觀察MK-801誘導的行為過動現象，分析斑馬魚中樞神經系統中早期基因的表現。Analysis immediate early gene (IEG) expression in the CNS of zebrafish in Mk-801 induced motor hyperactivity model.

指導教授 : 呂國棟教授指導研究生 : 吳民聰老師校內指導老師 : 蔡緻怡老師學生 : 曾霓、陳奕君

實驗起源 在國中課本中，我們第一次接觸到了有關於脊椎動物腦部解剖的構造圖。

目前，研究學者利用 MK-801 能夠阻斷鈣離子流入細胞內的現象，成功模擬了引發精神分裂症的可能致病原因。

精神分裂症研究模式

過去，科學家發現，有一些化學物質能夠與 NMDA 接受器結合，並阻斷 NMDA 接受器的功能，最為常見於文獻資料中的藥物就是 MK-801 。

實驗原理神經傳遞物質 --- 麥麩胺（ glutamate ） : 麥麩胺對細胞的影響，是透過活化細胞膜上蛋白接收器

(receptor) ，例如 NMDA 接受器。

接收器活化鈉、鉀、鈣離子流入

引發訊息傳遞

早期基因 : 基因不只是影響了外觀的性狀，當神經細胞感受到外在刺激壓力時，會立即啟動某些特定的基因，這類型的基因我們稱之為「早期基因」，常見的基因包括了 Egr1 、 c-fos 等。

實驗目的(1) 在水中投予 MK-801 藥物，觀察斑馬魚自發性探索行為的表現。(2) 利用半定量聚合酶連鎖反應，觀察

MK-801 藥物是否會改變腦部早期基因的表現。

實驗流程第一階段實驗 ( 動物實驗 )

第二階段實驗 ( 生化分析 )

自發性 探索 自發性 探索30 分鐘 24 小時

浸泡MK-801

浸泡MK-801

犧牲取腦

60 分鐘

實驗動物

六個月以上之成熟斑馬魚個體，體長約三公分左右之大小。實驗期間動物是飼養於師大生命科學系動物房內，飼養環境維持在 28.5℃ ，光週期採 14/10 小時，所有行為實驗均於動物之光週期中進行。

藥物處理 實驗中所使用的藥物是 MK-801

(NMDA 受體拮抗劑 ) ，藥物作用濃度為 20μM 。行為實驗前 30 分鐘，會將斑馬魚浸泡在含上述藥物濃度的溶液（ 300ml）中。而進行生化分析實驗時，則浸泡時間為60 分鐘。

自發性探索行為實驗組

( 投予 MK-801)

對照組

藥物處理的魚

自發性探索行為斑馬魚放置於一個小圓柱體缸子內（直徑 22 公分，高 20 公分），內置 6 公分高的水，缸子上方均勻照明。

6 公分20 公分22 公分

自發性探索行為 動物的移動狀態以影像偵測系統

(Etho Visio)錄影紀錄。實驗中主要觀察的項目為五分鐘內所游動的總移動距離。

影像偵測系統(Etho Visio)

未經藥物處理的移動情形

投予藥物後的移動情形

方法 半定量聚合酶連鎖反應 (Semi-quantitative PCR) 步驟 ( 一 )

利用 Trizol(Invitrogen) 進行斑馬魚全腦 total RNA 的萃取。純化完成的 RNA 會利用反轉錄酵素 (reverse transcriptase) 將組織內總RNA 合成首股 cDNA(first-strand cDNA) 。最後，再利用針對 Egr1及 c-fos 的引子(primer) 進行基因表現的分析。

a.RNA萃取步驟Homogenization ( 均質化 )Phase separation ( 分離 )RNA precipitation (沉澱 )RNA wash(淨化 )Redissolving the RNA (回溶 )

b. RNA 反轉錄 cDNA 步驟c.PCR 步驟

步驟 ( 二 )

實驗中會利用管家基因 (housekeeping gene)來當作對照處理。本實驗選擇之管家基因為 ß-actin 。最後，各基因的表現量會利用 AlphaEaseFC （ Alpha Innotech Corporation ， CA, USA ）分析軟體進行定量分析處理。

PCR溫度設定溫度 時間 週期94℃ 2min 1cycle94℃ 30s 30cycle62℃65℃

30s

72℃ 1min1min20s

72℃ 3min 1cycle

實驗結果實驗（一）自發性探索行為實驗

圖一、利用 MK-801誘導斑馬魚的過動反應。

實驗結果

圖二、觀察藥物投予 24 小時後斑馬魚的運動反應。

實驗結果實驗（二）生化分析實驗 (a)

(b)

圖三、 (a) 經過影像量化軟體分析後， c-fos 基因表現量之柱狀圖。 (b)電泳圖。

實驗結果(a) (b)

圖四、 (a) 經過影像量化軟體分析後， Egr-1 基因表現量之柱狀圖。 (b)電泳圖。

討論 --- 行為實驗(a) (b)

圖 (a) 藥物投予後 30 分鐘之行為測量圖 (b) 藥物投予後 24 小時之行為測量

討論 --- 生化實驗(a) (b)

圖 (a) 藥物投予後 60 分鐘之 C-fos 基因測量圖 (b) 藥物投予後 60 分鐘之 Egr1 基因測量

結論

結論 本研究結合了行為實驗觀察以及分子生物學技術之操作，探討MK-801誘導行為過動的現象。

綜合本研究的二個實驗，我們總結了三個重點：( 一 ) 濃度為 20μM 的 MK-801 藥物可引發斑馬魚的過動反應。( 二 )MK-801 藥物投予並不會造成動物產生不可逆的生理傷害。( 三 )MK-801 藥物會顯著降低斑馬魚全腦中 C-fos 基因的表現，但其表現之差異與過動反應兩者間的因果關係則還未獲得證實。

未來展望 本次研究的實驗結果進一步確立了利用斑馬魚探討精神分裂症的可能性。期待在未來的生物技術發展中，可透過利用 MK-801 藥物誘導的模式，以斑馬魚建立出開發治療精神分裂症新穎藥物的技術平台。

致謝首先 要感謝學校和呂國棟教授提供我們這個難得的機會讓我們去能到大學做實驗 並使我們提早了解自己的興趣及未來目標 謝謝這幾個月來帶著我們做實驗指導我們專業知識和實驗技術的吳民聰老師儘管我們有許多不懂的地方 他仍不厭其煩的細心指導 也謝謝在校內幫助我們許多的蔡緻怡老師在我們製作簡報時細心耐心的提醒

謝謝大家