elvÁlasztÁstechnikai mÓdszerek elmÉlete És gyakorlata dr. kremmer...
DESCRIPTION
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013. GÉLKROMATOGRÁFIA GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK
ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA
Dr. Kremmer Tibor
VI.
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK
GÉLKROMATOGRÁFIA
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013
GÉLKROMATOGRÁFIAGEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION
MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
SEC
GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA
GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY
GPC
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok
Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés
Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek
Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell
Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography
Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje
Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC)
Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján
Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA
A GÉLKROMATOGRÁFIA
ELVÁLASZTÁSI
MECHANIZMUSÁNAK
SZTERIKUS
ELMÉLETI
MODELLJE
Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.
PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE
GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK)
Kémiai tulajdonságai:Szerkezet – stabilitásFunkcionális csoportokBiológiai aktivitásMolekula méret-tömeg, eloszlás
Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek
Fizikai tulajdonságai:
Oldékonyság (poláris-apoláris)
Szolvatáció – hidratáció
Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció
Hidrodinamikai jellemzők
Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó,
belső viszkozitás, flexibilitás
GÉLKROMATOGRÁFIA
AZ ÁRAMLÓ FÁZIS
AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA
pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG
VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ)
ADALÉKOK detergensek,
stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS
A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE
Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás,
SZERVETLEN OXIDOK
SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék
(CPG),
SZERVES POLIMEREK
Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter-
észter, polivinilalkohol, polisztirol-
divinilbenzol,
KEVERT TÍPUSOK
Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid,
Szerves-szerves – dextrán - agaróz,
Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB
GÉLKROMATOGRÁFIA
AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)
TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE
N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK
GFC - SECPOLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés Összetétel Gyártó - Forgalmazó
Sephacryl
S 100 -1000Allil - dextrán akrilamid Pharmacia-LKB
Superdex 30-200 Dextrán-agaróz Pharmacia-LKB
SynChrom GPC Polipropil-gliceril Waters- Millipore
Sigmachrom
GFC 100-300Dextrán - polietilénglikol Sigma-Aldrich
Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán)
Nucleosil
Phenomenex GPC-P
Daisogel 2205
SiO2Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán)
Unisphere Al2O3 Biotage
HA Type 8 Hidroxiapatit Koken Science
GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó
Styragel HMW PS – DVB Waters
Fractogel TSK Szilikagél, ill. Merck
G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer
Toyopearl HW 55F TosoHaas
Metachem GPC 102 - 106
PS - DVB Metachem Tecnol.
Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates
BioSep SEC
2000-4000PS - DVB Phenomenex
Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co.
PL gel MIXEDPolietilénnel kevert
PS-DVB Polymer
PL Aquagel OH Polihidroxid Polihidroxil Lab Ltd,
Shodex UT 800
KF 80 M
Poliszachariddal kevert
PS – DVB kopolimerShowa Denko
Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetekNanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására
Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó
Sepharose CL 2B, 4B, 6B Dextrán-agaróz Pharmacia LKB
Sephacryl S 200, S 300 Dextrán-akrilát Pharmacia LKB
Styragel HMW PS – DVB Waters
Fractogel TSK Szilikagél, ill. polimer Merck
TSKgel G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer TosoHaas
Toyopearl HW 55F, -75 Etilénglikol/metakrilát kopolimer TosoHaas
Shodex HA 30 Hidrofil PS - DVB TosoHaas
Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB Showa Denko
PL aquagel OH Polihidroxid- polimer gyanta Polymer Laboratories
PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer Laboratories
Phenogel OH Hidrofil polimer gyanta Polymer Laboratories
NUCLEOGEL GFC Hidrofil polimer gyanta Macherey-Nagel
BioSep SEC 2000-4000 PS – DVB Phenomenex
Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co.
Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates
Metachem GPC 102 - 106 PS - DVB Metachem Technology
Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai
Géltípus Gélágy térfogatacm3/g xerogél*
Kizáródási moltömeg (kDa)
Frakcionálási tartomány (kDa)
G-10 2 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt
G-15 2,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt
G-25 4 – 6 5 1 –5
G-50 9 – 11 30 1,5 – 30
G-75 12 – 15 70 3 – 70
G-100 15 – 20 150 4 – 150
G-150 20 – 30 400 5 – 400
G-200 30 – 40 800 5 - 800
A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150,
finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.
HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) SEM KÉPE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE
HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI
to VV3
1
)( otavoe VVKVV
ot
oeav VV
VVK
10 avK
A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE
AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE
A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %)
Agaróz 0.3 – 1.5
Sephadex 3 - 30
Poliakrilamid 2.5 - 15
A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) !
ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET
A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek.
A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.
Az elválasztás technika szemlélete szerint a
GÉLKROMATOGRÁFIAa FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA
SPECIÁLIS HATÁRESETE
ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer,
a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák.
Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA
a fázisok közötti térfogati megoszlás
(fázisarány, megoszlási együttható)
a molekula méretének (tömegének) függvénye.
Kav ~ f(log M)
(A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)
ot
oe
VV
VV
Determann egyenletek (1966-69) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre
BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
logM = M0 - (6.06-5.00 )Ve
Vo
= a xerogél szemcse sűrűsége
log M Ve / V0 = Kav (Vt – V0)
(Vt – V0) állandó érték 2/3 . Vt
Kav = 0 – 1 log M Kav
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval
3
3
4 aNM
DN
RTa
6
A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:
M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.
A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI
OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA
BEKONCENTRÁLÁS
SÓMENTESÍTÉS
PUFFER CSERE
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS
TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS
MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS
DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA
KROMATOFOKUSZÁLÁS
MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
CHYLOMICRON VLDL
HUMÁN
SZÉRUM
LIPO
PROTEIN
OSZTÁLYOK
(SEM)
A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
VLDLLDL
HDL
ELFO
UC
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
ELVÁLASZTÁSA
ELEKTROFORÉZISSEL
AGARÓZ GÉLEN
HUMÁN SZÉRUM
LIPOPROTEINEK
SEC ELVÁLASZTÁSA
AGARÓZ (Sepharose 6B)
GÉLOSZLOPON
VLDL
LDL
HDL
PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL
(SDS - Na-dodecil szulfát)
Detergens
Sejtmembrán
SDS
(900 – 5 min)
Fehérje és lipid micellák
Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.
- o -
- ● -- X -