dificultades en la interpretacion de anca por ifi · kawasaki arteritis necrotizante con sind lmc...
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DIFICULTADES EN LA
INTERPRETACION DE
ANCA POR IFI
Conocimientos
Entrenamiento
Convicción
INTERPRETACION
DE ANCA POR IFI
# ANA (Coons AH, Kaplan MH.
J Exp Med 1950; 91:1-13) (IFI-
Frotis)
# Diferenciación de ANA. (1964)
# Anti GS – ANA. Wiik A.
Alergia 1980; 35: 263-289
(IFI). 75 % AR, 90 % Sind. de
Felty. (Ac coloreaban los núcleos y la región perinuclear de neutrófilos y Monocitos)
# 1973, GN – IFI, citoplasma
fluorescente
# 1981, IFI CSGGW
# 1982, Davies DJ, et al Br Med
J 1982; 285: 606. (Fluorescencia citoplasmatica – Formol/)
# Técnica Standard (GS-ANA)
(A. WiiK 1988).
Etanol
Núcleo
MPO MPO
MPO
MPO
MPO
Davies DJ, Moran JE, Niall JF. Segmental necrotizing
glomerulonefritis with antineutrophil antibody: posible
arbovirus aetiology. Br Med J 1982; 285:606-606.
Falk RJ, Jennette JC. Anti - neutrophil in patients with
sistemic vasculitis and idiopatic necrotizing and crescentic
glomerulonephritis. N Engl J Med 1988; 318:1651-1657
DEFINICION DE PATRONES DE
FLUORESCENCIA PARA ANCA
cANCA: patrón clásico de fluorescencia granular con acentuación central o interlobular .
pANCA: patrón perinuclear clásico, sin extensión nuclear
cANCA atípico: patrón difuso “flat” (plano), sin acentuación interlobular
pANCA atípico : patrón perinuclear, con extensión nuclear (GS-ANA)
aANCA atípico: incluye todos los otros patrones IFI de reactividad específica para neutrófilos o monocitos. Con frecuencia se trata de una combinación de fluorescencia citoplásmica y perinuclear.
1-Savige J et al. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies. Am J Clin Pathol 1999;111:507-513.
2-Savige J et al. Addendum to the International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoinmune diseases. Am J Clin Pathol 2003;120:312-318.
Distribución de ANCA en las
vasculitis de pequeño vasos y GN
Pauciinmune
DEFINICION DE PATRONES DE FLUORESCENCIA
EN RELACION A LOS ANCA
ANCA, basada en la presencia o no de puntos intranucleares y en los patrones IFI obtenidos en improntas fijados con etanol o formalina.
3-Terjung B et al. Differentiation of antineutrophil nuclear antibodies in inflammatory bowel and autoinmune liver diseases from antineutrophil cytoplasmic antibodies (p-ANCA) using immunofluorescence microscopy. Clin exp immunol
2001;126:37-46.
6-Terjung B et al. P-ANCAs in autoinmune liver disorders recognise human β-tubulin isotype 5 and cross-react with microbial protein FtsZ. Gut 2010; 59: 808-816. 7-Op De Beéck et al. Immune reactivity to β-tubulin isotype 5 and vesicular integralmembrane protein 36 in patients with autoimmune gastrointestinal disorders. Gut 2011; 60:1601-1602.
ANCA: metodología mas utilizada
Neutrófilos humanos Donantes Cultivados Dextran Ficoll – Hipaque + Dextran Adherencia Citocentrifugación
IFI
SUSTRATO: NEUTROFILOS HUMANOS
DONANTE (HOME MADE)
CULTIVADOS (COMERCIAL)
DEXTRAN
FICOLL – HIPAQUE + DEXTRAN
ADHERENCIA NATURAL
DEPOSITO
EXTENCION
CITOCENTRIFUGACIóN
pANCA (MPO)
cANCA pANCA
DEFINICION DE PATRONES DE
FLUORESCENCIA EN RELACION A LOS
ANCA
From: A historical essay on detection of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies Nephrol Dial Transplant. 2015;30(suppl_1):i8-i13. doi:10.1093/ndt/gfv070
Nephrol Dial Transplant | © The Author 2015. Published by Oxford University Press on behalf of ERA-EDTA. All rights reserved.
DEFINICION DE PATRONES DE
FLUORESCENCIA EN RELACION A LOS
ANCA
cANCA pANCA
ALGUNAS “DIFERENCIAS” ENTRE UN
METODO DESARROLLADO Y UNO
COMERCIAL
LAVADO DE LAS CELULAS CON SAB (La SAB evita la formación de inmunocomplejos entre proteínas del suero y el propio sustrato).
SABEMOS CON QUE SE FIJA Y CUANTO TIEMPO ?
(Fijar 15 minutos con etanol 96-99 %, o 7 minutos con formaldehído al 5 %).
PODEMOS ELEGIR COLOCAR EN LA IMPRONTA MONOCITOS Y LINFOCITOS
ASPECTOS PREANALITICOS ANALITICOS
EN RELACION A LA TECNICA DE IFI
DIFERENTES
DIFICULTADES EN LA
DETECCION DE ANCA
POR IFI
-Hagen EC, Ballieux BEP, van Es LA, Daha MR, van der Woude FJ. Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA): a review of antigens involved, the assays, the clinical and
possible pathogenetic consecuenses. Blood 1993; 81:199.
-Chevallier A, Noel LH, Renier G, Gardembas-Pain M,Subra JF, Nusbaum P, et al. Determination of anti-neutrophil cytoplasm antibodies on chronic myelocytic leukemia cells. J Immunol
Meth 1992,147:101-109.
-Hagen E Ch, Andrassy K, Chernok E, Daha MR, Gaskin G, Gross W, et al. The value of indirect immunofluorescense and solid phase techniques for ANCA detection. J Immunol Methods
993, 159:1-16.
-Ulmer M, Rautmann, Gross WL. Immunodiagnostic aspects of autoantibodies against myeloperoxidase. Clinical nephrology 1992, 37:161-168.
Arteritis Granulomatosa en <50a
Arteritis Granulomatosa en >50a
Enf Takayasu
Enf. Cel Gigante
Grandes Vasos Pequeños Vasos Medianos Vasos
Arteritis Necrotizante sin Sind LMC
PAN Enf. Kawasaki
Arteritis Necrotizante con Sind LMC
Depositos Inmunocomplejos en pared vascular
Otra origen de IC
Otras Vasculitis
Inmunocomplejos
Crioglobulinas séricas y en pared vascular
Vasculitis por
Crioglobulinas
IgA en pared vascular
Purpura de
Schönlein Henoch
LES / AR
Vasculitis
LES / AR
ANCA (+) Pauci-inmune
Vasculitis sin asma ni granulomas
PA
microscopica
Vasculitis sin asma con granulomas
Granulomatosis
Wegener
Vasculitis con asma + granulomas + eosinofilia
Sindrome
Churg Strauss
Enfermedad Inflamatoria Intestinal
Paraneoplásico Carcinoma Vasculitiis inducidas por neoplasias Linfo/mieloproliferativa
CHAPEL HILL CONSENSUS CONFERENCE
1992
2012 revised International Chapel Hill Consensus
Conference Nomenclature of Vasculitides.
INTERFERENCIAS EN LA IFI
+/- 100 sueros / 20 ANA
reactivos. 20/13 ANA
reactivos (PMN- Et)
84 sueros ANA Reactivos
(HEp-2)
67.7 % ANA Reactivos
(PMN- Et)
50 % ANA Reactivos
(PMN- For)
No alcanza PMN- Formaldehido !!
“Mayores dificultades en pacientes
hospitalizados”
ORDENES DE PRACTICAS COMPLEJAS
PACIENTES COMPLEJOS
LABORATORIO DE
AUTOINMUNIDAD
ANCA en otras enfermedades
pANCA - Colitis ulcerosa, colangitis esclerosante primaria.
pANCA, Hepatitis autoinmune (50 – 96 %)
pANCA, HIV, amebiasis, TBC pulmonar
pANCA, aANCA (colagenopatías)
AUTOANTICUERPOS EN LA HEPATITIS
AUTOINMUNE
Tipo I Tipo II Tipo III
Anticuerpos anti nucleares (ANA) + - -
Anticuerpos anti músculo liso (AML) + - -/+
Anticuerpo contra proteína hepática
específica (anti-PHE) + + +
Anticuerpo contra receptor
de asialoglicoproteína + + +
Anticuerpo contra antígeno de
membrana hepática - + +/-
Anticuerpo antimicrosoma
hepatorrenal (anti-MHR) - + -
Anticuerpo anticitosol hepático1 (anti CH 1) - + -
Anticuerpo contra el antígeno
hepático soluble (anti AHS) - - +
Anti Tejidos (Títulos > 1/640)
Anti Musculo Cardiaco
Anti Microsomal Tiroideo
Anti LKM
Anti Musculo Liso
QUE SABEMOS DE LOS ANCA Y DE SU
UTILIDAD EN LA CLINICA ?
cANCA y GW activa (S: 71-93 %), (E: 84-97 %).
Título correlaciona con actividad.
El aumento de título precede a la recaída (VPP
55-92 %).
Los aumentos no sig. de título dan idea de no
recaída en el futuro cercano (VPN 97 %).
Raro, manifestaciones floridas sin presencia de
ANCA.
cANCA asociado a anti PR3.
•Mahler y Fritzler . Ann Rheum Dis 2017 . doi: 10.1136 / annrheumdis-2017 hasta 211.157
•Damoiseaux J ,Csernok E ,Rasmussen N , et al. Ann Rheum Dis 2016 . doi: 10.1136 / annrheumdis-2016-209507
Se debe diferenciar entre solicitudes de prueba para VAA
frente a otras condiciones inflamatorias tales como,
enfermedades inflamatorias intestinales, la hepatitis
autoinmune, enfermedades del colágeno.
La relevancia clínica de las pruebas de ANCA en
enfermedades que no son VAA es limitada.
Se sostiene !!!!!, por el hecho de que los resultados de
las pruebas de ANCA no se incorporan en los
respectivos criterios de diagnóstico
Es importante la combinación de pruebas, incluyendo la
IFI y que se puedan cuantificar, no es aconsejable
resultados en la IFI como positivo o negativo.
Anti citoplasma de neutrófilos
(adherencia)
cANCA (aPR3)
pANCA (MPO)
ANCA : DIFICULTADES EN LA
INTERPRETACION LES JUVENIL
AR
GLOMERULOPATIAS
ANCA, 16 % pANCA,
aANCA (aMPO 9,8 % (5/51),
aLf 13,7 % (7/51), títulos bajos
Prevalencia de ANCA fue del 2.8 % (2/89), pANCA, títulos bajos 1/40, aMPO.
(18.18 %), GP lúpica
clase IV, y menos frecuentemente nefropatía diabética. pANCA, aANCA, cANCA. títulos bajos
aANCA
GS-ANA
Linfocito
Eosinófilo
Monocito
Lactoferrina
Catepsina G
Helastasa
MPO
PR3
DIFERENTES SITUACIONES EN LA DETECCION DE ANCA
POR IFI
cANCA PR3 + MPO - GW
cANCA PR3 - MPO + 5 – 10 %
cANCA son
MPO +
cANCA PR3 - MPO - BPI +
cANCA PR3 - MPO - GW
(improbable)
cANCA PR3 + MPO + Propiltiouracilo,
Hidralacina,
inespecificidad
en unión
DIFERENTES SITUACIONES EN LA DETECCION DE ANCA
POR IFI
pANCA MPO + PAM 45 %
GNCI 65 %
pANCA PR3 + 5 % pANCA
(GW)
pANCA Lf +
ABSORCION DE ANA INTERFERENTES
EN LA DETECCION DE ANCA POR IFI
ABSORCION DE ANA INTERFERENTES EN LA
DETECCION DE ANCA POR IFI
ANA + ANCA ?
ALOANTICUERPOS
# NB1 Aloantígeno más difundido
( 50 – 90 % de los neutrófilos)
# 54/68 Kd, glicoproteína de
membrana, gránulos secundarios
PMN
Stroncek DF, Egging MS, Eiber GA, Clay ME. Neutrophil
Alloantibodies React With Cytoplasmic Antigens: Possible
Cause of False - Positive Indirect Immunofluorescence
Assays for Antibodies to Neutrophil Cytoplasmic Antigens.
Am J Kidney Dis 1993; (21): 368-373.
Ac anti citoplasma (Títulos > 1/640)
Anti
Mitocondrias
Anti Golgi
Anti Ribosomas
Anti Mitocondrias
INFORME
Anticuerpos anti citoplasma de
neutrófilos
Metodo: Inmunofluorescencia indirecta
Sustrato: Neutrófilos Humanos
Resultado: No reactivo
INFORME
Anticuerpos anti citoplasma de neutrófilos
Metodo: Inmunofluorescencia indirecta
Sustrato: Neutrófilos Humanos
Resultado: Reactivo
Título: 1/160
Imágen: pANCA
Nota: ante resultado reactivo, se sugiere realizar
dosaje de Ac. aMPO y aPR3 (ELISA).
Conclusiones
Diferenciar patrones de fluorescencia
sobre neutrófilos y además diferenciar de
otros auto o aloanticuerpos depende del
conocimiento, del entrenamiento y en
algunos casos es dificultoso.
La determinación de aPR3 y aMPO, puede
indicar que la fluorescencia tiene
significancia clínica.
La relevancia clínica de las pruebas de
ANCA en enfermedades que no son VAA
es “limitada”, hay que contextualizar la
determinación
Conclusión final
Hay que trabajar para la incorporación
sistemática de aPR3 y aMPO (ELISA), sin
dejar de usar la IFI, ya que la misma es la
proveedora de muchos de los
conocimientos actuales sobre estos
antígenos y anticuerpos. Seguramente
nos seguirá inspirando con nuevos
conocimientos en relación a los ANCA y
las patologías asociadas.
