GUA LABORATORIO MICROBIOLOGA PARASITOLOGASIEMBRA, AISLAMIENTO Y TINCIONES

2011MODIFICADO DE MANUAL DE LABORATORIO 2009, T.M. LESLYE ARREDONDO ZAPATA. ACTUALIZADO DE MANUAL DE LABORATORIO 2010, T.M. BORIS PEREZ ESPINOSA.

T.M. BORIS PEREZ ESPINOSA

SIEMBRA Y AISLAMIENTO La siembra o inoculacin bacteriolgica tiene como objetivo introducir artificialmente una porcin de muestra en un medio de cultivo adecuado para el o los microorganismos que se desean estudiar. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a 37C o a una temperatura adecuada para el crecimiento del MO que se est estudiando. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, con la ayuda de distintos tipos de asa, hisopo o pipetas Pasteur estril.

INSTRUMENTAL Asa siembra o bacteriolgica Es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina en aro o en punta. Se emplea para arrastrar o diseminar microorganismos de un medio a otro para su adecuado desarrollo, as como para la realizacin de frotis. Existen varios tipos: Asa de siembra estril: son hechas de plstico o poliestileno, por lo que las hace desechables. Se las identifica por los diferentes colores segn sea su calibracin (volumen que toma la argolla del asa). Asa de siembra metlica: son de metal. Entre ellas se pueden distinguir entre un asa en forma de anillo, en forma de lanceta o en forma de aguja, teniendo cada una de ellas una funcin en particular. Asa anillo: de dimetro variable, siendo las asas de 2 mm de dimetro las ms utilizadas. Este dimetro variar segn las necesidades, y nos permitir en algunos casos realizar estudios cuantitativos. Asa recta o ajuga: sirve para sembrar en profundidad o realizar pruebas bioqumicas. Asa recta con punta en ngulo 90: Utilizada en el estudio de hongos. Esta permite tomar muestra desde los cultivos sin alterar la morfologa estructural de estos. Pipeta Pasteu Se emplea para el traspaso de lquidos o siembra en medios lquidos. Tambin puede ser til para sembrar en medios slidos. Debe ser esterilizada antes de su uso. Placa Petri Artefacto de vidrio o plstico, en la cual se vierte un volumen determino de medio de cultivo (agar), el cual es acorde con la dimensin de la misma. Consta de una base y una tapa. Esta debe mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos en que debe abrir para sembrar nuestra bacteria o muestra de inters. Bulbo de goma Este tipo de bulbo se utiliza junto con la pipeta Pasteur para evitar succionar con la boca lquidos peligrosos para el manipulador. Estufa de cultivo Las estufas son aparatos que nos permiten mantener en su interior una temperatura fija durante un tiempo determinado. Las estufas son utilizadas en el laboratorio clnico para la incubacin de medios de cultivo, luego de haber sido sembrados con las bacterias, para mantener la temperatura apropiada del germen (35-37C) y tambin para las tcnicas inmunolgicas que necesitan muchas horas de incubacin con el antgeno o anticuerpos especficos. Mechero Bunsen Es un instrumento utilizado en los laboratorios cientficos para calentar o esterilizar muestras, la boca de los tubos, fijar muestras al portaobjeto, etc.

TCNICA DE INOCULACIN ASPTICA Las tcnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varan dependiendo del objetivo. Sin embargo, existen pasos fundamentales para una correcta tcnica: Encendido mechero Bunsen Para encenderlo correctamente se debe cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de paso del gas y acercar un fosforo por el costado (lateralmente) de la boca del mechero. Regular la llave hasta obtener una llama con la altura deseada. Gradualmente, abrir la entrada de aire. Esterilizacin del asa bacteriolgica Tomar el asa por el mango y mantener verticalmente el alambre del asa en la parte azul de la llama, hasta que el metal quede al rojo vivo. Para evitar la produccin de aerosoles, el asa debe ser quemada por debajo del mango hasta llegar a la punta. Dejar enfriar, antes de tomar la muestra con el asa. No dejarla sobre una superficie contaminada. IMPORTANTE: ESTE PASO ES ESTERILIZACIN DEL ASA, NO FUNDICIN Manipulacin de los tubos con cultivo Flamear el cuello de los frascos y tubos de ensayo con muestra o cultivo despus de sacar y antes de colocar las tapas, tapones o algodones. Al inocular, no dejar que los algodones o tapas de los frascos y tubos toquen alguna superficie no estril. Esto se evita sosteniendo el algodn o tapa entre el borde de la mano derecha y el dedo meique. Siempre usar gradillas para colocar los tubos que contengan muestras o medios de cultivo. Despus de inocular los medios con el asa, esta debe ser flameada en el mechero para su esterilizacin. Importante: Antes de comenzar el trabajo practico limpiar bien la zona donde se va a llevar a cabo la prctica del da. Rotular adecuadamente con un lpiz marcador de vidrio o dermatogrfico (GRASO) todos los tubos o placas petri que contengan su muestra problema. PRINCIPALES MODALIDADES DE SIEMBRA Siembra de medio lquido a lquido Usar pipeta Pasteur, o bien asa en anillo. Si es la pipeta Pasteur destapar el tubo y aspirar la cantidad deseada con ayuda del bulbo de goma. Destapar el tubo que se va a sembrar, introducir la punta de la pipeta y vaciar el lquido presionando el bulbo de goma. Si es asa en anillo, introducirla en el caldo de cultivo, haciendo movimientos rotatorios. Siembra en medio solido o semislido (en picada) Debe usarse un asa recta o en punta Introducir el asa dentro de la muestra problema. Sacar el tapn del tubo que contiene el agar, ya sea solido o semislido. Colocar el tubo en forma vertical e introducir el asa hasta la parte media de tubo. Retirar el asa por la misma zona por donde entro Con el asa en punta se puede tomar muestras que provengan de caldos o colonias.

Siembra de medio lquido a solido (en estras) Aqu debe ser usada el asa en anillo, debido a que se quiere cubrir una gran superficie (placa petri) Introducir el asa en el caldo. El anillo debe estar lleno del caldo. Sembrar en estras sobre la superficie de la placa con el agar. En el caso de querer hacer una siembra en picadura y en estras, se debe utilizar un asa recta. Primero se pica y luego se hacen las estras. Siembra de medio solido a lquido Utilizar asa en anillo Sacar una porcin de una colonia con el asa Introducirla en el caldo, con movimientos rotatorios desprender la colonia del asa. Siembra de medio lquido a solido (en rastrillo) Colocar un poco del cultivo en una zona de la placa. Con un asa en rastrillo (triangulo) extender la muestra por la superficie de la placa sin pasar dos veces por la misma zona. Siembra en estras Tomar con la mano izquierda la base de una placa petri (la parte que tiene el agar). trabajar lo ms cerca del mechero para evitar contaminacin. Con asa en anillo, sobre la placa hacer un inoculo en uno de los extremos de una muestra problema. Hacer estras (lneas rectas) en el cuadrante del inoculo. Esto es para esparcir la muestra. Girar la placa sobre la mano, para hacer estras en el nuevo cuadrante. Tratar de no tocar las estras del primer cuadrante al trazar el segundo. Se debe hacer lo mismo con el tercer cuadrante En el cuarto cuadrante las estras deben ser ms cortas. No deben chocarse con las estras el inoculo. La ultima estra queda como una colita de chancho.

Otra manera de sembrar es quemando el asa cada vez que se van a realizar estras en un nuevo cuadrante. INCUBACIN Una vez realizada la siembra, ya sea en tubo o placa debe ser llevada a una incubadora bacteriolgica para poder proveer a la bacteria en estudio a la temperatura adecuada para su desarrollo. Por lo general el rango de temperatura en el que crecen las bacterias es entre 35-37C, debido a que es la temperatura del cuerpo humano. Aunque hay algunas excepciones que pueden crecer a menor T. El tiempo de incubacin es entre las 18 y 24 horas de sembrada la muestra en estudio.

AISLAMIENTO BACTERIOLGICO Es separar un tipo de germen a partir de un poblacin que contiene de varios tipos. En habitad naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de MO presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los MO estn en una proporcin adecuada. Cuando el MO que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en la muestra, o interesa un solo tipo de MO se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda que involucra una primera etapa de aumento del nmero de microorganismos del tipo que se desea aislar en relacin al resto de la poblacin. Luego se aisla por el mtodo de estras o por dilucin y se identifica. DISEMINACIN Es el mtodo ms utilizado, este consiste en extender en la superficie de una placa con medio de cultivo la bacteria que se desea aislar. Aqu se logra obtener colonias bien aisladas una de otra. Cualquier muestra patgena debe ser aislada de cualquier contaminante, debido a que puede interferir en la identificacin y pruebas de susceptibilidad a antibiticos. ACTIVIDADES Se entregaran placas sin medio de cultivo y un par de asas en anillo por grupo. Estas deben utilizarlas para aprender el movimiento de siembra y evitar rasgar las placas con medios de cultivo. En la segunda parte del laboratorio se les entregar un par de caldos de cultivos, los cuales contendrn 3 cepas bacterianas distintas, las cuales deber sembrar de la siguiente manera: Tubo A: En placas de Agar Sangre y Mac Conkey Tubo B: Mac Conkey y SS Para la siembra deben seguir los pasos descritos en siembra en estras. Las placas deben ser rotuladas con el grupo y da del laboratorio (ej. Viernes G1).

TINCIONES Los colorantes se utilizan en microbiologa para: Teir los microorganismos (MO) y sus estructuras (flagelos, cpsula, esporas, etc.) Usarlos como inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Determinar el pH de los medios. Diferenciar en grupos segn la forma de tomar dichos colorantes.

Ante la dificultad para observar las clulas bacterianas a fresco a travs del microscopio, se han desarrollados diversos procedimientos de tincin, que ayudan a dar un mayor contraste entre la clula y el medio que la rodea. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos con afinidad a algunos de los compuestos celulares. Con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) que se unen a compuestos qumicos electronegativos de la bacteria (compuestos cidos), tales como los cidos nucleicos. Algunos ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, cristal violeta, safranina, etc. Otros colorantes son los anionicos (cargados negativamente) que poseen afinidad con los constituyentes cargados positivamente de la clula. Si solo se requiere aumentar el contraste de la bacteria para la microscopia, se puede utilizar una tincin simple, que utiliza un solo colorante dejando todas las estructuras celulares con el mismo color, permitiendo distinguir solo la forma, tamao y agrupacin de las clulas bacterianas, sin que se logre diferenciar entre los grupos de bacterias como es el caso de las tinciones diferenciales. Estas utilizan varios colorantes combinados para obtener una mayor informacin acerca de la bacteria, como por ejemplo la tincin Gram y Ziehl Neelsen que aportan informacin sobre la conformacin de la pared celular. PREPARACIN DE UN FROTIS Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. Realizacin del frotis Sobre portaobjeto desengrasado y seco colocar una gota de solucin salina o agua con el asa en anillo. Flamear el asa por la zona azul de la llama, una vez fra sacar una pequea cantidad de la colonia y colocarla sobre la solucin salina, hacer una emulsin sin que quede muy grueso el extendido. En el caso de que esta sea un caldo o muestra liquida, no agregar agua. Una vez preparada una suspensin homognea (facilita el secado) dejar secar al aire, o bien se pasa varias veces el portaobjeto sobre la llama del mechero hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero que no queme, ya que esto podra llegar a alterar la morfologa celular). Fijacin de la Muestra al portaobjeto Calor: Pasar unas cuantas veces el portaobjeto sobre la llama durante unos segundos cada vez, dejar enfriar el portaobjeto entre cada calentamiento. Metanol: Una vez seca la muestra sobre el portaobjeto, aadir unas gotas de metanol eliminando el exceso, dejar que este se evapore.

Realizada la preparacin del frotis y la fijacin de la muestra, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste.

TINCIONES UTILIZADAS CON MAYOR FRECUENCIA TINCIN DE GRAM Es uno de los mtodos de tincin ms utilizados en el laboratorio de bacteriologa. Esta tincin se denomina as por el bacterilogo dans Christian Gram, quin la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas. Pasos de la tincin Gram: Una vez fijada la muestra, se tie con cristal violeta, quedando todas las clulas, tanto Gram positivas como Gram negativas de color azul. Cubrir el portaobjeto con una solucin de yodo-yoduro de potsico (mordiente). El yodo entra en la clula y forma un complejo insoluble en el agua con el cristal violeta. Decolorar utilizando una mezcla de alcohol-acetona, sustancia en la que es soluble el complejo yodo-cristal violeta. En este paso las bacterias Gram positivo no se decoloran a diferencia de la Gram negativa. Para poder visualizar las bacterias Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste, como es el caso de la safranina, que va a teir de color rasado a las clulas Gram negativas.

Nota: entre cada paso se lava el frotis bacteriano con un chorro de agua suave. Una vez realizada la tincin, se procede a visualizar el frotis en microscopio con el objetivo 100X y aceite de inmersin. Por una parte podemos visualizar diferencias tanto en la coloracin como en la morfologa bacteriana (distribucin, asociacin, forma bacteriana). Estas se describen a continuacin: Coloracin Gram positivas A causa de sus paredes celulares ms espesas (mayor cantidad de peptidoglicano y menos lpidos), no son permeables al disolvente ya que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.

Gram negativas Debido a que el alcohol acetona es un solvente lipdico, este disuelve la membrana exterior de la pared de la clula, quedando expuesta la delgada capa de peptidoglicano que es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo, quedando decolorada.

Morfologa bacteriana

Ejemplos

TINCIN DE ESPORAS (MTODO DE WIRTZ-CONKLIN) Algunos gneros bacterianos, como Clostridium y Bacillus, son capaces de producir en su interior una forma de resistencia llamada endospora. Esta endospora se produce solo cuando el medio le es adverso (cambios bruscos de temperatura, agotamiento de los nutrientes, radiaciones, etc.), aqu cada forma vegetativa va a formar una espora. Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales como agentes fsicos y qumicos y no se coloren con facilidad. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. Por lo general se requiere el calor para permitir la penetracin del colorante en las esporas. La tincin especfica de esporas requiere de dos colorantes: Verde de Malaquita capaz de teir las esporas en caliente Safranina colorante de contraste que tie las formas vegetativas

Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y as lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante. Interpretacin de los resultados La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. Estas pueden ser:

TINCIN DE FLAGELOS La tincin de flagelos se usa como prueba de diferenciacin entre los bacilos Gram negativos no fermentadores mviles, cuando las reacciones bioqumicas son dbiles o equivocadas. Las bacterias mviles tienen flagelos, los que varan, en forma, nmero y posicin, segn la especie. Dado que estos se hallan fuera del poder de resolucin del microscopio ptico comn, para poder visualizarlos, es necesario aumentar su tamao. El flagelo bacteriano es teido con soluciones alcohlicas a las que se les incorpora acido tnico, que acta como fijador de la tincin (mordiente), puede usarse un colorante de contraste para visualizar mejor la bacteria. La bacteria debe crecer en medio libre de carbohidratos, ya que la produccin de cido en el medio lleva a una disminucin del pH, y esto puede inhibir la formacin de flagelos, las bacterias deben ser teidas durante la fase logartmica activa de crecimiento, usualmente dentro de 24-48 hrs. TINCIN DE ZIELH NEELSEN (BAAR) El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias, que contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con colorantes bsicos. La coloracin clsica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Aqu se logran ver los bacilos de color rojo, mientras que el fondo de la preparacin se ve de color azul, al agregar azul de metileno como colorante de contraste. Se considera que la acido-resistencia es debida al alto contenido lipdico de estas bacterias. Fundamentalmente fosfolpidos, ceras y cidos miclicos. El complejo fucsina fenol resiste la decoloracin, porque est muy ligado a los lpidos, ya que es ms soluble en ellos que en el agente decolorante (alcohol-acido) Estos microorganismos se consideran Gram positivos, pero se colorean difcil e irregularmente. Las micobacterias como M. tuberculosis y los parsitos coccideos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades acido-alcohol resistente (BAAR) TINCIN SIMPLE Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). Las capsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes celulares. Uno de los procedimientos ms utilizados es la coloracin negativa. Aqu las clulas se dejan sin teir, pero se colorea el medio que las circunda. Lo que se ve, por lo tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la coloracin no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china o la nigrosina (Cryptococcus). Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos o levaduras, como as tambin estas en flujos vaginales.

ACTIVIDADES Listado de Materiales: Microscopio Aceite de inmersin Alcohol y papel suave Rociador de alcohol Portaobjetos y cubreobjeto Lpiz rotulador Colorantes especficos

Papel absorbente Recipiente para tincin Gotario con agua Asa anillo Fsforos Muestras bacterianas

TINCIN GRAM 1) calentar el asa de inoculacin hasta que este roja. 2) colocar una gota de agua sobre un portaobjeto desengrasado (cuando es una colonia). 3) sacar una porcin de la muestra en estudio, con un asa en anillo (desinfectar el asa). 4) preparar una emulsin homognea de la muestra con el agua. 5) Fijar la muestra por calor pasando el portaobjeto sobre la llama de mechero Bunsen. La muestra no debe recalentarse.

NOMBRE MUESTRA: TUBO A NOMBRE TINCION: OBSERVACIONES:

NOMBRE MUESTRA: TUBO B NOMBRE TINCION: OBSERVACIONES:

Morfologa Bacteriana

TINCIN SIMPLE

1. Quemar el asa 2. colocar una gota de agua sobre un portaobjeto desengrasado. 3. Tomar una gota de caldo de cultivo o emulsionar parte de la colonia tomada con asa desde agar. 4. Agregar una gota de tinta china diluida 5. Colocar cubre objeto 6. Observar al microscopio

NOMBRE MUESTRA: NOMBRE TINCION: OBSERVACIONES:

NOMBRE MUESTRA: NOMBRE TINCION: OBSERVACIONES: