparada com a mistura de

FMAs (contraste dois) reduziu a absorção de cobre na menor dose de fósforo

(60 mg dm-3). As espécies de FMAs inoculadas individualmente (contrate dois)

aumentaram a absorção de manganês quando comparadas ao tratamento

inoculado com a mistura de FMAs. S. calospora incrementou a absorção de

ferro e cobre (contraste quatro e cinco) e somente o cobre (contraste seis) na

menor dose de P (60 mg dm-3), já G. clarum (contraste três e sete) aumentou a

absorção de zinco também na menor dose de P (60 mg dm-3).

40

Tabela 9. Estimativas dos contrastes ortogonais para o teor de macro e micronutrientes nas folhas de Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

Contrastes K P S Ca Mg Fe Zn Cu Mn

P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120 P60 P120

(1) C vs.

demais

0,71 -1,02 -0,33 -0,62* 1,74 -3,59* -1,09 -1,57 -0,82 -0,74 -35,00* -1,50 -4,06 0,43 -0,96 0,10 -21,5 78,83*

(2) Am, Gc

e Sc vs. M

-2,34 -8,15* -0,48* -0,17 -3,18* -0,73 0,41 -1,23 0,34 -0,75 -4,44 -4,66 1,04 -0,23 -2,95* -0,04 -19,7 60,66*

(3) Am e

Sc vs. Gc

2,86 -2,50 0,07 -0,18 3,54* 0,88 0,78 -0,69 0,82 0,99 18,83 3,00 -12,05* -6,88 1,59 -1,35 32,33 9,00

(4) Am vs.

Sc

-1,79 5,11* 0,06 0,005 2,51 2,89 -2,75* 1,15 -1,73* 0,23 -39,00* 4,00 -3,75 -0,003 -2,61* 1,31 8,66 25,33

(5) Sc vs.

demais

1,40 -6,53* -0,07 0,02 -1,53 -0,77 2,45* -1,00 1,74* 0,21 39,58* -2,33 -1,33 -3,05 1,61* -1,42 7,25 -12,83

(6) Sc vs.

Am, Gc e

M

1,68 -7,24* -0,17 -0,14 -1,16 -1,78 2,32* -1,49 1,63* 0,03 32,88* -2,88 -2,51 -3,13 1,46 -1,49 2,00 7,33

(7) Am vs.

Gc

1,96 0,04 0,10 -0,18 4,80* 2,33 -0,59 -0,12 -0,04 1,11 -0,66 5,00 -13,93* -6,89 0,29 -0,70 36,66 21,66

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3

; P120 = 120 mg

dm-3

. *significativo a 5 % de probabilidade do teste t.

41

Geralmente os FMAs melhoram a captação de nutrientes para o vegetal,

mas a eficiência da absorção de cada um dos elementos depende de

mecanismos intrínsecos da interação planta e FMAs (ORTAS, 2010; GUPTA et

al., 2002; SAILO; BAGYARAJ, 2005).



mobilidade (MARSCHNER, 1995). Neste grupo situam-se primordialmente o

macronutriente fósforo e os micronutrientes zinco e cobre (CARDOSO et al.,

2010). A explicação mais aceita é a de que as micorrizas exploram uma área

maior de solo, em relação às raízes (CARDOSO et al., 2010). Porém as

micorrizas podem ser mais do que simplesmente uma extensão do sistema

radicular, contribuindo na absorção de nutrientes pela planta em até 80% de

fósforo, 60% de cobre, 25% de nitrogênio, 25% de zinco e 10% de K

(MARSCHNER; DELL, 1994).

Plantas respondem de maneira diferente à micorrização, e diferentes

espécies de fungos micorrízicos induzem efeitos diversos, não somente no

nível de colonização, mas também na absorção de nutrientes e crescimento do

vegetal. Em alguns casos a resposta molecular e fisiológica da planta ao fungo

pode ser explicada pela habilidade do fungo em suprir o hospedeiro com

fosfato inorgânico (BURLEIGH, et al., 2002; BURLEIGH; BECHMANN, 2002).

A análise do solo, no fim do experimento (Tabela 10), indica que os

tratamentos com a maior dose de superfosfato simples apresentaram maiores

concentrações de P solúvel no solo comparativamente com o solo que recebeu

a menor dose de superfosfato, confirmando o estabelecimento do tratamento

de fósforo.

42

Tabela 10. Características químicas finais (depois do experimento) do Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação Experimental da

Almada, localizada no município de Uruçuca, BA


CaCl2 g dm-3 mg dm-3 -------------------------mmolc dm-3--------------------------- % mg dm-3

C-P60 6,0 19 27 1,6 33 27 0 13 61,6 74,8 82 0,69 1,0 52 3,8 3,7

CP-120 5,8 19 50 1,7 39 23 0 18 63,6 81,8 78 0,78 1,4 86 5,0 4,1

Am-P60 6,3 16 25 1,4 29 23 0 15 52,5 67,2 78 0,65 1,0 44 2,2 3,3

Am-P120 5,8 18 45 1,1 30 23 0 15 54,4 69,1 79 0,73 0,8 55 5,2 3,6

Gc-P60 6,1 15 21 1,4 27 21 0 13 49,4 62,6 79 0,55 0,8 45 2,9 3,1

Gc-P120 5,5 19 44 1,3 32 24 0 18 56,9 75,1 76 0,74 0,8 81 5,1 3,6

Sc-P60 5,9 18 29 1,7 34 26 0 15 61,8 76,5 81 0,72 0,8 58 3,8 3,4

Sc-P120 5,6 17 41 1,7 25 19 0 16 46,1 62,4 74 0,76 0,8 58 5,2 3,4

M-P60 5,9 15 27 1,3 30 24 0 13 54,9 69,1 81 0,77 0,7 51 4,0 3,3

M-P120 5,5 18 44 1,5 26 19 0 16 46,2 62,6 74 0,81 0,9 81 5,0 3,4

P, K, Ca e Mg = Resina trocadora de íons; Al = titulometria; H + Al = pH SMP; M. O. = dicromato/colorimetria; B = água quente/microndas; Cu, Fe, Mn e Zn = extração

DTPA-TEA pH 7,3.

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3

; P120 = 120 mg

dm-3

.

43

1.3.3 Porcentagem de colonização micorrízica e número de esporos

Houve interação entre a dose de P e os FMAs inoculados em Mentha x

piperita para a colonização micorrízica das raízes, conforme pode ser

observado na Tabela 11. Para a variável número de esporos de FMAs em 50 g

de solo, somente o fator inoculação de FMAs resultou em efeito significativos

(Tabela 11).

Tabela 11. Resumo da Análise de Variância para o número de esporos e porcentagem de colonização micorrízica em Mentha x piperita var. citrata submetida a duas doses de fósforo


Esporos Colonização

FMA 4 13889,08* 1807,5*

Dose 1 13,33 316,03*

FMA*Dose 4 4474,91 338,5*

Erro 20 3391,56 32,25

Média Geral 160,66 32,28

CV (%) 36,25 16,10


Os valores médios do número de esporos em 50 g de solo e da

porcentagem de colonização micorrízica e da presença de estruturas nas

raízes de Mentha x piperita, inoculadas com FMAs e submetidas as duas doses

de P (60 mg e 120 mg dm-3), podem ser observados na Tabela 12.

44

Tabela 12. Número de esporos no solo e porcentagem de colonização micorrízica total e por estruturas fúngicas em Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

C = Controle não inoculado; Am = A. morrowiae; Gc = G. clarum; Sc = S. calospora; M = Mistura; P60 = 60

mg dm-3

de P; P120 = 120 mg dm-3

de P; Arb = Arbúsculo; H. intra = Hifa intracelular; H. extra = Hifa

extracelular; Ves. = Vesícula. n = 3

Os tratamentos controle apresentaram uma pequena contaminação, no

entanto a colonização nos tratamentos micorrízicos foi significativamente

superior. Dentro da menor dose de fósforo (60 mg dm-3) somente o contraste

dois (comparação entre os inóculos utilizados separadamente e a mistura

deles) não foi significativo (Tabela 13). S calospora apresentou maior

colonização como demonstrado nos contrastes quatro (comparação entre A.

morrowiae versus S. calospora), cinco (comparação entre S. calospora e

demais tratamentos) e seis (que compara o inóculo de S. calospora versus os

tratamentos que receberam adição de FMAs). A. morrowiae apresentou

porcentagem de colonização micorrízica superior a G. clarum (contrastes três e

sete).

Para a maior dose de fósforo (120 mg dm-3), além do contraste um, a

significância apareceu nos contrastes dois, três, cinco e sete, demonstrando

que os inóculos separados apresentaram porcentagem de colonização maior

FMA Dose Nº esporos Total Arb H. intra H. extra Ves. Esporo

C P60 55,6 7,13 4,25 1,89 0 0,97 0

C P120 110,6 3,93 0,99 0,95 1,99 0 0

Am P60 151,3 47,99 37,99 8,22 1,11 0 0

Am P120 195,6 37,35 26,66 10,68 0 0 0

Gc P60 249,3 32,44 25,91 6,52 0 0 0

Gc P120 181,3 50,37 27,68 22,19 0 0 0

Sc P60 184,3 59,73 25,55 4,69 28,53 0 0,46

Sc P120 137 40,93 20,39 14,16 4,34 0 2,02

M P60 166 45,35 24,96 9,80 11,25 1,88 0

M P120 175,3 27,6 16,34 1,61 8,05 0,52 0,52

45

(contraste dois) e que os inóculos de G. clarum foi o FMA que obteve a

porcentagem de colonização mais expressiva (contraste três e sete) seguida

por S. calospora (contraste cinco).

Tabela 13. Estimativas dos contrastes ortogonais para o número de esporos e para a porcentagem de colonização micorrízica Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

Contrastes Esporos Colonização

P60 P120 P60 P120

(1) C vs. Demais -132,08* -61,66 -39,24* -35.13*

(2) Am, Gc e Sc vs. M 29 -4 1,36 15,28*

(3) Am e Sc vs. Gc -81,5 -15 21,42* -11,22*

(4) Am vs. Sc -33 58,66 -11,73* -3,58

(5) Sc vs. demais 28,75 -28,75 26,49* 11,12*

(6) Sc vs. Am, Gc e M -4,55 -47,11 17,79* 2,49

(7) Am vs. Gc -98 14,33 15,55* -13,02*

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora

calospora; M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3

; P120 = 120 mg dm-3

. *significativo a 5 % de

probabilidade do teste t

A concentração de nutrientes principalmente do fósforo pode reduzir a

taxa de colonização, mas a interação linhagens de fungo versus planta é o

principal fator dessa alteração, pois diferentes FMAS comportam-se de maneira

diferente conforme observado por outros autores (FREITAS, et al., 2006;

COPETTA et al., 2006). O aumento na concentração de fósforo pode inibir a

incidência de colonização, mas nunca impedir. Dentre os motivos acredita-se

que com o aumento das doses de P diminui a atividade de fosfatases nas

raízes, em consequência as lecitinas presentes nestas raízes ficam livres e

ligam-se a carboidratos do fungo micorrízico, dificultando o seu crescimento.

Além disso, elevadas doses de fósforo pode aumentar a biossíntese de

fosfolipídeos e, como consequência, a permeabilidade celular, a exsudação

radicular de açúcares e aminoácidos, a infecção e a colonização radicular são

diminuídas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).

46

Os arbúsculos foram as estruturas mais abundantes em todos os

tratamentos, independente da dose indicando que todos os tratamentos

formaram simbioses funcionais. As hifas intracelulares obtiveram maiores

porcentagens nos tratamentos micorrizados com exceção da mistura dos

inóculos, já as hifas extracelulares tiveram maior desenvolvimento na menor

dose de fósforo, com exceção do inóculo G. clarum. Vesículas e esporos foram

as estruturas com menor incidência e podem ser observadas na Fig. 1.

47

E F

A B

C D

Figura 1. Imagens de raízes coradas pelo método de Phillips e Haymann mostrando a

morfologia das micorrizas encontradas em Mentha x piperita var. citrata. A. Vista geral

de um segmento de raiz sem colonização. B. Vista geral de um segmento de raiz

altamente colonizado. C. Detalhe do segmento de raiz com hifas intra e extra celular

(ponta da seta). D. Os arbúsculos (pontas das setas) bastante ramificados, presentes

no interior das células. E. Vesícula (ponta da seta) e hifas intraradiciais colonizando

segmento de raiz. F. Esporos de fungo micorrízico arbuscular formados pelas hifas.

A B

C D

E F

48

Morfologicamente as micorrizas de Mentha x piperita var. citrata

apresentaram semelhança aos da série Arun (Fig. 1), a qual predomina na

maioria das angiospermas herbáceas (SMITH; SMITH, 1997). Nesse tipo

micorrízico ocorre frequentemente arbúsculos bem desenvolvidos, os quais são

as estruturas onde ocorre a troca de nutrientes entre o fungo e a planta

(SMITH; READ, 1997). Vesículas intracelulares, que são características da

subordem Glomineae (MORTON et al, 1996) também foram observadas (Fig.

1). Nessas vesículas ocorre o armazenamento de lipídios, fonte de reserva

para desenvolvimento do fungo micorrízico.

1.4 CONCLUSÕES

Os FMAs incrementaram a produção de biomassa seca da raiz, caule,

folha e total na dose de 60 mg dm-3 P adicionada ao solo.

Para a colonização micorrízica G. clarum apresentou a maior

porcentagem na maior dose, enquanto S. calospora obteve a maior

colonização na menor dose de P aplicada.

Os tratamentos micorrízicos e as doses de fósforo influenciaram na

absorção de macro e micronutrientes nas folhas de Mentha x piperita.

REFERÊNCIAS

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49

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52

2. Capítulo II - INFLUÊNCIA DE FUNGOS MICORRÍZICOS

ARBUSCULARES NO TEOR, RENDIMENTO E COMPOSIÇÃO DO ÓLEO

ESSENCIAL DE MENTHA X PIPERITA L. VAR. CITRATA (EHRH.) BRIQ.

CULTIVADA COM DUAS DOSES DE FÓSFORO

RESUMO

As plantas medicinais assim como os demais organismos recebem influencia de fatores externos e dentre estes a colonização por fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) nas células radiculares é capaz de aumentar a sua produtividade. No caso das plantas aromáticas, os FMAs podem afetar principalmente o rendimento de óleo essencial, inclusive alterar a sua composição química. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência dos fungos micorrízicos arbusculares e de duas doses de fósforo na produção do óleo essencial em Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Universidade Estadual de Santa Cruz em fatorial 5x2, sendo cinco tratamentos (controle não inoculado, inoculação de Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck, e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand., e a mistura desses inóculos) e duas doses de fósforo (60 mg e 120 mg de fósforo por dm3 de solo) com cinco repetições cada. Após 75 dias as plantas foram coletadas e avaliadas quanto a biomassa de folhas, teor, rendimento e composição do óleo essencial. A inoculação com FMAs aumentou o teor e o rendimento do óleo na menor dose de fósforo. Os inóculos utilizados separadamente foram mais eficientes do que a mistura dos fungos no incremento do teor e do rendimento do óleo essencial na dose maior de fósforo e a espécie G. clarum elevou significativamente o rendimento do óleo quando a dose de 120 mg dm-3 de P foi aplicada ao solo. A colonização com FMAs não alterou a composição do óleo essencial, que teve como componentes majoritários o linalol e o acetato de linalol, mas houve alterações quantitativas (percentuais) dos componentes do óleo essencial de Mentha x piperita var. citrata.

Palavras-chave: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Planta medicinais, Linalol, Acetato de linalol.

53

ABSTRACT

Medicinal plants as well as other plants receive influence of external factors and among these the colonization by arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in root cells is able to increase the productivity of plant and essential oil producing plants primarily affect the oil yield and in some cases can affect the chemical composition. The aim of this study was to evaluate the influence of mycorrhizal fungi and two phosphorus levels in the production of essential oil on Mentha x piperita L. var. citrata (Ehrh.) Briq. The experiment was conducted in a greenhouse at the Universidade Estadual de Santa Cruz in a 5x2 factorial design, with five treatments (uninoculated control, inoculation with Acaulospora morrowiae Spain & Schenck, Glomus clarum Nicol. & Schenck, e Scutellospora calospora (Nicol. & Gerd.) Walk. & Sand. and the mixture of inoculum) and two doses of phosphorus (60 mg and 120 mg of phosphorus per dm-3 soil) with five replicates each. After 75 days the plants were collected and evaluated for leaf biomass, and content, yield and essential oil composition. Inoculation with AMF increased the content and oil yield at the lowest dose of phosphorus. Inoculums used alone were more effective than the mixture of fungi in increasing the content and yield of essential oil in the higher dose of phosphorus, and G. clarum significantly increased oil yield when 120 mg dm-3 of P was applied to the soil. The mycorrhizal colonization did not alter the essential oil composition, which had as its major components linalool and linalool acetate, but there were quantitative changes (percentages) of essential oil components of Mentha x piperita var. citrata.

Keywords: Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Medicinal plant, Linalool, Acetato de Linalool.

54

2.1 INTRODUÇÃO

O gênero Mentha é um dos mais importantes dentro família Lamiaceae,

e seu uso é amplamente difundido devido a sua adaptabilidade a diferentes

condições, ao ciclo vegetativo anual e à quantidade de informações já

existentes sobre suas características, desde anatômicas, bioquímicas,

taxonômicas e agronômicas. Espécies pertencentes a esse gênero enquadram-

se como excelentes produtoras de óleo essencial (MONTEIRO, 2009).

Dentre as espécies incluídas nesse gênero Mentha x piperita L. var.

citrata (Ehrh.) Briq. ou hortelã-limão, como é conhecida popularmente, vem

alcançando merecido destaque. Contrário a maioria das mentas, possui como

composto principal do seu óleo essencial o linalol e o acetato de linalila

(GARLET, 2007; MURRAY; LINCOLN, 1970). A presença desses compostos

aumenta o interesse econômico pela espécie, pois são utilizados nas indústrias

de perfumaria, cosmética, de alimentos, medicamentos, fragrâncias e tabaco,

principalmente como aromatizante e flavorizante de alimentos e na confecção

de perfumes (GARLET, 2007). Além disso, ecologicamente estes componentes

estão associados à defesa da planta contra patógenos e herbívoros, e à

atração de polinizadores (CROTEAU et al., 2000).

De toda a produção mundial de óleo essencial, as espécies do gênero

Mentha são as maiores contribuintes, geralmente sendo o mentol o composto

de maior interesse. No entanto, as espécies produtoras de linalol vem

ganhando mercado. Linalol é um dos compostos mais usados em fragrâncias e

estima-se que esteja presente em 60-90 % dos cosméticos existentes no

mercado (GARLET, 2007). Sua produção vem aumentando ano após ano,

devido a sua utilização não somente na indústria de perfumaria, mas também

na produção de vitaminas (STEFFANI et al., 2006).

A biossíntese de óleo essencial em plantas aromáticas é regulada por

diversos fatores, que podem ser genéticos, bioquímicos, fisiológicos e de

origem metabólica. A regulação fisiológica além de ser exercida por um padrão

de desenvolvimento específico é influenciada por fatores ambientais

(SANGWAN et al., 2001). Dentre estes fatores, pode-se ressaltar a interação

entre planta e fungos micorrízicos arbusculares (FMAs), que nas raízes de

55

plantas medicinais e aromáticas que pode influenciar na produção de princípios

ativos através da melhoria do estado nutricional, ou como resposta do fitobionte

ao fungo (MORAIS, 2009; VOLPIN et al., 1994).

A simbiose micorrízica arbuscular tem um importante potencial

biotecnológico e ecológico. Seu maior benefício diz respeito à absorção de

nutrientes no solo principalmente daqueles que possuem baixa mobilidade

como o fósforo, zinco e cobre (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). A ocorrência e o

funcionamento das micorrizas recebe influencia direta ou indireta de fatores

ambientais, podendo ser geralmente menor em condições de elevada

fertilidade pois a taxa de colonização micorrízica intrarradical apresenta uma

diminuição drástica com altos níveis de fósforo no solo (MOREIRA; SIQUEIRA,

2006; CARDOSO et al., 2010).

Dentre os fatores que podem interferir no teor e no rendimento do óleo

essencial em plantas medicinais, a micorrização merece destaque, pois

participa diretamente do processo de captação de nutrientes cuja deficiência ou

excesso pode intervir na quantidade e qualidade do óleo (MORAIS, 2009). O

objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito dos fungos micorrízicos

arbusculares sob duas doses de fósforo no teor, rendimento e composição do

óleo essencial de Mentha x piperita var. citrata.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no campus da

Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – BA, sob condições naturais de

luminosidade e temperatura. O delineamento experimental foi constituído por

um fatorial 5x2, sendo utilizados três inóculos de FMA: Acaulospora morrowiae

(Am) Spain & Schenck (A79 CNPAB 037), Glomus clarum (Gc) Nicol. &

Schenck (A5 CNPAB 005) e Scutellospora calospora (Sc) (Nicol. & Gerd.)

Walk. & Sand. (A80 CNPAB 038). além de um controle formado por plantas

não inoculadas (C) e um tratamento com a mistura de todos os três inóculos

(M), perfazendo um total de cinco tratamentos micorrízicos, e duas doses

diferentes de fósforo 60 mg (P60) e 120 (P120) mg dm-3 com cinco repetições

cada. A unidade experimental foi composta por um vaso de plástico de cinco

56

litros contendo quatro dm3 de solo e uma planta por vaso. Os inóculos foram

cedidos pela Coleção de Fungos Micorrízicos da Embrapa Agrobiologia

(Seropédica, RJ).

O solo utilizado no experimento foi um argissolo amarelo distrófico típico,

coletado da camada de 0 a 20 cm em área de pastagem de Brachiaria

humidicola com remanescente de dendê na Estação Experimental do Almada

(39º10’ W e 14º38’ S), localizada em Uruçuca (BA) e pertencente à

Universidade Estadual de Santa Cruz. O solo foi seco ao ar e tamisado em

peneira com malha de 5 mm e suas características químicas (Tabela 1) e

físicas (Tabela 2) foram determinados (Embrapa, 1997). Esse solo foi

autoclavado por uma hora a 121 °C e 1,5 atm por dois dias consecutivos para

esterilização.

Com o solo coletado foi realizada uma curva de incubação usando cinco

doses de calcário dolomítico com PRNT de 82,02 %. Os resultados foram

analisados por regressão para ajustar o pH em torno de 6,5. Além do calcário,

que também serviu de fonte para o cálcio e o magnésio, o solo contido nos

vasos recebeu uma adubação individual com base na análise do solo, na

produtividade da espécie e no comportamento do fungo, constituída por 100

mg dm-3 de nitrogênio na forma de sulfato de amônio; duas doses de fósforo 60

e 120 mg dm-3 como superfosfato simples; 80 mg dm-3 de potássio sob a forma

de cloreto de potássio; 1,55 mg dm-3 de ferro na forma de Ferro EDTA; 0,75 mg

dm-3 de boro na forma de ácido bórico; 1,33 mg dm-3 de cobre sob a forma de

sulfato de cobre; 0,15 mg dm-3 de molibdênio na forma de molibdato de amônio;

4 mg dm-3 de zinco e de manganês na forma de sulfato de zinco e sulfato de

manganês, respectivamente. A adubação foi subdividida em duas partes, uma

anterior a autoclavagem onde foi adicionado ao solo o calcário, o superfosfato

simples, cloreto de potássio em solução e os micronutrientes (boro, cobre,

molibdênio, zinco e manganês) também em solução e outra posterior à

autoclavagem que recebeu a adição do nitrogênio sob forma de solução

preparada com água autoclavada e o ferro, também em solução que foi

autoclavada separada. Antes da transferência do solo para os vasos, estes

foram lavados com água e desinfestados superficialmente com etanol 70 % e

com hipoclorito de sódio comercial (2 a 2,5 %).

57

Tabela 1. Características químicas iniciais (antes do início do experimento) do Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação Experimental da Almada, localizada no município de Uruçuca, BA


CaCl2 g dm-3 mg dm-3 -------------------------mmolc dm-3--------------------- % ----------------------mg dm-3--------------------

Solo inicial 4,0 17 ˂ 2 0,4 5 3 5,4 47 7,9 54,8 14 0,49 ˂ 0,3 171 2,0 0,9

P, K, Ca e Mg = Resina trocadora de íons; H + Al = pH SMP; M. O. = dicromato/colorimetria; B = água quente/microndas; Cu, Fe, Mn e Zn = extração DTPA-TEA pH 7,3.

Tabela 2. Características físicas iniciais (antes do início do experimento) do Argissolo Amarelo Distrófico típico coletado na Estação Experimental do Almada, localizada no município de Uruçuca, BA

Amostra Areia grossa Areia fina Areia total Silte Argila

Classificação textural ------------------------------------------------g kg-1--------------------------------------------------

Solo inicial 142 720 861 13 125 Arenosa

58

A propagação da Mentha x piperita L. var. citrata foi realizada por via

vegetativa. Estacas apicais com aproximadamente 5 cm de comprimento foram

obtidas junto ao Horto de Plantas Medicinais da Universidade Estadual de Santa

Cruz, Ilhéus-BA, e colocadas para enraizar em bandejas de polipropileno com

substrato areia e vermiculita (2:1) autoclavado por uma hora a 121 °C e 1,5 atm,

onde permaneceram por quatorze dias até o transplante.

No transplante, os inóculos de FMAs foram concomitantemente adicionados

ao solo junto das raízes e, por fim, pedriscos autoclavados por 20 minutos a 121 °C

e 1,5 atm foram colocados para diminuir a superfície de contato do solo com o ar e

minimizar as possíveis contaminações. Durante a condução do experimento as

plantas foram irrigadas com água deionizada autoclavada.

2.2.1 Determinação da biomassa

Após 75 dias de cultivo em casa de vegetação as folhas das plantas foram

coletadas e secas a 40 °C em estufa de circulação forçada e posteriormente foram

pesadas em balança semi-analítica até peso constante para a obtenção da

biomassa foliar, utilizada para o cálculo do rendimento.

2.2.2 Determinação do teor, rendimento e composição química do óleo

essencial

O óleo essencial foi extraído com aparelho de Clevenger modificado utilizando

de 2 a 3,6 g de biomassa seca foliar em 400 ml de água por uma hora com quatro

repetições por tratamento, proveniente de uma amostragem composta de todas as

repetições referente a cada tratamento.

O teor do óleo foi determinado com base no peso do óleo extraído do material

vegetal seco (% m/m) em balança analítica. O rendimento do óleo foi calculado por

meio do teor multiplicado pelo valor médio de biomassa seca foliar da planta (mg por

planta).

59

Os óleos foram caracterizados quimicamente pelo índice de refração (IR), e

posteriormente por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa

de alta resolução (CGAR). Os diversos constituintes químicos dos óleos essenciais

foram identificados por meio da comparação computadorizada com a biblioteca do

aparelho, literatura e índice de retenção de Kovats (ADAMS, 1995). Os índices de

retenção de Kovats (IK) foram calculados através da injeção de uma série de

padrões de n-alcanos (C8-C26) injetados nas mesmas condições cromatográficas

das amostras.

2.2.3 Análise estatística

Todos os dados foram submetidos à análise de variância, os tratamentos

fosfatados foram comparados pelo teste de F a 5% de probabilidade. Para as

médias dos tratamentos fúngicos foi utilizado o teste t de contrastes ortogonais

(Tabela 3) a 5% de probabilidade. No caso de significância da interação FMA x dose

de fósforo foi realizado o seu desdobramento. As análises estatísticas foram

realizadas pelo programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000).

Tabela 3. Descrição dos contrastes ortogonais para a avaliação da influencia de FMAs em Mentha x piperita var. citrata submetida a duas doses de fósforo

Contraste ortogonais Comparação

Ŷ1 = 4 1m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 4m̂ - 5m̂ Controle vs. Demais - contraste um (1)

Ŷ2 = 2m̂ + 3m̂ + 4m̂ - 3 5m̂ A. morrowiae, G. clarum, S. calospora vs.

Mistura dos inóculos - contraste dois (2)

Ŷ3 = 2m̂ + 4m̂ - 2 3m̂ A. morrowiae e S. calospora vs. G. clarum -

contraste três (3)

Ŷ4 = 2m̂ - 4m̂ A. morrowiae vs. S. calospora - contraste

quatro (4)

Ŷ5 = 4 4m̂ - 1m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 5m̂ S. calospora vs. demais – contraste (5)

Ŷ6 = 3 4m̂ - 2m̂ - 3m̂ - 5m̂ S. calospora vs. A. morrowiae, G. clarum e

mistura dos inóculos – contraste (6)

Ŷ7 = 2m̂ - 3m̂ A. morrowiae vs. G. clarum – contraste (7)

60

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Houve interação entre os FMAs e as doses de fósforo para as variáveis

biomassa seca foliar, teor e rendimento do óleo essencial (Tabela 4).

Tabela 4. Resumo da Análise de Variância para as variáveis biomassa, teor e rendimento de óleo de Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

FV GL Quadrado médio

Biomassa Teor Rendimento

FMA 4 0,59* 0,51* 549,31*

Dose P 1 0,46 0,31 14,67

FMA*Dose P 4 1,02* 0,41* 930,39*

Erro 20 0,15 0,12 61,91

Média Geral 2,82 2,23 62,44

CV (%) 13,87 16,09 12,60

*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F

Os valores médios para a biomassa seca, para o teor e rendimento do óleo

essencial de Mentha x piperita var. citrata inoculadas com FMAs e submetidas as

duas doses de P (60 mg e 120 mg dm-3) podem ser observados na Tabela 5.

Tabela 5. Valores médios da biomassa seca das folhas, do teor e do rendimento do óleo essencial extraído das folhas de Mentha x piperita var. citrata por hidrodestilação

FMA Dose Biomassa (g) Teor (%) Rendimento (mg planta-1)

C P60 2,33 1,58 36,89

C P120 3,36 2,08 69,89

Am P60 2,93 2,46 71,98

Am P120 3,35 1,85 61,98

Gc P60 2,74 2,46 67,31

Gc P120 3,19 2,59 82,73

Sc P60 2,32 2,65 61,65

Sc P120 2,04 2,4 43,08

M P60 3,31 2,56 77,85

M P120 2,65 1,76 51,02

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora;

M = Mistura dos inóculos. P60 = 60 mg dm-3

; P120 = 120 mg dm-3

. n = 3

61

De acordo com as estimativas dos contrastes (Tabela 6), na variável

biomassa seca, dentro da menor dose de P (60 mg dm-3), a mistura dos inóculos foi

significativamente superior à utilização dos inóculos separados (contraste dois) e o

tratamentos com A. morrowiae, G. clarum e a mistura dos inóculos foi superior ao

tratamento com S. calospora (contraste seis) . Já na maior dose de fósforo (120 mg

dm-3), o contraste um (comparação entre o controle e os demais tratamentos), o

contraste quatro (comparação entre o A. morrowiae e S. calospora), o cinco

(comparação entre o FMA S. calospora versus os demais tratamentos) e o contraste

seis (que compara o S. calospora com os tratamentos micorrizados) apresentaram

diferença significativa, mostrando que o controle apresentou massa seca superior

aos tratamentos micorrizados, e que o FMA S. calospora obteve resultado inferior

para esse parâmetro.

Para o teor as estimativas de contrastes (Tabela 6) apresentaram

significância apenas para o contraste um na dose de 60 mg de fósforo por dm3 que

compara o controle não inoculado com os demais tratamentos micorrizados, e nos

contrastes dois e sete na dose de 120 mg de fósforo, a primeira comparação, que

corresponde ao contraste dois, é entre os inóculos utilizados separados versus a

mistura de todos os inóculos e o contraste sete compara o FMA A. morrowiae com

G. clarum. Sendo assim, os tratamentos micorrizados se mostraram mais eficientes

na produção de óleo, comparado ao controle não micorrizado, dentro da menor dose

de fósforo (60 mg dm-3 de P), e na maior dose de fósforo (120 mg dm-3) para esse

mesmo parâmetro, os inóculos utilizados separadamente foram mais promissores do

que o tratamento com a mistura dos três inóculos, e G. clarum foi superior a A.

morrowiae.

62

Tabela 6. Estimativas dos contrastes ortogonais para teor e rendimento do óleo essencial de Mentha x piperita var. citrata inoculada com fungos micorrízicos arbusculares e submetida a duas doses de fósforo

Contrastes Biomassa Teor Rendimento

P60 P120 P60 P120 P60 P120

(1) C vs. Demais -0,45 0,73* - 0,94* -0,07 - 32,80* 10,18

(2) Am, Gc e Sc vs. M -0,88* 0,42 - 0,03 0,51* -10,86 11,57*

(3) Am e Sc vs. Gc 0,17 -0,43 0,09 - 0,46 -0,493 - 30,20*

(4) Am vs. Sc 0,60 1,02* - 0,19 - 0,55 10,32 18,89*

(5) Sc vs. demais -0,46 -0,87* 0,38 0,32 -1,85 -23,32*

(6) Sc vs. Am, Gc e M -0,61* -0,73* 0,16 0,33 -10,72 -22,16*

(7) Am vs. Gc 0,48 0,07 0 -0,74* 4,67 -20,75*

C = Controle não inoculado; Am = Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora;

M = Mistura dos inóculos; P60 = 60 mg dm-3

de P; P120 = 120 mg dm-3

. *significativo a 5 % de probabilidade do

teste t.

Alguns trabalhos relatam a influência dos FMA no teor do óleo essencial,

como os realizado por Freitas et al. (2004a) com M. arvensis, e Gupta et al. (2002)

que avaliaram o comportamento de três cultivares de Mentha, e Freitas et al.

(2004b), em seu trabalho com carqueja no qual apesar de não apresentar interação

entre FMA e adubação, a presença de micorrização aumentou a produção de fenóis

totais na carqueja. De uma maneira geral, a colonização de plantas medicinais por

FMA aumenta o teor do óleo essencial, pois os fungos podem majorar as

concentrações dos metabólitos secundários. A frequência e a intensidade com que

isso ocorre dependem muito da interação planta – fungo, como relatado por

Chaudhary et al. (2008) em Artemisia annua, a qual teve o teor do composto

majoritário alterado, sendo que a combinação espécie vegetal e a linhagem de FMA

também provocou variação no metabólito secundário.

Para o rendimento do óleo essencial em M. x piperita var. citrata as

estimativas (Tabela 6) demonstram diferença significativa apenas no contraste um

(comparação entre o controle versus os tratamentos micorrizados) para a menor

dose de fósforo (60 mg dm-3). Esse resultado significa que os tratamentos

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micorrizados elevaram a produção do óleo essencial quando comparados com o

controle.

Na maior dose de P (120 mg dm-3) a significância para o rendimento do óleo

das folhas M. x piperita var. citrata ocorre em praticamente todas as estimativas dos

contrastes, com exceção do contraste um. No contraste dois percebe-se que a

mistura dos inóculos foi menos eficiente em promover o aumento no rendimento do

óleo essencial do que os inóculos de FMAs utilizados separadamente. Já o contraste

três, evidencia que G. clarum incrementou o rendimento do óleo de M. x piperita var.

citrata em comparação aos outros dois inóculos e mais especificamente ao de A.

morrowiae como elucida o contraste sete. Esse comportamento está em

consonância com os dados da colonização micorrízica, onde tratamento micorrizado

com G. clarum na maior dose de fósforo obteve a maior porcentagem de

colonização (ver Capítulo 1).

Os contrastes quatro, cinco e seis, que foram significativos, demonstram que

o menor rendimento do óleo essencial foi obtido no tratamento inoculado com S.

calospora. Essa tendência de baixo rendimento no óleo foi devida a pequena

produção de biomassa das plantas inoculadas com S. calospora.

O acréscimo no rendimento do óleo essencial deve-se geralmente ao

aumento da produção de biomassa, ocasionado neste caso pela melhoria do estado

nutricional da planta hospedeira em função da micorrização. Pesquisa desenvolvida

por Kapoor et al. (2004) mostrou que Foeniculum vulgare Mill. teve o rendimento do

óleo incrementado em todos os níveis de fósforo utilizados para as duas espécies de

Glomus inoculadas.

Foram identificados treze componentes para o óleo essencial de M. x piperita

var. citrata, e apenas dois compostos não foram determinados (Tabela 7). Os

componentes majoritários para todos os tratamentos foram linalol e acetato de

linalol, confirmando as informações encontradas na literatura (MURRAY; LINCOLN,

1970; GARLET, 2007), onde M. x piperita é tida como espécie promissora na

produção de linalol. Além desses componentes outros nove foram identificados com

porcentagens menos expressivas, foram eles: cis-3- pinanona, α- terpineol, nerol,

acetado de nerila, acetato de geranila, cariofileno, γ-gurjuneno, elemol e guaiol.

Na menor dose de fósforo (60 mg dm-3) o tratamento com Glomus clarum

obteve a maior porcentagem de linalol (51 %) em contrapartida apresentou a menor

64

porcentagem de acetato de linalol (24,5 %). Para a maior dose de fósforo (120 mg

dm-3) foi o tratamento com Scutellospora calospora quem obteve a maior

porcentagem de linalol (48 %) e Glomus clarum apresentou a maior porcentagem de

acetato de linalol (37 %).

A maioria dos trabalhos não relata mudança qualitativa na composição do

óleo essencial, mas sim uma alteração quantitativa na porcentagem de alguns

componentes, como foi observado por Copetta et al. (2007) utilizando inóculos de

Gigaspora rosea e G. margarita. Zubek et al. (2010) que detectou uma mudança no

teor de derivados de timol. Karagiannidis et al. (2011) com mudanças nos

componentes principais de espécies de menta e orégano.

Além da presença dos FMAs a adubação fosfatada exerce forte influência

sobre o teor rendimento e composição do óleo essencial como foi proposto por Nell

et al. (2009) e Freitas et al. (2004). No primeiro caso plantas submetidas à adubação

fosfatada tiveram um aumento na concentração de fenóis totais e no segundo caso

os fungos micorrízicos arbusculares e as doses de fósforo influenciaram na

qualidade do óleo com alterações em seu composto majoritário. Sem adubação

fosfatada os FMAs foram benéficos à produção e qualidade do óleo, e com

adubação houve uma tendência à redução do teor e dos componentes majoritários

(FREITAS et al., 2004).

Os mecanismos utilizados pelo fungo que provocam as mudanças nas

concentrações dos compostos fitoquímicos podem ser multidirecionais e não estão

ainda elucidados (TOUSSAINT et al., 2007). Em geral a produção de óleo essencial

é considerada como uma resposta de defesa da planta à colonização pelo FMA, e a

modificação nessa produção pode ser em consequência de mecanismo de

sinalização entre os simbiontes (COPETTA et al., 2006; TOUSSAINT et al., 2007).

O aumento na produção de metabólitos secundários pode envolver vários

processos, e isso pode ser mediado pelo aumento na nutrição de fósforo e de

nitrogênio, por exemplo, causado pelo FMA (KAPOOR et al., 2002; TOUSSAINT et

al., 2007). Além disso, a presença da micorriza pode causar mudanças no nível de

fitormonios do vegetal (COPETTA et al., 2006; KAPOOR et al., 2007).

65

Tabela 7. Índice de Kovats (IK) e concentração relativa em porcentagem dos constituintes químicos do óleo essencial da biomassa seca de folhas de Mentha x piperita var. citrata inoculada com FMA submetida a duas doses de fósforo

Tratamentos fosfatados

60 mg dm-3

120 mg dm-3

Constituintes IK * C Am Gc Sc M C Am Gc Sc M

Linalol 1100 41,06 48,44

51,9 47,37 46,9 42,52 41,55 46,24 48,06 46,77

Cis-3-pinanona 1175 - 0,56

0,58 0,64 0,48 0,45 0,41 0,53 0,41 0,37

α- terpineol 1191 5,65 5,16

6,24 3,99 4,07 4,85 5,06 3,85 4,04 4,42

Nerol 1227 1,94 1,27

1,39 0,88 0,94 1,16 1,31 0,89 0,96 1,15

Acetato de linalol 1259 25,33 29,37

24,56 35,50 35,53 36,03 34,44 37,25 34,01 33,86

ND** - 6,93 4,03

4,35 2,66 2,95 3,65 4,23 2,77 2,94 3,67

Acetato de nerila 1363 1,85 1,50

1,61 1,12 1,10 1,36 1,49 1,05 1,11 1,23

Acetato de geranila 1382 4,42 3,18

3,35 2,32 2,29 2,90 3,20 2,16 2,35 2,64

Cariofileno 1419 1,25 1,36

1,37 1,67 1,43 1,69 1,57 1,47 1,47 1,28

γ- gurjuneno 1479 1,01 0,84

0,72 0,86 0,75 0,95 0,97 0,76 0,81 0,75

Elemol 1546 3,16 1,79

1,55 0,89 1,16 1,54 2,46 0,98 1,38 1,24

ND** - 0,68 - - - - - - - - -

Guaiol 1590 6,68 2,43

2,33 2,05 2,35 2,85 3,25 2,00 2,39 2,56

Total identificado (%) 99,96 99,93

99,95 99,95 99,95 99,96 99,93

99,95 99,95 99,94

*IK obtido em coluna capilar VF5-ms (30m X 0,25mm X 0,25m), com temperatura do injetor e do detector foram 250 e 280 °C, respectivamente; **ND = Não Determinado; C = Controle; Am =

Acaulospora morrowiae; Gc = Glomus clarum; Sc = Scutellospora calospora; M = Mistura.

66

2.4 CONCLUSÕES

Os fungos micorrízicos arbusculares aumentaram o teor e o rendimento

do óleo essencial de Mentha x piperita L. var. citrata quando o solo foi adubado

com 60 mg dm-3 de fósforo.

Os fungos inoculados separadamente foram mais eficientes do que o

tratamento com a mistura das espécies de FMAs em promover o incremento no

teor e no rendimento do óleo na dose 120 mg dm-3 de fósforo.

O fungo Glomus clarum aumentou o rendimento do óleo Mentha x

piperita L. var. citrata com 120 mg dm-3 de fósforo.

O óleo essencial teve como componentes majoritários o linalol e o

acetato de linalol, havendo alteração no percentual dos componentes, mas não

na composição do óleo.

2.5 REFERÊNCIAS

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69

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A associação simbiótica entre FMAs e o sistema radicular de organismos

vegetais é um dos fatores que podem interferir no desenvolvimento das

plantas, normalmente a micorrização aumenta a produtividade do fitobionte, em

plantas produtoras de óleo essencial, além desse benefício, a simbiose pode

influir no rendimento e no teor do óleo essencial. De maneira semelhante o

estabelecimento e a propagação dos FMAs são influenciados por fatores

edáficos, como por exemplo, a disponibilidade de fósforo, o que

consequentemente altera o comportamento do vegetal. Ambas as fontes de

variação (inoculação de FMAs e doses de P) influenciaram de alguma maneira

nos parâmetros avaliados. Tanto os tratamentos fúngicos como as doses de

fósforo influenciaram no teor de macro e micronutrientes nas folhas de Mentha

x piperita var. citrata.

Na menor dose de fósforo (60 mg dm-3), as plantas dos tratamentos

inoculados com FMAs apresentaram maior biomassa (raiz, caule, folha e total),

e maior teor e o rendimento do óleo essencial. Na maior dose de fósforo (120

mg dm-3) tanto o teor como o rendimento do óleo essencial de Mentha x

piperita var. citrata foram mais altos quando os inóculos de FMAs foram

utilizados separadamente.

A interação planta – microrganismo depende de características

intrínsecas inerentes a cada espécie envolvida na interação, os diferentes

FMAs tiveram comportamento distinto em cada dose de fósforo adicionada ao

solo. A inoculação com S. calospora obteve a maior colonização, na menor

dose de P (60 mg dm-3), enquanto que o FMA G. clarum apresentou a

porcentagem de colonização mais expressiva na maior dose de P (120 mg dm-

3) adicionada e foi o tratamento que proporcionou maior rendimento do óleo

essencial de Mentha x piperita L. var. citrata.

O óleo essencial apresentou como componentes majoritários linalol e

acetato de linalol, compostos utilizados como matéria-prima de diversos

70

produtos processados por indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica, o

que torna a utilização de FMAs importante para produção desse composto já

que, em alguns tratamentos fúngicos, a porcentagem de linalol chegou a mais

de 50 % do total de óleo extraído.

O acima exposto comprova a eficiência dos FMAs e indica a utilização

destes como estimuladores da produtividade do vegetal, do teor e rendimento

do óleo essencial, principal produto e fonte de interesse industrial proveniente

de M. x piperita var. citrata.

universidade estadual de santa cruz verÔnica...

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