elvÁlasztÁstechnikai mÓdszerek elmÉlete És gyakorlata dr. kremmer...

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK

ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA

Dr. Kremmer Tibor

VI.

FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK

GÉLKROMATOGRÁFIA

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

GÉLKROMATOGRÁFIAGEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION

MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

SEC

GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA

GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY

GPC

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok

Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés

Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek

Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell

Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography

Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje

Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC)

Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján

Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

A GÉLKROMATOGRÁFIA

ELVÁLASZTÁSI

MECHANIZMUSÁNAK

SZTERIKUS

ELMÉLETI

MODELLJE

Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK)

Kémiai tulajdonságai:Szerkezet – stabilitásFunkcionális csoportokBiológiai aktivitásMolekula méret-tömeg, eloszlás

Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek

Fizikai tulajdonságai:

Oldékonyság (poláris-apoláris)

Szolvatáció – hidratáció

Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció

Hidrodinamikai jellemzők

Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó,

belső viszkozitás, flexibilitás

GÉLKROMATOGRÁFIA

AZ ÁRAMLÓ FÁZIS

AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA

pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG

VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ)

ADALÉKOK detergensek,

stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS

A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE

Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás,

SZERVETLEN OXIDOK

SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék

(CPG),

SZERVES POLIMEREK

Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter-

észter, polivinilalkohol, polisztirol-

divinilbenzol,

KEVERT TÍPUSOK

Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid,

Szerves-szerves – dextrán - agaróz,

Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB

GÉLKROMATOGRÁFIA

AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

GFC - SECPOLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

Elnevezés Összetétel Gyártó - Forgalmazó

Sephacryl

S 100 -1000Allil - dextrán akrilamid Pharmacia-LKB

Superdex 30-200 Dextrán-agaróz Pharmacia-LKB

SynChrom GPC Polipropil-gliceril Waters- Millipore

Sigmachrom

GFC 100-300Dextrán - polietilénglikol Sigma-Aldrich

Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán)

Nucleosil

Phenomenex GPC-P

Daisogel 2205

SiO2Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán)

Unisphere Al2O3 Biotage

HA Type 8 Hidroxiapatit Koken Science

GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó

Styragel HMW PS – DVB Waters

Fractogel TSK Szilikagél, ill. Merck

G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer

Toyopearl HW 55F TosoHaas

Metachem GPC 102 - 106

PS - DVB Metachem Tecnol.

Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates

BioSep SEC

2000-4000PS - DVB Phenomenex

Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co.

PL gel MIXEDPolietilénnel kevert

PS-DVB Polymer

PL Aquagel OH Polihidroxid Polihidroxil Lab Ltd,

Shodex UT 800

KF 80 M

Poliszachariddal kevert

PS – DVB kopolimerShowa Denko

Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetekNanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására

Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó

Sepharose CL 2B, 4B, 6B Dextrán-agaróz Pharmacia LKB

Sephacryl S 200, S 300 Dextrán-akrilát Pharmacia LKB

Styragel HMW PS – DVB Waters

Fractogel TSK Szilikagél, ill. polimer Merck

TSKgel G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer TosoHaas

Toyopearl HW 55F, -75 Etilénglikol/metakrilát kopolimer TosoHaas

Shodex HA 30 Hidrofil PS - DVB TosoHaas

Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB Showa Denko

PL aquagel OH Polihidroxid- polimer gyanta Polymer Laboratories

PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer Laboratories

Phenogel OH Hidrofil polimer gyanta Polymer Laboratories

NUCLEOGEL GFC Hidrofil polimer gyanta Macherey-Nagel

BioSep SEC 2000-4000 PS – DVB Phenomenex

Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co.

Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates

Metachem GPC 102 - 106 PS - DVB Metachem Technology

Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai

Géltípus Gélágy térfogatacm3/g xerogél*

Kizáródási moltömeg (kDa)

Frakcionálási tartomány (kDa)

G-10 2 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt

G-15 2,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt

G-25 4 – 6 5 1 –5

G-50 9 – 11 30 1,5 – 30

G-75 12 – 15 70 3 – 70

G-100 15 – 20 150 4 – 150

G-150 20 – 30 400 5 – 400

G-200 30 – 40 800 5 - 800

A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150,

finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.

HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) SEM KÉPE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

to VV3

1

)( otavoe VVKVV

ot

oeav VV

VVK

10 avK

A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE

A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %)

Agaróz 0.3 – 1.5

Sephadex 3 - 30

Poliakrilamid 2.5 - 15

A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) !

ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET

A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek.

A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

Az elválasztás technika szemlélete szerint a

GÉLKROMATOGRÁFIAa FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA

SPECIÁLIS HATÁRESETE

ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer,

a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák.

Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA

a fázisok közötti térfogati megoszlás

(fázisarány, megoszlási együttható)

a molekula méretének (tömegének) függvénye.

Kav ~ f(log M)

(A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

ot

oe

VV

VV

Determann egyenletek (1966-69) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre

BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

logM = M0 - (6.06-5.00 )Ve

Vo

= a xerogél szemcse sűrűsége

log M Ve / V0 = Kav (Vt – V0)

(Vt – V0) állandó érték 2/3 . Vt

Kav = 0 – 1 log M Kav

MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

3

3

4 aNM

DN

RTa

6

A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE

A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:

M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI

PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI

OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA

BEKONCENTRÁLÁS

SÓMENTESÍTÉS

PUFFER CSERE

CSOPORT FRAKCIONÁLÁS

TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS

MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS

DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA

KROMATOFOKUSZÁLÁS

MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

CHYLOMICRON VLDL

HUMÁN

SZÉRUM

LIPO

PROTEIN

OSZTÁLYOK

(SEM)

A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA

VLDLLDL

HDL

ELFO

UC

HUMÁN SZÉRUM

LIPOPROTEINEK

ELVÁLASZTÁSA

ELEKTROFORÉZISSEL

AGARÓZ GÉLEN

HUMÁN SZÉRUM

LIPOPROTEINEK

SEC ELVÁLASZTÁSA

AGARÓZ (Sepharose 6B)

GÉLOSZLOPON

VLDL

LDL

HDL

PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL

(SDS - Na-dodecil szulfát)

Detergens

Sejtmembrán

SDS

(900 – 5 min)

Fehérje és lipid micellák

Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.

- o -

- ● -- X -