la medicina genómica en la práctica clínica dra. med laura martínez de villarreal departamento...
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La Medicina Genómica en la Práctica Clínica
Dra. med Laura Martínez de VillarrealDepartamento de Genética
Facultad de Medicina y Hospital Universitario UANL
Índice
Bases moleculares
Medicina Genética Vs Medicina Genómica
Variantes genómicas
El Genoma Humano
Pruebas de laboratorio
Contribución del Genoma Humano en Medicina
Aplicaciones
Fortalezas y limitaciones de la medicina genómica
DNA: Soporte de la DNA: Soporte de la información genéticainformación genética
Dogma central
ReplicaciónReplicación
TranscripciónTranscripción
TraducciónTraducción
La Antigua Genética
Enfermedades
Cromosómicas: Ganancia o pérdida de un cromosoma o una parte Ej., Sd. Down, Sd. Turner, Sd. Cri-du-chat
Monogénicas: Mutación de un solo gen Ej., Fibrosis quística, Sd. Marfán, Fenilcetonuria, Charcot Marie Tooth.
Cariotipo bandas GTG
La Antigua Genética
Estas condiciones:Son de gran importancia para los
individuos y sus familias.Aún agrupadas son raras.La mayor parte de la población no
está afectada.La Genética jugaba un pobre papel
en los servicios de salud y la sociedad.
La Antigua Genética
Estas condiciones “raras”: La atención del paciente genético
involucra un reducido grupo de especialistas (médicos genetistas, consejeros genéticos) con involucro ocasional de otros médicos generales o especialistas.
La Antigua Genética
Investigación:
Hasta hace 20 años la genética no había resuelto preguntas básicas, pero fue de gran apoyo para el desarrollo de herramientas en el laboratorio.
Revolución tecnológica
Obtención de ADN y secuenciación
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Método de secuenciación de Sanger (SAGE).
Clonación en vectores (BAC´s, YAC´s)
GRANDES CANTIDADES DE ADN
Herramientas moleculares
A G C T A G C T
CÁNCER NORMAL
ELECTROFORÉSIS EN GEL
SECUENCIACIÓN
Variantes genéticasLas variantes tienen dos componentes:
“alelos” (genes paterno y materno).
Cuando la frecuencia de estos es >1% se consideran polimorfismos.
El término mutación se utiliza cuando hay cambios en ADN que se consideran patológicos (Ej: FQ) o cambios en el DNA recientes (no germinales)
N Engl J Med 2010;362:2001-11.
Variación genómica
Los eventos que contribuyen a la variación genómica son:Mutaciones puntuales Inserciones/delecionesRe-arreglos estructurales.
N Engl J Med 2010;362:2001-11.
Patogénesis de mutaciones
Las Ins/Dels y los SNPs pueden conferir riesgo o protección contra enfermedades
Re-arreglos estructurales se asocian a estados patológicos.
CNV (variable número de copias) se han ido asociando a un mayor número de enfermedades (autismo, esquizofrenia)
Variación GenómicaSNP´s
(polimorfismos de un solo nucleótido) Mutaciones presentes en
>1% población C>T más frecuentes 1.8 millones 1 cada 800 pb 60 000 SNP´s MTHFR y DTN BRCA y Ca. de mama
Polimorfismos
Se han asociado a enfermedades complejas (enfermedad coronaria, DMT2).
Las enfermedades complejas son multifactoriales: genes y medio ambiente.
Pueden resultar de variantes comunes y raras.
Epigenómica
Alteraciones en la expresión génica sin cambios en la secuencia del DNA.
Ocurren por metilación en sitios CpG.
Patrones anormales de metilación están asociados a cáncer:Hipometilación de oncogenesHipermetilación de genes supresores
Proyecto del Genoma Humano
MetasIdentificar genes que contribuyen a
enfermedades
Tipo de variantes genéticas y su contribución al fenotipo
Desarrollo de pruebas diagnósticas
Entendimiento de la fisiopatología
Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Ramas de la Biología Beneficiarias del Conocimiento del Genoma
Humano
MedicinaBioinformáticaBiotecnología
Medicina Genómica
Medicina Genómica
Medicina GenómicaInteracción entre el genoma y factores no
genómicos y su asociación son salud y enfermedad.
Proporciona nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades multifactoriales
Incorporación de pruebas genómicas o terapéuticas al cuidado diario.
Ha cambiado el entendimiento de la biología de la mayoría de las condiciones médicas.
Medicina Genómica
Enfermedades:Causadas por mutaciones en genes:
Cáncer de colon, cáncer de mama, arterioesclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, Alzheimer, DMT2, etc.
Prevenibles por mutaciones en genes:HIV (CCR5), Posiblemente: arterioesclerosis, cáncer,
diabetes, otros.
Medicina genómica
Se han identificado contribuciones genéticas para enfermedades comunes relacionadas con genes de baja frecuencia y alta penetrancia. HNPCC (cáncer de colon)BRCA1 y 2 (Ca. ovario y mama)MODY 1,2,3… (diabetes)Alfa-sinucleína (E.Parkinson)
Medicina Genómica
A nivel de población general la principal contribución ha sido la identificación de genes de alta frecuencia y baja penetrancia.ApoE (Alzheimer)Factor V Leiden (trombosis)CCR5 (resistencia a infección HIV/AIDS)
Medicina Genómica
Conocimiento de predisposición genética permitirá: Tamiz individualizadoCambios de estilos de vida
individualizadosTerapia pre-sintomática: Ej: Ca de colon,
hipertensión.
Medicina Genómica
Farmacogenómica: Terapias individualizadas basadas en
las determinantes genéticas que condicionan respuesta a medicamentos.
Uso de medicamentos que pudieran ser rechazados por sus efectos adversos.
Nuevos medicamentos para genotipos de enfermedades específicos.
Métodos de estudio
Estudios de ligamiento: Familias (haplotipos)
Estudios de Asociación: Casos y Controles
Clonación Posicional
Clonación Funcional.
Herramientas Dx.Genética:
Enfermedades Raras: Genes causalesEnfermedades comunes: Genes de
riesgo (Historia clínica)
Ambas = análisis de un solo gen o panel
ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194
Herramientas Dx. Molecular
PCR: Tiempo real, mutación dirigida, metilada, múltiplex.
Microarreglos: SNPs, RNA, ADN, BACs, Tejidos, oligos.
MLPA
SecuenciaciónMonogénicaSecuenciación de nueva generaciónWGS
Expresión Génica: Microarreglos
Estudio de patrones
de expresión génica.
La cantidad de fluorescencia equivale a la expresión del gen
Microarreglo Microarreglo FarmacogenómicaFarmacogenómica
Roche Product
CYP 450 Genotyping(drug metabolizing system)
From: Nature Biotechnology 2003 21:959-60
Secuenciación
Proteómica Investiga los patrones y niveles de
expresión génica en células enfermas las cuales pueden analizarse para construir bases de datos de los perfiles de expresión.
Diagnóstico MolecularAplicaciones
Identificación preclínica o pre-sintomática de individuos con una condición hereditaria.
Bases moleculares de una enfermedad (polimorfismos funcionales o genes modificadores).
Farmacogenómica: determinantes genéticas que influyen en la respuesta a medicamentos.
Primer of Molecular Genomics Mayo Clinic Proc.,
Aplicaciones Clínicas
Pre-SxCardiología
Sd. Hereditarios de arritmia: Brugada, QT-largo.
Cardiomiopatías: dilatada, hipertrófica, ventricular derecha arritmogénica.
Enfermedades con heterogeneidad genética.
Reto diagnóstico de LQTS: 5 genes codificantes de canales iónicos explican el 66% de los casos
Actualmente se utiliza el tamiz ECG.
Solo el 25% de los electrofisiólogos recomiendan Tx con -bloqueadores en asintomáticos basados en ECG.
Caso Caso de un masculino que fallece cuando estuvo
a punto de ahogarse. La autopsia revela mutación en KVLQTI (canal de potasio).
La hija con ECG normal. Al inicio no se indica tratamiento.
El análisis molecular revela que es portadora de la mutación del padre.
Se recomienda tratamiento que de otra manera no se hubiera indicado.
Sd. muerte súbita infantil: se asocia a mutaciones en gen de canal de sodio SCN5A
Bases molecularesECA
Polimorfismo D/I (deleción/inserción)
Actividad D > I
Genotipo DD asociado a múltiples trastornos: infarto, enfermedad coronaria, nefropatía diabética, asma.
No se recomienda aún como prueba de tamiz
FarmacogenómicaCardiología
Uso de diuréticos en hipertensión:SNP C825T de la sub unidad 3 de la proteína G,
produce una menor respuesta al Tx con hidroclorotiazida.
SNP del gen de la - aducina produce mejor respuesta a Tx con diuréticos y mayor riesgo a infarto.
Se sugiere análisis genómico antes de empezar Tx.
CardiologíaRespuesta a anticoagulante Warfarina
Influencia de genes: VKORC1, CYP2C9, GGCX y CYP4F2 genes
Se recomienda buscar mutaciones patógenas.
Clopidrogel. Influenciado por genes metabolizadores (CYP2C9)No hay recomendación de pruebaNo respuesta = cambio de medicamento.
Hemocromatosis hereditaria
Enfermedad monogénica más frecuente
Portadores Hetero: 1/20 , Homo 1/250
Penetrancia variable
Riesgo de Cirrosis (hipertensión portal ), Cáncer
Gen HFE, diagnóstico y portadores.
Bases molecularesHematología
Factor V Leiden (R506Q) : polimorfismo funcional que influye en un proceso patológico
Prueba molecular diagnóstica de rutina en estados hipercoagulables.
Factor de riesgo para trombosis venosa y embolismo pulmonar. 20% de pacientes con trombosis venosa profunda 60% de mujeres embarazadas con trombosis
Se recomienda en casos de trombosis: < 50 años Sitios inusuales Historia familiar Recurrente Mujeres embarazadas Mujeres con AO Familiares con TP < 50 a Mujeres con infarto , fumadoras < 50 años
Pre Sx.Oncología
Variación en susceptibilidad a cáncer:Exposición a aminas aromáticas (tabaco y
colorantes)
Enzima destoxificante: N-acetiltransferasa NAT2
Gen normal: acetiladores rápidos
Gen mutado: acetiladores lentos
50% de la población son acetiladores lentos y tienen mayor riesgo de cáncer por exposición a aminas
Pre Sx.Oncología
Ca colon:20% : agregación familiar de los cuales 1/3 se
asocian a HNPCC o PAF ambas AD
Pruebas predictivas para familiares: HNPCC y APCHNPCC: Inmunohistoquímica de enzimas
reparadoras: hMLH1, hMLH2, MSH6, e inestabilidad de microsatélites en tumor, y secuenciación en línea germinal.
PAF: Mutaciones germinales de proteína C y electroforesis en gel y análisis de proteína trunca
OncologíaCa mama: BRCA1 y BRCA2 riesgo de Ca de
mama de 50-85% y de ovario de 15-45%.
Debe tamizarse en mujeres con riesgo: Ca de mama hereditario.
La aplicación de pruebas genéticas-genómicas a sujetos asintomáticos depende de la sensibilidad, especificidad y confiabilidad además de costos y accesibilidad.
Indicaciones para Prueba BRCA
> 18 años
Mujer con Ca de mama / ovario < 45 años
Mujer con Ca de mama/ ovario bilateral o metástasis múltiples.
Mujer con Ca de mama/ovario a cualquier edad con un familiar de primer grado afectado Dx < 45 años.
Mujer con Ca de mama /ovario con dos familiares afectados
Bases molecularesOncología
Ca mamaHER-2/neu (receptor del factor de crecimiento
epidérmico)Sobreexpresión en tumores (mama y ovario) es
indicador de pobre pronóstico: mayor recurrencia y menor respuesta a Tx.
Farmacogenómica: Trastuzamab actúa sobre células que sobre-expresan este gen.
BRCA. Perfiles de expresión (Microarreglos) metástasis y respuesta a tratamiento (Oncotype y Mamaprint)
OncologíaLinfoma difuso de células grandes (DLBCL):
Perfil de expresión (microarreglos): Identificación dos sub tipos:Análogo a célula B germinal (mayor sobrevida y
mejor respuesta a Tx.)Análogo a célula B periférica
La constitución genómica de los pacientes con neoplasias malignas modifica la práctica clínica
FarmacogenómicaOncología
Bases moleculares y Tx específico de:Leucemia mieloide crónica
t 9-22 Cr. Filadelfia = gen quimérico bcr-abl Actividad de tirosin cinasa = Trastuzumab
Leucemia pro-mielocítica agudat 15-17 altera receptor del ácido retinóico (RAR)
impidiendo maduración y muerte de promielocitos.Tx- derivados de vitamina A .
FarmacogenómicaOncología
Tiopurin metil transferasa (TPMT): responsable del metabolismo de Azatioprina
1/300 sujetos no tienen actividad de esta enzima
10% son hipometabolizadores
Responsable de leucopenia en un grupo de paciente Tx con Mercaptopurina.
Se debe buscar el genotipo en pacientes que van a recibir Tx (enfermedad intestinal inflamatoria, leucemia)
Pre-sintomático Gastroenterología
Familiares de pacientes con: Esofagitis por reflujo, adenocarcinoma de esófago y esófago de Barret: tienen 2X > riesgo de desarrollar la enfermedad
Lo anterior sugiere un factor genético subyacente
Debe vigilarse a los familiares con estas enfermedades
Genes asociados MSR1, ASCC1 y CTHRC en el 11% de casos
Bases MolecularesGastro
Esófago de Barret: se están buscando marcadores genéticos de progresión de la enfermedad.
Progresión de hepatitis C: se asocia a sobreexpresión de genes inmunomoduladores y pro-apotóticos.
Cirrosis biliar hepática: sobreexpresión de genes de vías Wnt y Notch (c-jun, c-myc, c-fos)
Investigación: arreglos de expresión para genes de riesgo de adenocarcinoma hepático, colangiocarcinoma e hígado graso
Colangitis esclerosante y riesgo de cáncer: uso de FISH para aneuploidías en muestras obtenidas por colangiopancreatografía retrógrada (cepillo)
FarmacoGastro- Psiq
Crohn – CUCI y resistencia a corticoesteroides: No expresión del receptor de glucocorticoides Gen de resistencia a multifármacos PG17A
CYP2D6: gen de citocromo asociado al metabolismo de psicofármacos y medicamentos para re-capatación de serotonina afecta la tasa metabólica de los fármacos W/W= Metabolizadores extensos W/w = Metabolizadores intermedios w/w= Metabolizadores lentos WW/WW= Ultrarápidos
Variación étnica: alrededor del 6.7% son metabolizadores lentos (riesgo de intoxicación)
Estudios de asociación genómica (GWAS)
Han sido de utilidad proporcionando información sobre el papel de proteínas y vías biológicas en la patogénesis de las enfermedades.
Las cuales sirven como blanco terapéutico Sistema de factor de complemento en la
degeneración macular Vía autofágica en enfermedad inflamatoria
intestinal
Análisis de SNPsLos estudios de GWAS y microarreglos de SNPs
permiten analizar la asociación de polimorfismos y condiciones complejas en cohortes.
La mayoría de los SNPs asociados se encuentran en regiones no codificantes.
La mayoría de los SNPs asociados con enfermedades comunes aportan una heredabilidad de riesgo del 5-10%
Actualmente no se recomiendan como marcadores de riesgo para enfermedad en la clínica.
ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194
GWASRiesgo de GWAS
Hallazgos incidentales
Se deben entregar al médico y si es posible se debe discutir con el paciente desde antes de enviar las muestras para estudio (American College of Medical Genetics (ACMG)
ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194
Enfermedades complejasLas enfermedades complejas se deben al efecto
conjunto de susceptibilidad genética (poligénica) y factores ambientales.
La diferencia en riesgo entre portadores y no portadores es mínima
El valor predictivo basado en una sola variante genética no es informativo.
La predicción de enfermedades complejas debe implicar el análisis simultáneo de múltiples loci : Perfil genético.
Deben ser establecidos para cada población y actualmente no están aprobados para su uso generalizado.
Enfermedades complejasEstudio del valor predictivo de variantes genéticas
para el desarrollo de ciertas enfermedades: DMT2, Enfermedad coronaria, Infarto miocardio,
degeneración macular asociada a la edad.
Con excepción de la enfermedad macular asociada a edad e hipertrigliceridemia el valor predictivo de la mayoría de las enfermedades es limitado.
Enfermedad macular = cinco genes
Hipertrigliceridemia= siete variantes genéticas
Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, Review Issue 2
Enfermedades complejasLas pruebas de susceptibilidad para enfermedades
complejas deben mejorar la predicción establecida por los factores de riesgo convencionales.
En el caso de DMT2, enfermedad coronaria y cáncer de próstata, las variantes genéticas analizadas no mejoran la predicción comparada con los factores de riesgo clásicos.
Falta llevar acabo el análisis de un mayor número de Loci
TCF7L2, Calpain 10, KCNJ11 son los más frecuentemente asociados a DMT2 en la mayoría de las poblaciones
ValidaciónLos estudios de predicción debe ser realizados en
poblaciones representativas para donde se desean aplicar las pruebas.
Los estudios de casos y controles se utilizan para ver asociación.
Si se quiere evaluar riesgo y valor predictivo se deben realizar estudios de cohorte a largo plazo y tomando en cuenta factores de riesgo clásicos.
Los estudios de predicción deben ser validados.
En el caso de predicción se prefiere la búsqueda de biomarcadores.
Guía para la práctica clínica (CDC)
Tamiz Neonatal Metabólico
BRCA1/2: Historia familiar
Sd. Lynch (HNPCC): paciente < 50 años, familiares primer grado.
Hipercolesterolemia Familiar.
HLA para Abacavir.
Guía (CDC) Análisis de mutaciones de KRAS en pacientes
considerados para terapia con anti EGFR (Cáncer de pulmón de cel. No pequeñas) Inhibidores de tirosin cinasa (predicción de no reespuesta a cetuximab y panitumumab)
Her2 (Ca mama)
Hemocromatosis
RecordarEl avance del conocimiento en medicina
genómica ha permitido conocer la asociación de genes de riesgo para enfermedades comunes.
Grupos poblacionales específicos deben ser tamizados para el diagnóstico pre-sintomático.
La aplicación de la farmacogenómica puede evitar efectos adversos y mejorar la respuesta clínica a los medicamentos. Además de que ha permitido el desarrollo de terapias específicas.
RecordarLas herramientas de diagnóstico molecular
ayudan en el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades.
En enfermedades como diabetes y coronariopatías los factores de riesgo clásicos aún tienen mayor poder predictivo.
Los GWAS no deben hacerse en forma individual si no hay una responsabilidad para la interpretación y evaluación de hallazgos.
Enfermedad
Locus Gen Cr Prot. Herencia
Edadaños
PARKINSON
PARK1 SNCA 4q21 -sinucleína AD 46
PARK3 ? 2p13 ? AD 59
PARK5 UCHL 4p14 Ubiquitina carboxil hdrolasa
AD 50
PARK8 LRRK2 12q12 Leucine rich repeat cinasa
AD 35-78
PARK2 Park2 6q25 Parkina AR 20-40
PARK6 Pink1 1p36 Serine threonine K
AR 45-68
PARK7 Park7 1p36 DJ-1 AR variable
Chromosome # Cellular Protein Function
1q31-q42 Presenilin 2 (PS2) Protease – intramembrane
proteolysis
14q24.3 Presenilin 1 (PS1) -secretase
Protease – intramembrane
proteolysis
19 APOE4 Major serum protein
21q21.2 Amyloid precursor protein (APP)
Membrane glycoprotein
12
Gene(s) not identified
?
Alzheimer
Herramientas Dxsequence-specific binding of short complementary
DNA probes (oligonucle- otides) to DNA samples from patients in order to detect mutations associated with single-gene dis- orders. Generally, these assays rely on the poly- merase chain reaction (PCR) to amplify regions of interest in a patient’s DNA; the PCR product is then analyzed for the presence or absence of mutations. New approaches, including the use of gene chips and sequencing, are rapidly eclipsing traditional methods of detecting human genetic variation and mutations.
IntroducciónActualmente es más común buscar los factores
genéticos responsables de las enfermedades raras.
En las enfermedades comunes para la evaluación de riesgo se sigue utilizando factores de riesgo clásicos obtenidos en la HC.
Debido a la diversidad humana no se considera que existe una secuencia genómica Humana “Normal”.
En sitios específicos del genoma existen diferencias “variantes” que se consideran como “normales” (WT) debido a su frecuencia en la población.
N Engl J Med 2010;362:2001-11.
Our initial concerns were cost and data accuracy, but the major challenges turned out to be the logistics of delivering genome sequence information to clinicians, how clinicians use the data, and how patients and their families deal with the secondary (incidental) fndings.