Universidad Nacional Andrés Bello

Laboratorio Química Analítica e Instrumental QUI-141

Profesora: Karina González

LABORATORIO 10:

“Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina’’

Integrante: Eduardo Valderrama

Curso: QUI141 – Sección 03

Fecha de entrega: sábado 9 de Noviembre del 2013

Introducción

En la cromatografía en capa fina es un método de separación que emplea una placa de vidrio o una lamina metálica, que se cubre con una película de unos 250 um de espesor de un adsorbente (gel de sílice u oxido de aluminio, entre otros). A continuación, de forma análoga a la cromatografía de papel, se sitúa en un extremo inferior la disolución de las sustancias que se van a separar. Esta separación se lleva a cabo en una cubeta, que contiene un agente eluyente hasta una altura de 0,5cm; las sustancias que se separen se detectan posteriormente de forma apropiada. Por variación y preparación adecuada de la capa de adsorción se consigue el análisis de mezclas de sustancias tanto hidrófilas como lipófilas. La mayor ventaja de este método es, junto a su gran capacidad de separación, la rapidez del proceso que, en general, requiere solamente 10-30 minutos. La cromatografía en capa fina resulta adecuada tanto para la separación de vitaminas, terpenos, esteroides y pigmentos como para la de aminoácidos, azúcares, nucleótidos, ácidos nucleicos, alcaloides, medicamentos e incluso para la de aniones y cationes inorgánicos.

El proceso de separación también se puede llevar a cabo por medio de la electroforesis o una combinación electroforesis-cromatografía, cuando se trata de identificación de sustancias de alto peso molecular. El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesario la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos de columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácidos mayoritarios existentes en la muestras. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo costo de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografístas son de la opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la columna.

Antes de realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de aminoácido y lavando después con agua destilada.

La separación de los aminoácidos se basa en que estos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatografía en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa. La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retaso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.

La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan los valores de Rf e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, al acido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos.

Objetivos

Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina, sus características y factores que en ella intervienen.

Calcular los valores de Rf de varias sustancias (aminoácidos).

Deducir, mediante los valores de Rf calculados, la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.

Aplicar la técnica de cromatografía de capa fina como criterio de pureza de las sustancias.

Aplicar la técnica de cromatografía de capa fina (TLC) como criterio parcial de identificación de sustancias.

Adquirir la destreza en la aplicación de muestras sobre cromatofolios.

Utilizar métodos físicos y químicos de localización de manchas.

Determinar la composición cualitativa de una muestra problema.

Parte experimental

1. Materiales y reactivos:

Tubos de ensayo

Gradilla

7 capilares de vidrio

Regla de 40 cm

Gafas de seguridad

Guantes

Muestra problema (aminoácidos)

6 Soluciones estándares de aminoácidos (AA)

Lápiz grafito

4 Placas para cromatografía de 10x10 cm (cromatofolios)

Cámara cromatográfica

Aspersor

Estufa de secado a 105ºC

Solución de ninhidrina (0.2% en etanol)

Fase móvil A: Solución n-propanol: NH3 (7:3)

Fase móvil B: Solución n-butanol: CH3COOH:H2O (6:2:2)

2. Métodos y Condiciones Experimentales:

Sembrado de muestras y patrones de caracterización: En el inicio del presente práctico se realizó el sembrado de muestras y patrones de caracterización en cuatro placas cromatográficas de sílice de 10 x 10 cm (cromatofolios) entregadas previamente. Para esto, en cada placa se marcó suavemente con un lápiz grafito la línea de origen a una distancia de 1 cm desde el borde inferior del cromatofolio, procurando de no levantar la sílice. Además de marcar esta línea, se marcó también con el lápiz grafito una línea superior (frente de disolvente) a una distancia de 1 cm desde el borde superior del cromatofolio. Una vez marcadas ambas líneas, se marcó nuevamente con el lápiz grafito las posiciones del sembrado a realizar sobre la línea de origen, de modo que la distancia entre las posiciones de cada patrón de aminoácido sea la misma siempre (1 cm aproximadamente).

Posteriormente se realizó el sembrado propiamente tal. Para esto se dispuso de una gradilla con siete tubos de ensayos rotulados, seis de ellos con distintos aminoácidos en su interior, y un tubo correspondiente a la muestra problema de aminoácidos:

Identificación Nombre de AminoácidoAA1 TriptófanoAA2 HistidinaAA3 Ácido GlutámicoAA4 GlicinaAA5 LeucinaAA6 ArgininaMP Muestra Problema

Luego, para el sembrado se introdujo un capilar de vidrio en la respectiva solución a sembrar y se esperó a que el nivel del líquido fuera suficiente. Posteriormente, el líquido se depositó en su posición correspondiente sobre la línea de origen, tocando la misma, manteniendo el capilar en posición perpendicular. Esto se realizó quince veces con cada solución y la muestra problema, en sus respectivas posiciones, esperando siempre que las manchas estuvieran secas entre aplicación y aplicación, para así evitar la difusión en el origen. Las posiciones (P) de cada aminoácido y muestra problema en todas las placas fue la siguiente:

P.1

P.2

P.3

P.4

P.5

P.6

P.7

AA1

AA2

AA3

AA4

AA5

AA6

MP

Preparación de la cámara cromatográfica: Las cámaras cromatográficas para las placas ya se encontraba previamente preparada, con los disolventes correspondientes: n-propanol: NH3 (7:3) para la placa A y B; n-butanol: CH3COOH:H2O (6:2:2), para la placas C y D. Se procedió a colocar las placas anteriormente preparadas, cuidando que el nivel de líquido no superase los 0,8 cm de altura.

Desarrollo del cromatograma: Una vez colocadas las placas cromatográficas en las respectivas cámaras, éstas se taparon rápidamente, y se esperó el tiempo suficiente para que el frente del solvente alcance su línea correspondiente dibujada anteriormente, a 1 cm del borde superior de la placa. Una vez alcanzada dicha línea, se retiraron las placas y se secaron en campana, para así acelerar el proceso.

Localización de las manchas y revelado: Estando secas ambas placas, éstas fueron reveladas bajo campana, asperjando las placas con una solución de ninhidrina cuidadosamente. Luego de ser pulverizadas ambas placas, se dejaron secar al aire (temperatura ambiente) bajo campana también, y posteriormente se trasladaron a una estufa a 105ºC, dejando las placas ahí durante 5 minutos. Al cabo de ese tiempo, se retiraron las placas, en las que ya se podían observar las manchas de colores de cada aminoácido. En estas manchas se analizaron sus características tales como color, forma y tamaño. Posteriormente se procedió a medir con una regla las distancias de cada mancha respecto del origen así como la distancia del frente de solvente con respecto de la línea de origen, para de esta manera calcular los Rf para los patrones y los diferentes componentes contenidos en la muestra problema, lo que permitirá finalmente poder determinar cualitativamente la composición de la muestra problema entregada, y de esta manera poder realizar la identificación y conclusiones correspondientes.

3. Descripción de la técnica :

Entre los métodos de cromatografía en plano está la cromatografía en capa fina (TLC), que es rápida, presenta una buena resolución y es bastante sensible. En la cromatografía en capa fina se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material que a la vez es el soporte, o bien, cubre una superficie metal. La fase móvil se desplaza por la fase estacionaria por acción capilar.

La aplicación de la muestra es tal vez el aspecto más decisivo de la cromatografía en capa fina. Por lo general se aplica una solución de la muestra de 0.01% a 0.1% como un punto a 1 o 2 cm del extremo de la placa. Para la separación más eficaz, este punto o mancha debe tener un diámetro mínimo, alrededor de 5 mm para un trabajo cualitativo y menor para el análisis cuantitativo. En el caso de soluciones diluidas, se realizan tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicación y aplicación. La aplicación manual de las muestras se efectúa por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra.

Se pueden aplicar una diversidad de procedimientos para localizar los componentes de la muestra después de la separación. Para la separación de aminoácidos se utiliza un reactivo específico, la ninhidrina, que sirve para localizar las especies separadas.

La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retardo) con otros tomados como referencia para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. El factor de retardo para un soluto es:

Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen Distancia recorrida por el solvente desde el origen

Ambas distancias lineales medidas desde la línea de aplicación. Los valores de Rf tienen la capacidad de variar desde 1, para los solutos que no se retrasan, hasta valores que se aproximan a cero.

Resultados

Tabla N°1: Placa A, medida en la fase móvil A (n-propanol:NH3 (7:3)) :

Número

Estándar o MP DM(cm) DS(cm) Rf

1 Triptófano 3,7 8 0,46252 Histidina 2,1 8 0,26253 Acido glutámico 1,0 8 0,18754 Glicina 1,7 8 0,21255 Leucina 3,5 8 0,4375|6 Arginina 0,5 8 0,06257 MP 3,5 y 1,7 8 y 8 0,4375 y 0,2125

Tabla N°2: Placa B, medida en la fase móvil A (n-propanol:NH3 (7:3)) :

Número

Estándar o MP DM(cm) DS(cm) Rf

1 Triptófano 3,7 8 0,46252 Histidina 2,1 8 0,26253 Acido glutámico 1,0 8 0,18754 Glicina 1,7 8 0,21255 Leucina 3,5 8 0,4375|6 Arginina 0,5 8 0,06257 MP 3,5 y 1,7 8 y 8 0,4375 y 0,2125

Tabla N°3: Placa C, medida en la Fase móvil B: Solución n-butanol (CH3COOH:H2O (6:2:2)):

Número

Estándar o MP DM(cm) DS(cm) Rf

1 Triptófano 4,2 8 0,52502 Histidina 0,7 8 0,08753 Acido glutámico 2,0 8 0,25004 Glicina 1,7 8 0,21255 Leucina 3,8 8 0,4750|6 Arginina 0,9 8 0,11257 MP 3,8 y 1,7 8 y 8 0,4750 y 0,2125

Tabla N°4: Placa D, medida en la Fase móvil B: Solución n-butanol (CH3COOH:H2O (6:2:2)):

Número

Estándar o MP DM(cm) DS(cm) Rf

1 Triptófano 4,2 8 0,52502 Histidina 0,7 8 0,08753 Acido glutámico 2,0 8 0,2500

4 Glicina 1,7 8 0,21255 Leucina 3,8 8 0,4750|6 Arginina 0,9 8 0,11257 MP 3,8 y 1,7 8 y 8 0,4750 y 0,2125

Discusión

Características de las manchas: Tras analizar las manchas obtenidas en todas las placas cromatográficas, se puede observar que en cada placa las manchas de los distintos aminoácidos difieren levemente en color, pese a ser similares. Aquí cabe destacar que en el desarrollo de color de cada mancha cumple un rol muy importante la solución de ninhidrina con la cual se asperjó cada placa cromatográfica. La ninhidrina decarboxila y desamina al aminoácido gracias a su fuerte poder oxidante. La ninhidrina reducida formada reacciona con una molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la desaminación para formar así un compuesto complejo capaz de absorber luz visible, presentando así una coloración que generalmente varía entre rosa y violeta, dependiendo del aminoácido. Los colores de cada aminoácido varían en las placas, lo que se debe a los distintos solventes utilizados. Respecto a la forma, se pueden observar manchas de distintas formas: circulares, ovaladas e irregulares; así como también se pueden observar manchas más pequeñas y otras más grandes. Todas estas características permiten determinar, por observación de las manchas, la composición cualitativa de la muestra problema. En la placa A se pueden observar dos manchas de la muestra problema: la superior, aplanada color violeta claro y otra inferior, circular de color rosado claro, ambas de tamaño mediano, siendo la primera relativamente más pequeña. La primera mancha, por todas las características descritas anteriormente, se asemeja a la mancha del aminoácido 5. La segunda mancha, también por sus características descritas, se asemeja a la mancha del aminoácido 4. En la placa B se puede apreciar las mismas observaciones de la placa A.

En la placa C se pueden observar también dos manchas de la muestra problema, ambas aplanadas y de tamaños similares, siendo la mancha superior de color violeta claro y la inferior de color beige. La primera mancha descrita se asemeja físicamente a la mancha del aminoácido 5, y la segunda mancha descrita se asemeja a la mancha del aminoácido 4. En la placa D se puede aprecian las mismas observaciones que la placa C.

Puesto que el análisis en base a la caracterización de las manchas coincide para todas las placas cromatográficas, se deduce que la muestra problema se compone de los aminoácidos 4 y 5 (glicina y leucina, respectivamente). Esto se puede corroborar mediante los valores de Rf calculados para cada aminoácido y muestra problema en ambas placas.

Valores de Rf calculados: En las placa A y B, los valores de Rf calculados de la muestra problema, para la mancha superior y la inferior, dentro de la línea de origen son 0,4375 y 0,2125, lo que demuestra una precisión perfecta de las medidas, al obtener los mismos Rf en ambas placas. Los valores de Rf de los patrones de aminoácidos que más se asemejan a los Rf de la muestra problema son los calculados para los aminoácidos 4 y 5, siendo estos valores 0,4375 y 0,2125, respectivamente. En la placa C y D, lo valores de Rf calculados de la muestra problema, para la mancha superior y la inferior, dentro de la línea

de origen son 0,4750 y 0,2125, lo que demuestra una precisión perfecta de las medidas, en ambas placas. Estos valores son idénticos a los valores de Rf de los patrones de aminoácidos calculados para los aminoácidos 4 y 5.

Puesto que el análisis en base a los valores calculados de Rf de las manchas coincide en todas las placas cromatográficas, se deduce que la muestra problema se compone de los aminoácidos 4 y 5 (glicina y leucina, respectivamente), corroborando así lo que se concluyó con respecto al análisis en base a la caracterización de las manchas.

Cuanto más polar sea el aminoácido, más retenido estará en el absorbente, y por lo tanto irá más lento y el Rf será también menor. Por otra parte, los aminoácidos menos polares, se consiguen desplazar a más distancia desde el origen. La polaridad del disolvente también influye en el valor del Rf, por lo que se debe tener en cuenta. Así, para un mismo tipo de aminoácido, un aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento en la placa y por lo tanto también aumentará su Rf. En este caso, los solventes utilizados (n-propanol y n-butanol) ambos son alcoholes, compuestos polares, y son de una serie homóloga, es por esto que se obtiene una buena resolución de la muestra problema utilizando ambos solventes, obteniéndose valores similares de Rf con ambos. Sin embargo, se pudo observar en la realización del práctico que en la cromatografía realizada con n-propanol, el ascenso del disolvente fue levemente más rápido, por lo que se considera que dicho disolvente es más polar. Pese a esto, los valores de Rf de cada aminoácido y muestra problema obtenidos con cada disolvente son tan similares, que la diferencia de polaridad de disolventes se considera mínima.

Conclusión

- Se conoció y aplicó la técnica de cromatografía en capa fina, sus características y los factores que en ella intervienen, como por ejemplo la polaridad tanto de los aminoácidos como del disolvente utilizado.

- Se logró adquirir la destreza necesaria en la aplicación de muestras de diferentes aminoácidos sobre cromatofolios de sílice de 10 x 10 cm.

- Mediante la utilización de métodos físicos y químicos, se logró la localización y caracterización de las manchas obtenidas para cada aminoácido y muestra problema.

- Tras el desarrollo de la cromatografía y posterior revelado de las manchas con ninhidrina, se pudo calcular los valores de Rf de los distintos aminoácidos sembrados, así como de la muestra problema entregada previamente. A partir de los valores de Rf calculados, se pudo estudiar y analizar la relación que existe entre la polaridad de los aminoácidos y la de los eluyentes utilizados.

- Se logró aplicar la técnica de cromatografía de capa fina como criterio de pureza de los aminoácidos, así también como criterio parcial de identificación de aminoácidos presentes en la muestra problema, cuyo análisis cuantitativo arrojó que la composición era de dos aminoácidos, glicina y leucina.

Bibliografía

Hans Beber, Wolfgang Walter. “Manual de Química Orgánica”. Editorial Reverté S.A. Año 1987. Capítulo: Análisis elemental orgánico cualitativo. Página 11.

Douglas A. Skoog, Stanley R. Crouch, F. James Holler. “Principios de Análisis Instrumental”; 6ª Edición, Editorial Cengage Learning Editores, Año 2008, Capítulo: “Cromatografía por afinidad”. Páginas: 848 - 850.

J.M.Teijón Rivera, A.Garrido Pertierra. “Fundamentos de Bioquímica Estructural”; 2ª Edición, Editorial Tébar, Año 2006, Capítulo 4: “Aminoácidos: propiedades generales”. Páginas: 67 – 68.