Pel ita Perkebunan 2003, 19(2), 78-89

Kenlanlpuan Produksi Ochratoxin A Secara in Vitro Spesies Jamur yang Diisolasi dari Biji Kopi

In Vitro Production Capability of Ochratoxin A of Mould Species Isolated froln Coffee Beans

Cahya Ismayadi I>, J. Silviana2), Fithri Choirun Nisa2),

Elok Zubaidah2) dan Zaenudin 1)

Ringkasan

Biji kopi dihasilkan di daerah tropik secara terbuka sehingga rawan terhadap infestasi jamur toksigenik, termasuk penghasil ochratoxin A (OTA). Isu kontaminasi pacta kopi telah merebak dengan diberiakukannya batas maksimum oleh beberapa negara kOllsumen dan ditemukan adanya OTA pada beberapa contoh yang diperdagangkan di dunia. OTA dihasilkan oleh jamur Aspergillus dan Penicillium verrucosum di daerah sub-tropik. Untuk mellgetahui kemampuall dalam menghasilkan OTA pada kopi, isolat jamul" Aspergillus dari kelompok Circumdati (termasuk A. ochraceus), Nigri, dan Flavi masing-masing sebanyak 36, 85, dan 60 isolat diambil dari biji kopi yang berasal dari Lampung, Jawa Timur, dan Bali. Uj i kemampuan produksi OTA dilakukan secara in vitro dalam medium YES cair dan senyawa metabolit dalam kultur dianalisis dengan KLT dan menggunakan OTA baku sebagai acuan. Keberadaan OTA dalam ekstrak yang masih meragukan dikonfirmasi lebih lanjut dengan HPLC. Sebanyak 44,4% isolat kelompok Circumdati, 2,4% isolat kelompok Nigri, dan 5% dari isolat kelompok Flavi terbukti mampu menghasilkan OTA. !solar tcrsebut terdapat pada semua daerah asal kopi yang diuji. Dengan demikian penghasil utama OTA pada kopi adalah kelompok Circumdati (A. ochraceus), sedangkan kedua kelompok lainnya sangat rendah pcranannya dalam kontaminasi OTA pada kopi Indonesia. Walaupun peluang kontaminasi OTA oleh spesies jamur tersebut cukup rendah tetapi perlu tetap diwaspadai terutama pada kopi yang masih relatif basah yang diperdagangkan atau disimpan di beberapa daerah penghasil.

Summary

Co.tfee is produced in the tropical areas in an open system, so that gristle to toxigenic moulds infestation, including by ochratoxin A (OTA) producers. aTA contamination in coffee have been becoming an important issue recently

1) Ajun Peneliti dan Ahli Pcncliti (AdjunCl Researcher and Senior Researcher); Pusal Pcnelitian Kopi dan Kakao Indonesia, JI. P.B. Sudirman 90, Jember 68118, Indonesia.

2) Mahasiswa (Post Graduate Student) Faku)tas Teknologi Pertallian, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia.

Naskah diterima 10 Februari 2003 (Manuscript received 10 February 2003).

78

Kemampuan produksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamur yang diisolasi dari biji kopi

since some consuming countries applying ma"timum limits and the publication (~l the presence of OTA in some coflee products. OTA produced by some species (~l Aspergillus and Penicillium verrUCOSllm (in the sub-tropical area). In order to know the ability to produce OTA, a number q{ moulds belong to Aspergillus Section Circumdati (including A. ochraceus), Nigri, and Flavi each 36, 85, and 60 isolates were taken from cofIee beans drawn from Lampung. East Java, and Bali, were tested. OTA producing capability test was conducted by growing the mould in the liquid YES medium. Metabolites presence in culture were analysed using a 1LC method and OTA standard was used as the reference. The existence q{ OTA in extracts which was still doubtful by TLC were c011/irmed further by the immuno-ajjinity-HPLC analysis. Abollt 44.4% isolat of Section Circumdati, 2.4% of Section Nigri, and 5% of Section Flavi were proved to produce OTA. The OTA producing isolates were spread all over coffee producing areas lvhere the sample dra'vvn. Apparently. the main source of OTA contamination in Indonesian cojjee is from Section Circumdati (A. ochraceus), while the other two sections are minor contributors. Although the chance of OTA contamination by those mould species is low, bilt its potential contamination has to be considered, especially for wet cojjees which traded or stored in some producing areas.

Key words: Aspergillus, Section Nigri, Flavi, Circumdati, Ochratoxin A.

PENDAHULUAN A. carbonarius. OTA rnerupakan senyawa toksin yang bersifat nephrotoxic, yaituKopi Inerupakan bahan minulnan yang dapat menyebabkan kerusakan ginjal.terkai t dengan aspek kenikmatan dan Beberapa pengaruh buruk lain darikepuasan bagi konsun1en. Sebagai bahan senyawa terscbut seperti sifatnlinuman Inaka aspek keamanan terhadap karsinogenik, teratogenik, sedangkankesehatan juga sangat penting. Kopi pengaruh mutagenik belurn diketahui111engandung senyawa-senyawa yang secara pasti. Karena adanya pengaruhberpengaruh positif terhadap kesehatan di buruk tersebut, beberapa negara konsumen samping pengaruh fisiologis maupun (terutatna di Eropa) telah menerapkanpsikologis. Namun demikian juga dapat pembatasan kadar OTA maksilnum pada rnengandung senyawa-senyawa yang biji kopi dan produk hilirnya denganberakibat buruk terhadap kesehatan, rentang 4-20 ppb.terutalna senya\va kontalninan yang

berasal dari luar kopi. Salah satu senyawa Kontalninasi OTA pada biji kopi yang dapat mengontmninasi kopi adalah tcrjadi sejak awal produksi, seperti yang Ochratoxin A (OTA) yang dihasilkan oleh dilaporkan oleh Bucheli et ai. (1998) beberapa Dlacam jamur dari golongan bahwa OTA telah di tetllukan pada kopi Aspergillus dan Penicilliun1. Jenis jamur yang baru selesai dijemur. Pertumbuhan yang sangat potensial menghasilkan OTA jamur terutama golongan Aspergillus dan di daerah tropik adalah A. ochraceus dan Penicillium juga dibuktikan telah terjadi

79

Ismayadi, Silviana, Nisa, Zuhaidah dan Zaenudin

sejak awal proses pengolahan terutama saat pcnjcrnuran, yaitu pada saat kOlldisi biji luasih rclatif basah. J arnur yang tumbuh dapat tetap bertahan hidup pada waktu biji disin1pan (lsmayadi et al., 2000). I-Iasil pcngalnatan terhadap contoh­contoh kopi yang diambil dari petani, pcdagang dan cksportir di beberapa daerah di Indonesia ditcluukan beberapa spesies janlur yang sering mcngontalninasi biji kopi yaitu kclompok A. niger (prcdo­nlinan), kelonlpok A. flavus, dan Penicillium sp.; sedangkan spesies penghasil OTA yang ditenlukan adalah A. ochraceus dengan frekuensi dan tingkat scrangan cukup kccil (hanya 1 %)

(Ismayadi & Zaenudin, 2001). Hasil pengamatan nlikroflora dan insiden kontmninasi kopi Arabika asal Brazil oleh Martins et al. (2003) rnenunjukkan bahwa hampir semua contoh (91,7 %) telah terkontaminasi oleh berbagai spesies jalllur, terutama A. niger (83,3%), A. ochraceus (53,3%), A. flavus (25,0%),

Cladosporium (16,6%), dan Penicillium (10,0%). Scbanyak 33,3 % dari 60 cOlltoh tcrbukti mcngandung OTA dengan kadar 0,2-7,3 ppb (rata-rata 2,38 ppb). Hasil tersebut menunjukkan bah\va biji kopi tidak terbebas dari jamur karena bersifat terbuka dan jamur tertentu dapat lnenghasilkall toksin apabila kondisinya 111endukung (terutama kadar air biji dan kelembaban lingkungan).

Selain dihasilkan oleh A. ochraceus dan P. verrucosurn, aTA juga dilaporkan dapat dihasilkan oIch galur (strain) tertentu dari A. niger (Abarca et al., 1994; ana et al., 1995; Accensi et al., 2001;

Schuster et al., 2002). :Mengingat jenis

80.

jalnur yang paling dOluinan 11lenyerang b~ji kopi Indonesia adaIah goIongan A. niger dan juga A. flavus maka perIli ditelaah lebih lanjut tentang kemampuan dari spesies tersebut dalall1 nlenghasilkan OT A. Pada penelitian ini ditelaah mengenai keillampuan Inenghasilkan OTA secara ill vitro dari spesies-spcsies jalnur Aspergillus yang diisoIasi dari biji kopi yang bcrasaI dari bcberapa daerah penghasil, yaitu dari kelonlpok Nigri, kelonlpok Flavi, dan kelonlpok Circurndati yang diketahui Inengontatl1inasi biji kopi Indonesia.

BAHAN DAN METODE

Bahan-bahan kinlia dan ll1edia untuk penelitian ini adalah dari jenis pro-analisis, dan Ienlbaran Krolnatografi I....apis Tipis (KLT) yang digunakan adalah silica gel 60 ukuran 20x20 cm (Merck 1.05553). Larutan baku aTA disiapkan dari senyawa 111ur11i yang didapat dari Signla (0-1877). Spesies jalTIUr yang diuji diisolasi dari biji kopi yang diambil dari petani dan pedagang dan eksportir di Lampung, Jawa Timur, serta Bali. Beberapa contoh kapi yang dialnbil dari eksportir di Ja\va Tinlur ada yang berasal dari luar daerah nlisalnya dari Jawa Tengah dan Timor-Lesle. Biji kopi yang akan diisolasi spesies jalllurnya distcriIkan permukaannya dcngan Na bisulfit 2 % sclama 10 mcnit scbelum ditempatkan pada media DG-18 dan diinkubasi pada suhu ruang selalna 5­7 hari (Samson et al., 1997). Spesies janlur yang tUlnbuh diisolasi secara acak

dan dipindahkan pada media Czapek Dox agar. Ada tiga kelompok jalnur yang diuji

Kemampuan produksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamur yang diisolasi dari biji kopi

yaitu golongan Aspergillus hitam scbanyak 85 isolat, golongan A. flavus sebanyak 60 isolat, dan A. ochraceus sebanyak 36 isolat. Sebagai kontrol positif digunakan galur A. carbonarius M323, M324, dan M336 (didapat dari Nestle Research Center , Lausanne) yang telah

tcrbukti rnenghasilkan OTA (Joosten et al., 2001). Pada waktu pengujian, spora masing-masing isolat diambil satu mata Ose dan diturnbuhkan pada agar ruiring Czapek Dox dan diinkubasi pada suhu ruang selalna 5-7 hari. Spora yang tumbuh diambil dengan 11lembuat suspensi dalam 2 Inl larutan steril 0,1% pepton­

0,01 % Tween 80. Scbanyak 100 III suspensi spora dipindahkan dalanl 5 nll

Inedia cair Yeast-Extract-Sucrose (YES) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari (Abarca et al., 1994). Tabullg kultur ditempatkan dengan posisi miring dan dikocok sekali setiap hari.

Senyawa metabolit yang dihasilkan oleh jaluur di dalam media YES diekstrak dengall 2 lui klorofom (60°C) dan dikocok dengan vortex selarna 5 menit. Fase

klorofom diambil dcngan sentrifugasi (J 0.000 rpnl, 2 mcni t), kemudi an dikcringkan dengan aliran gas nitrogen. Residu nletabolit kcmudian dilarutkan

dalam 100 III campuran Asetonitrill Toluen/Asarn asetat (50:49: 1) selanjutnya diallalisis dengan KLT pada len1baran silica gel 60 menurut prosedur Pittet &

Royer (2002) tanpa Inelalui fase pengeln­bangan pertama. Masing-masing ekstrak dititikkall sebanyak 60 III pada posisi 1 em dari tepi bawah lembaran KLT dengan

jarak antartitik 1,3 crn. Pada bagian paling luar dari deret titik-titik ekstrak (paling

kiri dan kanan) dititikkan larutan baku OT A sebanyak 20 ng. Selanjutnya lembaran KLT dikembangkan dengan campuran Toluen/etil asetat/asam format (5:4: 1) dalam wadah KLT jenuh sampai rnencapai ketinggian 18 Cln. Senyawa Inetabolit yang dihasilkan isolat jan1ur ditalupakkan dengan sinar UV gelombang panjang (366 nm) dan ditentukan nilai Rf dan warnanya scsuai dengan standar OTA yang diikutkan pada setiap lembar KLT.

U ntuk memastikan adanya senyawa OTA dalam metabolit beberapa hasil analisis dcngan KLT dari isolat yang masih

Ineragukan dianalisis lebih lanjut nlenggunakan HPLC dan pemurnian dengan kolom imunoafinitas khusus untuk OT A (Pittet et al., 1996). Ekstrak sisa analisis KLT (+ 40 fil) dikeringkan dengan gas nitrogen, kemudian dilarutkan dalam 1,5 mZ larutan ekstraksi (methanol + 3 % N aHC0 3 = 50 % + 50 %) dCllgan utrasonik bath selama 10 rnenit. Setelah diencerkan dellgan 100 n1l bufer fosfat salin (PBS) pH 7,6 atau 7,4 (Sigma, P­8033 atau P-4417) ekstrak kemudian dialirkan dalam kolom imunoafinitas OchraTest (Vicam) dengan laju aliran 2

mllmenit. Setclah dicuci dengan 10 ml air, OTA dalam kolom diel usi dengan 4 InZ methanol. Ekstrak methanol dikerillgkan dengan aliran gas nitrogen, kemudian residu dilarutkan dalan1 175 fil

larutan fase gerak HPLC yang merupakan

campuran 45 % atau 50 % asetonitril dan 55 % atau 50 % 4 mM natriwn asetat-asam asctat glasial (19: 1). Selanjutnya ckstrak dianalisis dengan Shimadzu LC 10ADvp HPLC sisteln dengan kondisi: Fase gerak dengan aliran 1 mllmenit; kolom Shin1­

81

Jsmayadi, Silviana, Nisa, Zuhaidah dan Zaenudin

pack CLC-ODS(M) (4.6 x 250 111m, ukuran partikel 5 jJ.m) yang dilengkapi dcngan kolom pclindung Shim-pack G-ODS (4) (4 x 10 mm); detektor Fllloresens pada Eksitasi 340 lun dan Emisi 470 nm; dan volume injeksi 25 jJ.1. Standar OTA masing-masing dengan konsentrasi 0,005; o 01' dan 0 02 ng/ IJ 1 digunakan seba(Yai" 'r 'b

acuan.

HASIL DAN PEMBA.HASAN

Isolat Jamur

Jenis-jenis jan1ur yang diisolasi

berasal dari biji kopi yang diambil dari berbagai daerah penghasil kapi lltanla yaitu dari Lampung, Ja\va Timur, dan Bali.

Bebcrapa contah biji kopi yang dimnbil dari salah satu eksportir di Jawa Tilllur ada yang berasal dari Jawa Tengah dan Timor-Leste. Beberapa cOlltoh kopi yang dialnbil dari eksportir kopi di Lampung juga ada yang berasal dari daerah sekitarnya (Bengkulu dan SUTnatera Selatan). Jumlah dari golongan jamur yang diisolasi dan diuji kenlanlpuannya dalaln Inenghasilkan OTA disajikan dalam Tabel 1. Dengan beragamnya asal kopi maka isolat-isolat jamur tersebut diduga menlpunyai keragaman yang cukup tinggi.

Jenis jamur yang diisolasi terdapat di dalaln biji kopi yang telah disterilkan permukaarmya. Dengan demikian isolat

TabeJ 1. Asal dan jumlah jenis jamur yang diisolasi dan diuji kemampnannya dalam menghasilkan OTA

Table 1. Origin and number (~t isolated mould species for its OTA producibility {Cst

Asal

Jumlah Isolat Aspergillus: Number of isolaced Aspergilus

Aspergilus carbonarius Keterangan

Origin sehagai kontrol Nores Section Circumdali Section Nigri Section Flavi Control

Lampung 6 19 12

Jawa Timur (East .Java) 17 32 23

Jawa Tengah Central .Java

+ Timor-Lcste + Timor-Leste

1 6 4 Diambil dari eksportir di Jawa Timur (Samples taken from an exporter in Easc Java)

Bali 12 28 21

Kontrol posirif galur: Positive control, strains

Didapat dari (Kindly provided by) Nesrle Research Center, Lausanne

M 323 1

M 324 1

M 326

Jum lah (Total) 36 85 (i) 3

82

Kemampuan prodllksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamur yang diisotasi dari biji kopi

jamur tcrsebut benar-benal' dari asal kopi diproduksi atau disimpan. Jumlah isolat jalnur yang diisolasi dan diuji kelnampuannya dalam menghasilkan OTA sesuai dengan frekuensinya dalam biji kopi dan peluangnya dalam menghasilkan OTA. Golongan Aspergillus hitalll (kelompok Nigri) yang paling banyak diisolasi (33­93 %) disusul dengan Section Flavi (0,4­8 %). Tingkat serangan yang lebih tinggi ditemukan pada beberapa kopi Arabika yang diambil dari Sulawesi Selatan (Ismayadi & Zaenudin, 2002). Semua spesies Aspergillus dengan spora berwarna hitam dikelolnpokkan dalam kelompok Nigri. Di dalamnya termasuk golongan A. niger dan juga mungkin terdapat A. carbonarius yang secara visual sulil dibedakan dcngan kelompok A. niger. Aspergillus kelolnpok Circumdati (A. ochraceus) ditemukan dengan frekuensi sangat rendah pada kopi-kopi asal daerah­daerah tersebut (sekitar 1 %). Spesies terscbut dikctahui Inerupakan penghasi} OTA utalna selain A. carbonarius dan P. verrucoswn (yang tcrakhir umumnya hanya ditclnukan pada dacrah sub-tropis).

Jenis yang paling dominan Inenyerang biji kopi adalah golongan Aspergillus hitam, termasuk di dalalnnya A. niger. Secal'a unlum golongan A. niger dikategorikan sebagai GRAS (generally recoqnized as save) oleh Badan Pangan dan Obat Amel'ika Serikat (US-FDA). Nanlun dClnikian golongan A. niger tetap hal'us diperhatikan mengingat adanya publikasi yang Incnyebutkan bahwa beberapa galur dari A. niger malnpu lllenghasilkan OTA (Abarca et al., 1994; Ono et al., 1995). Lebih lanjut dilaporkan

bahwa 6 dari 92 isolat agregat A. niger mampu menghasilkan OTA secara in vitro dalaln llledium YES (Accensi et al., 2001); sedangkan menurut Schuster et al., (2002) sebanyak 3-10% dari galur A. niger yang diuji mampu menghasilkan OTA pada kondisi yang mendukung. Dengan adanya informasi denlikian maka golongan Aspergillus hitam yang banyak 111engontalninasi kopi ini menjadi salah satu target dari analisis guna memastikan tingkat bahayanya yaitu potensinya dalarll menghasilkan OTA. Dalalll kelompok ini juga kemungkinan terdapat A. carbonarius yang juga melnpunyai spora berwarna hitmn.

Golongan A. flavus juga ditenlukan pada beberapa contoh dengan tingkat serangan lebih rendah dibanding dengan golongan Aspergillus hitaIn (Ismayadi & Zaenudin, 2001; 2002). Sccara umum dikctahui bahwa golongan A. flavus merupakan penghasil aflatoksin. Pada penelitian ini tidak disertakan senyawa baku atlatoksin, sehingga tidak diketahui potensi masing-illasing isolat A. flavus dalam mcnghasilkan toksin terscbut.

Analisis OTA dari Metabolit Isolat Dengan KLT

Spesies jamur yang ditumbuhkan dalam media YES dapat nlenghasilkan beberapa Inacaln senyawa metabolit yang dapat dideteksi dari lembaran KLT. Beberapa 111aCanl luetabolit dihasilkan oleh hanlpir SClnua isolat spcsics dari golongan yang sarna sebagai cOlnmon substances, di salnping senyawa-scnyawa yang unik untuk masing-masing isolat.

83

Ismayadi, Silviana, Nisa, Zubaidah dan Zaenudin

Sesuai dengan standar OTA yang discrtakan pada lcmbaran KLT, senyawa OTA mempunyai nilai Rf + 0,68 dengan warna biru-kehijauan bila ditampakkan dengan sinar UV gelombang pendek (366 nm) (Gambar 1). Dengan demikian senyawa nletabolit yang berada pada posisi dan warna yang salna dengan OTA dapat dikatcgorikan sebagai OTA. Beberapa

(a)

(b)

Gambar 1. KLT dari ekstrak metabolit beberapa isolat jamur Aspergillus. (a) Lajur 1 sampai 10 isoJat keJompok Circumdati. (b) Lajur 1-6 A. carbonarius (1-2: M323, 3-4: M324. 5-6: M336), dan 7 sampai 10 kelompok Nigri. (c) dan (d) Ekstrak kultur dari Kelompok Nigri yang menghasilkan OTA. OTA adalah standar dengan kadar 20 ng/spot. Anak panah menunjukkan OTA \

Figure 1. TLC of some Aspergillus ~etabolites.

(a) Lane 1 to 10 eXfract.~ of Section Circumdafi. (b) Lane 1 to 6 extracts of A. carbonarius (1-2: M323, 3-4: M324, 5-6: M336) , and lane 7 to 10 of Section Nigri. (c) and (d) are culture extracts of OTA producing isolates from Section Nigri. OTA is the srandard with amount of 20 ng/spot. Arrow head indicates OTA.

Inetabolit memiliki nilai Rf yang mlnp dcngan OTA tetapi dcngan warna yang berbeda tidak dikatcgorikan scbagai OTA. Namun demikian untuk ekstrak metabolit yang Inasih nleragukan karena nilai Rf

dan warnanya kurang jelas sebagai OTA dianalisis lebih lanjut dengan HPLC. Analisis dengan KLT tersebut Inenurut Pittet & Royer (2002) Inampu mendcteksi sarnpai dengan 10 ppb setara biji kopi. Pada percobaan ini kadar OTA yang dititikkan sebagai acuan sebanyak 20 ng dan terlihat cukup jelas pada lebar KLT (Gambar 1). Kebanyakan ekstrak ternyata hanya mengandung pita-pita yang lebih

tipis dari OTA standar, hanya bcberapa di antaranya yang tcrlihat cukup jelas.

Ketiga spesies konlrol A. carbonarius dapat terdeteksi mcnghasilkan OTA dcngan intensitas yang berbeda-beda seperti terlihat

pada lembar KLT (Gambar 1b). Guna

Inemastikan kebcradaan OTA pada ekstrak

sebagian dari ekstrak tcrsebut dianalisis dengan HPLC dan terbukti mengandung OTA dengan kadar cukup tinggi Tabel 2.

Frekuensi isolat yang rnarnpu meng­

hasilkan OTA menurut uji dengan KLT didolninasi oleh kelolnpok CirCUlndati yang

di dalamnya ada A. ochraceus yang lnencapai 44,4% (Tabel 1). Kelompok

Nigri hanya sedikit yang terdeteksi Inenghasilkan OTA dcngan analisis KLT yaitu sebanyak 2 dari 85 isolat diduga

menghasilkan OTA, seluelltara kelolllpok

Flavi 5 dari 60 isolat diduga mampu mcnghasilkan OTA. Analisis dcngan KLT

tidak dapat mcnlastikan kenlampuan isolat­isolat di atas dalanl lllenghasilkan OTA

terutama untuk ekstrak dengan pita yang

84

Kemampuan produksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamur yang diisolasi dari biji kopi

ada pada posisi (Rf) 01'A terlihat samar. Naluun demikian beberapa di antaranya cukup jelas sehingga dapat dipastikan sebagai penghasil 01'A (Gambar Ic dan d). Untuk memastikan kemampuan isolat yang diduga menghasilkan 01'A tetapi belum jelas maka dilakukan analisis lebih la~iut dengan HPLC. Analisis HPLC terbukti sangat teliti (batas deteksi setara dengan 10 pg 01'A/ml ekstrak kultur) sehingga dapat 11lcmastikan adanya 01'A dalam ckstrak. Setelah konfirmasi dengan HPLC tcrhadap isolat-isolat yang masih meragukan dapat dipastikan scbanyak 3 dari 5 isolat kclompok Circumdati, 1 dari 2 isolat kclompok Nigri, dan 3 dari 5 isolat kolompok Flavi dapat menghasilkan 01'A dengan kadar yang bervariasi (Tabel 2).

Frekllensi isolat kelompok Nigri yang Inampu menghasilkan aTA tcrnyata sangat kecil, yaitu satu isolat dari Jawa Tengah (kode: "NG-BN") dan Bali (kode "NG-BI (3) ") dari 85 isolat yang diuji (l, 2 %). IsoJat lain dari Jawa Timur (kodc "NG­Bdws-2") yang dcngan analisis KLl' tcrlihat ada pita yang mirip dengan pita 01'A, tetapi dengan \varna yang agak berbeda dengan aTA, setelah dikonfirnlasi dengan HPLC ternyata tidak mengandung OTA pada ekstrak 111etabolitnya. Hal tersebut menunjukkan bahwa jenis jamur kelompok tcrsebut tidak begitu nlengkhawatirkan scbagai penghasil 01' A pada kopi, walaupun nlasih ada di antaranya yang dapat mengontaminasi biji dengan aTA. Mengingat akan kenlampuannya yang cukup tinggi dalam menghasilkan 01'A, isolat NG-3(3) diduga dari spesies A.

carbonarius, seperti pada spesies kontrol. Nanlun dcmi~ian untuk memperjelas jenis

isolat tersebut maka perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut apakah dari spesies A. carbonarius atau A. niger yang juga diketahui beberapa galurnya dapat nlenghasilkan 01'A.

Studi oleh Batista et al. (2003) di Brazil yang menguji sebanyak 108 isolat jalnur Aspergillus yang diisolasi dari biji kopi Arabika ternlasuk dalam kelonlpok Circullldati (ada 10 spesies), Flavi (3 spesies), Nigri (3 spesies), VersicoJores (4 spesies) serra 2 spesies teleomorfik. Di antara kelonlpok Circunldati (termasuk A. ochraceus) sebanyak 75 % isolat 111aIllpU menghasilkan 01' A. Sell1Ua spes ies kclompok Circumdati kecuali A. elegans dan A. insulicola telah dikenal sebagai penghasil aTA. Tidak ada isolat dari kelompok Nigri dan Penicillium yang 111ampU luenghasilkan 01' A. Dengan deluikian sUlnber kontaminan 01'A utama pada kopi di Brazil adalah kelompok Circuludati.

Magnoli et al. (2003) melaporkan sebanyak 41,3 % dari 63 galur Aspergil­lus keJolnpok Nigri yang diiso lasi dari berbagai varietas anggur wine di Argen­tina terbukti Inalnpu meluproduksi OTA. Sell1entara Serra et al. (2003) nlelaporkan sebanyak 14% aspergilli yang diisolasi dari buah anggur di Portugis terbukti manlpu Inenghasilkan 01'A. Haillpir semua A. carbonarius (97 %) dan sedikit A. niger agregat (4 %) adaJ ah penghasil aT A. Diduga kedua spesies tersebut merupakan penghasil 01'A pada anggur.

A. flavus (dari kclompok Flavi) mcrupakan spcsies yang umumnya menghasilkan aflatoksin. Pada pcnclitian

85

Ismayadi, Silviana, Nisa, Zubaidah dan Zaenudin

Tabel2. Frekuensi isolat jamur yang mempunyai kemampuan menghasilkan OTA meourut uji dengan KLT, termasuk yang masih meragukan

Table 2. Frequency of mould group putatively produce OTA based on KLT analysis

Frekuensi isolat yang mampu menghasilkan OTA

Asal Frequency of isolated mould species capable to produce OTA

Origin Section Circumdati Section Nigri Section Flavi

Lampung 2/6 0/19 (1)*112

Jawa Timur (East Java) 2+(4)*/17 (1)*/32 (4)*/23

Jawa Tengah + Timor Leste Central Java + Timor Leste

1/1 1/6 0/4

Bali 9/12 (1)*/28 0/21

Kontrol positif galur: Positive control, strains

M323

M324

M336

Frekuensi penghasj) OTA berdasar KLT Frequency of OTA producer based on TLC

(18)/36 (2)/85 (5)/60

Frekuensi penghasil OTA setelah konfirmasi dengan HPLC Frequency of OTA producer after HPLC confirmation

16/36 = 44.4% 2/85 = 2.4% 3/60 = 5%

Aspergilus carbonarius

Kontrol Control

1/1

1/1

1/1

3/3

3/3 = 100%

Keterangan (Notes) : * = Pita pada posisi OTA tampak tetapi meragukan, dikonfinnasi lebih Janjut dengan anal isis HPLC, lillat Tabel 3. (Band correspond to OTA position was present but uncertain, need to be confirmed furr!1er by HPLC analysis, see TabLe 3).

Angka dalam kurung sementara scbclum konfirmasi dcngan HPLC (Nu.mbers in bracket prior to HPLC anaLysis).

ini kelompok spesies ini tidak diketahui kemalupuannya dalam menghasilkan toksin

tcrsebut karena tidak disertakan standarnya dalalll lembar KLT, mclainkan hanya OTA. Dari anal isis KLT terlihat ada 5

isolat dari keloillpok Flavi yang diduga

D1engandung OT A pada ekstrak metabolitnya (dengan pita sangat tipis).

Dari konfirmasi dengan HPLC ternyata ada 3 di antaranya terdeteksi nlengandung OTA, yaitu 2 isolat dari Jawa Timur dan

1 isolat dari Lampung (Tabcl 3). Ketiga isolat tersebut perlu dikonfinnasi jenis spesiesnya lebih lanjut. Penul is belum pernah D1endapatkan publikasi yang menyebutkan adanya spesies kelolupok Flavi yang malnpu menghasilkan OTA. Dengan adanya spesies kelompok Flavi yang maillpu menghasilkan OT A (di samping juga mampu menghasilkan aflatoksin) maka perlu diwaspadai mengingat kelompok tersebut sering ditemukan pada biji kopi.

86

Kemalllpuan produksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamur yang diisolasi dari biji kopi

Tabel 3. Hasil konfirmasi OTA pada metabolit beberapa isolat dengan HPLC

Table 3. Confirmation of OTA in metabolite of some isolates by HPLC

Kesetaraan kadar

No Isolat, asal Isolate. origin

OTA dalam \cultm Equi valent OTA

ammount in culture (ng OTA/m!)

Dilihat dari sebarannya, isolat yang dapat menghasilkan OTA kelolnpok Cil'culndati tel'dapat pada kopi yang dialnbil dari semua daerah contoh. Isolat kelompok Nigri dan Flavi penghasil OTA ditemukan tidak di semua daerah asal, hal itu kal'ena frekuensinya yang rendah.

Sel'angan jamul' kelompok Cil'cumdati pada kopi Robusta yang diambil dari ketiga daerah di atas secara umUlll sangat rendah yaitu (+1%), scdangkan untuk kopi Arabika dal'i Sulawesi Selatan tingkat sel'angannya cukup tinggi (Ismayadi & Zaenudin, 2002). Dengan fl'ekucnsi penghasil OTA yang kurang dal'i setengah populasi isolat maka jamul' penghasil OTA tersebut kul'ang berbahaya. Namun demikian tetap harns dipel'hatikan terutama pada kopi yang masih agak basah, karena kondisi denlikian akan memacu pcrtumbuhan dan pl'oduksi OTA. Pada kopi Al'abika yang diambil dal'i daerah Sulawesi Selatan (dan Sumatera Utara) yang umumnya diperdagangkan pada kondisi masih basah sangat rawan terhadap pertumbuhan jamur dan kontaminasi OTA, sehingga perlu lebih dhvaspadai.

KESIMPULAN

1. Isolat jamul' Aspergillus kelolnpok Circumdati, Nigri, dan Flavi dapat mernproduksi aTA pada kultur in vitro.

2. Aspergillus kclolnpok Circulndati mcrupakan penghasil OTA utalna (44,4%), sedangkan kelompok Nigri dan Flavi hanya sedikit yang n1enghasilkan OTA yaitu dengan frekuensi masing­masing 2,4% dan 5 %.

A. carbonarius M323

2 A. carbonarius M336

Circumdati :

3 OC-PKH-2, latim (E. Java)

4 OC-2B(4), latim (E. Java)

5 OC-6B, latim (E. Java)

6 OC-2B(l), latim (E. Java)

7 OC-GH(2), latim (E. Java)

Nigri

8 NG-Bdws-2

9 NG-3(3)

Flavi

10 FL-AIBt(lO), Lalllpung

11 FL-GH(l), latim (E. Java)

12 FL-7(l), latim (E. Java)

13 FL-PKM(3), latim (E. Java)

14 FL-2(l), latim (E. Java)

1.05

4.39

0.46

O.Ot

HDL

0.01

BDL

BDL

2.90

0.06

0.06

0.04

BDL

HOI...

Catatan (Note) : BDL = Di bawah aras deteksi (Belmv detection limit) 0.01 ng/ml.

Spcsics utama penghasil OTA yang sering ditclnukan pada biji kopi yang diuji adalah kelolnpok CirCU111dati (A.

ochraceus). Dari analisis KLT dan HPLC sebanyak 44,4% isolat yang diuji dari kelompok tersebut J11aInpU rnanghasilkan OTA. Nilai tersebut agak lebih rendah dibanding dengan yang dilaporkan oleh Batista et al. (2003) yaitu sebanyak 75 % dari kelompok yang diuji di Brazil terbukti mampu menghasilkan OTA.

87

Ismayadi, Silviana, Nisa, Zubaidah dan Zaenudin

3. Isolat penghasil OTA (khususnya kelompok Circumdati) tersebar pada ketiga daerah penghasil kopi yang diamati.

4. Analisis OTA dengan KLT cukup teliti untuk lnengetahui keberadaan OTA dalam ekstrak, namun demikian untuk rhenlastikan perlu dianalisis dengan HPLC.

UCAPAN TERIMA KASIH

Sebagian dari dana penelitian lnl didapat dari Proyek FAOICFC dengan kode GCP/INT/173/CFC, untuk itu penulis rnenyampaikan terima kasih. Secara khusus ucapan terima kasih disalnpaikan kepada Ir. Budi Sumartono dan Ninik Kuslniarsih yang membantu analisis janlur dan OTA.

DAFTAR PUSTAKA

Abarca M.L.; M.R. Bragulat; G. Castella, & F.J. Cabanes (1994). Ochratoxin A production by strains of Aspergil­lus niger val'. niger. Applied and En­vironmental Microbilogy, 60, 2650­2652.

Accensi F.; M.L. Abarca; J. Cano; L. Figuera & F.J. Cabanes (2001). Dis­tribution of Ochratoxin A producing strains in the A. niger aggregate. Antonie Van Leeuwenhoek, 79, 365­370.

Batista L.R.; S.M. Chalfoun; G. Prado; R.F. Schwan & A.E. Wheals (2003). Toxigenic fungi associated with processed (green) coffee beans (Coffea arabica L.). International Journal of Food Microbiology, 85, 293-300.

Ismayadi, C. & Zacnudin (2001). Toxigenic mould infestation in coffee beans taken from differen t level s of production and trading in Lampung­Indonesia. 19th ASIC Conference, Trieste 14-18 May, 2001, 7p.

Ismayadi, C. & ZaeJ?udin (2002). Pola produksi, infestasi jamur, dan upaya pencegahah kontanlinasi Ochratoxin­A pada kopi Indonesia. Makalah Disampaikan dalam Simposium Kopi 2002, Denpasar 16..17 Oktoher 2002, 15p.

Joosten H.M.L.J.; J. Goetz; A. Pittet, M. Schellenberg & P. BucheIi (2001). Production of Ochratoxin A by Aspergillus carbonarius on coffee cherries. International Journal of Food Microbiology, 65, 39-44.

Magnoli C.; M. Violante; M. Combina; G. Palacio & A. Dalcero (2003). Myconora and ochratoxin-producing strains of Aspergillus section Nigri in wine grapes in Argentina. Leuer of Applied Microbiology, 37, 179­184.

Martins M. L.; H. M. Martins & A. Gimeno (2003). Incidence of microflora and Ochratoxin A in green coffee (Coffea arabica). Food Additives and Con­taminants, 20, 1127-1131.

Ono H.; A. Kataoka; K.M.K. Tanaka; S. Kawasugi; M. Wakazawa; Y. Vena, & M. Manabe (1995). Ochratoxin A producibility by strains of Aspergillus niger group stored IFO culture collections. Mycotoxins, 41, 47-51.

Pittet A. & D. Royer (2002). Rapid, low cost thin-layer chromatographic screening method for the detection of Ochratoxin A in green coffee at a control level of 10 g/kg. 1. Agricultural and Food Chemistry, 50, 243-247.

88

Kemampuan produksi ochratoxin A secara in vitro spesies jamllr yang diisolasi dari biji kopi

Schus ter E.; N. Dunn-Coleman; 1. C. Frisvad, & P. W. Van Dijck (2002). On the safety of Aspergillus niger­a review. Applied Microbiology and Biotechnology, 59, 426-435.

Serra R.; L. Abrunhosa; Z. Kozakiewicz & A. Venancio (2003). Black As­pergillus species as Ochratoxin A producers in Portuguese wine grapes. International Journal of Food Microbiology, 88, 63-68.

***********

89