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RESÚMENES DE LAS COMUNICACIONES 77

MEDICINA (Buenos Aires) 2004; 64: 77-380

RESÚMENES DE LAS COMUNICACIONES

BIOLOGÍA GENERAL 1: ZOOLOGÍA

1. (6665) CLONADO Y EXPRESIÓN DE LA CITOCROMO P450AROMATASA CEREBRAL Y RECEPTORES DE ESTRÓ-GENOS (ALFA Y BETA) EN EL PEJERREY ODONTESTHESBONARIENSIS. STROBL, PABLO; MIRANDA, LEANDRO;MONCAUT, NATALIA; SOMOZA, GUSTAVO

IIB-INTECH. Chascomús. Buenos Aires.

En peces teleósteos, el estradiol (E[2]) está asociado a dis-tintos eventos fisiológicos: vitelogénesis, comportamiento y dife-renciación sexual. Muchas funciones cerebrales como la prolife-ración, morfología, supervivencia y sinaptogénesis neuronal de-penden de la síntesis local de E[2] a partir de testosterona poraromatasa (P450arom). Esta enzima ha sido detectada en dis-tintos tejidos, principalmente en cerebro de peces en donde sehan descripto dos variantes: aromatasa gonadal (P450aromA) ycerebral (P450aromB). El objetivo de este trabajo fue clonar elADN copia de P450aromB, ER-a y ER-ß y evaluar su expresiónen diferentes tejidos y áreas cerebrales para estudiar la regula-ción estrogénica de la diferenciación sexual y reproducción enpejerrey. El ADN copia (2503pb) conteniendo el ORF (1506pb)de P450aromB fue obtenido de una genoteca de cerebro ehipófisis de pejerrey. Fragmentos parciales de ER-a y ER-ß fue-ron clonados por RT-PCR, al igual que para P450aromB y utili-zados para evaluar su expresión en distintos tejidos. Se demos-tró expresión de P450aromB, en cerebro, hipófisis y riñón; mien-tras que ER-a y ER-ß se expresan en riñón, bazo, hígado, cere-bro, hipófisis y gónadas en ambos sexos. ER-a se expresa en bran-quia de hembra y ER-ß en la de ambos sexos. Se evaluó por RT-PCR semicuantitativa la expresión de estos tres genes en cere-bro anterior, medio, posterior e hipófisis de ambos sexos, utilizan-do ß-actina como gen de referencia. Se demostró mayor expre-sión de P450aromB (p

MEDICINA - Volumen 64 - (Supl. II), 200478

4. (6808) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE FSH-ß Y LH-ß EN EL PEJERREY BONAERENSE. MIRANDA,LEANDRO; SOMOZA, GUSTAVO; STRÜSSMANN, CARLOSIIB-INTECH (CONICET-UNSAM). Tokyo University ofMarine Science and Technology.

En peces teleósteos las gonadotrofinas (GtHs), hormonaluteinizante (LH) y la hormona folículo estimulante (FSH)secretadas por la hipófisis son las hormonas más importantesen la regulación de la gametogénesis y la maduración gonadal.Las GtHs son glicoproteínas que están formadas por dossubunidades: la alfa, común a FSH y LH en una misma especiey la subunidad beta que difiere y les confiere especificidad bio-lógica. En el presente trabajo se describe el clonado moleculary el análisis de la secuencia de las subunidades ß de FSH y LHen el pejerrey Odontesthes bonariensis, un desovador múltiplecon importancia económica en la región. Las secuencias com-pletas de los ADNc codificantes para FSH-ß y LH-ß se obtuvie-ron mediante 3’ y 5’ RACE a partir de la retrotranscripción deARN total de hipofisis de ejemplares de pejerrey sexualmentemaduros. El ADNc para FSH-ß y LH-ß de pejerrey está consti-tuido por 460 y 558 pb con un marco de lectura abierto de 345 y450 pb respectivamente. De la comparación con la secuenciaaminoácidica obtenida en otros peces teleósteos podemos de-ducir para FSH-ß de pejerrey un péptido señal de 15 aminoácidos(aa) y un péptido maduro de 100 aa mientras que LH-ß estaríaconstituida por un péptido señal de 32 aa y un péptido madurode 118 aa. La posición de las 12 cisteínas y un posible sitio deglicosilación identificado en pejerrey para LH-ß se encuentrancompletamente conservados en peces teleósteos. Sin embargo,FSH-ß de pejerrey presenta también 12 cisteínas cuya posiciónno se encuentra altamente conservada en peces teleósteos.Además, la identidad aminoacídica entre pejerrey FSH-ß y elresto de peces varía entre 24.6 y 62.8% mientras que para LH-ß estos valores se encuentran entre 49.8 y 72.4%. Estos resul-tados muestran que la estructura primaria de LH- ß ha sido me-jor conservada que la de FSH- ß durante la evolución de lospeces teleósteos. La caracterización de estos genes es de im-portancia para estudiar sus variaciones en el ciclo reproductivo.

5. (6817) DMRT1 COMO MARCADOR DE SEXO EN ELPEJERREY ODONTESTHES BONARIENSIS. FER-NANDINO, JUAN; GUILGUR, GASTÓN; STROBL-MAZZULLA, PABLO; SOMOZA, GUSTAVO

Lab. Ictiofisiología IIB-INTECH

En el pejerrey bonaerense, el sexo fenotípico está determi-nado por la temperatura a la que son expuestas las larvas en unperíodo crítico, fenómeno conocido como Determinación Sexualpor Temperatura (TSD). En mamíferos se han identificado va-rios genes autosomales envueltos en la vía de diferenciaciónsexual y muchos de ellos también han sido identificados en dis-tintos vertebrados, como SOX9, DMRT1, SF1 y AMH. DMRT1(Doublesex Maleabnormal-3 Related Transcription factor-1) es unfactor de transcripción que contiene un motivo de unión al ADN,dominio DM, similar al doublesex (dsx) identificado en Drosophilay a mab-3 en Caenorhabditis elegans, que juegan un rol crucialen la diferenciación sexual a macho. La deleción de este gen enhumanos causa reversión sexual de macho a hembra. En em-briones de ratón la expresión de DMRT1 es similar en la crestagenital indiferenciada en ambos sexos pero en estadios másavanzados de diferenciación muestra un claro dimorfismo y sólose expresa en testículo. La expresión de este gen fue tambiénestudiada en tres especies de reptiles con TSD en donde DMRT1se expresa sólo en temperaturas formadoras de machos. Enpeces teleosteos también se ha caracterizado este gen y su ex-presión y está generalmente asociado a macho pero en truchaarco iris su expresión fue detectada tanto en testículo como enovario, aunque en menor medida. El objetivo de este trabajo fuecaracterizar el sitio de expresión de DMRT1 en pejerrey por RT-PCR. Se utilizaron peces de pejerrey de 7 meses de plantelesmonosexo y mixtos generados por temperatura. Además se to-

maron adultos en diferentes estadios gonadales. Una gonada fueutilizada para realizar cortes histológicos y la otra para realizarRT-PCR con cebadores específicos. Se determinó también laexpresión de DMRT1 en distintos tejidos. DMRT1 presenta unaexpresión dimórfica, ya que sólo se expresa en tejido testicularen todos los estadios analizados y puede considerarse como unmarcador de sexo en el pejerrey. Se estudiará su expresión enel período crítico de TSD.

6. (7097) SUSCEPTIBILIDAD A LA LIPOPEROXIDACION DEMITOCONDRIAS DE RIÑON Y CEREBRO DE PALOMA(COLUMBA LIVIA). GUTIERREZ, ANA M (1); REBOREDO,GUILLERMO R (1); MOSCA, SUSANA M (1); CATALÁ, AN-GEL (2)

Cátedra de Fisiología Animal. Fac Cs Naturales y Museo.UNLP. (1) Cát de Fisiología Animal. Fac Cs. Nat. y Mu-seo. (2= Cát de Bioquímica. Fac. Cs. Veterinarias. UNLP

En estudios previos realizados en nuestro laboratorio mostra-mos la composición lipídica y la sensibilidad a la lipoperoxidaciónde las mitocondrias de hígado de la paloma casera Columba livia.El contenido de ácidos grasos de membranas biológicas difiereentre especies y tejidos de la misma especie. El objetivo del pre-sente trabajo fue determinar el perfil lipídico y la susceptibilidad ala lipoperoxidación de las mitocondrias de riñón y cerebro de lapaloma. Estas organellas fueron incubadas en un sistemaascorbato-Fe++ in vitro, midiendo quimioluminiscencia y variaciónen la composición de los ácidos grasos. El contenido de los áci-dos grasos saturados y no saturados fue de aproximadamente 50%en las mitocondrias de ambos órganos. La contribución de cadaácido al total de ácidos grasos nosaturados fue diferente en losdos órganos. Los porcentajes de C18:2n6, C20:4n6 y C22:6n3fueron 20.5 ± 0.9%, 14.0 ± 0.3% y 1.9 ± 0.1% en mitocondrias deriñón y 0.8 ± 0.2%, 12.7 ± 1.1% y 13.1 ± 2.0% en mitocondrias decerebro. La relación 20:4/18:2 en mitocondrias de cerebro fueaproximadamente 23 veces mayor que en riñón. Las organelas deambos órganos fueron afectadas por el proceso de peroxidaciónlipídica, siendo la emisión lumínica significativamente mayor en lasmitocondrias de cerebro (1.3 veces la de riñón). Los resultadosmuestran que las mitocondrias de riñón de paloma son menos sus-ceptibles al proceso de lipoperoxidación que las mitocondrias decerebro. Esta diferencia podría atribuirse a que las mitocondriasde riñón presentan un menor contenido del ácido altamente nosaturado, C22:6n3 y un mayor contenido de un ácido menos sa-turado, el C18:2n6.

7. (7156) REGULACION DE VOLUMEN EN HEPATOCITOSDE GOLDFISH. PAFUNDO, DIEGO E.; PÉREZ-RECALDE,MERCEDES; FAILLACE, MARIA PAULA; KRUMSCHNABEL,GERHARD (1); SCHWARZBAUM, PABLO J.

IQUIFIB. Facultad de Farmacia y Bioquimica (UBA), Junin856, Buenos Aires. (1) Department of Zoology andLimnology, University of Innsbruck, Insbruck, Austria.

En células hepáticas, la exposición a medios hipotónicos in-duce un rápido aumento de volumen, salida de ATP y disminu-ción regulatoria de volumen (RVD). Se ha reportado que el ATPsecretado, y la adenosina que resulta de su desfosforilaciónextracelular, pueden interactuar con receptores P1 (adenosina)y P2 (ATP) para modular el RVD. En el goldfish, a diferencia delresto de los vertebrados, los hepatocitos sometidos a medioshipotónicos no presentan RVD. El objetivo del presente estudioes verificar si en hepatocitos de esta especie el RVD puede serinducido y modulado por nucleótidos y adenosina extracelulares.El volumen celular fue estimado por microscopía de fluorescen-cia. El RVD fue evaluado a partir de su velocidad inicial (vRVD)y a los 40 min de iniciada la regulación volumétrica (RVD40).Resultados: en presencia de medio 190 mosM (HYPO), se ob-servó un aumento de volumen pero ausencia de RVD, mientrasque HYPO + 5 µMATP indujeron un RVD de 1.83 ± 0.24 (vRVD)y 37.5 ± 3.9 (RVD40). En presencia de HYPO y concentracionesvariables de ATPgS (análogo no hidrolizable del ATP), tanto el


vRVD como el RVD40 mostraron un aumento dependiente de laconcentración del nucleótido (0-50 µM). En medios HYPO + 5µM ATPgS, el agregado de 100 µM de suramina y cibacron blue(antagonistas de receptores P2) causó una disminución del RVDdel 87% (vRVD) y 63% (RVD40). Por otro lado, en presencia deHYPO + 5 µM ATPgS el agregado de 5 µM adenosina redujo elRVD en 53% (vRVD) y 25% (RVD40); esta inhibicion fue reverti-da por 100 µM 8-SPT (antagonista de receptores P1). Si bien enhepatocitos de goldfish sometidos a un medio hipotónico no severifica RVD, este puede ser activado por ATP y ATPgS e inhi-bido por la adenosina. Ambos efectos están mediados por re-ceptores P. Con subsidios de F. Antorchas, UBA, CONICET,ANPCyT (11017) y FWF Austria (P16154-B06).

8. (7158) DETECCIÓN DE VITELOGENINA DE CAIMANLATIROSTRIS (YACARÉ OVERO) COMO BIOMAR-CADOR DE CONTAMINACIÓN AMBIENTAL PORXENOESTRÓGENOS. REY, FLORENCIA; RAMOS, JGUILLERMO; STOKER, CORA; BUSSMANN, LEONARDOE; LUQUE, ENRIQUE H; MUÑOZ DE TORO, MÓNICALaboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonode-pendientes, Fac. Bioquímica y Cs. Biológicas, UNL..IByME, CONICET

En nuestro país los ecosistemas hídricos están amenazadospor contaminantes agroindustriales con actividad hormonal. Laselección de especies centinelas y de biomarcadores es críticapara el diseño de estrategias de evaluación de contaminaciónambiental. La vitelogenina (Vtg) es una proteína producida enhígado de especies ovíparas en respuesta a estrógenos. Nues-tro objetivo fue desarrollar un ELISA para detectar Vtg de yacarésy validar su uso como biomarcador de contaminación ambientalpor xenoestrógenos. Para obtener Vtg plasmática se inyectaronhembras juveniles con una dosis diaria (1mg/kg) de 17ß estradiol(E2) durante 7 días. La Vtg se purificó por precipitación conEDTA-MgCl[2] seguida de cromatografía de intercambio iónico.Con la Vtg purificada se generaron anticuerpos en conejos. Elantisuero se purificó por doble cromatografía de afinidad: unióna proteína A, seguida de unión a matrices ligadas con Vtg. Sediseñó un ELISA de competición por captura de anticuerpo ligan-do Vtg a fase sólida. El límite de detección del ELISA fue 1 ng/ml, la sensibilidad -0.202 ml/µg y el rango de linealidad de 6 a1563 ng/ml. La concentración de Vtg en plasma de hembras tra-tadas con una dosis alta de E2 (7 días con 1mg/kg/día) fue 25.6mg/ml. La administración a yacarés machos de bajas dosis de E2,una única dosis de 1mg/kg o dos dosis separadas 7 días, induje-ron 0.38 mg/ml y 4.65 mg/ml de Vtg en plasma, respectivamente.En machos y hembras juveniles, los niveles basales de Vtg fue-ron no detectables. El efecto de priming observado en machosdemuestra la alta sensibilidad del yacaré a bajas concentracionesde xenoestrógenos. El ELISA desarrollado permitirá monitorear laexposición de poblaciones silvestres de yacaré a estrógenos am-bientales y utilizar a esta especie como centinela.

9. (7385) SOMATOLACTINA: ¿HORMONA DE LA ADAPTA-CIÓN AL ENTORNO EN PECES TELEÓSTEOS? CáNEPA,MAXIMILIANO; PANDOLFI, MATÍAS; CAÑONES,CRISTIAN; MAGGESE, CRISTINA; VISSIO, PAULA

Laboratorio de Embriologia Animal, DBBE, FCEN, UBA.

Los peces teleósteos son un modelo muy interesante para elestudio de la regulación hipotálamo-hipofisaria. Carecen de unsistema portal hipofisario y las neuronas hipotalámicas inervandirectamente las células hipofisarias. En la pars intermedia (PI)de peces teleósteos se encuentran la hormona melanocito esti-mulante (MSH) y la hormona somatolactina (SL). SL estáestructuralmente relacionada con la hormona de crecimiento (GH)y prolactina (PRL) y aunque se la ha involucrado en diferenteprocesos biológicos, su función definitiva aún no se conoce.Objetivo: analizar si existe relación entre SL y la adaptación a lacoloración del entorno en el pez cíclido Cichlasoma dimerus. 90peces juveniles fueron transferidos a peceras con paredes blan-

cas (B) o negras (N) durante 15 días. Luego de este tiempo 15animales de cada tratamiento fueron procesados parainmunocitoquímica (ICQ) con el objetivo de poner en evidencialas células productoras de SL y determinar el área celularinmunomarcada y el número de células inmunoreactivas a SL (ir-SL). A los 30 animales restantes de cada tratamiento se les ex-trajeron las hipófisis, se homogeneizaron y se realizó WesternBlot para determinar los niveles de ir-SL en ambas condicionesexperimentales. Los animales expuestos a un entorno oscuromostraron una pigmentación más oscura y tanto el área prome-dio de las células ir-SL como el número por sección (7 µm) au-mentaron significativamente comparado con los animales prove-nientes de entorno claro (27.39 ± 2.09 µm2, 23 ± 3 (N) vs. 16.61± 1.23 µm2, 7 ± 1 (N), P


tualidad no hay acuerdo en lo referente a sus funciones. El ob-jetivo de este estudio fue determinar la función fisiológica de laglándula uropigia. Hemos observado que en ciertas especiesterrestres la glándula esta más desarrollada que en algunas acuá-ticas. En la paloma casera Columba livia, desarrollamos una téc-nica quirúrgica para remover la glándula lo que permitió demos-trar que la ablación de la misma no afecta la sobrevida de lasaves por lapsos de hasta 60 días. Tres semanas posteriores ala ablación no se observaron cambios de los pesos corporalesni en la alimentación. Tampoco hubo modificaciones en losparámetros bioquímicos básicos asociados al metabolismolipídico como los niveles en suero de colesterol (3.8 ± 0,7 y 4,1± 0,4 g/l: controles(con), n=6 vs. ablacionados(ablac) n=4), delípidos totales (13,8 ± 2,4 y 13,7 ± 2,7 g/l: con, n=6 vs. ablacn=6) y de calcio 8,1 ± 0,4 y 9,9 ± 0,9 g/l. Además se determinóla cantidad de secreción (0,385 mg), el contenido de lípidos to-tales (38%) y la composición de ácidos grasos de la secreciónde la glándula; el ácido graso más abundante fue el C18: 1 (37%).Se realizaron ensayos para evaluar si la glándula esta involucradaen una respuesta defensiva a substancias erógenas lipofílicas.Se inyectaron palomas con el insecticida lindano por un periodode 7 días. Los ejemplares control no presentaron trazas delxenobiótico; mientras que los contaminados alcanzaron un con-tenido de 6,90 µg de lindano por mg de tejido glandular. Estosresultados sugieren que la glándula puede acumular y concen-trar contaminantes, cumpliendo funciones de excreción de sus-tancias tóxicas. Además, podemos afirmar que el rol fisiológicode la glándula no depende de la masa. La secreción de la glán-dula preserva además la estructura física de las plumas y prote-ge la superficie del cuerpo contra factores ambientales.

BIOLOGÍA GENERAL 2: BIOLOGÍA DEL DESARROLLO

12. (6666) EFECTO DE AGONISTAS DE PPAR ALFA SOBRELOS NIVELES DE LÍPIDOS EN FETO Y PLACENTA DERATA A MEDIADOS DE LA GESTA. MARTINEZ, NORA;JAWERBAUM, ALICIA; CAPOBIANCO, EVANGELINA;WHITE, VERÓNICA; PUSTOVRH, CAROLINA; HIGA,ROMINA; GONZALEZ, ELIDACEFYBO - CONICET

Los fibratos son fármacos que modulan el metabolismolipídico en tejido adiposo a través de la activación del receptornuclear PPARalfa. Dicho receptor nuclear es esencial para eldesarrollo placentario y aunque se desconoce su función se ex-presa en el feto a partir del día 13 de gesta. El objeto de esteestudio es evaluar el posible efecto modulatorio de LTB4(agonista endógeno de PPARalfa) y de clofibrato (agonistafarmacológico de dicho receptor) sobre los niveles de lípidosplacentarios y fetales de rata a mediados de la gesta. Metodolo-gía: Los tejidos estudiados se incuban en presencia o ausenciade LTB4 (0.1µM) o clofibrato (20 µM) para luego determinar losniveles de distintas especies lipídicas mediante TLC, revelado ycuantificación por densitometría. Resultados: En el tejidoplacentario los agonistas endógenos o farmacológicos dePPARalfa no modifican los niveles de triglicéridos, colesterol,ésteres de colesterol y fosfolípidos. En el tejido fetal LTB4 redu-ce los niveles de triglicéridos (41%, p


traron abundacia de tejido estromático y cordones sexuales dis-puestos en la zona perimedular. En el hígado se distinguieronáreas hematopoyéticas amplias. Los pulmones se encontraronen la etapa canalicular. Las observaciones indicarían que, a pe-sar del reducido tamaño corporal de los especímenes analiza-dos en comparación con estadíos posteriores, los mismos pre-sentan un avanzado estado de organogénesis.

15. (6809) HISTOLOGÍA DEL OVARIO FETAL DE MYOCAS-TOR COYPUS (COIPO) . MASSON, PATRICIA GABRIELA;FELIPE, ANTONIO EDUARDO; EYHERAMENDY,VERÓNICA; RODRÍGUEZ, JULIO; ALZOLA, RICARDO

Facultad Ciencias Veterinarias, UNCPBA. Grupo de Inves-tigaciones Biológicas, Facultad de Ciencias Veterinarias,UNCPBA, Tandil, R. Argentina

La histoarquitectura del ovario adulto de Myocastor coypus(coipo) ha sido caracterizada, estableciéndose sus modificacio-nes durante la madurez sexual. El objetivo de este trabajo fuedescribir la histología de la gónada del coipo en diferentes eta-pas del desarrollo fetal. Para ello se utilizaron ovarios de fetosde 60, 90 y 120 días de gestación, que se procesaron hasta suinclusión en parafina, se cortaron longitudinalmente y en seriecada 5 µm y se colorearon con hematoxilina y eosina. Para laclasificación de los folículos se aplicó la tipología específica deM. coypus. En los fetos de 60 días la superficie ovárica se pre-sentó festoneada, cubierta por un epitelio de revestimiento sim-ple cúbico. La corteza y la médula no presentaron un límite defi-nido, observándose en la primera abundantes folículos primor-diales (tipo II). En los fetos de 90 y 120 días se observó el epi-telio de revestimiento simple cúbico o plano, apoyado sobre unatúnica albugínea de tejido conectivo laxo. La corteza y la médu-la mostraron un límite neto. En el área cortical, los folículos sepresentaron circundados por un estroma de conectivo de aspectolaxo y muy celular. En el área medular, el conectivo presentópredominio de fibras y la vascularización fue notoria. En ambostiempos de gestación se observaron folículos primordiales (tipo II)y primarios (tipos IIIa, IIIb y IV). En los ovarios de 120 días degestación se determinó la existencia de folículos secundarios, con2 a 4 capas de células granulosas (tipos Va y Vb) y con vacuolas(tipo VI). Las observaciones realizadas indicarían que en el coipo,como en otros animales de laboratorio, el crecimiento y la dife-renciación folicular también acontecerían en la etapa fetal.

16. (6874) HISTOGÉNESIS DEL DUODENO DE MYOCASTORCOYPUS (COIPO). EYHERAMENDY, VERóNICA; FELIPE,ANTONIO; MASSON, PATRICIA; SOLANA, HUGO;RODRIGUEZ, JULIO; ALZOLA, RICARDO

Facultad Ciencias Veterinarias UNICEN. Grupo de Inves-tigaciones Biológicas, Fac. Cs. Veterinarias, UNCPBA,Tandil, R. Argentina

Al presente, son escasos los conocimientos referidos al de-sarrollo fetal del coipo (Myocastor coypus), en particular en losaspectos referidos a su organogénesis. El objetivo de este tra-bajo fue efectuar la descripción y análisis de la evolución de laestructura histológica de la primera porción del intestino delga-do (duodeno) durante diferentes estadios del desarrollo fetal com-parándola con la estructura presente en el adulto. Se trabajó conmuestras de la primera porción del intestino delgado de adultosy de fetos de 60, 90 y 120 días de gestación. Las muestras sefijaron en solución de Bouin y se procesaron mediante técnicashistológicas corrientes hasta su inclusión en parafina. Se reali-zaron cortes seriados de 5 µm, los cuales se colorearon conhematoxilina y eosina o ácido peryódico de Schiff-hematoxilina(PAS-h). En los fetos de 60 días, se observó la pared del duo-deno compuesta por dos túnicas. La interna consistió en un teji-do epitelial estratificado de revestimiento, formado por célulasisodiamétricas. La túnica externa se observó como una gruesaformación de tejido mesenquimático limitada por un epitelio sim-ple plano (mesotelio peritoneal). En el tejido mesenquimático sepudieron diferenciar dos zonas: una capa interna de aspecto laxo

y una externa más densa. En los fetos de 90 y 120 días se ob-servaron vellosidades recubiertas por un epitelio cilíndrico sim-ple, una lámina propia-submucosa de tejido conectivo laxo, doscapas musculares y una serosa. Las células caliciformes (PASpositivas) se observaron a partir del día 120, no visualizándoseglándulas duodenales ni capa muscular de la mucosa. El duo-deno fetal del coipo presenta un proceso de histogénesis similaral observado en otros roedores de laboratorio, asemejándose suorganización tisular a la del adulto.

17. (7188) PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA PLASMÁTICADE OVOCITO CAPACES DE UNIR ESPERMATOZOIDESEN BUFO ARENARUM. COUX, GABRIELA; CABADA,MARCELO O.

Area Biología- IBR/CONICET- Facultad de Cs. Bioq. yFarmacéuticas-UNR

En el anfibio Bufo arenarum, durante la fecundación, el esper-matozoide interacciona con la cubierta gelatinosa del ovocito yluego se une a la cubierta vitelina, donde se dispara la reacciónacrosómica. Seguidamente, el espermatozoide reaccionado seaproxima, une y finalmente fusiona con la membrana plasmáticadel ovocito. Mientras que los detalles de las interaccionesmoleculares entre el espermatozoide y las cubiertas gelatinosa yvitelina están comenzando a dilucidarse, es poco lo que se sabesobre las reacciones de unión y fusión de membranas plasmáticas.Nuestro objetivo fue detectar y caracterizar las proteínas de lamembrana plasmática del ovocito involucradas en la unión aespermatozoides. Utilizando membranas plasmáticas aisladas pro-venientes de ovocitos previamente biotinilados superficialmente serealizaron ensayos de incubación con espermatozoides reaccio-nados. Los espermatozoides fueron centrifugados y lavadosexhaustivamente, resuspendidos en buffer muestra y sometidosa SDS-PAGE. Los geles se electrotransfirieron a membranas denitrocelulosa y se detectó la presencia de proteínas biotiniladasmediante el uso de estreptavidina-peroxidasa (‘biotin-blot’) y re-velado con quimioluminiscencia. Se identificó una bandabiotinilada, ausente en espermatozoides no incubados con mem-branas plasmáticas. Esta proteína siguió siendo detectada aún enpresencia de 10 mg/ml de albúmina sérica bovina en el medio deincubación. Se estimó un peso molecular de aproximadamente 110kDa mediante SDS-PAGE. Las membranas plasmáticas deovocitos también fueron sembradas en una columna con unamatriz que tenía acoplado un extracto de proteínas de cabezasde espermatozoides. El análisis por SDS-PAGE en condicionesreductoras, seguido de ‘biotin-blot’ de las muestras eluidas, mos-tró la presencia de al menos tres proteínas de aproximadamente110, 70 y 30 kDa. Estos datos sugieren que estas proteínas es-tarían involucradas en la interacción ovocito-espermatozoide anivel de membrana plasmática en B. arenarum.

18. (7414) ESTUDIO DE LA REGULACIÓN TRASCRIP-CIONAL DE LA PROTEÍNA DE UNIÓN A ÁCIDOSGRASOS INTESTINAL (I-FABP) EN PEZ CEBRA (DANIORERIO). LISA, MARíA NATALIA; SCIARA, ANDRÉS;ARRANZ, SILVIA

Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario(CONICET), Área Biología, FCByF, UNR, Argentina

La proteína de unión a ácidos grasos de intestino (I-FABP)es un polipéptido intracelular que interviene en la absorción delípidos de la dieta uniendo ácidos grasos de cadena larga. Elobjetivo de este trabajo es analizar la expresión espacio-tempo-ral de I-FABP de pez cebra. Mediante RT-PCR se observó quela transcripción de i-fabp comienza a las 6 horas postfecundación(hpf) en el estadío de placa. Por otra parte se clonó en elplásmido pEGFP-1un fragmento de 930 pb 5' del inicio de la tra-ducción de dicho gen. Esta contrucción se linealizó y semicroinyectó en embriones de pez cebra en estadío de una cé-lula. La misma estrategia se empleó con 430 pb 5´del inicio dela traducción. En el primer caso el promotor dirigió el inicio de laexpresión de la proteína verde fluorescente a las 6 hpf en la


célula vitelina (tejido extraembrionario de reserva nutritiva) y enel epitelio intestinal a los 5 días postfecundación cuando el vite-lo se hubo reabsorbido. En el segundo caso, a las 8,4 hpf seobservó fluorescencia no sólo en la célula vitelina sino, a su vez,en células embrionarias. En el promotor de i-fabp de pez cebrase encontraron múltiples sitios putativos de unión al factor detranscripción C/EBPalpha. Para evaluar el papel de dicho factorse microinyectaron embriones con un anticuerpo contra C/EBPalpha. Estos individuos mostraron anormalidades en lareabsorción del vitelo y en la formación del intestino. I-FABP depez cebra comienza a transcribirse tempranamente en el desa-rrollo, antes de la formación del intestino. Análisis de 930 pb delpromotor utilizando un gen reportero mostraron que I-FABP noes exclusiva de intestino si no que se expresa en la célula vitelinay podría estar relacionada con la reabsorción del vitelo. El pro-motor de 430 es suficiente para la expresión en la célula vitelinay luego en el intestino en formación si bien podría carecer de si-tios represores. Miembros de la familia de factores de transcrip-ción C/EBP podrían actuar regulando la transcripción de i-fabp.

19. (7519) IMPACTO DE LA HIPERESTIMULACIÓN OVÁRICASOBRE EL DESARROLLO EMBRIOFETAL EN UN MO-DELO MURINO. CEBRAL, ELISA (1, 2); PAZ, DANTE (1)Lab.deBiología del Desarrollo-IFIBYNE-CONICET. Labo-ratorio de Biología del Desarrollo-IFIBYNE (1). CEFYBO(2) CONICET

Las bajas tasas de preñez generalmente son debidas a inade-cuada hiperestimulación de la ovulación. Se ha sugerido que lapérdida embrionaria temprana luego de la superovulación esatribuíble a elevados niveles de estrógenos, a alteraciones de laviabilidad y calidad ovocitaria y a la hostilidad hormonal del tractoreproductor post-inducción. Sin embargo, no se han evaluado losefectos de la hiperestimulación sobre el desarrollo postimplan-tatorio ni las concentraciones óptimas gonadotróficas para la ob-tención de una gestación y desarrollo embriofetal normal. El obje-tivo fue estudiar la tasa y calidad de la preñez y el desarrolloembriofetal en días «claves» de la fase postimplantatoria luegode la inyección de PMSG/hCG. Hembras adultas murinas se in-yectaron con 0- 2,5- 5 y 10 UI/hembra de PMSG/hCG con inter-valo de 46-48 hs. Se sacrificaron a los días: 10 (organogénesistemprana), 13 (fase fetal temprana) o 16 (fase fetal media) (día 1de preñez: tapón vaginal). El Nro. de sitios de implantación y elNro. embrionario estuvo elevado al día 10 con 2,5 y 10 UI (p


Instituto de Biología Celular y Neurociencias Prof E DeRobertis, FMED, Universidad de Buenos Aires. (1) Insti-tuto E De Robertis, FMED, UBA (2) IMBICE, La Plata.(3) The Burnham Inst, USA (4) U. Favaloro

Las células ganglionares de la retina (CGR) nasal (N) conec-tan con el tectum óptico (TO) caudal y las temporales (T)contactan con el TO rostral. Los receptores Eph y sus ligandos,las ephrinas, se expresan en gradientes complementarios en laretina y el TO y participan en la guía de las fibras ópticas. LasephrinasA del TO caudal repelen a los axones T portadores deEphA3. El objetivo es evaluar in vitro el efecto del EphA3 comosustrato sobre el crecimiento neurítico, dado que no se conocesu rol en el TO rostral. Realizamos cultivos de retina (explantosy neuronas disociadas) de embriones de pollo y evaluamos elcrecimiento axonal sobre EphA3 (dominio extracelular fusionadocon Fc vs Fc). Sobre EphA3: Los axones presentan mayor lon-gitud (p=0.005). Una mayor proporción de neuronas T disocia-das desarrollan axones (p=0.013). En los explantos T se obser-va una mayor densidad de axones emitidos y de axones mayo-res de 250 um de longitud. En los explantos N sólo se apreciamayor densidad de los axones mayores de 250 um. Estos efec-tos dependen de la concentración de EphA3 (p25kg/m2) con una po-blación normopeso (IMCT, que corres-ponde a un cambio T225M, y una transición 859 C>T, sin varia-ción del aminoácido 233L. En el exón 9 se observó una transi-ción 1166 G>A correspondiente a un cambio G336S y en el exón12 una transición 1477 G>A sin variación del aminoácido 439A.Se realizaron estudios poblacionales por PCR-SSCP confirmandoque las mutaciones identificadas no corresponden a polimor-fismos. A partir de ARNm purificado de tiroides humana, la secuen-cia codificante de PAX8 se amplificó por RT-PCR utilizando primersespecíficos y fue clonada en el vector pcDNA6B en los sitios co-rrespondientes a las enzimas EcoRI y BamHI. Se secuenciaronlas 1360 pb del inserto, no observando ninguna variación con res-pecto a la secuencia de referencia. En conclusión se identificaroncuatro nuevas mutaciones, dos con cambio de aminoácido: T225My G336S y 2 dos mutaciones silenciosas: 233L y 439A. Se clonóy se secuenció el cDNA del PAX8, el que será utilizado para es-tudiar la expresión del gen y el efecto de las mutaciones sobre lafunción de la proteína en su unión al DNA.

25. (7288) TRANSFERENCIA Y EXPRESIÓN DE VEGF ME-DIANTE VECTORES NO VIRALES EN ISLOTESPANCREÁTICOS Y HEPATOCITOS HUMANOS. ADRIS,SORAYA; BARBICH, MARIANA; CEBALLOS, CANDELA;ARGIBAY, PABLO

Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental,Hospital Italiano de Buenos Aires

Antecedentes: La funcionalidad e injerto del trasplante decélulas depende de factores, metabólicos, angiogenéticos einmunológicos, los cuales pueden ser manipulados in vivo o exvivo por medio de la transferencia de genes. Objetivo: Evaluarla expresión de diferentes isoformas de VEGF en cultivos dehepatocitos e islotes pancreáticos. Material y Método: Se ampli-ficaron por PCR las 4 isoformas de VEGF, se purificaron las


bandas correspondientes a las isoformas 121 y 165 y se clonaronen un vector de expresión. Estos genes fueron transferidos pormedio de liposomas comerciales a cultivos de hepatocitos e is-lotes pancreáticos humanos. La expresión de VEGF se determi-nó mediante ensayos de Elisa. Conjuntamente se analizaroncomo parámetros funcionales los niveles de albúmina en el casode los hepatocitos, y de insulina en los islotes pancreáticos.Resultados: Hepatocitos e islotes transfectados con las dosisoformas de VEGF presentaron niveles de proteína significa-tivamente mayores (pC y p.S965fsX994. Cuatro compuestos heterocigotashan sido identificados, dos en el gen de TPO (p.R396fsX472/p.V433M y p.N129fsX208/p.G387R) y dos en el gen DUOX2(p.Q36H/ p.S965fsX994 y 2840-2 A>C/p.G418fsX482) Estudiospoblacionales confirmaron que las mutaciones identificadas nocorresponden a polimorfismos. En conclusión, se identificaroncinco mutaciones con cambio de aminoácido en el gen de TPO(ex.8, 9 y 14) y una en el de DUOX2 (ex. 2); una deleción en elgen de TPO (ex. 5) y dos en el de DUOX2 (ex. 11 y 21); unaduplicación en el exón 8 de TPO y un cambio de base en el intrón19 que afecta la secuencia dadora de splicing en el gen deDUOX2. Estos resultados ponen en evidencia que más de un gendebe ser analizado en los pacientes con hipotiroidismo congéni-to y bloqueo de la organificación del yodo.

28. (7694) ASOCIACIÓN ENTRE EL GENOTIPO DE CYP3A5Y LA OBESIDAD EN UNA POBLACIÓN ARGENTINAADOLESCENTE. FERNÁNDEZ GIANOTTI, T.; GARCÍA,S.I.; STEPPAT, N.; PIROLA, C.J.

Cardiología Molecular, Instituto de Investigaciones Médi-cas A. Lanari, Fac. de Medicina, UBA

Las isoenzimas CYP3A forman la mayor porción de proteí-nas del citocromo P450 en hígado, y se expresan en distintosórganos. CYP3A son responsables del metabolismo de más del50% de las drogas en uso y de esteroides endógenos. De las 4isoenzimas CYP3A, la isoforma CYP3A5 es la que presentamayor variabilidad de expresión interindividuo. Contiene unpolimorfismo SNP g6986A>G. El alelo CYP3A5*1 (g6986A)correlaciona con alta expresión de CYP3A5, mientras que el aleloCYP3A5*3 (g6986G) da por splicing alternativo una proteína trun-ca, sin función. En población afroamericana adulta existe unaasociación entre el SNP y la presión arterial. Dado estos ante-cedentes, nos interesó estudiar la posible asociación del SNP conalgunos de los componentes del síndrome metabólico(hipertensión, obesidad, etc.) en población adolescente. Estudia-mos 175 adolescente (15±2 años): 121 normotensos (71 muje-res) y 54 hipertensos (22 mujeres), 17 de los cuales eran obe-sos (Z-BMI >percentilo 95 por sexo y edad), y con diferenciassignificativas en HDL-colesterol, triglicéridos e insulinemia. Sedosó cortisol sérico por RIE. La genotipificación del SNPg6986A>G se realizó por PCR-RFLP (SspI). En normotensos, lafrecuencia alélica de CYP3A5*3 fue de 0.888 y en hipertensosde 0.935 (en equilibrio de Hardy Weinberg). No encontramosasociación entre la hipertensión con algún genotipo de CYP3A5(chi², NS). Sí observamos que todos los obesos fueron genotipoCYP3A5*3 homocigota (chi², p


centes sugiere que la isoenzima podría participar en este compo-nente en el desarrollo del Síndrome Metabólico.

29. (7776) CONSTRUCCIÓN DE UNA SECUENCIA DE ADNCODIFICANTE PARA LA HORMONA TÍMICA TIMULINA.REGGIANI, PAULA (1); RIMOLDI, OMAR (1); HEREÑÚ,CLAUDIA (1); SOSA, YOLANDA (1,2); BROWN, OSCAR (1);PLÉAU, JEAN-MARIE (2); DARDENNE, MIREILLE (2);GOYA, RODOLFO (1,2)(1) INIBIOLP-Histología B, Fac. Medicina, UNLP, La Pla-ta. (2) UMR-8147, CNRS, Necker, Paris, Francia

La timulina (FTS), hormona tímica involucrada en la diferen-ciación intra y extratímica de las células T, ejerce una acciónfacilitadora sobre la secreción hormonal de la pituitaria anteriory administrada en ratones atímicos restaura ciertas funciones delas células T. No ha sido posible clonar su gen, lo cual obstacu-lizó la exploración de los mecanismos moleculares que partici-pan en las acciones de la timulina. OBJETIVO: Diseñar y cons-truir una secuencia sintética de ADN codificante para un análo-go biológicamente activo para timulina. El oligonucleótido doblehebra sintético codificante para timulina fue insertado en el vectorde expresión pCDNA3.1, con el cual se transfectaron dos líneascelulares HEK 293 y BHK. Se obtuvieron sobrenadantes y lisadoscelulares de ambas líneas con los que se realizó un bioensayode formación de rosetas para timulina: los lisados poseían nive-les de FTS de 1.200 ng/ml en las células HEK 293 y 450 ng/mlen las BHK y sus sobrenadantes poseían 300 y 130 ng/ml res-pectivamente. Lisados y sobrenadantes de células transfectadascon el plásmido vacío (controles) no mostraron actividad de FTS.La inyeccion i.p. (50 µl/animal) de los lisados de ambas líneasen ratones timectomizados (FTS sérica no detectable) indujo laaparición de niveles séricos de FTS detectables (150 fg/ml).Contrariamente, los lisados controles no indujeron niveles séricosdetectables de FTS. La incubación de lisados de ambas líneastransfectadas con un suero policlonal anti-FTS redujo un 90% laactividad de FTS, un antisuero contra un antígeno irrelevante nocausó disminución en la actividad de FTS. CONCLUSION: Laactividad biológica detectada en los lisados de célulastransfectadas con pcDNA3.1-FTS es producida por un factor conidentidad inmunoquímica de timulina. La futura inserción de esteoligonucleótido sintético en vectores de expresión apropiadospermitirá realizar terapia génica en animales timo-deficientes.

30. (7921) POLIMORFISMO MSP I DE LA APOLIPOPROTEI-NA A I Y ENFERMEDAD VASCULAR ATEROSCLERÓ-TICA EN ARGENTINA. BAÑARES, V (1, 2); POLISECKI, E(3); PETERSON, G (2); BERG, G (3); DEBEZA, A (2);PIVETTA, O (1); BARENGO, N (5); TAVELLA, J (1, 4)

(1) CNGEM ANLIS, (2) PROPIA UNLP-CIC. (3) ServicioH Dig Gen Cátedra Gen Biol Mol UBA, (4) CONICET Ar-gentina, (5) U Kuopio Fin

Argentina ocupa el cuarto lugar de América en mortalidadcardiovascular. Factores ambientales y genéticos modulan elmetabolismo lipídico. Niveles bajos de HDL (lipoproteinas de altadensidad) en plasma son indicadores de riesgo cardiovascularaumentado. La apolipoproteina AI (APO AI) es el mayor compo-nente proteico de las HDL. Objetivo: investigar la relación entreel polimorfismo para la enzima Msp I en el intrón 3 del gen APOAI y la lesión vascular aterosclerótica en pacientes con indica-ción de angiorafía. Métodos: los genotipos se obtuvieron porPCR, digestión con la enzima de restricción Msp I y elctroforesisen gel de agarosa en 386 muestras de ADN, 261 con lesiónaterosclerótica (L) y 124 sin lesión (NL) y Colesterol total (CT),HDL y Trigliceridos (TG). El análisis estadístico se realizó conSPSS agrupando los genotipos: M1M1 vs. M1M2 y M2M2. Resul-tados: como es de esperarse en una muestra de este tipo el CTse asocia con la presencia de lesión (OR: 1.01) y en varones (OR:2.33). La regresión logística no muestra diferencias significativasde asociación entre el alelo M2 y la lesión aterosclerótica (OR:

1.12; 95% CI 0.52-2.38). Sin embargo el genotipo M2M2 (de bajafrecuencia) se observó en mujeres (n=3, 2 NL y 1 L) y varones(n=10), estos últimos todos con lesión. Conclusion: si bien, noobservamos una asociación significativa entre el alelo M2 de APOAI y la lesión vascular aterosclerótica, dado que todos los varo-nes homocigotas para el alelo M2 presentan lesión ateroclerótica,no podemos aún descartar este polimorfismo como posible factorde riesgo en varones, el análisis en un mayor número de mues-tras permitirá llegar a un resultado certero.

31. (7993) ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO MSP1 DELGEN APOB CON LA ENFERMEDAD CORONARIA.POLISECKI, ELIANA; BERG, GABRIELA (1); BANARES,VIRGINIA (2); AGUILAR, DANIEL (2); PETERSON,GRACIELA (2); WIKINSKI, REGINA (1); TAVELLA,MARCELO (2); CORACH, DANIEL; SCHREIER, LAURA(1)

Servicio de Huellas Digitales Genéticas, Cátedra deGenética y Biología Molecular. (1) Lab Lipidos y Lipoprot,Bioquím Clínica–ffyb-UBA (2) PROPIA–UNLP

La lipoproteína aterogénica LDL constituye un importante fac-tor de riesgo en la enfermedad coronaria (EC) prematura. Laapoproteína B es su principal proteína. Se han descrito variospolimorfismos de sustitución única que se asociarían con EC. Sinembargo, en nuestro país no se estudiaron aún polimorfismosdel gen APOB. El objetivo de este trabajo fue investigar la aso-ciación de la frecuencia del polimorfismo RFLP-Msp1 (A3611G)que produce un cambio de aminoácido (GluxArg) con la presen-cia de lesiones ateroscleróticas, y eventualmente evaluar la exac-titud diagnóstica del polimorfismo. Se estudiaron 459 pacientes,ambos sexos, de 33 a 80 años, sometidos a angiografía coronariacomo st de referencia, realizada por único observador, para diag-nóstico de EC o evaluación prequirúrgica valvular, conformán-dose 2 subgrupos: con presencia (L) n=307 (edad:59.1±10.2) oausencia de lesiones ateroscleróticas (NoL) n=152 (edad:58.9±10.8), sin diferencias significativas en edad. Se determinóen plasma colesterol-LDL, triglicéridos y apo B. Un fragmento am-plificado de 479pb fue digerido con la enzima de restricción Msp1con posterior detección en geles de agarosa 2%. En cada grupose cuantificó la frecuencia del genotipo con el alelo menos fre-cuente (GA-AA) y el genotipo homocigota para el alelo común(GG). Se observó que los pacientes L presentaron mayor pro-porción de GA-AA (41%), con respecto a NoL (33%), p=0.049.El likelihood ratio positivo fue 2.9 indicando una aceptable po-tencialidad diagnóstica de la detección del alelo A. No se encon-tró asociación entre los parámetros lipídicos y el genotipo. Lafrecuencia del alelo A en pacientes con EC fue 21%, superior alas reportadas en EC de otros paises (10,2% a 16%). El RFLP-Msp1 se asociaría con EC sumándose al conjunto de factoresdeterminantes de la aterosclerosis

32. (8015) CUANTIFICACION DE LA DELECION COMUN DE4977PB DEL ADN MITOCONDRIAL. SU RELACION CONENFERMEDAD CARDIOVASCULAR ATEROSCLERÓ-TICA. POLISECKI, ELIANA; ARRUVITO, LOURDES(2);BERG, GABRIELA(1); SALA, ANDREA; DE LOS SANTOS,RAUL(2); SCHREIER, LAURA(1); CORACH, DANIEL

Servicio de Huellas Digitales Genéticas, Cátedra de Gené-tica y Biología Molecular. (2) Dto Bioq Clín-FFyB (3) VCátedra Medicina-Hospital Clínicas UBA

El ADN mitocondrial (ADNmt) tiene mayor susceptibilidad aldaño oxidativo que el ADN nuclear. En estudios previos hemosobservado acumulación de la deleción común de 4977pb en elADNmt (4977-ADNmt) en muestras de músculos de fallecidos pormuerte súbita en comparación con fallecidos por otras causas,lo cual se asociaría con la elevada incidencia de enfermedadcardiovascular (ECV) entre los primeros. Existen pocos trabajosque demuestren el acúmulo de esta deleción en pacientes conECV, algunas controversias pueden deberse a las metodologíasanalíticas empleadas. Nos propusimos cuantificar la deleción


4977-ADNmt en 14 muestras de músculo estriado obtenido depacientes sometidos a cirugías programadas, con diagnóstico deECV (n=7, Fem/Masc:1/6, 38 a 82 años) y libres de ECV (n=7,Fem/Masc:3/4, 31 a 88 años), sin diferencias significativas enedad. No se incorporaron muestras de diabéticos. Se realizarondiluciones del ADN extraído -300 a 25 ng- para amplificar 389pb que muestra presencia de deleción, y 75 a 0,1 ng para am-plificar un fragmento de 440 pb del ADNmt total. Se fotografia-ron productos de dilución en geles de agarosa y se cuantificócon Image Quant 5.1. A partir del gráfico semilog de disminu-ción de DO de los productos de PCR en función de ng ADN, secalculó regresión lineal y la proporción de ng de 4977-ADNmt conrespecto a ADNmt total. Las muestras ECV mostraron mayoracumulación de 4977-ADNmt (mediana: 0.052% rango: 0.036-0.100) que las sin ECV (0.024%, 0.012-0.075), p=0.042. Ladeleción correlacionó con el aumento de la edad r=0.76, p=0.016.El aumento en la acumulación de 4977-ADNmt en ECV podríaexplicarse por el mayor estrés oxidativo asociado con la enfer-medad isquémica. Cuantificar la deleción en un mayor númerode muestras podría esclarecer mecanismos subyacentes de laenfermedad aterosclerótica.

BIOLOGÍA MOLECULAR - GENÉTICA 2

33. (6652) UNA NUEVA MUTACION EN EL EXON 2 DEL GENDE LA GLUCOKINASA. LóPEZ, ARIEL PABLO; CERRONE,GLORIA; CAPUTO, MARIELA; PEREZ, MARIA SILVIA;ALVAREZ, MONICA; TARGOVNIK, HECTOR MANUEL;FRECHTEL, GUSTAVO DANIEL

Cátedra de Genética y Biología Molecular. Facultad deFarmacia y Bioquímica. UBA.

Antecedentes: la Diabetes tipo MODY es un subtipo de Dia-betes tipo 2, con herencia autosómica dominante que se carac-teriza por su aparición en la edad infanto juvenil. A diferencia dela Diabetes tipo 1, los pacientes generalmente no requiereninsulina al comienzo de la enfermedad. Existen 6 formas clíni-cas de las cuales el MODY 2 tiene su causa genética determi-nada por mutaciones en el gen de la glucokinasa. Objetivos:confirmar en un paciente con fenotipo clínico compatible conMODY 2 la alteración genética causante de la enfermedad me-diante técnicas de biología molecular estudiando posibles alte-raciones en el gen de la glucokinasa. Material y métodos: a par-tir de sangre periférica del individuo se purificó el ADN por elmétodo de digestión con CTAB. Se rastreó la posible presenciade mutaciones en alguno de los diez exones del gen de laglucokinasa con la utilización combinada de los métodos de PCRy SSCP y la posterior secuenciación de los fragmentos que pre-sentaron patrones alterados de corrida electroforética. Resulta-dos: se encontró una mutación en el exón número 2 que consis-te en una transcisión que cambia el codón 43 del gen de laglucokinasa de CGC a AGC, en forma heterocigota, lo que pro-duce un cambio de Arg por Ser a nivel de la proteína. Esta mu-tación, aún no descripta, podría ser la causa de la enfermedaden este individuo. Conclusiones: al ser la Diabetes una enferme-dad heterogénea y multifactorial, resulta extremadamente com-plicado desde el punto de vista clínico el diagnóstico certero decada subtipo. Establecer la causa genética del MODY es de fun-damental importancia ya que de ello depende directamente laterapia que se va a instaurar. El estudio de mutaciones en el gende la glucokinasa por medio de los métodos de PCR, SSCP ysecuenciación, permite realizar una genotipificación específica,en este caso de subtipo MODY 2. De esta manera se puede ins-tituir en el paciente la terapia farmacológica mas adecuada se-gún la alteración genética presente.

34. (6985) PEQUEÑAS DELECIONES E INSERCIONES ENEL GEN DEL FACTOR VIII CAUSALES DE HEMOFILIAA SEVERA: 9 MUTACIONES NO REPORTADAS.

ROSSETTI, LILIANA; RADIC, PAMELA; LARRIPA, IRENE;DE BRASI, CARLOS

Academia Nacional de Medicina. Instituto de Investigacio-nes Hematológicas Mariano R Castex, Academia Nacio-nal de Medicina

En hemofilia A (HA) el análisis directo de la mutación causalen el gen del factor VIII (F8) constituye la ruta ideal para la pro-visión de asesoramiento genético. El objetivo de este trabajo esidentificar y analizar los efectos de las mutaciones Ins/Del enfamilias con HA severa (HAs). Se estudiaron muestras deprobandos de 30 familias con HAs y negativas para las grandesinversiones y deleciones de F8. Primero, se amplificaron por PCRlas regiones génicas codificantes (35 amplímeros), luego se apli-có la técnica de Conformation Sensitive Gel Electrophoresis(CSGE), con subsecuente secuenciación del segmento señala-do. Mediante estudios de predicción bioinformática utilizando elprograma nnpredict se analizaron las potenciales consecuenciasen la estructura secundaria del F8 mutado en los 2 cambios In-Frame caracterizados. En un total de 65 familias con HAs sedetectaron 12 mutaciones específicas de familia, 3 recurrentesy 9 nuevas. Tres correspondieron a pequeñas inserciones (Ins)ninguna de ellas previamente reportada: c.435insTTT(p.D145_K146insF) In-Frame; c.5592insA Frameshift +1 (A-run);y c.3500insA Frameshift +1 (A-run); y 9 resultaron pequeñasdeleciones (Del): c.208_211delTTTG Frameshift –4; c.6049delGFrameshift –1; c. 2014_2016delTTC (p.F672del) In-Frame ya re-portadas; y c.3756delG Frameshift –1; c.6919_6920delGAFrameshift –2; c.5689_5690delCT Frameshift –2; c.4388_4391delCTTT Frameshift –4; c.1409delC Frameshift –1; y c.2490delCFrameshift –1 (No A-run); aún no reportadas. En 4/13 (30%) ca-sos con Ins/Del se detectó anticuerpo inhibidor. Los datos defrecuencia y riesgo relativo de inhibidor asociados a Ins/Del re-sultan similares a los reportados en la literatura. El estudiobioinformático permitió predecir cambios en la estructura secun-daria del F8 que determinarían el fenotipo severo asociado a lasIns/Del In-Frame. El abordaje presentado permite la provisión deinformación segura y directa para asesoramiento genético enfamilias con HA severa.

35. (7018) CAMBIOS DE FALSO Y NO-SENTIDO DEL GENDEL FACTOR VIII EN HEMOFÍLICOS A SEVEROS: 6NUEVAS MUTACIONES. ROSSETTI, LILIANA; RADIC,PAMELA; LARRIPA, IRENE; DE BRASI, CARLOS

Instituto de Investigaciones Hematológicas Mariano RCastex, Academia Nacional de Medicina

La Hemofilia A (HA) es una coagulopatía hereditaria ligadaal sexo, originada por defectos en el gen factor VIII (F8). Ade-más de las inversiones y las grandes deleciones causales de lamayoría de las HA severas (HAs), es importante la detección demutaciones pequeñas, responsables de los restantes defectosmoleculares. Los objetivos de este trabajo fueron identificar yanalizar las mutaciones missense y nonsense en familias Argen-tinas con HAs. Se detectó la presencia de pequeñas mutacio-nes en un grupo de 65 familias con HAs, por la técnica deConformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) y se estu-diaron mediante esta misma técnica 80 cromosomas X de indi-viduos sanos de la población Argentina. Mediante el programannpredict se analizaron los posibles cambios en la estructurasecundaria asociada al F8 mutado. En 9 familias se caracteriza-ron mutaciones puntuales: 4 nonsense, que determinan la ter-minación prematura de la traducción y el fenotipo severo, 2 re-portadas c.6496T>A (p.2166R>X), c.2443C>T (p.815Q>X), y 2 noreportadas, c.6825T>A (p.2275Y>X), c.1656C>A (p.552Y>X); 5missense que afectaron aminoácidos conservados entre las 4especies analizadas (humano, porcino, murino y canino), 1 re-portada c.6683G>A (p2228R>Q), y 4 no reportadas, c.6959T>C(p.2320L>S), c.755C>A (p.252T>K), c.6947T>C (p2316L>P), yc.5881T>A (p.1961W>R). En los 80 cromosomas X normalesanalizados se confirmó la ausencia de estas mutaciones. Median-te el estudio molecular exhaustivo del F8 se lograron caracteri-


zar las mutaciones de cambio de base en 9 familias con HAs, elestudio de la población normal y el análisis bioinformático per-mitió determinar fehacientemente que las 4 mutaciones missenseno reportadas, son causales de la HAs en cada caso. La carac-terización de la mutación causal permite el asesoramientogenético de las familias afectadas, y la provisión de informaciónclave para el tratamiento y seguimiento de la enfermedad.

36. (7167) UTILIZACION DE POLIMORFISMOS COMO HE-RRAMIENTA PARA EL DIAGNOSTICO DIRECTO DEPACIENTES CON RETINOBLASTOMA. FERNANDEZ,CECILIA SOLEDAD; DALAMON, VIVIANA; FERREIRO,VERONICA; GILIBERTO, FLORENCIA; SZIJAN, IRENE

Cátedra de Genética y Biología Molecular. Facultad deFarmacia y Bioquímica. UBA

El retinoblastoma (RB) es un tumor ocular maligno que sedesarrolla en niños hasta los 4-5 años (1:20.000). Es el más fre-cuente de los tumores oculares de la niñez. Se presenta pormutaciones en el gen RB1 (13q14), el 80% de éstas son peque-ñas mutaciones y el 20% son grandes rearreglos. El objetivo deltrabajo fue detectar grandes deleciones en el gen RB1 median-te la aplicación de polimorfismos como herramienta molecular.Se analizó el ADN de leucocitos de 4 familias con afectados deRB de diferente presentación fenotípica, a través de los siguien-tes polimorfismos intragénicos: BamHI-intrón 1, Rbi4-intrón 4,XbaI-intrón 17, Rb1.20-intrón 20. La segregación de los alelospolimórficos dentro de cada familia permitió establecer: Pacien-te 1) hemicigota para Rb1.20 evidenciando una deleción del alelomaterno para ese locus; paciente 2) hemicigota para los 4 lociestudiados, deleción del alelo paterno; paciente 3) hemicigota paralos 4 loci estudiados, deleción del alelo materno; paciente 4)hemicigota para los loci XbaI y Rb1.20, deleción del alelo paternopara esos loci. La detección de las mutaciones en el ADN deleucocitos de los pacientes demostró su origen germinal y debidoa que ninguna familia presentaba antecedentes familiares, se cla-sificaron los RB como Hereditarios de Novo. Se pudo excluir a loshermanos de los pacientes 1), 2) y 4) de ser portadores de lamutación que predispone a desarrollar la patología, por no pre-sentar la deleción hallada en los pacientes, para cada caso. Lahermana del paciente 3) también desarrolló RB y presentó la mis-ma deleción que se identificó en su hermano. . Los polimofismosse utilizan generalmente para estudios indirectos de segregaciónde alelos polimórficos intrafamilia, se demuestra mediante estetrabajo que también pueden convertirse en una herramienta parala identificación de mutaciones en estudios directos.

37. (7267) EVOLUCIÓN CROMOSÓMICA CLONAL EN PA-CIENTES CON LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA(LLC). CHENA, CHRISTIAN (1); ARROSSAGARAY,GUILLERMO (2); SLAVUTSKY, IRMA (1)

Deptos de Genética (1) y Clínica Hematológica (2), Aca-demia Nacional de Medicina, Buenos Aires

La LLC se caracteriza por una lenta acumulación de linfocitosB neoplásicos en sangre periférica (SP) y un curso clínico alta-mente variable. Se considera evolución clonal (EC) a la adquisi-ción de cambios cromosómicos no específicos que acompañana las anomalías primarias. Datos previos de nuestro grupo mues-tran un peor pronóstico para la asociación de +12 y deleción13q14. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la presenciade EC en pacientes con LLC y determinar su correlación con laprogresión de la enfermedad. Se estudiaron 62 casos (edadmedia: 65 años, rango: 41-85 años; 32 varones). Se efectuócultivo de SP con estimulación mitogénica, análisis cromosómicopor bandeo G y FISH empleando las siguientes sondas:centrómero de 12 y secuencia única de los genes TP53 (17p13),ATM (11q23) y D13S319 (13q14). Se realizó el análisis molecularde las secuencias promotoras de los genes p15INK4B, p16INK4Ay ARF (9p21), mediante la técnica MSP (methylation sensitivePCR), no observándose metilación en ningún paciente. Se ob-

servaron anomalías cromosómicas en 47 casos (76%), +12 en15 (24%), deleción de TP53 en 9 (15%), deleción de 13q14 en27 (44%), ATM (16%), detectándose 12 pacientes (19%) con EC.El análisis cromosómico de estos últimos casos permitió obser-var las siguientes alteraciones participando en EC: +12, deleción11q23, -14, -15, +22, las traslocaciones t(2;17) y t(2;14), pérdidamonoalélica de TP53, ATM y D13S319. El análisis de sobrevidalibre de eventos (Kaplan-Meier), mostró diferencias significativaspara los casos con EC (33 meses) y deleción de TP53 (10 me-ses) con respecto a los grupos con deleción 13q14 (156 meses)y sin anomalías (92 meses) (p


cionales. Sin embargo, si son fusionados sus cDNA en un vector,esta unión resulta también en una enzima activa y por lo tantoen la expresión de genes. Nuestra hipótesis es que insertandouna secuencia de ADN entre ambos fragmentos, la presencia deun codón «stop» en esta, daría un solo fragmento no funcional;y en caso de ocurrir un evento de re-iniciación río abajo del codón«stop», se obtendrían dos fragmentos, pero separados y por lotanto tampoco funcionales. Al transformar bacterias carentes deesta enzima, se podría medir la presencia de un codón stop enla secuencia insertada por la expresión del gen reportero ß-Gal.Nuestro objetivo fue diseñar y desarrollar este plásmidorecombinante, y confirmar su reconstitución funcional a través dela observación de distintos fenotipos del reportero ß-Gal. Paraesto se insertó uno de los fragmentos del gen de la enzima (seevita mencionar la enzima por posible patentamiento del méto-do), en marco de lectura y separado por un MCS, dentro delplásmido que contenía el otro fragmento de la enzima, y poste-riormente se transformaron bacterias carentes de esta enzimaendógena. Se obtuvieron colonias de color azul (en presencia deX-Gal) en las bacterias transformadas, mientras que las célulascontrol (sin transformar) fueron de color blanco. Concluimos queel plásmido diseñado es funcional y revierte el fenotipo de lasbacterias, y de esta manera se plantea su posible uso como he-rramienta para diagnóstico de mutaciones truncantes.

40. (7771) VARIACIÓN Y MUTACIÓN DE MARCADORESMICROSATÉLITES DE CROMOSOMA Y EN UNA MUES-TRA CAUCASOIDE. CATANESI, CECILIA INéS; DIROCCO, FLORENCIA; SILBESTRO, MIRIAM; VIDALRIOJA, LIDIA

Lab. de Genética Molecular - IMBICE. Área temática se-cundaria: Otros: Genética de poblaciones humanas

Los microsatélites ubicados en la región no recombinante delcromosoma Y (Y-STRs) son de herencia exclusivamente pater-na y se transmiten en bloque a través de un linaje masculino.Son de utilidad para estudios de paternidad e identificación dematerial genético masculino en muestras forenses mezcladas conmaterial femenino. Sin embargo, para la correcta resolución decasos es importante conocer las frecuencias haplotípicas regio-nales y la tasa mutacional de los Y-STRs. El presente es unaporte a dicho conocimiento en varones caucasoides de Argen-tina. Los microsatélites DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390,DYS391, DYS392, DYS393, DYS385a/b, DYS437 y DYS438 fue-ron tipificados por PCR y electroforesis en geles de poliacrilamidaen individuos pertenecientes a 35 familias. Para el análisis de latasa mutacional de estos Y-STRs se analizaron 500 eventosmeióticos en duplas padre-hijo, de vínculo biológico comproba-do (edad paterna promedio=32,94). Se hallaron 34 haplotiposdiferentes, siendo el más frecuente (p=0,05714 ±0,040): DYS19-14; DYS389I-13; DYS389II-29; DYS390-24; DYS391-10; DYS392-13; DYS393-13; DYS385-11/14; DYS437-15; DYS438-12. La di-versidad génica fue de 0,6273 ±0,3426. Se detectaron dos mu-taciones (una en DYS391 y una en DYS385). El conjunto demarcadores DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391,DYS392, DYS393 y DYS385a/b es llamado comúnmente«haplotipo mínimo». Datos previos de tasa mutacional (µ) deestos marcadores indicaron un total de 18 mutaciones en 8659eventos meióticos, los cuales sumados al presente resultado in-dicarían un valor de µ=0,0020. Hasta el momento no existenestimaciones de µ para los Y-STRs DYS437 y DYS438, siendonecesario el análisis de un mayor número de eventos meióticos.Estos datos preliminares son de utilidad para obtener un valorde µ fidedigno. Esto redundará en una mejor estimación de pro-babilidades en casos de paternidad que presenten mutaciones.

41. (7926) AUSENCIA DE INESTABILIDAD DE MICROSA-TÉLITES EN SINDROMES MIELODISPLÁSICOS. VÁZ-QUEZ, MARIA LORENA (1,2); DE DIOS SOLER, MARCELA(1); TACCHI, CECILIA (2); VENICA, ANDREA (2);ALBERBIDE, JORGE (2); NUCIFORA, ELSA (2); LARRIPA,IRENE (1); FUNDIA, ARIELA (1)

Depto. de Genética, Academia Nacional de Medicina; Lab.Central, Hospital Italiano. (1) Academia Nacional de Me-dicina; (2) Hospital Italiano

El desarrollo de los síndromes mielodisplásicos (SMD) es unproceso gradual en múltiples etapas que llevan a la expansiónleucémica del clon maligno. En la fase inicial habría lesionesiniciadoras citogeneticamente indetectables originando inestabi-lidad genómica que induciría cambios cromosómicos críticos. Afin de establecer si las SMD presentan inestabilidad de micro-satélites (MSI) se estudiaron 10 pacientes al diagnóstico o tra-tados con ácido fólico, vitamina B12 o eritropoyetina. Para eva-luar la MSI en las células malignas respecto de las células nor-males, se separaron las células mononucleares de médula óseapor Ficoll-Hypaque y se incubaron 1 hora a 37°C obteniéndoselas células no adheridas enriquecidas en stem cell CD34+. Seextrajo ADN de las células no adheridas (ADN tumoral) y depolimorfonucleares (ADN normal) con fenol/cloroformo y precipi-tación con etanol. Se seleccionaron 3 microsatélites: BAT 25, BAT26 y D18S58 recomendados como panel de referencia de MSI.La amplificación se efectuó por PCR touchdown con disminuciónde la temperatura de annealing de 65 a 55°C en 25µl con 1,0mMCl2Mg, 100µM dNTPs, 0,4-0,8µM primers, 1U de Taq polimerasay 200ng de ADN. Los productos se separaron por electroforesisen geles de poliacrilamida no desnaturalizantes teñidos con ni-trato de plata (0,1%). El tamaño de los alelos observados paraBAT 25 y 26 mostró una variación alélica de –2 a +1 pb en lospacientes estudiados, no observándose diferencias entre tejidonormal y tumoral. Con el microsatélite D18S58, un caso presen-tó una amplificación de un alelo en el ADN de las células noadheridas respecto del alelo constitutivo observado en el ADNnormal. Estos resultados demuestran que ninguno de los pacien-tes con SMD presenta alteraciones en los microsatélites anali-zados, sugiriendo que la MSI no tendría un rol importante en lapatogénesis de los SMD.

42. (7958) ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DEMTHFR CON TOXICIDAD AL METOTREXATO (MTX) ENPACIENTES PEDIÁTRICOS CON LEUCEMIA LINFOBLÁS-TICA AGUDA (LLA). ESTUDIO PRELIMINAR. ARÁOZ,VERÓNICA (1); FELICE, MARÍA (2); D´ALOI, KARINA (2);ALFARO, ELIZABETH (2); CHERTKOFF, LILIEN (1)

(1) Biología Molecular-Genética. Hospital Garrahan. (2)Servicio de Hemato-oncología. Hospital Garrahan

La enzima metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) cumpleun rol esencial en el metabolismo del folato. Diferencias en suactividad debido a variantes genéticas como C677T y A1298Cpueden modular la respuesta a agentes quimioterápicosantifolato. De ellos, el MTX es el más usado en el tratamientode LLA. El objetivo de este estudio es evaluar si existe asocia-ción entre la presencia de los polimorfismos C677T o A1298C yla toxicidad en niños con LLA que reciben altas dosis de MTX.Se estudiaron 101 pacientes con LLA sometidos a esquemas detratamiento que incluyen 4 ciclos de 2 ó 5 gr/m2/día de MTX. Seanalizó un total de 247 ciclos en los 65 niños que completaronel tratamiento con MTX. Se evaluó toxicidad hematológica, re-nal, hepática, gastrointestinal, de mucosa, infecciosa, cardíacay neurológica. La toxicidad se definió en 5 grados según OMS.Considerando la dosis de MTX los pacientes se estratificaron endos grupos: A) 2gr y B) 5gr. La búsqueda de las variantes C677Ty A1298C se realizó por PCR y posterior corte con enzimas derestricción. La asociación entre genotipos y toxicidad se analizócon tablas de contingencia y test de Fisher. En los niños con LLAla frecuencia genotípica encontrada fue: 51.5%CC, 37.4%CT,13.1%TT para C677T y 4%CC, 39.4%AC y 58.6%AA paraA1298C. En el grupo A se observó asociación significativa delalelo T con la presencia de fiebre (p=0.029) y estomatitis(p=0.003). Por otro lado, los niños que presentaron toxicidadneurológica tuvieron al menos un alelo T. En el grupo B, no seobservó asociación significativa entre genotipo y toxicidad. Elpolimorfismo A1298C no presentó asociación con las variablesconsideradas. En la serie analizada el alelo T sería un alelo de


susceptibilidad para la presencia de estomatitis y fiebre, aunqueno parece predecir el grado de severidad. Estos resultados, sibien preliminares, son similares a los encontrados en otros gru-pos con LLA.

43. (8025) PORFIRIA VARIEGATA EN LA POBLACIÓN AR-GENTINA. ESTUDIOS GENÉTICOS. FERREIRA GOMES,MARIELA SOLEDAD; PARERA, VICTORIA ESTELA;BATLLE, ALCIRA; ROSSETTI, MARIA VICTORIA

Departamento de Química Biológica-FCEN-UBA. CIPYP-CONICET

La Porfiria Variegata (PV) es una enfermedad metabólicaautosómica dominante que surge como consecuencia de unadeficiencia parcial en la Protoporfirinógeno oxidasa (PPOX), en-zima que cataliza la oxidación del Protoporfirinógeno IX enProtoporfirina IX en la biosíntesis del Hemo. Hasta el momentose han descripto 120 mutaciones diferentes en el gen que codi-fica para la PPOX responsables de PV. La mayor prevalencia seencuentra en la población blanca sudafricana (1:300), siendo lamutación más frecuente la R59W debido a un efecto fundador.En Europa la mayor frecuencia se encuentra en Finlandia(2:100.000) donde se han descripto 3 mutaciones en más de unafamilia (I12T, 338G-C y R152C). En nuestro país la frecuenciaes de 1:600.000. Hemos diagnosticado bioquímicamente comoPV 50 familias, de las cuales 8 ya han sido estudiadas a nivelmolecular habiéndose detectado 5 mutaciones nuevas: 3 puntua-les (R168H, H106P, L178V), una inserción (1320insT) y unamutación de splicing (IVS 7-1 G-A). En esta oportunidad presen-tamos los resultados en otras 7 familias PV. Mediante amplifica-ción por PCR y secuenciación manual se detectaron 2 mutacio-nes nuevas de splicing: IVS7-1G-C y IVS5-1G-A, que produci-rían la deleción de los exones 5 y 8 respectivamente. De las 5familias restantes 2 presentan la mutación insT1320, ya encon-trada en 3 casos, con lo que el número de familias aparentementeno relacionadas que portan esta mutación aumenta a 5. Los re-sultados refuerzan nuestra hipótesis de que, a pesar del escasonúmero de familias estudiadas, la InsT1320 sería la mutación másfrecuente en la población argentina (35%). Si bien el análisiscomparativo de los datos bioquímicos, sintomatología y la muta-ción presente en estos pacientes no permiten establecer, por elmomento, una clara relación genotipo/fenotipo, la identificaciónde la mutación responsable de la PV en cada familia permite ladetección de portadores asintomáticos y su asesoramiento paraevitar el contacto con los agentes desencadenantes de la porfiria.

BIOLOGÍA MOLECULAR 1: RELACIONESESTRUCTURA-FUNCIÓN 1

44. (7052) SUBCLONADO Y EXPRESIÓN DE LA ENZIMAUROD WT HUMANA, Y MUTANTES QUE ALTERAN SUINTERFASE DE DIMERIZACIÓN. GRAZIANO, MARTÍN;CARCAGNO, ABEL L.; RÍOS DE MOLINA, M. C.

Dpto. de Química Biológica, FCEyN, UBA

La Uroporfirinógeno decarboxilasa (UroD) es la quinta enzi-ma de la biosíntesis del hemo. Se encuentra como homodímeroen solución, pero aun se desconoce la importancia de ladimerización para su función. El objetivo de este trabajo essubclonar y expresar la UroD humana tanto salvaje (wt), comomutantes con una alteración en la interfase de dimerización.Aplicamos un nuevo método para la selección de las mutantesa diseñar basado en el cálculo de la energía de interacción en-tre complejos proteína-proteína y del efecto de mutaciones so-bre la estabilidad de dicho complejo, utilizando para ello el pro-grama Fold-X diseñado por Serrano y col. Comprobamos que sólouna de las 34 mutaciones puntuales clínicas (en pacientes conporfiria cutánea tarda) detectadas hasta el momento (Y311C)provoca una significativa disminución en la energía libre de uniónde las subunidades, con una variación, respecto de la wt, de 1,02

± 0,33 Kcal/mol y 2,72 ± 0,33 Kcal/mol para el heterodímero y elhomodímero respectivamente. En tanto que la mutación Q183Fes una de las pocas mutantes que no afecta la estabilidad delmonómero pero sí afecta significativamente la del dímero (3,97± 0,33 Kcal/mol). Para expresar la enzima wt se subclonó el cDNAde humanos en el plásmido de expresión pRSET. Las mutantesse generaron por mutagénesis dirigida por PCR (método overlapextension) y se confirmó su marco de lectura abierto mediantesecuenciación automática de los clones. Se expresó en E. coliBL21pLys la UroD wt, las mutantes simples y la doble mutanteY311C,Q183F y se purificaron mediante una columna de afini-dad hacia poliHis. La purificación se siguió midiendo la activi-dad UroD y por SDS-PAGE, detectando dos bandas, a 45 ± 2kDa y 89 ± 4 kDa. Se realizó una curva de inducción con IPTG1mM de la UroD wt, determinando un tiempo óptimo de induc-ción de 4 hs. Hemos logrado diseñar y expresar la UroD wt ymutantes que alteran su interfase de dimerización, como pasoprevio para el estudio de la relación estructura-función de lamisma.

45. (7237) PÉPTIDOS QUIMÉRICOS DEL INTERFERÓN-A2BCOMO AGONISTAS PARCIALES DE LA ACCIÓN ANTI-PROLIFERATIVA DE LA CITOQUINA. BLANK, VIVIANA;PEÑA, CLARA; MARINO, JULIETA; ROGUIN, LEONOR

IQUIFIB (UBA-CONICET), Facultad de Farmacia y Bioquí-mica. Buenos Aires, Argentina

En la búsqueda de dominios que simulen la región delinterferón-a2b (IFN-a2b) que se une a sus receptores, previamen-te sintetizamos dos derivados de la citoquina: un péptido linealde 28 aminoácidos y otro cíclico obtenido por reacción de losextremos N- y C-terminales del fragmento lineal. En el presentetrabajo, evaluamos las propiedades biológicas de ambas quime-ras en una línea de células que expresa receptores específicospara IFN-a2b (WISH). Luego de incubar las células durante 72horas en presencia de los derivados sintéticos, observamos quela proliferación celular disminuyó en forma dependiente de laconcentración de péptido agregado, alcanzando valores de inhi-bición máximos de 30 ± 10% y 40 ± 6% para 20 µg/ml del frag-mento lineal o cíclico, respectivamente. Por ensayos de citometríade flujo demostramos que, en las mismas condiciones experi-mentales, se obtuvo un incremento moderado del porcentaje decélulas hipodiploides (3% control, 19% IFN-a2b, 9-11% pép-tidos). Además, los dos péptidos (20 µg/ml) inhibieron signifi-cativamente la unión del (125)I-IFN-a2b a sus receptores(51±11% de inhibición para el fragmento lineal y 73±3% parael cíclico). Los resultados obtenidos indicaron que los péptidosquiméricos se comportan como agonistas parciales del IFN-a2b,desencadenando un efecto antimitogénico probablemente rela-cionado con la inducción de apoptosis. Aunque ambos deriva-dos mimetizan el epitope conformacional de la citoquina queinteractúa con sus receptores, es posible que otros dominiosde la molécula sean necesarios para activar una respuesta bio-lógica máxima.

46. (7377) INGENIERÍA DE LA ENZIMA LUMAZINA SINTE-TASA DE BRUCELLA SPP. (BLS) PARA LA OBTENCIÓNDE INMUNÓGENOS QUIMÉRICOS POLIVALENTES.AINCIART, NATALIA; ZYLBERMAN, VANESA; CRAIG,PATRICIO; GOLDBAUM, FERNANDO ALBERTO

Fundación Instituto Leloir

BLS es una proteína decamérica de 180 KDa, altamenteinmunogénica y termodinámicamente muy estable. Se puedeutilizar a BLS como proteína carrier reemplazando los 10 aa desu extremo amino terminal por diferentes péptidos foráneos. Laincubación de BLS en 2M GuHCl da lugar a intermediariospentaméricos plegados y el incremento de agente desnatura-lizante genera monómeros desplegados. Por medio de estos dosequilibrios reversibles,y mezclando dos quimeras diferentes (con-teniendo los péptidos OMP31 y KETc1), pudimos producir qui-meras polivalentes o mixtas con 2 péptidos foráneos distintos en


una misma estructura proteica. Las quimeras mixtas BLS-OMP31-KETc1 fueron purificadas por columna de intercambio iónico yanalizadas por SDS-PAGE e IEF. Seis ratones Balb/cinmunizados con 40µgr de la quimera desarrollaron altareactividad en ensayos de ELISA, DOpromedio: BLS=1,3?0,24,OMP31=2,28?0,14, KETc1=0,95?0,14, contra los respectivosantígenos. Generamos también quimeras mixtas W22F-BLS-OMP31 (W22F es una mutante de BLS donde el único residuode Trp fue reemplazado por uno de Phe, y que tiene diferentecoeficiente de extinción molar) para poder analizar quimeras quecontengan distintos números de copias del péptido OMP31 (0-2,4-6, y 8-10) en su estructura decamérica. Además medimos lafluorescencia intrínseca del trp de esta quimera mixta obtenidapor disociación y reasociación de los pentámeros y de las pro-teínas quiméricas por separado. (Emisión a 350nm: W22F=1,4,W22F-BLS-OMP31=3,6, BLS-OMP31=7,22). Las quimeras mix-tas son capaces de desarrollar anticuerpos contra el carrier ycontra dos péptidos foráneos simultáneamente. Este sistemaexperimental nos permitirá establecer un modelo que relacionedensidad de epitopes con inmunogenicidad, estudiando la rela-ción entre la repetitividad del epitope OMP31 con la respuestainmune contra este péptido generada por las distintas quimeras.

47. (7380) ESTUDIO DE LA FUNCIÓN BIOQUÍMICA Y LAEXPRESIÓN EMBRIONARIA DE LA PROTEÍNA CELU-LAR DE UNIÓN A ÁCIDOS NUCLEICOS CNBP. ARMAS,PABLO; CALCATERRA, NORA B.

IBR, CONICET. Fac. de Cs. Bioq. y Farm., UNR, Suipacha531, (S2002LRK). Rosario, Argentina.

Introducción: La proteína celular de unión a ácidos nucleicosCNBP ha sido identificada como un factor celular de interacción conácidos nucleicos de simple hebra. Se la ha relacionado con diversosmecanismos de regulación de la expresión génica que abarcan des-de la trascripción hasta la traducción. Objetivos: En este trabajo sepropuso identificar y caracterizar la actividad bioquímica de CNBP yanalizar su expresión y distribución en embriones durante las prime-ras etapas de su desarrollo. Resultados: La inmunolocalización deCNBP en embriones del anfibio Bufo arenarum y del pez cebra Daniorerio muestra señal citoplasmática en los primeros estadios del de-sarrollo, y señal nuclear en estadíos posteriores al de gástrula. A partirde ese mismo estadio se observó una disminución de la unión defactores de extractos embrionarios a las sondas blanco de CNBP.Se analizó por ensayos de retardo en geles la capacidad deinteracción de CNBP de Bufo arenarum (bCNBP) y formas mutantes,con sondas de ácidos nucleicos de simple hebra para establecer losmotivos proteicos involucrados en la unión. Las versiones mutantesque carecen del motivo rico en arginina y glicina (RGG) presente enla estructura primaria de bCNBP no presentaron unión con sondasblanco de ARN, pero si con las de ADN. Se determinó la actividadde chaperona de ácidos nucleicos de bCNBP por ensayos de hibri-dación de oligonucleótidos en geles. bCNBP mostró una actividadsignificativa como aceleradora de la hibridación, mientras que las ver-siones mutantes sin el dominio RGG muestran menores velocidadesde hibridación que los controles. Conclusiones: CNBP muestra uncambio de localización subcelular del citoplasma al núcleo de lascélulas embrionarias de Bufo arenarum y Danio rerio después delestadio de gástrula. Además, es capaz de interactuar con sondas deARN y ADN de simple hebra y de catalizar la hibridación deoligonucleótidos complementarios, siendo el motivo RGG esencialpara estas actividades.

48. (7724) LA HORQUILLA ß DE MICROCINA J25, IMPOR-TANTE PARA EL TRANSPORTE DEL ANTIBIÓTICO, NOESTARÍA INVOLUCRADA EN LA INHIBICIÓN DE LA RNA-POLIMERASA Y DEL CONSUMO DE OXÍGENO.BELLOMIO, AUGUSTO; VINCENT, PAULA A.; F. DEARCURI, BEATRIZ; SALOMÓN, RAÚL A.; FARÍAS, RICAR-DO N.; MORERO, ROBERTO D.

Departamento Bioquímica de la Nutrición, INSIBIO,(CONICET/UNT). Chacabuco 461. S. M. de Tucumán

La estructura de microcina J25 (MccJ25) [G(1)-G-A-G-H(5)-V-P-E-Y-F(10)-V-G-I-G-T(15)-P-I-S-F-Y(20)-G], presenta unaunión lactámica entre el grupo alfa-amino de Gly1 y el carboxilo-gama de Glu8, formando un anillo de 8 residuos (Gly1-Glu8). Elresto de la cadena (Tyr9-Gly21) atraviesa el anillo quedando atra-pado estéricamente por los residuos aromáticos Phe19 y Tyr20.Mediante tratamiento con termolisina se obtuvo un derivado(MccJ25-Th19) de dos cadenas: la A (Gly1-Phe10) y la B (Ile13-Gly21) que aún permanece atrapada dentro del anillo. MccJ25ingresa al citoplasma de Escherichia coli luego de atravesar lasmembranas externa e interna a través de los receptores especí-ficos FhuA y SbmA respectivamente. Su blanco de acción es laRNA polimerasa (RNAP) en E. coli y en Salmonella newport ac-túa además sobre la membrana celular inhibiendo el consumode oxígeno. MccJ25-Th19 fue capaz de inhibir «in vitro» a laRNAP, pero no afectó el crecimiento de varias cepas de E. coli.Sin embargo, MccJ25-Th19 inhibió el crecimiento y la síntesisde RNA «in vivo» de las cepas de E. coli MC4100 y AB259 trans-formadas con plásmidos con fhuA o SbmA clonados. MccJ25-Th19 conserva actividad antimicrobiana disminuida y la capaci-dad de inhibir la respiración «in vivo» en cepas de salmonella.Estos resultados indican que la estructura de la orquilla-ß afec-tada por el tratamiento con termolisina: a) es muy importante parael transporte del péptido al interior de la célula y b) no influye enla inhibición de la RNAP ni en la inhibibión del consumo de oxí-geno. Por lo tanto la región del anillo con el extremo C-terminalenhebrado, cuya estructura se conserva intacta en MccJ25-Th19,tendría un rol importante en los efectos inhibitorios inherentes ala actividad antimicrobiana de MccJ25.

49. (7869) MODIFICACIONES DENTRO DEL PRIMER ASACITOSOLICO DE LA BOMBA DE CA2+ DE MEMBRANAPLASMATICA PRODUCEN UN AUMENTO DE LA AFINI-DAD APARENTE DE LA ENZIMA POR EL CALCIO. DETEZANOS PINTO, FELICITAS; ADAMO, HUGO P.

IQUIFIB-Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas,Fac. de Farmacia y Bioquímica (UBA-CONICET)

El transportador de Ca2+ de membrana plasmatica, bombade Ca2+ o PMCA, es una proteina integral de membrana de al-rededor de 134 kDa y pertenece al grupo P de ATPasas trans-portadoras de iones. En humanos se conocen cuatro genes quecodifican distintas isoformas de la PMCA . El número de varian-tes de cada isoforma aumenta por el procesamiento alternativode mRNA. Recientemente mostramos que la eliminación de lasecuencia comprendida entre los aminoácidos 296 y 349 en elprimer asa citosólica de la isoforma humana 4x de la PMCA(hPMCA4x) produce un aumento de la afinidad por el Ca2+ (deTezanos Pinto, F., Adamo H.P., (2002) J. Biol. Chem. 277:12784-12789). Esta región de la molécula está involucrada en la gene-ración de variantes de la PMCA por el procesamiento alternati-vo del mRNA (splicing site «A») que en la hPMCA4 conlleva lainclusión (isoforma x), o exclusión (isoforma z) de un pequeñoexón de 36 nucleótidos. Las consecuencias funcionales de es-tas variaciones aún se desconocen. Mediante mutagénesis diri-gida hemos generado una PMCA similar a la forma natural 4z(~h4z) por la eliminación de los aminoácidos 300 al 314 de laisoforma h4x. La proteína recombinante se expresó en formaestable en células CHO. Medidas del transporte de Ca2+ envesículas de membrana mostraron que la velocidad maxima deh4x y ~h4z es similar. Sin embargo la afinidad aparente por Ca2+fue de 1.83 ± 0.52 uM para h4x y de 0.74 ± 0.22 uM para ~h4zLos resultados muestran que la deleción 300-314 aumentó laafinidad aparente de la enzima por el Ca2+ y abren la posibili-dad de que el procesamiento alternativo en el sitio «A» genereformas de PMCA con diferente afinidad por Ca2+ .

50. (7902) IMPORTANCIA DE LA ASPARAGINA 879 EN LAFORMACIÓN DEL SITIO DE UNIÓN PARA EL CA2+ DELTRANSPORTADOR DE CALCIO DE MEMBRANASPLASMÁTICAS HUMANAS. RINALDI, DÉBORA E.;ADAMO, HUGO P.



El transportador de Ca2+ de membrana plasmática o PMCAes responsable de la expulsión del Ca2+ con alta afinidad des-de el citosol de células eucariotas al medio extracelular. Es unaATPasa del grupo P que comprende las ATPasas transportado-ras de iones que forman una fosfoenzima mediante la unióncovalente con el fosfato-g del ATP. Estudios previos sugieren queen la PMCA, en analogía con la SERCA o Ca2+ ATPasa del re-tículo endoplásmico, la asparagina 879 en el segmentotransmembrànico 6, es uno de los residuos que forman el sitiode unión del Ca2+. Con el objetivo de establecer la importanciade la asparagina 879 en la formación del sitio para el Ca2+ seobtuvo por mutagénesis dirigida un ADN que codifica la isoformahumana 4xb de la PMCA conteniendo la substitución de laasparagina 879 por aspartato (N879D). Resultados anteriores denuestro laboratorio (Bredeston, L.M. y Adamo, H.P. 2004, J. Biol.Chem., en prensa) mostraron que la mutación del residuoaspàrtico 170 por asparagina (D170N) genera una forma activa-da de la PMCA. Por este motivo se construyó además unamutante doble conteniendo los cambios N879D y D170N. Se uti-lizó un sistema de expresión de levaduras para la producción dePMCA recombinante. Células de Saccharomyces cerevisiaeDBY2062 fueron transformadas con el vector pMP 625 contenien-do el gen de la hPMCA4xb N879D bajo el control de un promo-tor PMA1 fuerte. Se seleccionaron las levaduras transformantesy se aislaron las membranas celulares. La reactividad conanticuerpos anti PMCA indicó que ambas proteínas mutantesfueron expresadas a niveles similares a los de la proteína salva-je. Los resultados muestran que es posible expresar en levadu-ras mutantes del transportador de Ca2+ de membrana plasmáticahumana conteniendo la substitución individual o conjunta deD170N y N879D, y sugieren que estos cambios no afectan larelación entre síntesis y degradación de la PMCA.

51. (7955) IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS DEL SITIOCATALÍTICO DE LA CA2+ ATPASA DE MEMBRANAPLASMÁTICA PROBABLEMENTE INVOLUCRADOS ENLA INTERACCIÓN CON LA REGIÓN AUTOINHIBIDORA.DE TULLIO, MATIAS B.; ADAMO, HUGO P.


El sitio catalítico de la PMCA o Ca2+ ATPasa de membranaplasmática es bloqueado por el segmento regulador C-terminal.En la isoforma humana 4xb (hPMCA4xb), se ha postulado queuna de las regiones del sitio catalítico aceptoras del C-terminales la comprendida entre los aminoácidos 206-271. Para poner aprueba esta hipótesis hemos construido cuatro mutantes dehPMCA4xb conteniendo los cambios G209A, G210A, D223A,I227A. El estado funcional de las mutantes se analizó utilizadoel sistema de rescate fenotípico en Saccharomyses cerevisiaeK616. Debido a la inactivaciòn de los genes que codifican lostransportadores de Ca2+ endógenos, las células K616 no soncapaces de proliferar en medios deficientes en Ca2+. Las leva-duras se cultivaron en un medio rico y fueron transformadas conel vector de expresión pYX conteniendo el gen de la forma sal-vaje de la hPMCA4xb o de las mutantes. Los clones recom-binantes se seleccionaron en un medio 0.75% de basenitrogenada, 0.09% de suplemento de aminoácidos sin uracilo,2% glucosa y 2.8 mM MES (pH 6). Ensayos de western blot yrevelado con anticuerpos específicos confirmaron la expresiónde las proteínas mutantes. Las pruebas de complementación sellevaron a cabo agregando al medio de cultivo 10mM CaCl2 o10 mM de EGTA. Tanto las levaduras que expresaron hPMCA4como el resto de las mutantes crecieron en el medio suplemen-tado con Ca2+. Por el contrario en el medio conteniendo EGTA10 mM, las células que expresaron la hPMCA4 salvaje no fue-ron capaces de crecer pero si lo hicieron aquellas que expresa-ron la mutante truncada CT120 que carece de la secuenciaautoinhibidora. Al igual que la mutante CT120, clones que ex-presaron la mutante I227A crecieron en presencia de 10 mM

EGTA Los resultados sugieren que substitución de I227A activala PMCA modificando en forma directa o a través de cambiosconformacionales la interacción entre el sitio catalítico y la re-gión autoinhibidora

52. (7989) ß-GALACTOSIDASE ACTIVITY IN A MOLECULARCROWDED ENVIRONMENT. COLLIN, ALEJANDRO AL-BERTO; SANCHEZ, JULIETA MARIA; PERILLO, MARIAANGELICA

Depto.de Química, FCEFy N., U.N.C. Av.Vélez Sarsfield1611, 5016 Córdoba, Argentina.

In the present work we investigated the modulation of ß-galactosidase (ß-Gal) activity, stability and structure in a molecularcrowded environment. Enzyme activity against ß-D-ortho-nitrophenyl-galactopiranoside (ONPG) in the presence or absenceof poly ethylene glycol (PEG) as the crowded agent was determinedat [PEG]= 0-35% P/V, by spectrophotometry. The effect of PEGon the protein structure and the thermal behavior of the enzymewas studied through the ß-Gal intrinsic fluorescence (IF). ONPGsuffered a non-enzymatic hydrolysis in the presence of PEG. Thisphenomenon was taken into account in the experimental procedurefollowed to evaluate the enzyme activity. ß-Gal activity changedin the presence of PEG (respect to the control). This effect reacheda maximum at 25% PEG, where the activity increased a 40%respect to the control; at higher concentration, the effect was lower.The emission spectra (EI) of ß-Gal were recorded in the wavelengthrange 300-500 nm, (excitation waveleght = 295 nm), with or withoutPEG at different concentrations and temperatures (28-55°C). Themaximal wavelenght of ß-Gal emission was red-shifted as a directfunction of PEG concentration. This indicated that the Trp residuesof ß-Gal were localized in a more polar environment in the presenceof PEG. Moreover, PEG conferred more stability to the proteinagainst high temperature respect to pure water. Our results canbe interpreted in terms of the effects of the water-structure of thesolution (more ordered in the presence of PEG) on the enzymeconformation as well as on the very reaction mechanism (a watermolecule is use in the second stage of the reaction mechanism).However, at present we cannot discard a direct PEG-proteininteraction.

53. (8075) ESTUDIO TEÓRICO DE LA DINÁMICA GLOBALCOMÚN A MIEMBROS DE UNA MISMA FAMILIA DE PRO-TEÍNAS. FERNÁNDEZ ALBERTI, SEBASTIÁN; MAGUID,SANDRA; ECHAVE, JULIÁN

Universidad Nacional de Quilmes

Presentamos un procedimiento para explorar la dinámica glo-bal común entre miembros de una misma familia de proteínas.El método permite la comparación de patrones de movimientovibracional obtenidos por análisis de modos normales. Seguidoa la identificación de las coordenadas colectivas que se hanconservado durante la evolución, cuantificamos la similitud diná-mica dentro de una familia de plegamiento. La utilización delmétodo de Descomposición en Valores Singulares permite defi-nir vectores representativos de la dinámica común. Hemos con-siderado la familia de las globinas como caso testigo. Nuestrosresultados permiten pronosticar la posibilidad del desarrollo demétodos teóricos de evolución de proteínas basados en la con-servación de características dinámicas. El metodo desarrolladopermite la comparación de patrones de movimiento vibracionalobtenidos a partir del análisis de modos normales. Se muestraque es posible construir vectores representativos de la dinámicacolectiva común a miembros de una misma familia de proteínas.Hemos podido observar un alto valor de conservación de los dosmodos normales de menor frecuencia en la familia de lasglobinas. Sin embargo, las diferencias en la dinámica de las pro-teínas homólogas crece rápidamente con la frecuencia promediode sus modos equivalentes correspondientes. El trabajo muestraque las mutaciones, dentro de una misma familia de plegamiento,permiten la conservación no solamente de características estruc-turales sino también dinámicas dentro de la familia.


54. 8091 PLEGAMIENTO ANÓMALO DE APOLIPOPRO-TEÍNA A-I INDUCE AMILOIDOSIS. TRICERRI, M. ALEJAN-DRA; FERREIRA, SERGIO T.INIBIOLP, Fac. Cs. Médicas, Universidad Nacional de LaPlata, La Plata, Argentina. Departamento de BioquímicaMédica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio deJaneiro, Brasil.

Las amiloidosis están caracterizadas por depósitos extrace-lulares de proteínas fibrilares anormales. La apolipoproteína A-I(apoA-I) humana normalmente no está involucrada con estaspatologías. Sin embargo, un caso de severa amiloidosis asocia-da con arteroesclerosis se observó cuando la apoA-I presentauna deleción de un residuo de lisina en una región central de laproteína (apoA-I Lys107-0). Para detectar los posibles factoresque predisponen esta precipitación anómala, analizamos el ple-gamiento de la proteína mutante mencionada, comparada con laapoA-I salvaje (wt). Análisis de denaturación química y utilizan-do presión hidrostática, indican que la apoA-I Lys107-0 es másinestable y tiene más tendencia a formar estructura de hoja betacon el tiempo de incubación, en particular a pH ácido. En estascondiciones la denaturación deja de ser cooperativa, sugiriendoestados de plegamiento interme

biologÍa general 1: zoologÍašmenes de las... · pcr semicuantitativa la expresión de estos tres...

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