laboratorio de reproducción asistida 2006 -...

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.............................. 1 Manual de Procedimientos Laboratorio de Reproducción Asistida 2006 Red Latinoamericana De Reproducción Asistida ...............................................................

Author: phungkhue

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    Manual de ProcedimientosLaboratorio deReproduccin Asistida

    2006

    Red Latinoamericana De Reproduccin Asistida ...............................................................

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    Este documento fue preparado por:

    Dr. Ariel Ahumada (Chile) Dr. Santiago Brugo Olmedo (Argentina) Dr. Juergen Liebermann (Alemania) Dra. Ana Lcia Mauri (Brasil) Dr. Randolfo Medina (Venezuela) Dra. Maria Natalia Posada (Colombia) Dr. Luis Roblero (Chile) Dra. Estrella Rosenberg (Venezuela) Dra. M. Teresa Olivieri (Venezuela) Dra. M. Soledad Seplveda (Chile) Dr. Michael Tucker (USA) Dra. M. Teresa Urbina (Venezuela) Dr. Roberto Coco (Argentina) Dra. Catherine Staessen (Blgica)

    Traducido al portugus por:

    Sra. Marina Diaz (Brasil)

    Corregido por:

    Dra. Ana Lcia Mauri (Brasil) Dra. M. Soledad Seplveda J. (Chile)

    Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006

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    CREDITOS ...............................................................

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    EDITORIAL ...............................................................

    El Manual de Laboratorio en su nueva edicin busca mantenerlas caractersticas de la versin anterior, o sea, la estandardizacinde los procedimientos laboratoriales de Reproduccin Asistida enLatinoamrica segundo la opinin de sus embrilogos clnicos.Adems, el Manual servir como modelo para los Centros que deseanformar parte de la RED y que quieren adaptar su laboratorio segundolas normas de acreditacin de nuestra institucin.

    La Direccin Ejecutiva de la RED agradece la participacin de todoslos embrilogos clnicos, especialmente Soledad Seplveda, quinha coordinado ese grupo.

    La edicin en espaol y ahora tambin en portugus hace posiblela propagacin de las informaciones y respeta la individualidadidiomtica de los diferentes pases que compone la RED.

    Finalmente, mis votos de suceso para esa nueva realizacin de laRED.

    Prof. Dr. J.G. Franco JuniorDirector EjecutivoRed Latinoamericana de Reproduccin Asistida

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    INDICE ...............................................................

    INTRODUCCION:1. Maduracin meitica del ovocito.2. Fecundacin en mamferos.3. Desarrollo preimplantacional.

    CAPITULO I:PREPARACION DE UN LABORATORIO PARAREPRODUCCION ASISTIDA

    1. Recomendaciones para la construccin de un Laboratorio deReproduccin Asistida.

    2. Normas de trabajo para el Laboratorio de Reproduccin Asistida.

    3. Normas de aseo del personal que participa en un procedimientode Reproduccin Asistida.

    4. Acondicionamiento fsico de un Laboratorio de ReproduccinAsistida cuando se trabaja en ciclos.

    5. Rutinas diarias de chequeo en un Laboratorio de ReproduccinAsistida.

    6. Otras normas de trabajo.

    7. Certificacin de equipos.

    8. Controles biolgicos.

    CAPITULO 2:PROCEDIMIENTOS DE REPRODUCCION ASISTIDA

    1. Tipos de procedimientos.

    2. Medios de cultivo.

    3. Mtodos de preparacin y seleccin de espermatozoides.

    4. Recepcin de ovocitos durante la aspiracin folicular.

    5. Clasificacin de la madurez somtica del complejo cmulo-corona-ovocito.

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    6. Inseminacin.

    7. Evaluacin de la fecundacin.

    8. Desarrollo preimplantacional in vitro.

    9. Evaluacin del desarrollo embrionario.

    10.Transferencia de embriones.

    CAPITULO 3:FECUNDACION ASISTIDA : INYECCIONINTRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI)

    1. Preparacin de los ovocitos para ICSI: tratamiento conhialuronidasa.

    2. Realizacin de la tcnica de ICSI.

    3. Procesamiento de las muestras de espermatozoides segnsu clasificacin.

    4. Puncin de epiddimo.

    5. Biopsia testicular.

    6. Protocolos accesorios.

    CAPITULO 4:CRIOPRESERVACION DE GAMETOS, CIGOTOS Y EMBRIONES.

    1. Criopreservacin de espermatozoides.

    2. Criopreservacin de ovocitos.

    3. Criopreservacin de cigotos y embriones.

    4. Tips para mejorar la tasa de sobrevida de los embriones.

    5. Mantenimiento de los equipos y problemas ms frecuentes.

    6. Vitrificacin y descongelacin de ovocitos, cigotos yembriones: una alternativa a la criopreservacin convencional.

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    CAPITULO 5:CULTIVO Y CRIOPRESERVACION DE BLASTOCISTOS.

    1. Cultivo de blastocistos en medios secuenciales.

    2. Congelacin lenta de blastocistos.

    3. Vitrificacin de blastocistos con el sistema de hemi-pajuela.

    CAPITULO 6:DIAGNOSTICO GENETICO PREIMPLANTATORIO (PGD)

    1. Quines podrian acceder al PGD?

    2. Las principales ventajas del PGD.

    3. Cmo se realiza el PGD?

    4. Cmo se realiza la biopsia?

    5. Es seguro el PGD?

    6. Requisitos para realizar el PGD.

    7. Consideraciones especiales.

    8. Equipos y materiales.

    9. Realizacn de la tcnica de PGD/PGS.

    10. Procedimiento para realizar el FISH en dos etapas.

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    En los mamferos, los ovocitos permanecen detenidos en la profasede la primera divisin meitica, hasta que la hembra experimenta lamadurez sexual. Con el estmulo hormonal apropiado, el ovocitoadquiere gradualmente la competencia para entrar en la etapa final de laprimera divisin meitica, a medida que aumenta de tamao durante lamaduracin folicular. La estimulacin por la hormona luteinizante (LH),ocasiona la maduracin nuclear del ovocito, el que experimenta rupturade la vescula germinativa. Los cromosomas se ensamblan en el husomeitico I y ocurre la primera divisin meitica: un set de cromosomashomlogos rodeado por una pequea cantidad de citoplasma es extruidocomo primer corpsculo polar. En este estado cada cromosoma estcompuesto por cromtidas hermanas las que no se separan hasta laanafase de la segunda divisin meitica (figura 1).

    Figura 1: Meiosis en el Ovocito

    La meiosis II prosigue y el ovocito entra en arresto de divisin, conlos cromosomas alineados en la placa ecuatorial del segundo husomeitico. En este estado el ovocito es liberado del folculo y ocurre laovulacin, en respuesta al pico de LH.

    1. MADURACION MEIOTICA DEL OVOCITO HUMANO

    INTRODUCCION ...............................................................

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    La fecundacin de un ovocito comprende una serie de eventosque ocurren en un orden cronolgico y que llevan a la incorporacindel material gentico del espermatozoide en el citoplasma del huevo,dando origen a la formacin de un zigoto.

    Durante el trnsito por el tracto genital hasta las trompas deFalopio, el espermatozoide se capacita, es decir, le ocurren cambiosfisiolgicos y estructurales que le permiten hiperactivarse y luegoexperimentar la reaccin acrosmica. La cabeza delespermatozoide hiperactivo se une a la zona pelcida del ovocito(unin primaria), mediante la interaccin de residuos carbohidratode un componente de la zona pelcida ZP3 con molculas ligandoen la superficie del espermatozoide. Esta unin provoca lareaccin acrosmica, en que se fusiona la membrana acrosomalexterna con la membrana plasmtica del espermatozoide,liberando el contenido acrosomal, cuyo componente principal esla serina proteasa, acrosina.

    La unin primaria progresa a una unin denominada uninsecundaria que corresponde a una interaccin especie-especficaentre otro componente de la zona pelcida ZP2 y acrosina. Mediantela accin protesica de acrosina el espermatozoide se suelta y vuelvea interactuar con la zona pelcida, penetrndola luego de ciclosalternados de unin y lisis. El espermatozoide alcanza as el espacioperivitelino, toma contacto con la membrana plasmtica del ovocitoy la cola cesa de batir. Se fusiona la membrana plasmticapostacrosomal con la membrana plasmtica del ovocito,incorporndose el espermatozoide al citoplasma.

    La fecundacin induce la reaccin cortical en el ovocito, que asu vez provoca la reaccin de zona. La reaccin cortical consisteen la liberacin del contenido enzimtico de los grnulos corticalespor fusin de la membrana plasmtica del ovocito con la membranade los grnulos. La difusin de este contenido a travs de la zonaprovoca cambios estructurales que impiden la unin de nuevosespermatozoides.

    2. FECUNDACION EN MAMIFEROS

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    La fecundacin activa el ovocito que se encontraba detenido en lametafase de la segunda divisin meitica (figura 2 a y b).

    Se completa esta divisin eliminndose el segundo cuerpo polar(figura 2 c). El material gentico haploide del ovocito y delespermatozoide se rodea de membrana nuclear, constituyendo losproncleos femenino y masculino, que migran hacia el centro de laclula (figura 2 c y d). Durante esta migracin ocurre duplicacin delDNA. Las membranas de los proncleos se rompen (singamia) y loscromosomas se ensamblan en el huso mittico (figura 2 e), para darlugar al primer clivaje del nuevo individuo (figura 2 f).

    La Fecundacin

    Figura 2: Fecundacin en Mamferos

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    Se define como desarrollo preimplantacional el periodocomprendido entre la formacin del cigoto y la implantacin delblastocisto en el endometrio (figura 3). En el humano dura entre 6y 7 das, durante los cuales migra desde la porcin ampular de latrompa hasta el tero. Durante este periodo el conceptus experimentauna serie de divisiones celulares sin experimentar crecimiento yfinalmente se forma el blastocisto que contiene un grupo de clulasque dar origen al embrin denominado masa celular interna (mci)y el primer tejido diferenciado, el trofoblasto que rodea la mci.

    Figura 3: Desarrollo PreimplantacionalFigura 3: Desarrollo PreimplantacionalFigura 3: Desarrollo PreimplantacionalFigura 3: Desarrollo PreimplantacionalFigura 3: Desarrollo Preimplantacional

    3. DESARROLLO PRE-IMPLANTACIONAL

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    1. RECOMENDACIONES PARA LA CONSTRUCCION DE

    UN LABORATORIO DE REPRODUCCION ASISTIDA.

    El Laboratorio de Reproduccin Asistida debe estar ubicado en unrea independiente del espacio general, cuyo acceso debe ser restringidoslo a las personas y materiales necesarios para cada procedimiento.Debe tener un tamao adecuado al nmero de procedimientos a realizar.Debe estar localizado al lado del quirfano, donde se realiza la aspiracinfolicular, de preferencia con una ventana de comunicacin pass-through.

    El laboratorio debe ser construido con material resistente y defcil aseo. La divisin de las salas puede ser de albailera o laminados.El suelo revestido de vinil quirrgico o monoltico (poliuterano oepoxi), con bordes recortados, con el fin de no acumular partculas yfacilitar su limpieza. Se debe poner especial cuidado en la unin delsuelo a la pared, recomendndose la forma redondeada continuapara evitar ranuras que puedan acumular partculas.

    Las paredes deben ser pintadas con pintura no txica, sin olor, noporosa, y no pegadizas para no adherir suciedad; no debe exhalar vapory debe ser de fcil aseo (por ejemplo, pintura epxica a base de agua).

    La iluminacin debe ser hecha con luz amarilla incandescente conajuste de dimer, para graduar la intensidad.

    Los mesones de trabajo deben ser lisos e impermeables, con el finde disminuir la acumulacin de partculas. Se recomienda el aceroinoxidable.

    El laboratorio debe contar con un equipo generador de corrienteelctrica para todos sus equipos, en caso de cortes de energa. Serecomienda adems el uso de UPS para evitar la demora que a vecesocurre en el restablecimiento de la corriente, cosa que puede ser graveen algunos equipos que se desprograman, como por ejemplo, lasmaquinas de congelacin.

    Captulo 1: Preparacin de un Laboratorio paraReproduccin Asistida

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    La calidad del aire en el laboratorio, es un factor importante deconsiderar puesto que existen evidencias que muestran que el usode filtros favorece el desarrollo embrionario. Por esto debe existir unsistema de presin positiva, con recambio de aire de al menos 12veces por hora, con filtros HEPA y de carbn activado. El filtro HEPAes empleado para evitar el ingreso de partculas y el de carbn activadoes empleado para la retencin de sustancias voltiles (VOCs),provenientes del exterior o del interior del laboratorio, incluyendochimeneas, combustibles, emanaciones vehiculares, ceras, materialesplsticos, alcoholes, materiales de limpieza, aire acondicionado,etc.

    AREAS DE TRABAJO EN UN CENTRO DE REPRODUCCIONASISTIDA:

    Sala de vestuario y sanitario: deben estar antes de ingresar allaboratorio y a la sala de aspiraciones.

    Lavado quirrgico: debe tener un grifo especial que se activasin utilizar las manos. Lo mismo debe ocurrir para la obtencindel liquido de limpieza.

    Sala de procedimientos quirrgicos: debe estar cerca o allado del Laboratorio de Embriologa. Esta destinada a la aspiracinfolicular transvaginal y a la transferencia de embriones, realizacinde PESA, BITE y TESA para obtencin de espermatozoides en loscasos de azoospermia.

    Laboratorio de Embriologa: en el se encuentran los equiposnecesarios para la realizacin de los procedimientos deReproduccin Asistida. Debe estar cerca o al lado de la sala deaspiraciones. Debe contar con sistema de respaldo deemergencias.

    Laboratorio de Andrologia: rea separada del Laboratorio deEmbriologa, destinada a la manipulacin en condiciones aspticasde las muestras de semen.

    Sala de criopreservacin: rea separada del Laboratorio deEmbriologa, destinada a la realizacin de los procedimientos decriopreservacin y al almacenamiento de muestras biolgicas entanques de nitrgeno lquido. Esta rea debe tener buenaventilacin pues durante el proceso de congelacin hay liberacinde nitrgeno, el cual reacciona con el oxgeno del medio ambiente,consumindolo.

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    Debe contar con un tanque de nitrgeno lquido que no contengamuestras biolgicas para utilizarlo de respaldo, en caso de una descargainesperada.

    Depsito de materiales: rea reservada para el almacenamiento demateriales descartables. Al Laboratorio de Embriologa, debe ingresarjusto lo necesario para utilizar, no debe haber almacenamientos.

    2. NORMAS DE TRABAJO PARA EL LABORATORIO DE

    REPRODUCCION ASISTIDA

    MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

    Todos los procedimientos y normas a seguir en un Laboratorio deReproduccin Asistida deben estar claramente detalladas en unmanual de procedimientos, el cual debe ser constantementerevisado y actualizado. Todas las personas que laboran en el lugardeben tener conocimiento del contenido de esta manual.

    Tambin se debe contar con un libro de registro de Control de Calidadde todos los ensayos que se realizan, de acuerdo a las siguientesnormas:

    REGLAS DEL CONTROL DE CALIDAD:

    Toda observacin y control de los sistemas del laboratorio debe serregistrado en un cuaderno de Control de Calidad. Si no est escritono se ha hecho.

    Cualquier dato registrado tiene valor slo si se han establecido losvalores de tolerancia.

    Los valores de tolerancia tienen significado slo si estn escritas lasinstrucciones de cmo proceder si los lmites son excedidos (accionescorrectivas).

    Las acciones correctivas tienen significado slo si son registradas.

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    3. NORMAS DE ASEO DEL PERSONAL QUEPARTICIPA EN UN PROCEDIMIENTO DE

    REPRODUCCION ASISTIDA

    LAVADO QUIRURGICO DE MANOS E INDUMENTARIA

    El objetivo es limpiar la piel de manos y antebrazos de grmenes,grasa y otras materias orgnicas, previo a algn procedimiento omanipulacin. Este procedimiento permite eliminar la flora microbianatransitoria y disminuir la flora microbiana normal de la piel. El propsitodefinitivo es prevenir la diseminacin de microorganismos por vamano portadora, evitando la contaminacin microbiana durante lamanipulacin del material biolgico. Por otra parte, el uso de losguantes tiene un doble cometido: proteger al operador de latransmisin de patgenos contenidos en lquidos orgnicos o tejidosy reforzar la barrera de control frente a la contaminacin por vamanoportadora. Finalmente, el uso de la mascarilla permite evitar latransmisin de microorganismos infecciosos que se propagan a travsdel aire y aquellos cuyas fuentes de entrada o salida pueden dar alaparato respiratorio.

    MATERIALES Solucin de clorhexidina al 4%. Toalla o compresas estriles. Guantes de ltex o pristano, estriles, libres de talco. Mascarilla desechable.

    PROCEDIMIENTOPrevio a un procedimiento de Reproduccin Asistida las personas

    que ingresarn al laboratorio deben vestirse de acuerdo a las normasestablecidas para un recinto quirrgico. Lavar las manos y antebrazoscon agua y solucin de clorhexidina al 4 %, frotndolos por unosminutos hasta obtener bastante espuma, poniendo nfasis en espaciosinterdigitales y palmas. El lavado debe prolongarse por al menos 3minutos.

    - Enjuagar con agua corriente, desde las manos hacia los codos.- Cerrar la llave del agua con los codos.- Secar primero las manos y despus antebrazos con toalla individual

    estril.

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    USO DE GUANTES ESTERILES- Previo lavado quirrgico de manos, abrir el paquete de guantes (o

    un ayudante presentar los guantes). Tomar el primer guante por sucara interna, es decir, por la cara que estar en contacto directo consu piel e introducirlo. Tomar el segundo guante con la manoenguantada, tomndolo por su cara externa e introducirlo. Los guantesdeben ser sin talco ya que este es toxico para los gametos y embriones.

    USO DE LA MASCARILLA- Previo lavado de manos, colocar la mascarilla cubriendo nariz y

    boca, luego amarrarla tomando solamente las tiras.- Moldear a la altura de la nariz para dejarla cmoda y segura.- Lavar las manos.

    CONSIDERACIONES GENERALES Las personas deben usar las uas cortas, limpias y sin esmalte. No deben usar joyas. Las mangas deben estar sobre el codo. A fin de no contaminar las manos, la mascarilla no debe tocarse, ni

    colgar al cuello mientras se lleve puesta. El mal uso de la mascarilla o el uso de mascarillas inadecuadas

    aumenta la posibilidad de transmisin de microorganismos y da unafalsa impresin de seguridad.

    El uso de guantes no reemplaza el lavado de manos. Los guantes no deben contener polvos talco, estos deben ser

    enjuagados con agua estril y luego se debe proceder a secarlos conun clnico o compresa estril.

    Las personas que ingresan a los procedimientos no deben utilizarperfumes, lacas ni nada que sea voltil.

    Se recomienda marcar tubos y cpsulas con lpiz diamante paraevitar el alcohol expelido por los marcadores indelebles.

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    4. ACONDICIONAMIENTO FISICO DE UNLABORATORIO DE REPRODUCCION ASISTIDA

    CUANDO SE TRABAJA EN CICLOS

    ASEO DEL LABORATORIO

    Objetivo: Disminuir al mximo la carga contaminante (virus, bacterias,hongos, particulas en suspensin, fuentes orgnicas, etc) del ambientedel laboratorio, antes, durante y despus de cada procedimiento deReproduccin Asistida.

    MATERIALES- Solucin para remocin de residuos orgnicos. Se utiliza el

    detergente DETERGEM o cualquier amina cuaternaria.- Agua y paos limpios.

    PROCEDIMIENTOi) Antes de un ciclo de FIV

    Como mnimo una semana antes del inicio de un ciclo defecundacin in vitro debe efectuarse un aseo terminal dellaboratorio de FIV. Este consiste en una limpieza a fondo tantode pisos, paredes y cielo del laboratorio.Empapar un pao limpio con solucin de DETERGEM y aplicarpor todas las superficies (para remover materias orgnicas).

    ii) Durante un ciclo de FIVSe debe realizar una limpieza peridica slo con agua sobre pisos.Bajo ninguna circunstancia emplear soluciones de detergentes,cloro o desinfectantes durante el procedimiento de fecundacinin vitro pues son altamente nocivos para los gametos y embriones.

    iii) Despus de un ciclo de FIVUna vez finalizado el ciclo de FIV repetir el aseo terminal dellaboratorio de FIV.

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    5. RUTINAS DIARIAS DE CHEQUEO DE UN

    LABORATORIO DE REPRODUCCION ASISTIDA.

    Anlisis de la historia clnica y de laboratorio si tuvo procedimientosprevios, de los casos que se planifica realizar, para definir laconducta a seguir.

    Registro de los lotes y fecha de caducidad de todos los materiales,reactivos y medios de cultivo empleados, durante losprocedimientos.

    Verificacin de la identidad de los pacientes antes de la aspiracinfolicular, de la colecta del semen, de la inseminacin y de latransferencia de los embriones. Todas estas etapas deben serrealizadas con un testigo, cuyo nombre tambin debe quedarregistrado en la ficha del procedimiento.

    Identificar todos los elementos a utilizar en un procedimiento(frasco de colecta, tubos, placas, etc) en una manera homogneay relacionada con la ficha clnica de la paciente.

    Chequear y registrar los niveles de CO2 y temperatura de lasincubadoras, externa e internamente.

    Chequear temperatura de todas las platinas termorreguladas. Chequear, dos veces a la semana, los niveles de nitrgeno lquido

    de los tanques de almacenamiento y del tanque de respaldomantenido para una emergencia.

    Limpieza de los mesones de trabajo, cmara de flujo laminar yequipos de purificacin de agua.

    Desecho de materiales contaminados de acuerdo a las normas locales.

    6. OTRAS NORMAS DE TRABAJO

    No portar documentos o artculos de uso personal (lpices, relojes,joyas, etc).

    Todo traslado de material para los procedimientos de ReproduccinAsistida debe ser controlado, previamente, por el jefe del laboratorio.

    Una vez abierto el laboratorio y antes de realizar cualquier operacinproceder al lavado quirrgico de manos y brazos (segn procedimientos),evitando el contacto posterior con materiales o instrumental noesterilizado.

    Activar Cmara de Flujo Laminar y encender platinas termorreguladas(ajustadas en 37C). Se recomienda no apagarlas durante todo el ciclo.

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    En la limpieza de las superficies de trabajo en la cmara de flujolaminar. Emplear compresas o clnicos estriles y alcohol al 70%,solo si no hay embriones en las incubadoras. En caso contrario sedebe usar solo agua.

    Al final del da se puede limpiar por una vez con alcohol al 70%sobre las reas de trabajo e inmediatamente secar con una compresaestril, deslizndola por arrastre sobre la superficie comprometida.Finalmente, se debe botar esa compresa fuera del laboratorio paraevitar contaminacin con alcohol.

    La platina termorregulada es el centro de actividad de cadaoperacin que se realiza en la cmara de flujo laminar, por lo que serecomienda depositar slo material estril en la superficie y evitarapoyar manos o brazos sobre el lugar.

    La Cmara de Flujo Laminar debe permanecer encendida porlapso de 20 minutos antes de cualquier operacin o manipulacinen ste ambiente. Se recomienda no apagarla durante todo el ciclo.

    Antes y durante la manipulacin de gametos o embriones cuidarde no interrumpir el flujo laminar en la zona de manipulacin destos. Preocuparse, en todo momento, de no bloquear el flujo laminarpor interferencia de objetos dispuestos en el espacio de trabajo. Hacerextensivo estos cuidados durante la manipulacin del propio materialbiolgico. Trabajar en todo momento en el centro de la cmara deflujo laminar, pues es la zona en que efectivamente el flujo de aire eshorizontal y libre de partculas ambientales.

    En todo momento se debe disponer en el laboratorio de FIV decompresas estriles, agua estril, perxido de hidrgeno para limpiarsuperficies en las que se hayan derramado lquidos orgnicos, talescomo: fluido folicular, sangre, suero, medio de cultivo, etc. En estoscasos se debe aplicar primero agua para remover componentesorgnicos y luego H2O2 en la zona afectada, luego limpiar concompresa estril. No aplicar soluciones de alcohol sobre componentesorgnicos previa utilizacin de agua pues el alcohol fija loscomponentes orgnicos en la superficie.

    Se debe tener cuidados en la apertura y manipulacin del materialestril. Todo el material de cultivo se encuentra esterilizado porradiacin y su duracin es indefinida, a menos que el envoltorioplstico que lo contiene sea violado o abierto en un ambiente carentede flujo laminar y/o presin positiva.

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    El instrumental o material que se esteriliza por autoclave, tieneduracin definida y debe estar convenientemente rotulada su Fecha deVencimiento. Certificar, antes de su uso, que el material no haya caducadoen cuanto a su condicin de esterilidad.

    7. CERTIFICACION DE EQUIPOS

    CAMPANA DE FLUJO LAMINAREl programa de manutencin de los equipos de flujo laminar incluye:

    a) Sustitucin semestral de Pre-Filtros . Con esto se evita la saturacinde los filtros absolutos y se asegura un correcto y segurofuncionamiento del sistema de flujo laminar.

    b) Calibracin anual del Flujo Laminar. Se evala calidad del flujolaminar y cantidad de partculas en suspensin contenidas.

    c) Certificacin anual tipo D.O.P. a filtros absolutos. La finalidadde esta prueba es determinar la calidad de aire que esta proporcionandoel sistema. Examina las velocidades mximas y mnimas permitidaspara asegurar un adecuado Flujo Laminar. Permite detectar fugas y/odeterioros en el filtro absoluto y sus empaquetaduras. La prueba tipoD.O.P. incluye la calibracin del equipo mediante la deteccin de ndicesde penetracin utilizando partculas estndares en tamao.

    d) Revisin anual de sellos de cmaras y burletes de goma defiltros absolutos (con el tiempo pueden ceder y generar escapes enel sistema).

    Consideraciones Generales:a) No exponer el equipo de Flujo Laminar a corrientes de aire.b) Limpieza constante del equipo, evitando el uso de soluciones de

    hipoclorito de sodio, detergentes y/o alcohol concentrado.

    EQUIPOS OPTICOS Y ACCESORIOSLupas Estereoscpicas, Microscopios Convencionales e Invertidos.

    Al considerar este tipo de equipos se deben observar tres aspectos:

    a) Elementos Opticos,b) Elementos Mecnicos y Pinturas de Revestimiento y,c) Accesorios tales como Equipos de Obtencin de Imgenes y

    Microinyeccin.

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    i) Elementos Opticos.Los componentes pticos de uso ms frecuente y que manipulandirectamente los usuarios, son los objetivos y oculares. Para losprimeros la mantencin depender del grado de uso del equipo,pero si consideramos un Laboratorio de Reproduccin Asistidacuyas condiciones son las de un pabelln quirrgico y dondedos o tres usuarios regulares manipulan los equipos con unpromedio de 3 o ms horas por da. Bajo estas condiciones sedebe considerar una rutina de limpieza de los objetivos en formasemanal con papel lente.

    En el caso de frecuencias de uso superiores se debe realizarlimpieza cada tres das o menos, pero todo depender delnmero de muestras analizadas diariamente y del aseo generaldel laboratorio, de hecho es posible operar sin problemas losequipos por semanas sin que estos requieran una limpiezaprofunda.

    Por ltimo, es conveniente realizar mantencin preventiva generalde las partes pticas con el servicio tcnico del representanteoficial, cada 6 meses por lo menos o a ms tardar una vez alao, para asegurar un rendimiento ptimo. En esta mantencinse considera desarme parcial del equipo, con aseo interior deoculares, limpieza y aspirado de los tubos binoculares del revolver,adaptadores de video, etc.

    ii) Elementos Mecnicos y Pinturas de Recubrimiento.En general, se considera que para los elementos mecnicos elusuario slo puede hacer servicio de aseo externo sin interferir endispositivos mecnicos interiores, ya que esto puede ocasionaralguna falla de operacin.Se debe considerar que todos los componentes mecnicos llegancon estrictas calibraciones de fbrica, que por ningn motivo sedeben cambiar o alterar. En cuanto al aseo slo se deben empleardetergentes suaves no corrosivos, aplicndolos con paos suavesy limpios. Por otra parte, las pinturas de recubrimiento tienenpor objeto evitar corrosin por accin de agentes qumicos, porlo que para una adecuada limpieza se deben utilizar solamentedetergentes suaves no corrosivos. Cuando se presentan manchasadheridas nunca debe rasparse ya que se puede remover parte lapintura y as favorecer el ataque al metal interior del equipo.

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    iii) Accesorios

    a) Equipos de obtencin de imgenes.Considerando accesorios corrientes como cmaras de video,monitores, etc., para cada marca existirn reglas individuales quedeben seguirse en forma precisa, especialmente los tpicos deajustes de sensibilidad de cmaras y monitores. En estos casos esconveniente revisar en detalle los manuales de funcionamiento yconsultar con el representante autorizado, antes de cambiar losparmetros de operacin, especialmente los internos. De hechotambin en estos casos se considera que los equipos deben operarsin problemas durante largos lapsos de tiempo, salvo que elmanual especficamente indique algn tiempo definido para elrecambio de algn componente.

    b) Equipos de microinyeccin.Los accesorios para micromanipulacin generalmente incluyen unconjunto bsico de controladores gruesos y finos, que pueden sermanuales o automticos (la mayora con sistemas hidrulicos),inyectores de 4 ml y 10 ml y en algunos casos inyectores automticos.Todos estos componentes estn diseados para operacin en formaindefinida y slo requieren mantencin en lo que se refiere a limpiezaexterior de las diferentes unidades. Si el usuario detecta problemasde operacin, como: fugas o filtraciones del sistema hidrulico,desajustes de operacin u otros dirigirse a la fabrica o servicio tcnicoautorizado para una adecuada calibracin de las diferentes unidades,especialmente cuando se trata de micromanipuladores gruesos yfinos. En caso de problemas mayores el equipo debe ser retornado ala fbrica para recambio o calibracin. Nunca se debe intentardesarmar o modificar la calibracin original.

    INCUBADORAS DE CO2

    i) Control de Temperatura y Nivel de CO2

    Se debe realizar un control diario tanto de la temperatura como delnivel de CO2 de la incubadora. Para un control adecuado de estosparmetros se debe tabular diariamente la informacin no empleandode gua los parmetros de temperatura y CO2

    proporcionados por el

    equipo a menos que estos hallan sido previamente calibrados. Paracalibrar la temperatura de la incubadora se requiere un termmetrode precisin (0.1C) certificado que se debe instalar en el interiorde la cmara de incubacin. Este termmetro no puede ser demercurio por riesgo de que se quiebre dentro de la incubadora.

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    La informacin entregada por este termmetro debe ser empleadapara calibrar el sensor de temperatura de la propia incubadora.Por su parte, el nivel de CO2 debe ser controlado con uninstrumento capaz de medir la tensin del gas dentro de la cmarade incubacin de la incubadora. Esto permite cuantificar elporcentaje de CO2 contenido en la incubadora y as calibrar loque registra el equipo. Estos pasos de control y calibracin debenser hechos con el equipo equilibrado y antes de haber realizadocualquier operacin o apertura del equipo. Se recomienda utilizarel analizador infrarrojo de CO2 Bacharach.

    ii) Limpieza InternaLa sanitizacin de la incubadora se debe realizarmensualmente. Para este procedimiento es precisodesensamblar el interior de la cmara de incubacin extrayendobandejas, paredes y receptculo de agua. Las pezas debe serlavado con agua ultrapura y jabn neutro (Rocall, 7X, ExtramMA-01), compresas estriles. Cada uno de estos componentesdebe ser esterilizado por autoclave a 134C antes de su reposicin.Por otra parte, la cmara interna debe ser sanitizada con unasolucin saturada de bicarbonato (NaHCO3) durante 20 minutos(esto genera un ambiente alcalino que permite la eliminacinselectiva de bacterias y hongos) y luego con alcohol al 70%aplicado con compresas estriles. Si no hay embriones en lasotras incubadoras se puede pasar al final alcohol al 70%, aplicadocon compresas estriles. Finalmente, se procede al ensamble dela cmara de incubacin y a la reposicin del receptculo conagua destilada estril. Todos estos pasos deben realizarse con laincubadora encendida, manteniendo interrumpido el suministrode CO2. Una vez sanitizada la incubadora se recomienda sustituirsemanalmente el agua y su receptculo. Tambin es aconsejablesustituir semanalmente las bandejas por estriles.

    iii) Calibracin y Reemplazo de Componentes de laIncubadora.Se debe reemplazar anualmente el kit de descontaminacin,empaquetaduras y aspas del ventilador y sensor y filtrobacteriolgico de CO2. Tambin, anualmente se debe realizar unalimpieza de los circuitos electrnicos y compartimentosacumuladores de polvo y calibracin de los circuitos electrnicos(voltajes de la fuente de poder, circuitos de control, etc.). Deigual forma, se debe calibrar la temperatura y CO2 de la cmarainterna de la incubadora, como se detall en el primer punto desta seccin.

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    Es importante hacer notar que la calibracin y sustitucin decomponentes debe ser efectuada por personal calificado o poroperadores experimentados.

    Por otra parte, el ventilador de homogenizacin del CO2 funcionacontinuamente y por ende est expuesto al desgaste por lo quese recomienda su cambio cada 4 meses. Adems, si se disponede 2 o ms incubadoras es necesario disponer de un ventiladorde repuesto para cada modelo.

    8. CONTROLES BIOLOGICOS

    A. CULTIVO PARA HONGOSi) Control del laboratorio y equipos:

    Las incubadoras y el lugar donde se realizan los procedimientosse deben controlar bacteriolgicamente para hongos, se realizanen placas de Agar - Saubureaud. Las placas se ponen en formaesteril dentro de las incubadoras y en los sitios a ser controladoscomo: campanas de flojo laminar, mesones de trabajo, etc.

    ii) Control de los medios de cultivo:Este control se realiza con el medio de cultivo donde fueroninseminados los ovocitos y dejados en la incubadora por 5 o 6 das.La frecuencia va a depender de la forma de trabajo, es decir, en serieo en forma continua, de la cantidad de pacientes y de los resultados.

    B. CULTIVO PARA BACTERIAS

    i) Control laboratorio y equipos:Los cultivos para bacterias se realizan en placas de Agar - Sangre(Gram + y -) y Agar - McConkey. Se controlan para bacterias lasincubadoras, el agua del receptculo, con el mismo protocolo descritoen A. para hongos.

    ii) Control medios de cultivosSi no son comprados en compaas confiables, los medios de cultivodeben ser preparados con agua estril y excenta de pirgenos, paraesto ltimo se recomienda analizar el agua para endotoxinas TestLAL 0.03. Despus de preparado, el medio de cultivo debe seresterilizado por filtracin en membrana de poro de 0.22 m ycontrolar bacteriolgicamente.

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    C. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

    i) Sobrevida EspermticaSe entiende por sobrevida espermtica al % deespermatozoides con motilidad progresiva despus de unperiodo de incubacin largo (18 - 20 hrs). Para realizar estasobrevida espermtica los espermatozoides se separanmediante gradiente de densidad o Swim-Up y se incuban en losdiferentes medios a probar. Un buen medio de cultivo debe sercapaz de mantener, al menos, el 60% de los espermatozoidescon motilidad progresiva al final del tiempo de incubacin.

    ii) Desarrollo de embrin de ratnPara este control se utilizan embriones de ratn de 2 clulas loscuales se ponen a desarrollar en los medios de cultivo que sequieren chequear..

    Se observa diariamente el desarrollo embrionario y a las 72 horasse calcula el porcentaje de blastulacin el cual no puede ser menordel 80%.

    Este control biolgico se debe utilizar cada vez que se preparaun medio de cultivo nuevo y cuando se compran hechos; a pesar deque estos vienen con esta prueba realizada pero es necesarioasegurarse de que no hubo problemas en su traslado.

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    1. TIPOS DE PROCEDIMIENTOS

    A. FECUNDACION IN VITRO CON TRANSFERENCIAEMBRIONARIA FIV (IVF-ET: In Vitro Fertilization with Embryo Transfer)

    En este procedimiento, los ovocitos recuperados por aspiracinfolicular, son inseminados con espermatozoides separados del lquidoseminal por tcnicas de separacin espermtica. De este modo, elencuentro de los gametos y posterior fecundacin ocurre fuera delorganismo materno. Los embriones originados son colocados en uncatter de transferencia y depositados en el fondo de la cavidad uterina.

    Una variacin a este procedimiento es transferir, va laparoscpica, losembriones, al estado de cigoto o de 4-6 clulas, en la cavidad de latrompa de Falopio. A la primera modalidad se le conoce como transferenciade proncleos a la trompa (PROST) y a la segunda como Transferencia deEmbriones a la Trompa (TET).

    B. TRANSFERENCIA DE GAMETOS A LA TROMPAGIFT (Gametes intra fallopian transfer)

    El GIFT es un procedimiento en que la fecundacin ocurre en latrompa de Falopio. Para esto, por medio de una intervencinlaparoscpica, los gametos son depositados en la regin ampular de latrompa, con ayuda de un catter de transferencia. En este catter, losovocitos estn separados de los espermatozoides por una burbuja deaire.

    De esta manera el encuentro de los gametos y la fecundacin seproduce en la trompa, tal como ocurre en la fecundacin natural. Poresto mismo, el desarrollo embrionario progresa a medida que losembriones son transportados por la trompa hacia el tero, producindoseuna perfecta sincrona entre desarrollo embrionario y receptividadendometrial.

    Captulo 2: Procedimientos de ReproduccinAsistida ................................................................

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    C. INYECCION INTRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDEICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection).

    La ICSI es una tcnica de fecundacin que consiste en la micro-inyeccin de un solo espermatozoide al citoplasma del ovocito pormedio de una micropipeta adosada a un micromanipulador. Despusque el ovocito ha sido microinyectado, es llevado a una incubadoradonde se completa la fecundacin y se inicia su desarrolloembrionario, hasta la transferencia al tero materno. Una variacina este procedimiento es el llamado SOFT (sperm oocyte-microinjectedfallopian transfer), en que el ovocito una vez microinyectado esinmediatamente transferido a la trompa por va laparoscpica, demodo que la fecundacin y el desarrollo embrionario se producenen el tracto genital materno.

    2. MEDIOS DE CULTIVO

    A. FORMULACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

    En la Reproduccin Asistida, la calidad del desarrollo embrionarioy la consecuente posibilidad de embarazo depende en gran medidade la calidad del medio de cultivo que se utilice.

    En el presente, la mayora de los centros de fertilizacin asistidautilizan medios de cultivo preparados por las diferentes empresasque comercializan productos destinados a este propsito. Sinembargo, tambin existen aquellos centros que prefieren prepararsus propios medios. Generalmente, estos son medio de cultivo conrelativamente pocos constituyentes, siendo la mayora de ellos salesinorgnicas, ms uno o dos compuestos orgnicos como fuentesenergticas, por lo que pueden ser fcilmente preparados en ellaboratorio.

    Hasta no hace mucho, los medio de cultivo fueron suplementadoscon suero humano preovulatorio, proveniente de la paciente que estabasiendo preparada para una fecundacin asistida o bien con suero decordn umbilical. El uso de estos sueros da buenos resultados, perose corre el riesgo de que estn contaminado con agentes patgenos(virus de hepatitis, HIV, etc) o contener anticuerpos que pueden interferircon la fecundacin y el desarrollo embrionario.

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    Cualquiera sea el suero humano usado, estos deben ser inactivadospor 30 minutos a 1 hora a 56C. Actualmente, los medios de cultivo sesuplementan con albmina de suero humano (HSA) suero sustitutosinttico (SSS) preparados comercialmente por empresas dedicadas a esterubro.

    Los medios que pueden ser preparados en el Laboratorio son losllamados medios simples. Los ms usados en la actualidad son el HumanTubal Fluid (HTF) de Irvine Sc, y el IVF Medium de Medicult.

    B. PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

    MATERIALESLos materiales necesarios para preparar estos medios de cultivo son lossiguientes:

    Agua ultra pura con una resistencia de 15-18 Ohms, esterilizadaen membrana de poro de 0.22 m y apirognica (agua con estascaractersticas se puede obtener con los sistemas de ultrapurificacinde aguas como Millipore).

    Matraz aforado a 1 Lt. Osmmetro. Balanza analtica. Agitador magntico. Campana de Flujo Laminar. Sistema de esterilizacin por filtracin con membrana de poro 0.22 m. Pipetas volumtricas de 5 y 10 ml. pHmetro

    MEDIO HTF (Human Tubal FLuid)Se usa como medio de inseminacin y para el desarrollo embrionariohasta el tercer da.

    Su formulacin es la siguiente:

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    MEDIO HTF MODIFICADO

    El HTF puede ser modificado para ser usado sin tensin de CO2.Para esto, el NaHCO3 debe ser rebajado a 4.0 mM y agregar Hepes25 mM. Llevar a pH 7.3-7.4 con NaOH 1 N. Este medio se usa parasuspender espermatozoides y para mantener gametos y embrionesen ambiente sin CO2.

    MEDIO DE CULTIVO P1 (Preimplantation stage one)Este medio es una modificacin del HTF. Se caracteriza por no tenerglucosa ni fosfato y estar suplementado con Taurina, Citrato de Sodioy Glutamina.

    Su formulacin es la siguiente:

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    MEDIO DE EARLE (Earles Balanced Salts Solution).

    Es la base para la preparacin de IVF Medium y Flushing Medium,comercializados por Medicult.

    Su frmula es la siguiente:

    MEDIOS IVF Medium y Flushing Mediun

    FORMULA PARA AJUSTAR LA OSMOLARIDAD:

    Osmolaridad Observada - Osmolaridad Deseada-------- x Volumen de medio preparado Osmolaridad Observada

    Medir la osmolaridad del medio recin preparado (OsmolaridadObservada), restar la Osmolaridad deseada (por ejemplo: 280), elresultado dividirlo por la osmolaridad observada y multiplicar por elvolumen, en ml, del medio preparado (por ejemplo: 1000 ml). Elresultado obtenido es la cantidad de medio que se debe retirar delmedio preparado y reemplazarlo por igual cantidad de agua ultra pura.Volver a medir la osmolaridad para comprobar la osmolaridadalcanzada. Finalmente, el medio se debe suplementar con suero auna concentracin de acuerdo al procedimiento en el cual ser usadoy luego esterilizar por filtracin en membrana de 0.22 m.

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    Los medios compuestos tambin se pueden usar sin tensin de CO2al 5%. Para esto se debe usar Hepes y NaHCO3 en las mismasconcentraciones indicadas en la preparacin de los Medios Simples.

    C. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LASDIFERENTES ETAPAS DE UN PROCEDIMIENTO DEREPRODUCCION ASISTIDA

    1. MEDIO PARA LA SEPARACION ESPERMATICAMedio de Cultivo (tamponado con Hepes) suplementado consuero sinttico sustituto (SSS) al 10%

    2. MEDIO DE ASPIRACION FOLICULARBuffer Dulbecco adicionado a pH 7.4 y con una osmolaridadigual a 280 +++++ 5mOsmol. No es necesario suplementar con SSS.Actualmente, se recomienda usar medio HTF modificado paralos lavados durante la aspiracin folicular.

    3. MEDIO DE INSEMINACIONMedio de cultivo suplementado con SSS al 10%.

    4. MEDIO DE CRECIMIENTOMedio de cultivo suplementado con SSS al 10 o 15%.

    5. MEDIO DE TRANSFERENCIAMedio de cultivo suplementado con SSS al 30 o 50%.

    D. MEDIOS PREPARADOS DE FABRICA

    En la actualidad, en el mercado Norteamericano y Europeo,existen diferentes medios de cultivo ya preparados, algunosincompletos en que solo hay que agregarles suero y otros completoslistos para ser usados. Se ofrecen medios para todas las etapas delos procedimientos de fecundacin asistida: para la aspiracin folicular,separacin espermtica, inseminacin, cultivo de ovocitos, primerosestados del desarrollo embrionario, y para la diferenciacin delblastocisto.

    Estos Medios de Cultivo son los ofrecidos por:

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    IRVINE SCIENTIFIC

    HTF Medium, requiere la adicin de suero.

    Modified HTF Medium- Hepes, requiere ser suplementado con suero.

    P1, , , , , requiere ser suplementado con suero.

    Estos tres medios tambin pueden ser adquiridos en polvo para serreconstituidos en el laboratorio. Requieren la adicin de lactato de sodioy bicarbonato de sodio. Tienen una duracin de hasta 3 aos.

    Blastocyst medium,,,,, requiere ser suplementado con suero. Generalmentese usa en conjunto con P1 como medio secuencial para la obtencin deblastocistos.

    Adems, estos mismos medios pueden ser adquiridos listos para serusados, no necesitando la adicin de ningn suplemento.

    MEDICULT

    IVF Medium, para el cultivo de ovocitos y embriones (contiene EBSS,piruvato, SSS, NaHCO3, HSA, Insulina y antibiticos).

    M3 Medium, , , , , para el cultivo de embriones de 3 a 5 das de desarrollo.(Contiene MCDB, que es una modificacin de los Medios Ham F-10 yF-12, SSS, HSA y antibiticos).

    Flushing Medium, para la aspiracin folicular, preparacin deespermatozoides y mantencin de gametos en ambiente sin CO2 (contieneEBSS, piruvato, SSS, Hepes, HSA y antibiticos).

    COOK CULTURE MEDIA

    Sydney IVF Follicle Flushing Buffer, solucin tamponada con Hepes,conteniendo aminocidos no esenciales. Este buffer es usado paraaspiracin folicular.

    Sydney IVF Oocyte Wash Buffer, solucin tamponada con Hepes,contiene aminocidos no esenciales y es usada para lavar el complejocmulo-ovocito.

    Sydney IVF Fertilization Medium, medio diseado para optimizar lastasas de fecundacin. Contiene glucosa, antioxidantes y aminocidosno esenciales.

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    Sydney IVF Cleavage Medium, , , , , este medio puede o no contenerglucosa, posee baja concentracin de fosfato para adaptarse a losrequerimientos metablicos del desarrollo embrionario desde 2 PN a8 clulas.

    Sydney IVF Blastocyst Medium, , , , , este es un medio complejo,contiene glucosa, aminocidos esenciales y no esenciales parapromover el desarrollo al estado de blastocisto.

    VITROLIFE CULTURE MEDIA

    G-MOPS, , , , , solucin tamponada con Hepes, conteniendo aminocidosno esenciales. Este buffer es usado para aspiracin folicular

    G-1, , , , , meio para del desarrollo embrionario desde 2 PN a 8 clulas.

    G-2, , , , , para cultura de embriones de 8 clulas al estado de blastocisto.

    3. METODOS DE PREPARACION Y SELECCION DE

    ESPERMATOZOIDES

    Una vez obtenida la muestra de semen, ya sea por masturbacinu otro procedimiento, se debe esperar su liquefaccin, al menos por20 minutos a 37C o por 1 hora a temperatura ambiente. Si al cabode este tiempo el semen permanece no licuado, se puede inducir sulicuefaccin hacindolo pasar por una jeringa provista de una agujaN 21, por una o ms veces. Una vez obtenida la licuefaccin, sedeben evaluar los diferentes parmetros espermticos segn criterioOMS (*). Luego se procede a la separacin de los espermatozoidesdel lquido seminal, mediante gradientes de densidad.

    En los casos en que el paciente presente antecedentes de dificultad enla obtencin del semen, se recomienda tener una muestra criopreservadacon anterioridad al procedimiento de Reproduccin Asistida.

    (*) Normalidad de los parmetros espermticos (OMS, 1999):Concentracin : 20 millones o ms por ml.Motilidad :50% o ms con motilidad A+ B.Morfologa (**) :14% o ms con morfologa normal.

    (**) No hay una definicin de valor de referencia para morfologa segn laOMS 1999. Los autores optaron por la utilizacin del Criterio Estricto deKrger (Krger et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor inin vitro fertilization. Fert. Steril. 46:1118, 1986).

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    A. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION Y MOVILIDAD

    Se colocan 5 l de semen con pipeta automtica y tips estriles enla Cmara de Makler. La muestra se evala con un microscopio invertido(40X) y se procede a la determinacin de la concentracin deespermatozoides, expresada en millones por mililitro (Nx106/mL). Lamovilidad se determina como el porcentaje de espermatozoides mvilescontados en la Cmara en funcin del total de espermatozoides presentes.Adems de determinar la movilidad total, se evala el porcentaje deespermatozoides traslativos rpidos (III); lentos (II) y mviles in situ (I).

    Concentracin: N x 106 espermatozoides /mLMovilidad: % total (% III; % II; % I) % total = %III+ %II+ %I

    Cuadrcula de la Cmara de Makler

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    Cuando la muestra de espermatozoides presenta una distribucinuniforme en la cuadrcula de la cmara de Makler y se puede contaral menos con 1 espermatozoide por cuadrado, se saca un promediode espermatozoides por cuadrado usando al menos 10 cuadrados.Luego, este valor multiplicado por 10, indicar la concentracin deespermatozoides en 106 /mL (ejemplo: las muestras consideradasnormales; promedio de espermatozoides por cuadrado: 6,concentracin: 60x106 /mL).

    Cuando la cantidad de espermatozoides presenta una distribucincomparable pero entre filas (o columnas) de la cuadrcula, se procedera sacar el promedio de espermatozoides de 10 filas o columnas y, esevalor indicar la concentracin de espermatozoides en 106 /mL (ejemplo:pacientes con muestras subnormales; promedio de espermatozoidespor fila o columna: 4, concentracin: 4x106 /mL).

    En pacientes oligozoosprmicos severos, la concentracin deespermatozoides es evaluada contando todos los espermatozoidespresentes en la cuadrcula. Esto se realiza al menos 3 veces y as sesaca un promedio. De esta forma se obtiene la concentracin deespermatozoides en 105 /mL (ejemplo: promedio de espermatozoidespor cuadrcula: 2.5, 250.000/ mL)

    En aquellos pacientes con escasos espermatozoides presentes enla Cmara, se realiza el conteo en distintos campos. El resultado seindica como N espermatozoides cada P campos contados.

    Se debe homogeneizar la suspensin de espermatozoides antesde tomar la alcuota de 5 l y proceder a su evaluacin.

    En todos los casos la suspensin de espermatozoides debecontarse sobre la Cmara de Makler previamente calentada sobreplatina trmica a 37C, de otra manera la movilidad se veraafectada, disminuyendo de manera importante y presentandomovimientos espsticos.

    Criterio de inclusin para el conteo con la Cmara de Makler: seconsidera dentro del cuadrado (o la cuadrcula) a aquellosespermatozoides que toquen los bordes superiores y derechos (oinferiores e izquierdos). As, se evita contar los espermatozoidesdos veces.

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    B. SEPARACION POR GRADIENTES DE DENSIDAD

    Para la preparacin de las gradientes se usan lquidos de alta densidadtales como, Isolate (Irvine Sc), Pure Sperm (Nidacon), Sydney IVF spermgradient (Cook). Desde Enero de 1997, los laboratorios Pharmacia handesaconsejado el uso de Percoll para la separacin de clulas humanaspor poseer efecto txico.

    Cada uno de estos lquidos se usan, generalmente, en gradientes al40% y 80% en gradientes de 45% y 90%.

    MATERIALES:

    Tubos cnicos de 15 ml de poliestireno. Gradiente de densidad (Isolate, puresperm, etc.). Medio de cultivo para lavar. Pipetas Pasteur estriles. Pipetas graduadas de 1 ml. Medio de lavado (por ejemplo: HTF modificado ms 10% SSS).

    PROCEDIMIENTODependiendo de la concentracin espermtica de la muestra, vara

    el volumen de cada gradiente. Muestra espermtica con: Ms de 6 Millones/ml se coloca 1.0 ml de cada uno de los gradientes. 0.5 a 6 Millones/ml, 0.5 ml de cada gradiente.

    Si la muestra seminal contiene una concentracin espermtica inferiora 0.5 millones/ml se sugiere emplear otra tcnica de separacin deespermatozoides, como es el Swim-out.

    PREPARACION DE LA COLUMNA CON GRADIENTES

    1. Depositar en un tubo de centrfuga 1 ml del gradiente de mayordensidad (80% 90%) y sobre ste, colocar cuidadosamente 1 mlde la gradiente de menor densidad (40% 45%), de modo que lasdiferentes gradientes se vean separadas por un menisco de interfase.

    2. Depositar suavemente sobre la gradiente de menor densidad 1 ml dela muestra de semen.

    3. Centrifugar a 300g por 15 a 20 minutos4. Retirar el semen con pipeta Pasteur y descartarla.5. Con una pipeta Pasteur nueva, aspirar el pellet formado y resuspenderlo

    en un tubo con 5 ml de medio de cultivo.

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    6. Centrifugar a 300g por 5-7 minutos. El pellet formado se puedevolver a lavar en 5 ml de medio de cultivo.

    7. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con el medio decultivo que se usar en la inseminacin.

    8. Evaluar los parmetros espermticos.9. Ajustar la concentracin de espermatozoide de acuerdo al volumen

    con que se quiere inseminar.

    C. SWIM-OUT

    Esta tcnica se usa principalmente para ICSI, cuando el volumende la muestra seminal es muy pequeo y/o la concentracinespermtica es menor a 0.5 millones/mL. La muestra seminal sediluye 1:1 con medio de cultivo y se centrifuga por 10 minutos a300g. El pellet formado se resuspende en 0.5 ml de medio. Seprepara una cpsula de Petri con gotas de 50 l de medio de cultivocubiertas con aceite mineral. En cada una de estas gotas se colocan10 l de la suspensin de espermatozoides.Se incuba por 15 o ms minutos (dependiendo de la concentraciny motilidad espermtica). Durante este tiempo los espermatozoidesmviles migran a la interfase aceite mineral-medio de cultivo desdedonde se pueden retirar con micropipetas adosadas a unmicromanipulador.

    D. CENTRIFUGACION A ALTA VELOCIDAD

    Se hacen alcuotas de la muestra en tubos Eppendorf de 1.5 c.c.(no ms de 0.5 mL de semen por tubo) y se completa con medio decultivo (Hepes-HTF adicionado con 15 % de SSS); se pasan los tubospor vortex; se centrifugan durante 5 minutos a 4800 r.p.m.; lossobrenadantes son descartados con pipeta Pasteur estril; los sedimentosson recuperados en un nico tubo Eppendorf resuspendiendo en unpequeo volumen de medio de cultivo (50-100 L de acuerdo alsedimento obtenido). Luego se evala la concentracin y movilidadde los espermatozoides recuperados colocando 5 l de esta suspensinen la Cmara de Makler o directamente colocando una pequea gotade la suspensin en la tapa de una cpsula de Petri.

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    4. RECEPCION DE OVOCITOS DURANTE LA

    ASPIRACION FOLICULAR.

    En este procedimiento se puede usar como medio de aspiracin,buffer Dulbecco (Sigma) suplementado con antibiticos, pH 7.4 y conuna osmolaridad de 280 + 5 mOsmol. No es necesaria la adicin desuero. La adicin de Heparina es opcional. Este medio puede serfcilmente preparado en el Laboratorio o bien adquirido en Sigma cat.D-5773.

    Tambin se puede utilizar medio HTF modificado sin necesidad desuplementar con suero.

    Formulacin del buffer Dulbecco:

    MATERIALES NECESARIOS PARA LA RECEPCION DE OVOCITOS

    Tubos estriles de 17 x 100 mm (Falcon 2001) Cpsulas de 60 x 15 mm (Falcon 3037) Cpsulas de 60 x 15 mm (Falcon 3002) Pipetas volumtricas de 5 10 ml. Pipetas Pasteur estriles Platina termoregulada a 37C. Medio de cultivo tamponado con Hepes y suplementado con suero

    al 7% 10%. Buffer Dulbecco suplementado con antibiticos.

    PROCEDIMIENTO DE RECEPCION DE LOS OVOCITOS ASPIRADOS

    El da anterior a la aspiracin folicular.

    El da anterior a la aspiracin folicular se recomienda dejar preparadaslas cpsulas 3037 para la recepcin de ovocitos.

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    Para esto, en el pocillo central de cada cpsula, colocar una gota de120 l de medio de cultivo tamponado con Hepes (p.ej. HTFModificado), cubrirla con 1 ml de aceite mineral y guardarlas enincubadora a 37C. No se debe usar incubadora con tensin de CO2ya que sta acidifica el medio con Hepes. Tambin se debe dejar a37C el buffer Dulbecco.

    El da de la aspiracin folicular.

    1. Despus de recibir el tubo (tubo Falcon 2001) con la aspiracindel lquido folicular desde quirfano, depositar el contenido deltubo en una o dos cpsulas de 60 x 15 mm.

    2. Revisar bajo lupa la presencia de complejos cmulo-ovocitos (CCO).

    3. Ubicado un CCO, transferirlo con ayuda de una pipeta Pasteur auna cpsula de doble pocillo. Lavarlo 2 o 3 veces en elcompartimento marginal y transferir el CCO al compartimentocentral de la cpsula. En cada una de estas cpsulas se puedenalmacenar hasta 5 CCO. Mantener las cpsulas a 37C.

    4. Antes de la inseminacin, evaluar la madurez de los CCO conobjetivo 20x del microscopio invertido y clasificarlos de acuerdoal aspecto morfolgico del cmulo y corona.

    5. CLASIFICACION DE LA MADUREZ SOMATICA

    DEL COMPLEJO CUMULO-CORONA-OVOCITO.

    La clasificacin del CCO se realiza atendiendo al:a) Tamao y filancia del cmulo.b) Grado de dispersin de las clulas del cmulo y de la corona.

    Sobre la base de estos criterios se puede evaluar la madurez los CCO yas elegir aqullos con mejores probabilidades de fecundacin y desarrollo.

    Madurez 1, o Inmaduro (M1): Cmulo pequeo o grande, conpoca filancia. Corona compacta formando una capa densa (oscura)alrededor del ovocito.

    Madurez 2, o Intermedio (M2): Cmulo grande, disperso y filante.Corona an oscura y compacta alrededor del ovocito pero con iniciode dispersin (pequeos espacios entre sus clulas).

    Madurez 3, o Maduro (M3): Cmulo grande, disperso y filante.Corona radiada caracterstica, con espacios entre las clulas en formade rayos, pudiendo observarse los lmites del ovocito. Este CCO es elque tiene mejores probabilidades de fecundacin y desarrollo.

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    Madurez 4, o Post-maduro (M4): Cmulo muy disperso, grande opequeo por fragmentacin del mismo. Muy filante y corona inexistente.El ovocito se puede observar con nitidez e identificar el primer corpsculopolar.

    Figura 4: Clasificacin de la madurez del complejo cumulo-corona-ovocito.

    6. INSEMINACION

    El nmero de espermatozoides que generalmente se usan para lafecundacin in vitro vara entre 50.000 y 100.000/ml. Sin embargo,concentraciones de 25.000 a 1.000.000/ml tambin son usadas singrandes diferencias en las tasas de fecundacin. Sin embargo lasconcentraciones ms altas aumentan el riesgo de poliespermia.

    a) INSEMINACION EN CAPSULA ABIERTA

    MATERIALES:

    Medio de cultivo de inseminacin mantenido desde el da anterior a37C y bajo tensin de CO2 al 5%.

    Cpsula de doble pocillo (Falcon 3037) Pipeta automtica para puntas de 5 a 40 l. Puntas de pipeta estriles de 200 l. Pipetas volumtricas de 1 y 5 ml. Pipetas Pasteur estriles.

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    PROCEDIMIENTO

    - Preparar cpsulas de doble pocillo, colocando 2 ml de medio decultivo en el compartimento marginal y 1 ml en el compartimentocentral. Preparar estas cpsulas al menos 3 hora antes de lainseminacin o bien dejarlas preparadas el da anterior, con lafinalidad de permitir que el medio de cultivo se equilibre a latemperatura y tensin de CO2 de la incubadora.

    - Colocar 1 2 ovocitos por cpsula para ser inseminados.- Con ayuda de una pipeta automtica, inseminar con 50.000

    100.000 espermatozoides por mL de medio de cultivo. Esconveniente que el volumen de medio conteniendo losespermatozoides no sea mayor de 10 l.

    - Tres a 4 horas post inseminacin se recomienda cambiar losovocitos a una cpsula con medio de cultivo limpio para evitarla accin de especies reactivas del oxgeno que se liberanespontneamente de los espermatozoides, especialmente de losque van muriendo. Lo mismo ocurre con las clulas del cmulusooforus. Otra alternativa, que es la tradicional, es dejar losovocitos junto a los espermatozoides por 15 a 18 horas.

    - Colocar las cpsulas de inseminacin por 15 a 18 horas en incubadoraa 37C y CO2 al 5%. Al trmino de este tiempo observar la presenciade 2 proncleos y 2 polocitos, para verificar la fecundacin.

    a) INSEMINACION BAJO ACEITE MINERAL

    MATERIALES:

    Cpsulas estriles de 35 x 10 60 x 15 mm. Medio de cultivo para inseminacin. Aceite mineral de baja densidad (0.8 g/ml), calidad embryo tested. Pipeta automtica para puntas de 5 a 40 l. Puntas de pipetas estriles. Pipetas Pasteur estriles Pipetas volumtricas estriles de 5 ml.

    PROCEDIMIENTO

    1. Bajo campana de flujo laminar, preparar las cpsulas deinseminacin con 4 gotas de lavado de 30-40 l de medio decultivo y 4 a 6 gotas de inseminacin de 20 30 l.

    2. Cubrir las gotas con aceite mineral.3. Dejar las cpsulas de inseminacin estabilizando en la incubadora

    a 37C y CO2 al 5%, por al menos 3 hora antes de la inseminacino dejarlas preparadas el da anterior.

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    4. Con ayuda de una pipeta Pasteur lavar los CCO en las gotas delavado y colocar 1 a 2 CCO por gota de inseminacin.

    5. Estabilizar en incubadora por 15 minutos.6. Inseminar con 20.000 espermatozoides en las gotas de 20 l, o con 30.000

    en las gotas de 30 l, en un volumen de no ms de 5 l.7. Dejar las cpsulas de inseminacin en incubadora por 3 a 4 horas y

    cambiar a una nueva cpsula de inseminacin o bien dejar por 15 a18 post fecundacin y luego verificar fecundacin.

    7. EVALUACION DE LA FECUNDACION.

    MATERIALES

    Mechero Pipetas Pasteur estriles Cpsulas de Petri de 35x10 de 60x15 mm. Medio de cultivo de crecimiento.

    PROCEDIMIENTO

    1. Observar los ovocitos 15 a 18 horas post-inseminacin.2. Comprobar la total dispersin de las clulas del cmulo. Si persiste el

    cmulo coagulado alrededor del ovocito, se puede liberar con ayudade 2 agujas de tuberculina a manera de microbistur.

    3. Dispersar bajo la lupa las clulas de la corona que permanecenpersistentes, adosadas al ovocito, con ayuda de una pipeta Pasteurestirada en la llama del mechero, hasta un dimetro un poco mayorque el de los ovocitos (140 + 5 m).

    4. Con la pipeta Pasteur estirada, succionar y botar repetidamente elovocito hasta que las clulas de la corona se desprendan.

    5. Constatar la fecundacin identificando la presencia de 2 PN, en elcitoplasma del ovocito y de 2 corpsculos polares en el espacioperivitelino (usar aumento 20x del microscopio invertido).

    6. Lavar por 3 veces los ovocitos fecundados y cambiarlos a una cpsulacon medio de cultivo nuevo y transferirla a una incubadora para suposterior desarrollo.

    ANORMALIDADES DE LA FECUNDACION

    Como resultado de la fecundacin in vitro, es posible encontrarcigotos con un nmero anormal de PN:

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    1. PRONUCLEO UNICO. Esta anormalidad puede deberse a:a) No desarrollo del PN paterno o materno.b) Activacin del ovocito debido a una breve exposicin a

    temperaturas por sobre 37C, o a un cambio osmtico, antesde ser inseminado. Ambos problemas pueden inducir a unaruptura precoz de los grnulos corticales provocando la reaccinde zona y la consiguiente imposibilidad de penetracinespermtica. Los cigotos con un solo proncleo pueden clivardando origen a embriones morfolgicamente normales peroinviables.

    2. POLIPLOIDIA. Formacin de 3 ms proncleos, lo cual se debe a:a) Falla en el bloqueo de la poliesperma (lo cual es frecuente en

    los ovocitos post-maduros).b) Internalizacin en el citoplasma del 2 corpsculo polar.c) Fecundacin por un espermatozoide binucleado o por la

    fecundacin de un ovocito binucleado.

    Estos cigotos pueden dar origen a embriones morfolgicamentenormales, pero no viables.

    8. DESARROLLO PREIMPLANTACIONAL IN VITRO

    El desarrollo embrionario se debe realizar bajo aceite mineral.

    MATERIALES

    Cpsulas de 35x10 mm de 60x15 mm. Aceite mineral de baja densidad, embryo tested. Pipetas Pasteur estriles, estiradas bajo llama a un dimetro de

    200 m. Medio de cultivo de crecimiento Pipetas volumtricas estriles de 5 ml. Pipetas automticas para puntas de 1 a 10 l y de 5 a 40 l. Puntas de pipetas estriles.

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    PROCEDIMIENTO

    1. Preparar, con al menos 3 horas de anticipacin, una cpsula de35x10mm, con 4 a 8 gotas de medio de cultivo de crecimiento ycubiertas con aceite mineral.

    2. Transferir 1 cigoto a cada una de las gotas de medio de cultivo, si sequiere hacer un seguimiento de desarrollo, o bien todos los cigotosa una sola gota.

    3. Dejar en incubadora a 37C y CO2 al 5% hasta el da de la transferenciade los embriones.

    9. EVALUACION DEL DESARROLLO EMBRIONARIO

    En el presente, existen dos criterios que son los ms usados para evaluarla calidad del desarrollo embrionario:

    a) La calidad embrionaria puede ser pronosticada, indirectamente, porla evaluacin morfolgica del cigoto al estado de dos proncleos.Esta clasificacin est basada en la localizacin y nmero de loscuerpos precursores de nucleolos (CPN) en los compartimentospronucleares, masculino y femenino (figura 6 a). As como tambin,la formacin de un halo en el crtex del ovocito, producto de lacontraccin de los organelos citoplasmticos alrededor de losproncleos, los que seran predictivos de la calidad embrionaria (figura6 b). Durante el desarrollo de los proncleos (PN), los CPN sonmviles y su distribucin puede cambiar desde el azar hasta alinearseen la regin de contacto de ambos PN.El patrn de polarizacin de los CPN es considerado un buen signopara el subsecuente desarrollo embrionario. Por lo tanto, la presenciaconjunta del halo con la ubicacin de los CPN, ha resultado ser uneficiente marcador positivo de embriones de buena calidad.

    Figura 6 a: Figura 6 b:Clasificacin de los ovocitos en estado de Pronucleo. Ovocito con la presencia del halo

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    Patrn 0: Con altas probabilidades de desarrollo y embarazoPatrn 1 a 3: Con malas probabilidades de desarrollo y embarazo

    b) El criterio mas usado para evaluar la calidad embrionaria, es eldescrito por L. Veeck. Este sistema toma en cuenta la presenciade fragmentos citoplasmticos anucleados y el tamao relativode los blastmeros (figura 7). Para este sistema el mejor embrines aquel que se califica en grado I, aunque tambin hay centrosen que al mejor embrin se le designa como grado IV.

    Grado I: Embrin con blastmeros de igual tamao; sin fragmentoscitoplasmticos y con citoplasma claro y homogneo.

    Grado II: Embrin con blastmeros de igual tamao y menos del30% de fragmentos citoplasmticos.

    Grado III: Embrin con blastmeros de tamaos diferentes; 0 % defragmentos citoplasmticos.

    Grado IV: Embrin con blastmeros de igual o desigual tamao;con 30% a 50% de fragmentos citoplasmticos.

    Grado V: Embrin con mas del 50% de fragmentos citoplasmticos.

    Figura 7: Evaluacin de la calidad embrionaria:

    1) Grado I; 2) Grado II; 3) Grado III; 4) Grado IV; 5) Grado V

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    10. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

    La transferencia de los embriones se puede realizar al tero o a lastrompas.

    MATERIALES

    Cpsulas de doble pocillo Medio de cultivo de transferencia Pipetas volumtricas estriles de 5 ml. Mechero. Pipetas Pasteur estriles, estiradas en la llama de un mechero hasta

    un dimetro de 200 m. Jeringas de 1 ml Catter de transferencia (para transferir a las trompas (TET): catter

    de transferencia laparoscpica).

    PROCEDIMIENTO

    1. Preparar el da anterior o con al menos 3 horas de anticipacin unacpsula de doble pocillo con medio de cultivo de transferencia.

    2. Cambiar los embriones desde la cpsula de crecimiento a la cpsulade transferencia, lavando los embriones en el compartimentomarginal y luego transferirlos al compartimento central de la cpsula.

    3. Guardar la cpsula de transferencia en la incubadora hasta el momentode la transferencia al tero o a las trompas.

    Para la transferencia:

    a) Colocar la jeringa de 1 ml al catter de transferencia.b) Transferir los embriones desde la cpsula de crecimiento a la cpsula

    de transferencia.c) Ubicar la punta del catter en el compartimento central de la cpsula

    y aspirar 10 l de medio de cultivo.d) Levantar la punta del catter y aspirar aire para formar una pequea

    burbuja.e) Volver a hundir la punta del catter en el medio y aspirar un poco de

    medio conjuntamente con los embriones (no ms de 5 l).f) Levantar la punta del catter y aspirar 10 l de medio de cultivo.

    De esta manera los embriones quedarn en un sandwich de mediode cultivo, que los proteger y asegurar su transferencia al tero oa las trompas.

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    Debido a que la transferencia de embriones al tero es unprocedimiento ciego y con gran trascendencia para el xito de lareproduccin asistida es muy importante dejar registrado si latransferencia de embriones fue:

    1. Fcil: Sin dificultad en la introduccin del catter de transferenciapor el cuello uterino, cualquiera sea el tipo de catter que se use.Al extraer el catter desde el cuello, no debe estar contaminadocon sangre.

    2. Difcil: Dificultad para introducir el catter, como por ejemplo: sifue necesario cambiar de catter, o la presencia de sangre ya seaen el conductor o gua, como en la punta del catter. Si todos oalgn embrin qued retenido en el catter y si se requiri de unsegundo o ms intentos de transferencia.

    En la actualidad, con la existencia de catteres con punta eco-refringente, la transferencia embrionaria puede ser realizada con msprecisin bajo visin ecogrfica, lo que asegura la ptima ubicacinde los embriones en la cavidad uterina.

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    INYECCION INTRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI)

    La Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (ICSI), es una tcnicade fertilizacin in vitro, introducida por G. Palermo y col. en 1992. El ICSIest indicado para parejas infrtiles por factor masculino severo, azoospermiasobstructivas y aplicable tambin a parejas infrtiles con sucesivas fallas defertilizacin in vitro. Como su nombre lo indica, el ICSI consiste en laintroduccin mecnica, con ayuda de un sistema de micromanipulacin,de un solo espermatozoide en el citoplasma de un ovocito.

    1. PREPARACIN DE LOS OVOCITOS PARA ICSI:

    TRATAMIENTO CON HIALURONIDASA.

    MATERIALES

    Hialuronidasa SIGMA tipo VII. Medio de cultivo HTF-Hepes (H-HTF) con 15 % SSS. Cpsulas Petri. Pipetas Pasteur estriles o Stripper con punta de 1 mm, 300 m, 150

    m y 120 m. Aceite mineral equilibrado y probado para cultivo de embriones.....

    PROCEDIMIENTO

    Los ovocitos se dejan estabilizar y madurar en la incubadoraaproximadamente 3-5 horas. Luego, para proceder a la eliminacin dela corona y del cmulus ooforus, se prepara una cpsula con una gotacentral de 80 UI de hialuronidasa, con varias gotas perifericas de medioHTF modificado ms 15% SSS, para realizar los lavados. Todo esto serealiza en la cmara de flujo laminar sobre la platina trmica. Se cubrencon aceite pre-equilibrado.

    Captulo 3: Fecundacin Asistida ...............................................................

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    Se utiliza microscopio estereoscpico con una platina trmica parael mismo. Los ovocitos son traspasados, desde la gota de medio decultivo hacia la de hialuronidasa, arrastrando la menor cantidad posiblede medio de cultivo con el fin de no diluir la enzima. Con la mismapipeta Pasteur se hace subir y bajar los ovocitos enrgicamente (concierta presin) para favorecer la liberacin de las clulas del cmulus yde la granulosa. Evitar la formacin de burbujas. Luego de no ms de10 segundos, se retiran los ovocitos y se colocan en una gota de H-HTF-SSS. Los capilares, que se deben seleccionar antes de comenzar apelar los ovocitos, debern ir desde un dimetro francamente mayorque el ovocito (por ejemplo 200 m) y afinndose para llegar finalmentea un dimetro no menor de 135-140 m, ya que de otra manera elovocito se rompera. Con el capilar ms grueso, se traspasan losovocitos a gotas de medio fresco (por lo menos se los hace pasar porcuatro gotas) para quitarles los restos de hialuronidasa. Luego, concapilares de dimetro menor se van limpiando hacindolos rodarcon cierta presin, contra el borde de la gota. Es importante que elovocito no se deforme al pasar por el capilar, de lo contrario es probableque posteriormente degenere.

    Todos estos pasos se realizan con un dispositivo de aspiracin ycapilares de vidrio. Tambin se puede utilizar la pipeta STRIPPER y loscapilares correspondientes.

    Una vez que los ovocitos fueron pelados correctamente se guardanen la incubadora por unos minutos para su recuperacin antes deinyectarlos.

    Se rotula la cpsula prestando especial atencin. Se evala lamadurez de los ovocitos en el microscopio invertido si no fue posiblesu clasificacin en la lupa. Se anota en la ficha correspondiente a lapaciente. Se coloca la cpsula en estufa gaseada (5 0.5 % CO2; 37 0.5 C; cmara 100% humedad) hasta el momento de la inyeccin.Como mnimo deben pasar aproximadamente 1.5-2 horas antes sesu inyeccin. Si se tratara de un caso donde la mayora de los ovocitosse encontraren en estado de Metafase I, se esperar el tiemponecesario para que stos maduren, siendo como mximo 10-12 horas.

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    CLASIFICACION OVOCITARIA

    A. SEGUN SU MADUREZ

    La clasificacin de los ovocitos se realiza con mayor precisinutilizando el microscopio invertido (40x), ya que permite evaluar posiblesdefectos citoplasmticos (grnulos, vacuolas, etc.) adems de determinarel estadio de madurez en que se hallan los mismos (figura 8).

    Figura 8

    B. SEGUN MORFOLOGIA

    En los ltimos aos han sido publicados varios trabajos quecorrelacionan positivamente la morfologa del ovocito con el desarrolloembrionario y las tasas de embarazo. Es as como tambin, el dimorfismodel ovocito se ha correlacionado con bajas tasas de implantacin a pesarde que el desarrollo embrionario es similar a los ovocitos con morfologanormal. En este contexto la citomorfologa ovocitaria es un factorimportante, especialmente en el xito de la inyeccin intracitoplasmticade espermatozoide (ICSI).

    Las principales anormalidades del ovocito se muestran en las figuras9 y 10. El origen de estas alteraciones es multifactorial y no son bienconocidas, entre la cuales se pueden mencionar la hiperestimulacinovrica con gonadotrofinas exgenas, la asincrona en la maduracinnuclear y citoplasmtica y la edad de la mujer. Sin embargo, alteracionescomo granulacin e inclusiones citoplasmticas es ms frecuenteobservarlas en ovocitos con citoplasma inmaduro; fragmentacin depolocito y espacio perivitelino amplio se han observado en ovocitos conenvejecimiento intrafolicular, y alteraciones de la zona pelcida frecuentesen mujeres mayores de 40 aos. Adems, se ha observado unaimportante incidencia de anormalidades cromosmicas relacionada conla morfologa ovocitaria.

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    ANORMALIDADES DE LA MORFOLOGIA OVOCITARIA

    Figura 9

    ANORMALIDADES DEL OVOCITO

    Figura 10

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    2. REALIZACION DE LA TECNICA DE ICSI

    MATERIALES

    Pipeta de Microinyeccin. Pipeta de sostn (holding). Solucin de PVP (polivinyl pirrolidona). Cpsula Falcon 1006. Aceite mineral equilibrado y probado para cultivo de embriones.....

    Antes de realizar el ICSI, se controla el buen funcionamiento delmicromanipulador (ausencia de burbujas, correcto nivel de aceite, etc.)y se colocan las pipetas de inyeccin y de sostn.

    La cpsula (Falcon 1006) en la cual se llevar a cabo la inyeccin delos ovocitos se prepara con gotas de 5 l de H-HTF-15 % SSS y secubren con 5 ml de aceite pre-equilibrado.

    Luego se procede a remover algunas de las gotas de medio de cultivoy se las reemplaza por Polivinilpirrolidina (PVP). Con dos gotas o tres dePVP suele ser suficiente en los casos donde se encuentran fcilmenteespermatozoides. Luego a una de las gotas de PVP se le agregaaproximadamente 1-2 l de la suspensin de los espermatozoides yaprocesados.

    Para reemplazar las microgotas de H-HTF por el PVP, PVP +espermatozoides ya procesados y espermatozoides procesados solamente,se vacan las gotitas con un tip y se las rellena con otro tip limpio, luegode haber sido cubiertas por el aceite.

    En los casos en que la muestra de espermatozoides luego deprocesada presente muy baja movilidad (5 % o menos luego de laseparacin) o una movilidad razonable (5 % o ms) pero donde todoslos espermatozoides presentan movilidad Grado I, se realizar ademsuna microgota que contenga slo medio de cultivo conteniendoespermatozoides ya procesados sin PVP.

    Se agregan, con tip, aproximadamente 3 l de la suspensinespermtica si la concentracin final es de 1x105 1x106; si laconcentracin es mayor, se sugiere diluir la muestra o colocar menorvolumen a una de las gotas que contiene el PVP y a otra que slocontiene medio de cultivo (guardar un orden para reemplazar las gotasy rotular correctamente).

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    Resumiendo, se hacen las microgotas con HTF modificado ms15% SSS, se cubren con aceite, se vacan algunas y se reemplazan porel PVP y se adicionan los espermatozoides ya procesados segnconvenga. Finalmente se colocan los ovocitos. En los casos dondecuesta mucho encontrar espermatozoides mviles, se procederprimero a buscar todos los espermatozoides necesarios y luego deencontrados, se colocaran los ovocitos en la cpsula para su inyeccin.

    Las microgotas pueden realizarse como muestra la figura 11.

    En el caso de tratarse de espermatozoides provenientes de BiopsiaTesticular o Puncin de Epiddimo, la cpsula se preparar ligeramentediferente. Se utilizarn tres gotas con PVP solo y se harn varias gotasde medio de cultivo (por ejemplo 14-16 gotas) para agregar en ellasaproximadamente 3 L de la suspensin de los espermatozoidesprovenientes de la biopsia testicular o puncin epididimaria, reservandoun nmero de gotas apropiado para luego de encontrados losespermatozoides necesarios, se coloquen en ellas los ovocitos.

    Las microgotas pueden realizarse como muestra la figura 12.

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    Los ovocitos se colocan en las microgotas de la cpsula de inyeccin(siempre controlar dos veces el nombre de la paciente, leyndolo en vozalta)

    Luego de realizada la inyeccin, los ovocitos son transferidos a lospozos libres de la cpsula de 4 pozos correspondiente a la paciente.

    Para ello se lavan primero los ovocitos en la parte central de la cpsula.Esto se realiza porque estamos cambiando de medio de cultivo (de H-HTF-SSS a HTF-SSS) y se los deja en los pozos libres. La proporcin es de5 ovocitos cada 200 l. Como el volumen de medio de cultivo en cadapozo es de 400 l, se pueden colocar hasta 10 ovocitos juntos.

    Se guarda/n la/s cpsula/s, correctamente rotulada/s, en la estufaasignada.

    Luego de aproximadamente 15-18 horas de realizado el ICSI, se verificala fertilizacin utilizando el microscopio invertido (40x) y no se cambiade cpsula ni de medio de cultivo, a menos que se quiera seguir losovocitos uno a uno para lo cual se cambian a una capsula con microgotasde 20 l bajo aceite mineral y se coloca cada ovocito en una gotaindividual.

    Se registra la informacin correspondiente a cada paciente en surespectiva ficha consignando fecha, hora, persona que realiz laobservacin y los comentarios que se crean necesarios (ovocito vacuolado,granulado, cuerpo polar fragmentado, etc.).

    En el caso de fertilizaciones anormales (3 proncleos, 1 proncleo,etc.) y ovocitos degenerados, se descartan en el momento.

    Aproximadamente a las 48 y 72 horas de la inyeccin se evala lacalidad embrionaria.

    3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE

    ESPERMATOZOIDES SEGUN SU CLASIFICACION

    De acuerdo a la Organizacin Mundial de la Salud (OMS 1999), unamuestra de semen normal presenta los siguientes parmetros: volumen:2-6 mL, concentracin 20 x 10 6 espermatozoides /mL, movilidad 50 %y morfologa segn Krger 14 % de formas normales.

    Cuando trabajamos con muestras normales, utilizamos la tcnica degradiente discontinuo como mtodo de separacin.

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    En aquellas muestras de semen consideradas por la O.M.S. comoSubnormales, la tcnica de separacin que utilizamos sergradiente discontinuo si hay buena motilidad o swim out, comose explic en el capitulo 2.

    En los casos de pacientes que presenten Criptozoospermia,procesamos la muestra de semen por centrifugacin a altavelocidad. Este mismo procedimiento lo aplicamos en los casosde Oligozoospermia severa en los cuales no se recuperanespermatozoides post-gradiente.

    Cuando se trabaja con muestras de Espermatozoides EyaculadosCriopreservadas, se las deja descongelar a temperatura ambiente.Lentamente y gota a gota, se agrega medio de cultivo en unarelacin 2:1, a la suspensin de espermatozoides. Se coloca enun tubo de centrfuga de 15 mL y se centrifuga a 1600 r.p.m.durante 5 minutos. El sedimento obtenido se resuspende en 1mL de medio de cultivo H-HTF con 15 % de SSS si se va a realizarla tcnica de ICSI o en HTF comn suplementado al 15 % de SSS,y se evala la concentracin y movilidad en Cmara de Makler.Normalmente las muestras criopreservadas presentan bajamovilidad inicial. La suspensin obtenida se siembra sobre ungradiente de densidad de 2 (95% y 45 %) o 3 (95 %, 70 % y 45 %)capas segn las caractersticas de la muestra y se procede comose explic en ese punto.

    Si se trata de Espermatozoides Criopreservados provenientes depunciones (epiddimo, testculo) o de biopsias testiculares, luegode la centrifugacin de 5 minutos, el sedimento obtenido seresuspende en un pequeo volumen (100-500 l) de H-HTFsuplementado con 15 % SSS; se observa una pequea gota de lasuspensin en el microscopio invertido y se incuba en la estufagaseada hasta su utilizacin.

    Si las muestras de semen son muy viscosas, se hacen pasar atravs de una jeringa de 1 10 c.c. con aguja de calibre 21de1 pulgadas de largo (21x1) para romper la masa viscosa yluego se evala la concentracin y movilidad. Cuando se realizaeste procedimiento, normalmente la movilidad espermtica seve afectada transitoriamente. Se la procesa segn corresponda alos parmetros seminales que presente.

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    En los casos en que el paciente presenta Retroeyaculacin, se leindica ingerir una dieta escasa en lquidos y tomar 2 cucharadassoperas de Bicarbonato de Sodio disueltas en un vaso de agua, cada8 horas, el da anterior al procedimiento. La noche anterior no debecasi ingerir lquido. A la maana siguiente debe orinar y luegomantener una relacin sexual o bien efectuar una masturbacin.Luego, deber orinar nuevamente y recoger esa orina en un recipienteestril que contiene 10 mL de Buffer Fosfato Salino de Dulbecco. Seentrega lo antes posible al laboratorio donde se la divide en alcuotasen tubos de centrfuga de 15 mL, se centrifuga por 5 minutos a1700 r.p.m. Se descarta el sobrenadante y los sedimentos obtenidosse resuspenden y se colocan en un nico tubo con medio de cultivoH-HTF 15% de SSS y se evala concentracin y movilidad final en laCmara de Makler. Siempre que sea posible, aplicar el gradientecomo mtodo de separacin evaluando, segn las caractersticas deconcentracin y movilidad, si se utiliza un gradiente de una solacapa (90%) o de dos (90% y 45%).

    En pacientes discapacitados medulares o con aneyaculacin, lamuestra de semen es obtenida por Electroestimulacin. Para ello seutiliza un electroestimulador con transductores transrectales; lamuestra de semen se recolecta en un frasco estril que contiene 5mL de Buffer Fosfato Salino de Dulbecco; una alcuota de 5 l esevaluada en la cmara de Makler y, la muestra es luego procesadapor gradientes de densidad por centrifugacin a alta velocidad segnsus caractersticas de concentracin y movilidad iniciales.El sedimento final se resuspende en medio de cultivo H-HTF 15% deSSS y se evala concentracin y movilidad final en la Cmara deMakler. Siempre que sea posible aplicar el gradiente como mtodode separacin evaluando, segn las caractersticas de concentraciny movilidad, si se utiliza un gradiente de una sola capa (90%) o dedos (90% y 45%).

    Cuando el paciente presenta Azoospermia, segn se trateAzoospermia Obstructiva o de Azoospermia No Obstructiva(Secretora), la tcnica de recuperacin de espermatozoides aplicadavara. En los casos de A. Obstructiva, se utiliza Puncin de Epiddimo,ya que es un buen mtodo por el cual se recupera gran cantidad deespermatozoides y en la mayora de los casos, un gran porcentaje delos mismos es mvil. Cuando se trata de Azoospermias Secretoras,se realizan biopsias testiculares mltiples.

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    4. PUNCION DE EPIDIDIMO

    La Puncin de Epiddimo se realiza con habn anestsico en piely tnica vaginal a nivel de la cabeza del epiddimo. Luego se procedea la puncin de dicha estructura con jeringa de 1 c.c. y aguja calibre30 (30 G) (la jeringa contiene 0.1 mL de H-HTF suplementado conSSS al 15%). Las jeringas son enviadas inmediatamente al laboratoriodonde se vaca el contenido de las mismas en una cpsula de 60x15mm y luego se hace pasar a travs de las agujas y jeringas unapequea cantidad de H-HTF adicionado al 15 % con SSS. Se verificabajo microscopio invertido la presencia de espermatozoides y lamovilidad. Se toma nota de cual epiddimo fue punzado y lascaractersticas de los espermatozoides presentes. Esta suspensin deespermatozoides se coloca con pipeta Pasteur de vidrio estril en untubo de centrfuga de 15 mL; se agrega aproximadamente 1 mL deH-HTF suplementado con SSS al 15 %; se centrifuga durante 5minutos a 1700 r.p.m. y el sedimento obtenido se resuspende en50-200 l de H-HTF suplementado al 15% con SSS (dependiendodel sedimento).

    Siempre que sea posible, aplicar el gradiente como mtodo deseparacin evaluando, segn las caractersticas de concentracin ymovilidad, si se utiliza un gradiente de una sola capa (90%) o de dos(90% y 45%).

    En el caso de no encontrar o considerar insuficiente la cantidadde espermatozoides mviles se realizan otras punciones epididimarias.

    5. BIOPSIA TESTICULAR

    La anestesia requerida para esta intervencin puede ser general,peridural o local. Una vez exteriorizados los testculos se realizanpequeas biopsias (6 7 / testculo) con el objeto de cubrir la mayorparte de la superficie de la glndula. Las muestras se lavan en solucinfisiolgica (ClNa al 0.9 % estril) e inmediatamente se colocan enun tubo de 16 mL que contiene 2 mL de H-HTF adicionado con15% de SSS. Se envan al laboratorio donde, con la ayuda de unacpsula de 60 x 15 mm y 2 portaobjetos estriles se disgrega eltejido minuciosamente. Se determina la presencia de espermatozoidesy su movilidad en el microscopio invertido. Se toma nota del ladobiopsiado y de las caractersticas de los espermatozoides presentes.Se recolecta esta suspensin con una pipeta Pasteur de vidrio estrily se coloca en un tubo de centrfuga de 15 mL; se agrega

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    aproximadamente 1 mL de H-HTF suplementado con SSS al 15 %; secentrifuga durante 5 minutos a 1700 r.p.m. y el sedimento obtenido seresuspende en 50-200 L de H-HTF suplementado al 15% con SSS(dependiendo del sedimento obtenido). En el caso de no encontrar oconsiderar insuficiente la cantidad de espermatozo