Í N D I C E

INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

HISTORIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

HISTOLOGÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

PROPIEDADES DE LAMEMBRANA AMNIÓTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

SISTEMAS DE CONSERVACIÓN DE LAMEMBRANA AMNIÓTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

OBTENCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LAMEMBRANA AMNIÓTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

APLICACIONES DEL TRASPLANTE DEMEMBRANA AMNIÓTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

Nº: 22

Dr. Alberto Aranda Yus(1)

Dr. Xosé Vázquez Dorrego(2)

Dr. Pablo Díaz Couchoud(1)

Dr. José Ramón Fontenla García(1)

(1) Hospital Clínic i Provincial de Barcelona. Servicio de Oftalmología(2) Hospital Municipal de Badalona. Servicio de Oftalmología.

Laboratorios Thea publica íntegramente los manuscritos recibidos de sus legítimos autores, sin introducir modificaciones en los mismos, y por ello no sehace responsable de las opiniones e infor maciones contenidas en los ar tículos.

INTRODUCCIÓNLa utilización de tejidos derivados de la placenta es una técnica que se ha v enido utilizan-do desde hace más de 90 años para el tratamiento de div ersas enfermedades cutáneas ymucosas. En la actualidad, dentr o de la moderna cir ugía oftalmológica el trasplante demembrana amniótica es un procedimiento quirúrgico en expansión, en el que sus indica-ciones son cambiantes, estando posiblemente muchas de ellas aún por definir .

La literatura muestra un aumento exponencial de publicaciones científicas r elacionadascon diversos aspectos de la utilización del trasplante de membrana amniótica en oftalmo-logía desde mediados de los años 90. U na búsqueda bibliográfica que incluya “ amnioticmembrane transplantation” en el P ubMed arroja un r esultado de 655 r eferencias hastaenero de 2006. Este cr eciente interés puede ser debido a una may or disponibilidad de lamembrana amniótica, a una cr eciente per cepción de sus posibilidades en el terr eno de la cirugía oftálmica y a una lista de indicaciones que cada vez es mayor. Tampoco es ajenoel hecho de que la may or parte de sus indicaciones son enfermedades con muy mal pr o-nóstico para la función visual, en las que no existen terapéuticas alternativ as y que debidoa su gravedad justifican el tomar medidas extr emas.

No sólo las indicaciones quir úrgicas se encuentran sometidas a constante r evisión. La téc-nica quirúrgica también constituye un punto en evolución para determinar la mejor formade implantar el fragmento de membrana en cada entidad clínica, para que garantice una ade-cuada permanencia y proporcione todas las propiedades de la membrana amniótica.

El presente artículo pretende acercar al oftalmólogo a un terreno muchas veces desconoci-do pero que en algunas enfermedades nos abr e caminos que en este momento solamentepodemos imaginar. Partiendo de una breve reseña histórica se realizará una descripción desus propiedades, obtención, procesamiento, aplicaciones clínicas y, por qué no, las posibi-lidades que el futuro nos puede deparar sobre sus nuevas (o no tan nuevas) aplicaciones.

HISTORIALos intentos racionales de utilizar la parte más interna del amnios, es decir, la membranaamniótica (MA) en M edicina, han sido r ealizados podemos decir que desde hace dossiglos, y no exclusivamente por parte de la Oftalmología. Se ha estimado que para tratara un paciente con quemaduras de segundo o ter cer grado en el 50 % del organismo senecesitan del orden de 6.000 cm 2 de piel 1. Tal cantidad probablemente no esté disponi-ble con la rapidez que requiere la situación de una quemadura extensa de ter cer grado, yde ahí la necesidad de inv estigar en nuevos tejidos. Hace más de cien años comenzar onlos intentos con tejidos homólogos y , posteriormente, heter ólogos. En 1890, I vanova 2

publica un artículo donde realiza trasplantes de piel fetal a un gran quemado, abogandopor la utilización de tejidos jó venes dado que poseerían una may or vitalidad. E n 1910,Davis3 comunica el primer intento de injertar fragmentos de la capa más interna del sacoamniótico con el fin de fav orecer la granulación de una herida abier ta. Dos años mástarde es tratado con membrana amniótica el primer gran quemado4. De todas formas nosencontramos ante soluciones de emergencia dado que estos fragmentos de membranaeran sólo pr ovisionales, necesitaban ser cambiados cada pocos días y eran r etirados encuanto se disponía de otro tejido dado que se creía que podían inducir rechazo.

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Este temor era lógico en aquel momento ya que la may or parte de autores utilizaban lamembrana amniótica adherida al corion y , por tanto, no es la membrana basal acelularque utilizamos en nuestros días. Desde ese momento los tejidos placentarios humanos (ybovinos en casos aislados) han sido utilizados de muy diversas formas por diferentes espe-cialidades médicas 5.

Aunque el uso de MA en la reparación quirúrgica de defectos cutáneos data de comienzosdel siglo XX6, no se describe su uso en O ftalmología hasta 1940 cuando De Rotth7 utilizó elamnios y el corion fr escos como implante para la r econstrucción de la super ficie ocular.Posteriormente, Sorsby y colaboradores8 usaron con éxito la amnioplastina, MA procesadaquímicamente, como recubrimiento temporal en el tratamiento de quemaduras químicasoculares. A pesar de los buenos resultados obtenidos por Sorsby en 1947, por razones des-conocidas, durante un período de casi 50 años no se publicar on nuevos trabajos utilizan-do la MA, probablemente debido a la escasez de conser vantes adecuados.

Los precursores de los injertos de membrana amniótica con el fin de sustituir a otro teji-do o cubrir un defecto epitelial practicaban la “histioterapia”, situando tejidos placenta-rios a nivel periocular en el tratamiento de diversas enfermedades. Los autores que prac-ticaban este procedimiento se basaban en la observación de Filatov en 1933 de que unacórnea dañada sometida a una queratoplastia penetrante mejoraba su transpar encia enla región adyacente al injer to. Este autor lo atribuy ó al hecho de que en condicioneslímite los tejidos pr oducirían factores capaces de estimular el cr ecimiento, unas “ esti-mulinas biogénicas” que serían algo par ecido al último suspir o que emiten las célulasantes de morir. De todos los tejidos el que más fácilmente se encontraba disponible enunas condiciones similares a las descritas era la placenta, y de esta forma se inició la tera-pia tisular: la placenta era conser vada durante quince días en frío, posteriormente este-rilizada y tr oceada en pequeños fragmentos que se intr oducían bajo la conjuntiv a. S ihemos de hacer caso de las numer osísimas publicaciones españolas y extranjeras de losaños 30-50 se consiguier on verdaderos milagros, consiguiendo la curación de enferme-dades como el tracoma, queratitis tuberculosa, coriorretinosis miópica, atrofia de nervioóptico y r etinosis pigmentaria. A niv el general tampoco eran “despreciables” los efectosobtenidos: se aliviaban las cefaleas, se pr oducía un aumento de peso, se solucionaba laesterilidad masculina o, lo más importante, aumentaba la predisposición para el trabajo9.La utilización de extractos placentarios en cosmética ha seguido en pleno auge, y elextracto de placenta liofilizado para utilización tópica oftalmológica aún estaba dispo-nible no hace muchos años. E n literatura se siguen encontrando comunicaciones sobr ela escleroplastia con tejidos amnióticos o del cor dón umbilical en el tratamiento de lamiopía progresiva 10, 11, 12.

Sin embargo, y de una forma paralela, en la mente de algunos oftalmólogos comenz ó agerminar la idea de sustituir la conjuntiva dañada por placenta. Al ser considerada la pla-centa demasiado gruesa como para poder sustituir a una capa tan fina como era la con-juntiva se optó por prescindir del corion, implantándose únicamente el amnios. Esta téc-nica fue utilizada en los años 50 en el tratamiento de la queratitis tuberculosa, pterigiumy en algunos casos de simbléfar on. Su utilización se basaba en la facilidad de obtencióncomparada con la mucosa labial que hasta ese momento se había utilizado. Sin embargo,la llegada de nuev os tratamientos médicos arrinconó este pr ocedimiento prácticamentehasta nuestros días.

En 1995, Kim y Tseng13 comenzaron sus experimentos con MA para la r econstrucción dela superficie ocular de ojos de conejo severamente dañados con n-heptanol y queratectomía

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lamelar limbar asociada, para provocar una deficiencia limbar total. Demostraron en sus tra-bajos que el 40 % de las córneas de conejo con deficiencia total de las células madr e lim-bares podían r econstruirse r eemplazando la super ficie ocular “ conjuntivalizada” con unaMA humana crioconservada. Desde entonces se han publicado un gran númer o de artícu-los con un gran espectro de indicaciones oftalmológicas, generalizando así su utilización.

HISTOLOGÍAEl amnios es una membrana delgada, transparente, plateada, que tapiza la cara interna delcorion y de la placa corial de la placenta, y forma una v aina al cordón umbilical. Se debeal crecimiento de la vesícula amniótica, la cual se pone en contacto con el corion. A sim-ple vista, comparando la estr uctura del amnios con la de otr os órganos del cuerpo huma-no, se echan en falta una serie de estr ucturas como serían músculo liso, ner vios y, sobretodo, vasos linfáticos y sanguíneos. Estas cir cunstancias pueden ser las que justifiquen subaja antigenicidad y la inexistencia de r echazo tras su implantación.

La estr uctura histológica del amnion v aría desde la concepción hasta el momento delparto. A continuación describir emos el amnios madur o, que es el que podemos encon-trar en los embaraz os a término . Derivado del ectodermo, se compone de cinco capas:epitelio, membrana basal y tres capas mesenquimatosas (capa esponjosa, capa de fibroblastos ycapa compacta).

El epitelio está firmemente adherido a la gr uesa membrana basal sub yacente. El epiteliode la MA es cuboideo y, observado al microscopio, presenta numerosas vacuolas. Este epi-telio posee capacidad de secr eción y reabsorción activas, en relación con la formación delíquido amniótico. La superficie apical de las células amnióticas posee muchos micr ovilli.En la base, los pr ocesos ciliares o pedículos se extienden dentr o de la membrana basal amodo de podocitos. Los pr ocesos de las células basales tienen una unión con la membra-na basal tipo hemidesmosomas con tonofilamentos, y la sustancia de la membrana basalsubyacente es parcialmente amorfa y parcialmente microfibrilar 14. Microanatómicamentelas células epiteliales pr esentan núcleos irr egulares; de forma perinuclear se obser vannumerosas vacuolas que r evelan la base de la función secr etora de estas células. Tambiénencontramos, intracelularmente, un aparato de Golgi activo que confirma la existencia deun metabolismo celular activ o 15. Esta complicada ultraestr uctura epitelial sugier e que elamnios no es una simple membrana que contiene al líquido amniótico, sino que tienemúltiples funciones específicas a r ealizar y básicamente tr es: efecto mecánico epitelial derecubrimiento, acción secretora activa de diferentes péptidos y transporte intenso intrace-lular y transcelular.

En el lado más externo de esta capa existe una hilera de células mesenquimáticas. La capamás externa es una z ona esponjosa relativamente acelular que se continúa con la segundamembrana fetal, el corion.

Por debajo del epitelio amniótico encontramos la membrana basal de gran grosor y resis-tencia. Finalmente, la capa más inferior corr esponde a la matriz estr omal, cuyo espesorpuede variar ampliamente entr e diferentes placentas, y que se divide en una capa com-pacta, desprovista de células y formada por un tejido compacto, capa fibroblástica, for-mada por fibroblastos y células de Hofbauer, y capa esponjosa, formada por el retículo delceloma extraembrionario y que está en contacto con el corion.

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PROPIEDADES DE LA MEMBRANA AMNIÓTICAEl origen y composición de la membrana amniótica son muy determinantes a la hora dedefinir los mecanismos que permiten que la MA sea utilizada en tan diferentes aplicaciones.Entre las propiedades de la MA que determinan su utilidad se encuentran las siguientes:

• Regula el tr ansporte hidroelectrolítico: ésta es una pr opiedad que hace a la membranaamniótica altamente inter esante en el tratamiento de los grandes quemados per o que enoftalmología pierde gran par te de su impor tancia dado el mínimo tamaño del injer to conrespecto a la super ficie ocular total. Ya previamente hemos comentado que se trata de untejido metabólicamente muy activo que regula la composición del líquido amniótico y pro-duce gran variedad de compuestos activos (hormonas, factores de crecimiento y citoquinas).

• Propiedad de disminuir el cr ecimiento bacteriano: una de las utilizaciones más fr e-cuentes de la membrana amniótica en Oftalmología es el recubrimiento de defectos epi-teliales corneales persistentes donde el evitar una infección sobr eañadida es fundamen-tal. E n un estudio experimental, Rao y Chandrasekharam 16 provocaron quemadurasprofundas en animales de experimentación y cinco días más tarde se realizó escarectomíay aposición de membrana amniótica sobre la mitad de la herida. Cultivos posteriores dela zona situada bajo la membrana fueron infructuosos, mientras los realizados en la zonadescubierta mostraron amplia variedad de gérmenes. Robson y Krizek 17 han demostra-do recuentos bacterianos menores en aquellas heridas que habían sido inoculadas con P.aeruginosa y recubiertas con membrana amniótica que en aquellas recubiertas con injer-tos de piel o descubiertas. Dado que estos autores no han podido demostrar en el tejidoamniótico la presencia de un factor con actividad bacteriostática o bactericida, postulanque el cierre biológico de la herida con una más rápida instauración de un tejido de gra-nulación bien v ascularizado favorece la llegada de leucocitos y la eliminación de r estosnecróticos. Aunque este mismo experimento no ha sido (hasta donde nosotr os tenemosconocimiento) realizado en córneas de animales de experimentación, se puede av anzarque el resultado podría diferir dado que la respuesta reparadora que sucede tras un dañocorneal es sustancialmente difer ente del que sucede en la piel y tejidos blandos. O traduda es saber si los factor es antibacterianos presentes en el líquido amniótico (lisozima,fundamentalmente18) son formados por el amnios o pr ovienen de la madre.

• Escasa inmunogenicidad: de las dos par tes en que se dividen las membranas fetales(amnios y corion) es conocido que la membrana amniótica se forma a par tir del ecto-dermo fetal, por lo que un embaraz o es en r ealidad un injer to. El cómo es posible queun feto llegue a término sin ser r echazado es r ealmente difícil de compr ender y puedeobedecer a dos factores. Por una parte se ha podido constatar un cier to grado de inmu-nodepresión de la madre durante el embarazo, pero por otra en los tejidos fetales en con-tacto directo con los maternos se echan en falta la presencia de vasos sanguíneos y linfá-ticos y de determinados antígenos. Estas características que le permiten al feto llegarfelizmente a término pueden ser las mismas que nos permitan utilizar la membranaamniótica en Oftalmología sin la necesidad perentoria en otro tipo de trasplantes comoes el limbar o la queratoplastia penetrante: la inmunosupr esión del paciente. Adinolfi ycols 22 demostraron con cultivos celulares de epitelio de la membrana amniótica que losantígenos de histocompatibilidad HLA 1, B, C y DR no pueden ser detectados en estascélulas con las técnicas de inmunofluor escencia habitualmente utilizadas. S í se puededetectar una proteína relacionada con la ß2-microglobulina, cuya secuencia es casi idén-tica al HLA-G, gen del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I aislado a par-

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tir de una línea de células B malignas y que se cr eía que no se expresaba en ningún teji-do humano sano 19. El hecho de que la expr esión de esta proteína sea máxima al princi-pio del embaraz o y baje posteriormente añadido al hecho de que no se haya podidoencontrar en ningún tejido humano, apo ya la hipótesis de que el tr ofoblasto es un teji-do antigénicamente inmadur o y, tal v ez, incapaz de pr ovocar una r eacción de r echazo.De forma experimental se implantar on injertos de membrana amniótica a seis v olunta-rios, dos de los cuales habían r echazado pr eviamente injer tos de piel. La r egión delimplante fue extraída y examinada sin que se encontraran datos de r eacción inmunoló-gica. Las muestras de suero extraídas un mes más tarde no mostraron reactividad contracélulas del epitelio amniótico cultiv adas in vitr o 20. S in embargo, una comunicaciónreciente nos aler ta sobr e una posible r eacción de hipersensibilidad con formación dehipopion tras trasplantes r epetidos de membrana amniótica pr ocedente de la mismadonante que se r esolvieron con la utilización de ester oides tópicos, y sugier e utilizarmembrana amniótica procedente de distintos donantes si es necesario el retrasplante conel fin de minimizar el riesgo de inflamación postoperatoria inmediata 21.

• Permitir una adecuada reepitelización: de todas sus propiedades probablemente sea lamás importante y la que permite que su utilización sea hoy tan popular en Oftalmología.Numerosos autores utilizando muy difer entes membranas basales han llegado a la con-clusión de que favorecen una más rápida epitelización. La membrana no es otra cosa queuna capa de células epiteliales asentadas sobr e un tejido constituido por sustancia fun-damental (matriz extracelular, membrana basal). Se ha visto que la membrana amnióti-ca expr esa mRNA de gran númer o de factor es de cr ecimiento (EGF, K GF, HGF ybFGF) que pueden fav orecer la r eepitelización tras su trasplante, tanto si llev a célulascomo si no, aunque las cantidades de factor es de cr ecimiento son significativ amentemayores cuando el epitelio está adherido a la membrana, que sugier e un origen epitelialpara estos factores de crecimiento22. Se ha demostrado que el cultiv o de fibroblastos enpresencia de una matriz de membrana amniótica reduce la expresión de TGFß, así comolas señales intercelulares vía CD44, integrina b1 y FGFR1/flg 23. El resultado final con-forma un fenotipo menos mitogénico, contráctil y fibr ogénico que podría explicar enparte el efecto inhibidor de la cicatrización que la membrana amniótica pr esenta cuan-do es utilizada en la reconstrucción de la superficie ocular. Este mismo resultado ha sidoconseguido por otros autores 24, que también comunican una supr esión del receptor deTGFß tipo II y de la difer enciación a miofibroblastos de un cultivo de fibroblastos cor-neales y limbares en presencia de una matriz de membrana amniótica. Algunos autores25

otorgan a la membrana amniótica una actividad inhibidora de la pr oteinasa que podríaser útil en el desarr ollo de agentes para el tratamiento de queratitis r ecidivantes.Asimismo, se ha detectado en el estr oma de la membrana amniótica criopreservada tin-ción positiva para los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas, agentes con conoci-do efecto antiangiogénico y antiinflamatorio 26.

En su ya mencionado trabajo de 1995, Kim y Tseng lanzan de nuev o la idea de que lareconstrucción de una super ficie ocular alterada puede lograrse implantando una mem-brana basal gruesa sobre la cual el epitelio restante (en este caso el conjuntival) pueda des-lizarse con más facilidad para cubrir el defecto y r estaurar una super ficie ocular lo másfisiológica posible. El mecanismo por el cual este pr oceso reparativo tiene lugar es incier-to. Es posible que la composición de la membrana amniótica (en su mayor parte una grue-sa membrana basal) juegue un papel impor tante por medio de varios mecanismo:

• Facilita la migr ación de las células epiteliales: en el trabajo experimental de Kim yTseng se apr ecia que tras el trasplante de membrana amniótica ( TMA) algunos ojos

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(desafortunadamente no todos) experimentan una pr ogresiva epitelización con unasuperficie relativamente transparente y escasa vascularización. Dado que las células lim-bares y corneales habían sido pr eviamente eliminadas, se puede afirmar que las célulasque cubren la membrana amniótica deriv an del epitelio conjuntiv al. Estudios pr eviosrealizados en otros órganos27 ya habían llegado a la conclusión de que la presencia de unamembrana basal fav orece la migración de células epiteliales. Esta labor facilitadora delcrecimiento y migración de las células epiteliales se v e facilitado en gran medida si lasuperficie de la membrana amniótica es denudada pr eviamente de sus pr opias célulasepiteliales, como han demostrado Koizumi y cols28. Sin embargo, los mecanismos mole-culares de esta acción fav orecedora de la epitelización son todavía el gran desconocido .Recientemente, Yeh y cols 29 han descrito una glicopr oteína derivada de la membranaamniótica humana, el L umican, que administrada de forma soluble a tejidos cornealesde animales de experimentación es capaz de favorecer la proliferación y migración de lascélulas epiteliales, permitiendo una cicatrización más rápida de las heridas.

• Evita la vascularización de la superficie corneal: una de las características más comunesde la gran may oría de trabajos consultados (entr e ellos el trabajo experimental de Tsengsobre el efecto inhibidor que sobre la vascularización corneal tiene el TMA en ojos de ani-mal de experimentación30) es la coincidencia en destacar la menor vascularización (en algu-nos ojos ausente) de la córnea en comparación con los ojos no sometidos a TMA. La pro-pia avascularidad de la membrana amniótica podría ser determinante, dado que podríareducir los tejidos de granulación v ascularizados y las cicatrices en el postoperatorio .Algunos autores han comunicado la identificación de proteínas que se comportarían comoagentes antiangiogénicos en la membrana amniótica humana 31. Estudios posteriores reali-zados por Kobayashi y cols han demostrado la inhibición de la migración y crecimiento decélulas endoteliales de cordón umbilical tras la administración de un extracto de membra-na amniótica obtenido tras su digestión con colagenasas 32, lo cual sugiere que su adminis-tración podría ser útil en las enfermedades corneales que cursan con neo vascularización.

• Favorece la diferenciación de un epitelio conjuntival a otro más parecido al corneal.El epitelio conjuntival es típicamente negativo para los marcadores AE5 y AK2 (dos anti-cuerpos monoclonales dirigidos contra componentes específicos de la queratina) y posi-tivo para el AM3 (que identifica las pr oteínas glicosiladas de las células caliciformes,habitualmente presentes en la conjuntiv a pero ausentes del epitelio conjuntiv al) mien-tras el epitelio corneal pr esenta unas características tintoriales totalmente difer entes(positividad para AE5 y AK2 y negatividad para AM3). E n el trabajo experimental deKim y Tseng46 las córneas no sometidas a TMA mostraban un fenotipo típicamente con-juntival, mientras aquellas córneas en las que el r esultado fue mejor captaban los anti-cuerpos AE5 y AK2 sugiriendo presencia de subunidades de queratina y, por tanto, ins-tauración de un fenotipo corneal, aunque estas circunstancias pueden no ser exactas dadala posibilidad de r eacción cruzada de esos anticuerpos con otras subunidades pr oteicas.Sin embargo, la conclusión que resulta fácil extraer es que en determinadas condicionesambientales el epitelio conjuntiv al es capaz de modificarse pr oduciendo queratina asemejanza del epitelio corneal. Sin embargo, estudios posteriores realizados en humanosmediante citología de impr esión 33 señalan el hecho de que el epitelio pr esente sobre lamembrana amniótica no es un epitelio corneal sino que continúa teniendo células cali-ciformes y que se trata, por lo tanto, de un epitelio conjuntival. No existiría, por lo tanto,una transdiferenciación de epitelio conjuntiv al a otro corneal. Otros autores han culti-vado fragmentos conjuntivales y células epiteliales corneales sobre membrana amniótica,habiendo podido demostrar al final del mismo que los mar cadores inmunohistoquími-cos de ambos tejidos permanecen sin cambios 34.

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• Impide la apoptosis de las células epiteliales: estudios en difer entes órganos handemostrado que la presencia de una membrana basal 35 o de una matriz extracelular 36 escapaz de evitar la apoptosis de las células epiteliales r escatándolas hacia un nuev o ciclocelular.

• Actúa como inhibidor de la fibrosis: se ha demostrado que la membrana amniótica ejer-ce una do wn-regulation sobre las señales que activ an la secr eción de factor es de cr eci-miento, responsables de la activ ación fibroblástica en el pr oceso de cicatrización de lasheridas 37. Estudios muy r ecientes de Kim y cols 38 sugieren que la utilización de unextracto de membrana amniótica sobre una base oleosa reduce la migración de polimor-fonucleares, la apoptosis de queratocitos y la per oxidación lipídica en ojos de animalesde experimentación sometidos a PRK, lo cual puede sugerir que su aplicación puede serútil en aquellos procesos que cursan con cicatrización ocular importante. El mecanismode acción por el que consigue este efecto no es del todo conocido. La MA constituye unacapa continua de colágeno sobre la esclera que podría actuar como barrera mecánica antela formación de fibrosis. Por otro lado, los diferentes factores de crecimiento producidosen las células epiteliales de la MA podrían ser los r esponsables de la modulación de laproliferación y diferenciación de los fibroblastos estromales y conjuntivales, así como lainhibición de la señal de beta-T GF 39, limitando el pr oceso de formación de cicatrices.Además, parece que la MA pr omueve la epitelización normal y el paso de citoquinasentre las células epiteliales y estromales, que podrían ser las responsables de inhibir la for-mación de tejido fibrótico40.

Algunos estudios han intentado cambiar las pr opiedades de la membrana amnióticasometiéndola a un tratamiento enzimático, aunque según las conclusiones de los mismosautores 41 los resultados que se obtienen no son mejor es que si se utiliza sin tratamientoalguno. Sí se necesitan tratamientos adicionales en el caso de que se quiera utilizar la mem-brana como sopor te vital para un cr ecimiento celular 42. De todas formas es inter esanteseñalar que, según trabajos r ecientes de Kruse y cols, la criopr eservación elimina la viabi-lidad de las células epiteliales de la membrana amniótica 43.

SISTEMAS DE CONSERVACIÓN DE LAMEMBRANA AMNIÓTICAEn el momento actual, la inmensa may oría de trasplantes de membrana amniótica que serealizan en el mundo en sus div ersas aplicaciones se llevan a cabo con membrana amnióti-ca criopreservada sin otr o tipo de manipulación. S in embargo, continúa la búsqueda demedios de conservación alternativos que puedan facilitar su almacenamiento y distribución.

Existen publicaciones aisladas sobr e la utilización de la membrana amniótica en fr esco,modificada enzimáticamente, mantenida en medio de cultiv o y sobr e la utilización demembrana amniótica liofilizada en div ersas enfermedades (epidermolisis bullosa, v estibu-loplastia).

Aunque existen, como ya hemos mencionado, comunicaciones aisladas sobr e la utiliza-ción de membrana amniótica en fr esco 44, en el momento actual se considera una técnicapoco recomendable. El riesgo, no por pequeño desdeñable, de que una pr ueba serológicade HIV con resultado negativo represente un período ventana y, por tanto, se trate de unmaterial contaminado, nos obliga a r ealizar una segunda pr ueba ser ológica meses mástarde45, circunstancia que, evidentemente, no nos es de utilidad si el injerto ya ha sido rea-

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lizado. Esta desv entaja podría eliminarse con la sistematización de las determinacionesserológicas por PCR, per o no permite ampliar el plaz o de utilización del tejido . Por otraparte, estudios r ecientes realizados sobre placentas obtenidas tras par tos vaginales o porcesárea encontraron contaminación bacteriana en todos los especímenes estudiados (mediade 2,45 especies por muestra en los par tos por cesárea y 3 en los par tos vaginales), entreellos estafilococos, P. acnes, difteroides, Shigella y B. fragilis, entre otros46. De aquí la nece-sidad de un tratamiento pr evio a su implantación y de unos medios de conser vación quenos aseguren la pureza microbiológica.

La liofilización tiene impor tantes ventajas teóricas sobr e la criopr eservación: el manteni-miento de la membrana se puede r ealizar a temperatura ambiente siempr e que se evitentemperaturas extremas, lo que facilita enormemente el traslado hasta el centr o donde sevaya a realizar el procedimiento, incluso a miles de kilómetros de distancia. Los tejidos lio-filizados pueden ser enviados a su destino por medio de un ser vicio de mensajería ordina-rio y se puede disponer del stock necesario in situ, lo que disminuye enormemente los gas-tos de logística en comparación con el transpor te refrigerado requerido por la membranacriopreservada y su caducidad, mucho más rápida que en el caso de la liofilización (pocosmeses frente a varios años). Además, la esterilización por radiación utilizada en el pr ocesode liofilización permite asegurar unas condiciones de esterilidad que el procedimiento con-vencional no puede asegurar al 100 %. Los estudios r ealizados por N akamura y cols 47

muestran que la MA liofilizada mantiene la may oría de las características físicas, biológi-cas y morfológicas de la MA criopreservada, por lo que se trata de una alternativa factible,aunque en la actualidad poco utilizada.

La liofilización es un pr oceso de conser vación cuya utilidad se encuentra ampliamentereconocida para otros tejidos humanos utilizados en cirugía oftalmológica (fascia lata parael tratamiento de las ptosis palpebrales mediante suspensión al fr ontal, duramadre liofili-zada utilizada para r ecubrir pr ótesis intraesclerales de politetrafluor oetileno expandido(PTFE) en evisceraciones, pericar dio utilizado para r ecubrir v álvulas de deriv ación enpacientes con glaucomas r efractarios para evitar su extr usión) y en otr os tipos de cir ugía(hueso). Estas prótesis biológicas se encuentran almacenadas en el mismo antequirófano yúnicamente se han de rehidratar en los minutos previos a la intervención o al principio dela misma. Otra ventaja añadida es el hecho de que, al ser tratada con radiación, se asegu-ra todavía más la inviabilidad de las células epiteliales residuales así como la pureza micro-biológica del injerto. Se han realizado estudios en estructuras oculares (córneas de anima-les de experimentación) que demuestran que la liofilización no altera sustancialmente laarquitectura de las fibras de colágeno contenidas en la córnea 48. Estos estudios y la expe-riencia con otr os materiales biológicos que ya se someten a este medio de conser vaciónhace factible pensar en que el compor tamiento de la membrana amniótica liofilizada seasimilar al de la criopreservada.

Entre los inconv enientes que plantea la liofilización se encuentra el hecho de que en elmomento actual existe escasa experiencia en el pr ocesado de la membrana amniótica conesta técnica, existiendo muy pocos bancos de tejidos que suministren membrana amnióti-ca liofilizada debido a que se necesitan unas instalaciones muy especializadas. P or otraparte, estudios r ecientes muestran que la liofilización ocasiona una disolución par cial delos haces de colágeno en fibras simples, además de presentar un menor grosor final que lasmembranas amnióticas criopreservadas en glicerol o preservadas por otros métodos. Paraestos autores este diferente grosor nos permitiría optar por injer tos más finos o más gr ue-sos en función de la enfermedad a tratar 49.

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OBTENCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LAMEMBRANA AMNIÓTICA

ObtenciónLas placentas se obtienen de partos controlados mediante cesárea electiva. Previamente a laobtención del tejido se ha obtenido el consentimiento informado autorizando la donación.

Selección de la donante

El protocolo de selección de las donantes de MA sigue las mismas ev aluaciones que losdonantes de órganos y tejidos para trasplante, siendo criterios de ex clusión específicos:

• Embarazo no controlado.• Historia obstétrica con alteraciones.• Presencia de síntomas de infección en el neonato .• Fiebre materna superior a 38 ºC.• Gestación inferior a 34 semanas.• Bolsa rota más de 12 horas antes del par to.• La placenta debe colocarse en un r ecipiente previamente esterilizado y envuelto en una

doble bolsa estéril.

Desde el momento de la extracción hasta su llegada al centr o de pr ocesamiento el tejidodebe permanecer en frío, con una oscilación de temperatura entr e 2 y 8 ºC. El tejido debeacompañarse de un tubo de sangre de la madre para la realización de controles serológicos(tabla 1). Al tratarse de un donante viv o es necesario cubrir el periodo v entana de estasenfermedades. Por ello se debe realizar el estudio de la donante en el momento del par to ycon posterioridad, esperando un mínimo de 3 meses si utilizamos serologías, o un mínimode 10 días si el método utilizado es la PCR. E l envío de la placenta al centr o de procesa-miento debe ser lo más rápido posible, siendo el tiempo límite de 24 horas. (F otos 1 y 2.)

ProcesamientoUna vez obtenida la placenta se pr ocede a su lav ado bajo condiciones de flujo laminar consuero fisiológico estéril solo o con la adición de un combinado de antibióticos: penicilina (50 µg/ml), estreptomicina (50 µg/ml) neomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (100 µg/ml).

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Posteriormente, el amnios es separado del resto del corion mediante disección roma (foto3) y tendido sobre un papel de nitrocelulosa con la superficie correspondiente al epitelio yla membrana basal hacia la par te superior. A continuación se pr ocede a r ecortar el papelcon la membrana amniótica adherida en discos de 3 x 4 cm que son almacenados a –80 ºCen placas de P etri estériles con glicer ol y medio de Eagle modificado por D ulbecco(DMEM) al 50 %. (Foto 4.)

De esta manera podemos conservar la MA congelada y disponible para su uso durante unmínimo de 12 meses, aunque pr obablemente sea viable con garantías durante más tiem-po. Para utilizarla basta con extraerla del congelador 10-15 minutos antes de la cirugía, yaque en poco tiempo se produce la descongelación a temperatura ambiente.

APLICACIONES DEL TRASPLANTE DEMEMBRANA AMNIÓTICAMecanismo de acción de la MALos mecanismos de acción potenciales del trasplante de MA se encuentran ob viamenteíntimamente relacionados con las moléculas que sintetiza y secr eta, tal y como se puedeobservar en las tablas 2 y 3:

• El epitelio amniótico contiene gran cantidad de factores de crecimiento y citoquinas quemantienen el microambiente necesario para la proliferación de las células germinales.

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Foto 1. Llegada de la placenta al centrode procesamiento.

Foto 2. Aspecto macroscópico de la placenta una vez abierta la bolsa.

Foto 3. Disección roma separando elamnios del resto de corion.

Foto 4. Tendido de la membrana amniótica sobre papel de nitrocelulosa.

• La Membrana basal contiene colágeno tipo IV, laminina 1, laminina 5, fibr onectina ycolágeno VII. Su composición es muy similar a la de la conjuntiv a y las lamininas sonparticularmente efectivas en mejorar la adhesión de las células epiteliales de la córnea. Engeneral la membrana basal de la MA facilita la migración de las células epiteliales, refuer-za las adhesiones de las células epiteliales basales, pr omueve la diferenciación epitelial ypreviene la apoptosis.

• La matriz estromal. La por ción estromal de la AM contiene un componente de lamatriz que suprime la señalización mediante el TGF-beta, así como la pr oliferación ydiferenciación de los miofibroblastos de la córnea humana normal y de los fibroblastosdel limbo. Este componente también suprime la pr oliferación y difer enciación de losfibroblastos de la conjuntiv a normal y de los fibr oblastos del cuerpo del pterigium.Estas acciones explican por qué el trasplante de MA r educe la formación de cicatricescuando se utiliza en la r econstrucción de la super ficie conjuntival, previene la cicatri-zación recidivante tras la r esección del pterigion y r educe la opacidad estr omal tras laqueratectomía fototerapeútica y la queratectomía fotor efractiva. La matriz estr omalpuede también atrapar las células inflamatorias excluyéndolas del resto de los tejidos yllevándolas a una rápida apoptosis. También contiene pr oteínas antiinflamatorias yantiangiogénicas y sustancias inhibidoras de v arias proteasas. Estas propiedades expli-can por qué la inflamación estr omal y la neovascularización corneal se r educen tras eltrasplante de MA.

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Formas de implantar la membrana amnióticaSe han descrito dos formas de implantarla50: como injerto o como recubrimiento, segúnel objetivo deseado porque tiene comportamiento e indicaciones diferentes. Según el ladopor el que se implante la membrana amniótica, se puede utilizar como «parche biológico»si se utiliza por su cara epitelial (no adhesiva, rica en citoquinas inmunomoduladoras, fac-tores de crecimiento epitelial,...) o como injerto «suministrador de tejido» si es por su caraestromal (rica en lamininas de colágeno). F iguras 1 y 2.

En los casos que se usa como injerto el objetivo es emplear la MA, aprovechando su grue-sa membrana basal como sopor te que fav orezca la epitelización rápida. A demás, propor-ciona una reducción de la inflamación, de la v ascularización y de la formación de cicatri-ces. Para ello recortamos un fragmento de MA del tamaño adecuado y lo depositamos enel interior del lecho ulcer oso o defecto estromal. Al encontrarse destruida o inexistente lamembrana basal del epitelio corneal en el seno del lecho ulcer oso, dificulta el proceso dereparación fisiológico de las heridas corneales, dando lugar al fenómeno anómalo de repa-ración, de conjuntivilización corneal. Así, las células sanas del bor de de la herida tendránun soporte (la membrana) sobre el que r eplicarse centrípetamente hasta “cerrar” la úlceracorneal. La MA se debe colocar con la super ficie epitelial mirando hacia arriba y la estr o-mal hacia abajo. Esta orientación es fundamental para conseguir mayor adhesividad y mul-tiplicación celulares.

El tamaño del fragmento de MA que debemos emplear para r ellenar el defecto debe sersimilar al tamaño del lecho ulcer oso, de tal modo que no sobr epase los bordes. Si sutura-mos la MA al tejido corneal cir cundante es pr eferible hacerlo mediante nylon monofila-mento de 10.0. Otros autores prefieren emplear poliglactina (vicryl) 9-0 y/o 10-0, ya queno hay que retirar la sutura al ser reabsorbible. Si anclamos la MA al tejido conjuntival cir-cundante y/o epiescleral se recomienda utilizar vicryl 9-0. El parpadeo continuo puede lle-gar a desprender la MA durante los primeros días: las lentes de contacto terapeúticas pue-den ser útiles en las primeras semanas, así como la r ealización de una tarsorrafia lateral.

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Figura 1. Utilización de la membrana amniótica como injerto

Figura 2. Utilización de la membrana amniótica como recubrimiento

Finalmente, recordar que antes de suturar la MA a modo de injer to, es importante revita-lizar los bordes de la lesión o lecho ulcer oso eliminando el tejido necr ótico para anclar laMA a tejido sano.

La segunda opción es el uso de la MA como un recubrimiento. La super ficie se r ecubrecon el fragmento de MA sobr epasando los márgenes del defecto epitelial, de manera queel objetivo es conseguir reducir el proceso inflamatorio, favorecer la epitelización y dismi-nuir el pr oceso y cicatrización bajo la membrana. (F otos Caso 1.) C uando se emplea deeste modo, la MA funciona esencialmente como una lente de contacto terapéutica bioló-gica temporal 51. La MA tarda en reabsorberse entre 3 y 4 semanas aproximadamente. Porlo tanto, no sólo actúa pr oporcionando una barr era mecánica sino también actúa comouna barrera fisiológica para proteger la córnea subyacente o el estroma limbar de los media-dores de la inflamación segregados en la película lagrimal y de la infiltración de las célulasinflamatorias. La orientación del fragmento de la MA no parece ser tan importante con latécnica del par che como en la técnica del injer to, aunque también se r ecomienda que elestroma de la MA se oriente hacia abajo . El parche se ajusta holgadamente anclado a laconjuntiva y/o epiesclera cir cundante preferiblemente mediante sutura continua que cie-rre a modo de cr emallera. (Fotos Caso 2.) S e suele emplear vicr yl de 9-0 alr ededor dellimbo esclerocorneal. Tabla 4.

Por último comentar la posibilidad de poder utilizar la MA en forma de multicapa, dondese emplean varias capas de MA para tratar úlceras profundas e incluso microperforaciones.Aunque la orientación de las capas más pr ofundas parece no tener impor tancia, se r eco-mienda que la capa más superficial tenga el epitelio (membrana basal) orientada hacia arri-ba, impulsando la epitelización sobre la superficie de la MA del tejido receptor circundantesano. Sólo se necesita suturar la capa más super ficial de la MA, de forma similar a la téc-nica del injerto52.

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Caso clínico 1. Evolución satisfactoria de úlcera neurotrófica pre y post implante de MA.

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Caso clínico 2. Úlcera neurotrófica post queratoplastia penetrante que requirió implante de MA.

La membrana amniótica como injer to en la reconstrucción de la conjuntivaEl trasplante de MA facilita la epitelización manteniendo el fenotipo epitelial normal yreduce la inflamación, la neovascularización y la formación de cicatrices. Implantada comoinjerto en zonas de defecto tisular conjuntiv al, la MA ayuda a r estaurar un estroma nor-mal y proporciona una membrana basal adecuada para una nueva proliferación y diferen-ciación epitelial 53.

Ha sido utilizado con éxito en tratamiento del pterigium 54 (Fotos Caso 3), de tumor esconjuntivales55, cicatrices conjuntivales y simbléfaron56 y conjuntivochalasis57. Como sus-tituto de un autoinjerto de conjuntiva, el injerto de MA puede utilizarse para el cierr e deampolla de filtración de glaucoma per foradas 58 y, con o sin un injer to de esclera, puedeayudar a reparar perforaciones esclerales 59 (Fotos Caso 4). La MA también puede ser unabuena alternativa a los autoinjer tos de conjuntiva o de membrana mucosa en cir ugía pal-pebral y orbitaria.

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Caso clínico 3. Cirugía de pterigium con exéresis simple e implante de MA.

La membrana amniótica como injer to en la reconstrucción de la superficie cornealEn los casos de insuficiencia límbica parcial, la MA restablece el entorno de las células ger-minales en el estr oma del limbo esclerocorneal, reduciendo la inflamación y estimulandola proliferación de estas células. En las situaciones en que el déficit de células germinales estotal, se hace imprescindible el trasplante de limbo que restablece la población de las célu-las germinales.

Como injerto es útil en el tratamiento de patologías de la super ficie corneal, promovien-do la curación de úlceras corneales persistentes de difer ente etiología 60 (Fotos Caso 5);defectos epiteliales persistentes asociados y no asociados a severo adelgazamiento del estro-ma corneal; secundarios a queratitis neur oparalíticas, después de queratoplastia penetran-te, por exposición, secundarios a infecciones, cicatriciales, postquir úrgicos (queratopatíasbullosas sintomáticas 61), erosiones corneales recidivantes...

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Caso clínico 4. Sutura con nylon 10.0 y aplicación de MA en paciente con úlcera corneal y perforación corneal tras cirugías repetidas de pterigium.

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La utilización del injer to de MA puede ser también útil en la queratopatía en banda trasretirar los depósitos cálcicos, aunque este método no pr eviene la r ecurrencia de nuev osdepósitos62.

La membrana amniótica como recubrimientoLa MA se puede utilizar como recubrimiento de forma temporal o prolongada. Cuando seutiliza como r ecubrimiento la MA r educe las opacidades corneales que pueden apar ecertras la ablación estr omal con el láser ex cimer o PRK 63. Además, también r educe la infla-mación (Fotos Caso 6). Además, también facilita la epitelización y pr eviene la formaciónde cicatrices causadas por causticaciones químicas agudas. Finalmente, el recubrimiento deMA también se ha usado con éxito en la fase aguda del síndr ome de Stevens-Johnson.

Caso clínico 5. Injerto de MA en úlcera corneal.

La membrana amniótica como sustrato para el cultivo de las células germinales epitelialesdel limbo esclerocornealLas patologías oculares que cursan con una deficiencia limbar parcial y unilateral podemostratarlas mediante un trasplante de limbo pr ocedente del ojo contralateral sano . S inembargo, esta técnica r equiere la extracción de un gran fragmento de limbo del ojo con-tralateral sano que, cuando se trata de lesiones bilaterales, no podemos disponer con faci-lidad. La MA puede ser utilizada como soporte para el crecimiento de estas células en cul-tivos in vitro. Esta nueva técnica representa un gran avance en el tratamiento de pacientescon insuficiencia límbica severa en un ojo pero que mantienen zonas de limbo sano en elojo contralateral. Tres o cuatr o semanas después se dispone de un fragmento de MAcubierto por gran cantidad de células germinales del limbo que puede implantarse comoautoinjerto en el ojo afectado para restaurar la superficie corneal. Esta técnica, que evita elriesgo de rechazo y la necesidad de inmunosupr esión sistémica, ha sido ya utilizada tantoen animales como en humanos 64.

Una de las limitaciones que presenta esta técnica de cultivo de células madre procedentesde una biopsia de limbo esclerocorneal es que no sabemos exactamente qué estamos culti-vando: si células madre sólo, o bien un conjunto formado por células madre, células ampli-ficadoras transitorias y células diferenciadas. Con las tecnologías disponibles en la actuali-dad no podemos r ealizar con cer teza una biopsia selectiv a de las células madr e, que seríala situación ideal. Los intentos de caracterización e identificación de mar cadores inmu-

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Caso clínico 6. Mejoría significativa tras implante de MA en un caso de queratopatía bullosa postqueratoplastia penetrante.

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nohistoquímicos de las stem cells corneales humanas es uno de los grandes r etos a los quese está enfrentando la oftalmología en la actualidad. E ntre los marcadores propuestos nosencontramos la P63, citoqueratina K3, vimentina, ABCG2,... 65

Otra de las alternativas que se han empleado con éxito para la r econstrucción de la super-ficie ocular es el cultivo de células de la mucosa oral, tanto en conejos como en humanos,sobre MA 66.

LimitacionesEl trasplante de MA cuenta también con una serie de limitaciones, en las cuales el tras-plante por sí solo no es suficiente para conseguir el éxito . La primera de estas limitacioneses el déficit absoluto de “ stem cells” a nivel del limbo escler ocorneal, siendo necesario enestos casos el trasplante de células limbar es, como hemos visto con anterioridad.

Aunque el trasplante de MA funciona en muchos casos de úlcera neurotrófica, en ojos conalteraciones tróficas muy importantes, y en los ojos con necrosis estromales severas la MApuede no ser suficiente. De la misma manera, en ojos con isquemia sev era o con ausenciade lágrima el trasplante de MA no conseguirá restablecer la superficie ocular, y en algunoscasos puede incluso apar ecer una infección postoperatoria (estos pacientes car ecen de losmecanismos de defensa que pr oporciona la sangre y la lágrima). F inalmente, y aunque laMA reduce significativ amente la inflamación, ésta puede fracasar en ocasiones por unasevera inflamación en la superficie ocular. En presencia de una reacción inflamatoria puedeser reabsorbida rápidamente (tanto en implantes tipo injer to como tipo recubrimiento).

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