Enzymy

Izoenzymy, izoformy, makroenzymy

Enzymy w diagnostyce laboratoryjnej

Znaczenie enzymów w diagnostyce klinicznej

zmiany aktywności enzymów we krwi – odbicie zmian zachodzących w narządach

rodzaj uszkodzenia determinuje rodzaj enzymów uwalnianych z uszkodzonej

tkanki - „konstelacja zmian enzymatycznych”

uszkodzenie narządu = uszkodzenie struktur komórkowych lub zmiana przepuszczalności błon komórkowych

ucieczka enzymów

zwiększenie zmniejszenie ich ilości w płynach ustrojowych i wydalinach

spadek syntezy enzymów

Izoenzymy

enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki

produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów

różne właściwości fizyczne i chemiczne:

punkt izoelektryczny

ruchliwość elektroforetyczna

powinowactwo do substratów

wrażliwość na czyniki regulatorowe

wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mAb

niepożądanych izoenzymów

dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz.

znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można

przypisać ich aktywności enzymatycznej!

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

enzym cytoplazmatyczny, wyst. we wszystkich komórkach organizmu

katalizuje odwracalną reakcję mleczan ←→pirogronian

największa aktywność w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym

mózg, mięsień sercowy,

erytrocyty, leukocyty, płytki krwi (hemoliza ↑akt.)

nerki, wątroba, płuca

występuje 5 izoenzymów

wykrywanie:

elekroforeza (różna ruchliwość elektroforetyczna poszczególnych

izoenzymów)

dla LDH1 – reakcja z β-hydroksymaślanem (swoisty substrat) – kiedyś w

diagnostyce zawału mm sercowego

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek – tetramer

dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie:

M – typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11)

H – typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12)

geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach

w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu

wytwarzane

rożne połączenia podjednostek – 5 izoenzymów:

LDH1 – HHHH

LDH2 – HHHM

LDH3 – HHMM

LDH4 – HMMM

LDH5 – MMMM

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

w surowicy ludzkiej obecne wszystkie izoenzymy LDH

ich proporcje zmieniają się w różnych stanach chorobowych, w

zależności od tego, które izoenzymy są produkowane przez uszkodzony

narząd

u osób zdrowych - LDH2>LDH1

zawał serca, uszkodzenie mięśnie szkieletowych – LDH1>LDH2

anemia hemolityczna - ↑LDH1, ↑LDH2, LDH2>LDH1

dystrofia mięśniowa, nowotwory, ch. wątroby - ↑LDH4, ↑LDH5

(10-20x)

zawał serca z niewydolnością w krążeniu wrotnym – ↑LDH1,

↑LDH2, ↑LDH5

nasieniak najądrza – ↑ LDH1 izolowany

Izoformy enzymów

produkty tego samego genu

katalizują tę samą reakcję chemiczną

inna budowa cząsteczki enzymu na skutek:

zmian posttranslacyjnych struktury białka

fosfataza alkaliczna (ALP) – izoformy kostna i wątrobowa

degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i

osocza

kinaza kreatynowa – CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2

wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem

przeciwciał moloklonalnych

Fosfataza zasadowa (ALP)

hydrolaza – odszczepia monofosforany od reszt organicznych w środowisku silnie zasadowym (pH 10)

białko zewnętrznej błony plazmatycznej lub w kompleksach z innymi

białkami błonowymi

funkcja:

transport jonów fosforanowych przez błony

uczestniczy w interakcji między osteoblastami a macierzą

nieorganiczną

transport IgG z osocza matki do płodu (?)

występują izoenzymy, izoformy i frakcje

hemoliza, tłusty posiłek, menstruacja, doustne estogeny –

podwyższenie akt. ALP

Fosfataza zasadowa (ALP)

1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny

wyst. praktycznie w każdej tkance

cztery izoformy (glikozylacja): kostna, wątrobowa i nerkowa

izoforma kostna

uwalniana przez aktywne osteoblasty

dominuje u dzieci w okresie wzrostu

wzrost akt. w chorobach kości (osteomalacja, krzywica, osteoporoza)

wzrasta w okresie rekonwalescencji, podczas zrastania kości, po

zabiegach operacyjnych

Obecnie oznacza się masę izoformy tech. immunoenzymatycznymi

Fosfataza zasadowa (ALP)

izoforma wątrobowa

produkowana przez hepatocyty

wzrost akt. w chorobach wątroby i cholestazie

w cholestazie i przerzutowych guzach wątroby pojawać się

mogą frakcje (nawet, gdy całkowita ALP w normie)

f. żółciowa – wielonzymatyczny kompleks błonowy

f. makromolekularna – kompleks e. z lipoproteiną X

izoforma nerkowa

nie wyst. u osób zdrowych

w chorobach nerek (bez znaczenia diagnostycznego)

Fosfataza zasadowa (ALP)

1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny

2. Izoenzym jelitowy

gr. krwi O i B

produkowana przez enterocyty

wzrost w chorobach wątroby: przewlekłe zap. wątroby, marskość

(osłabione usuwanie przez wątrobę)

3. Izoenzym komórek zarodkowych

nie obecny w osoczu osób zdrowych

ektopowo w nowotworach zarodkowych, przysadki i grasicy

4. Izoenzym łożyskowy

fizjologicznie u ciężarnych, od II trymestru, zanika wkrótce po porodzie

ektopowo w nowotworach płuc, jajnika, macicy, jąder, ukł.

żołądkowo-jelitowego

Makroenzymy

enzymy występujące we krwi, które tworzą kompleksy o dużej masie cząsteczkowej poprzez:

polimeryzację

łączenie z immunoglobulinami (IgG, rzadziej IgA) lub lipidami

prawdopodobnie związane z powstawaniem autoprzeciwciał,

niekiedy u chorych z nowotworami

u 1,5 – 2,5% populacji ogólnej, najczęściej u osób starszych

dotyczy przede wszystkim amylazy i aminotransferazy asparaginowej (AspAT)

najczęściej zjawisko niezwiązane z chorobą

kiedy? - izolowana, kilkakrotnie stwierdzana podwyższona aktywność enzymu bez

objawów klinicznych lub z symptomami nietypowymi dla danej enzymopatii

duża masa cząsteczkowa → osłabiona filtracja kłębkowa → wydłużony czas

półtrwania → podwyższona aktywność

wykrywanie: strącanie makromolekuł glikolem etylenowym, HPLC, elektroforeza

Klasyfikacja enzymów

ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji

EC 1 – oksydoreduktazy

EC 2 – transferazy

EC 3 – hydrolazy

EC 4 – liazy

EC 5 – izomerazy

EC 6 – ligazy (syntetazy)

ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej

(podział kliniczny)

e. wskaźnikowe

e. sekrecyjne

e. ekskrecyjne

Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe)

enzymy wewnątrzkomórkowe

uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki –

wzrost aktywności we krwi

zawartość enzymu wskaźnikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od:

jego ilości w uszkodzonej tkance

liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia

rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów

przykłady:

kinaza kreatynowa (CK)

dehydrogenza mleczanowa (LDH)

aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)

Aminotransferaza alaninowa (AlAT, ALT)

występowanie:

cytoplazma komórek wątroby

komórki ścian cewek nerkowych

mięśnie poprzecznie prążkowane, w tym serce

w niewielkich ilościach – wszystkie tkanki (hemoliza zawyża wynik)

fizjologicznie niewielkie ilości w osoczu, pł. mózgowo-rdzeniowym, moczu

wzrost akt. w osoczu – gł. przyczyny wątrobowe

uszkodzenie wątroby (stany zapalne, gł. zakażenia HBV, HCV,

poalkoholowe, toksyczne uszkodzenia)

uszkodzenie mięśni szkieletowych (urazy, niedokrwienie, mioliza)

zawał serca

często oznacza się wraz z akt. aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)

– wskaźnik de Ritisa

Enzymy sekrecyjne

fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi

tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza

niewydolność narządu produkującego i wydzielającego

powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach

wątroby)

przykłady:

czynniki krzepniecia i fbrynolizy

esteraza cholinowa

ceruloplazmina

lipaza lipoproteinowa

Cholinoesteraza, pseudocholinoesteraza (ChE)

katalizuje hydrolizę estrów choliny do choliny i kw. tłuszczowego

acetylocholinesteraza (AchE) ukł. nerwowego i erytrocytów, rozkłada

acetylocholinę

pseudocholinoeateraza (ChE) – produkowana przez wątrobę, wydzielana do

krwi, funkcja nieznana

znaczenie diagnostyczne:

diagnostyka/monitorowanie osób narażonych na kontakt ze związkami

fosforoorganicznymi (niodwracalne inhibitory AchE)

↓ aktywności

miąższowe choroby wątroby

niedożywienie

wstrząs pourazowy

terapia promieniami X, lekami cytotoksycznymi

produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych:

śliny

światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy)

płynu nasiennego

ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania

(zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu

przykłady:

amylaza

lipaza

fosfataza zasadowa

γ-glutamylotranspeptydaza

Enzymy ekskrecyjne

α-amylaza i lipaza

enzymy ekskrecyjne

lipaza – trzustka, zoładek, jelita

α-amylaza – trzustka, ślinianki , wątroba, mięśnie, neutrofile

↑ akt. amylazy

ostre zapalenie trzustki (max. ↑ po 12 h., potem ↓ - wyczerpanie

zdolności wydzielniczej trzustki

kolka nerkowa

kolka zółciowa

perforacja wrzodu

niedrożnośc jelit

zapalenie ślinianek (izoenzym śliniankowy)

↑ akt. Lipazy

proces zapalny trustki (wyższa swoistośc narżdowa niż amylaza)

hemoliza – zaniża akt. lipazy

MAKROAMYLAZEMIA

stan nie związany z chorobą

↑ akt. we krwi bez ↑ w moczu

polimeryzowanie cz. enzymu lub łączenie się z immunoglobulinami

duże kompleksy białkowe nie przechodzą do moczu

Triacyloglicerole (hipertriglicerydemia) hamują aktywność amylazy

Amylaza w moczu

odzwierciedla akt. we krwi

monitorowanie przebiegu ostrego zapalenia trzustki

α-amylaza i lipaza

Pośrednio - aktywność

badanie przemiany chemicznej substratu katalizowanej przez dany enzym

pomiar ilości enzymu w układzie na podstawie pomiaru szybkości reakcji

w określonych warunkach szybkość reakcji jest proporcjonalna do

ilości enzymu

szybkość reakcji wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu

szybkość rekcji maleje z czasem (hamujący wpływ produktu, stopniowa

inaktywacja enzymu) → mierzona jest prędkość początkowa vo

,

dostateczni duże stężenie substratu dla wysycenia enzymu

prędkość początkową – przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu

umożliwiającej zachodzenie reakcji odwrotnej

Bezpośrednio - masa

oznaczanie ilości białka enzymatycznego met. immunochemicznymi

Oznaczanie enzymów

Badanie aktywności enzymatycznej w płynach ustrojowych

surowica/osocze mocz płyn mózgowo-rdzeniowy

aktywność w surowicy/osoczu <<< aktywność w tkankach (także w kwinkach) – surowica z hemolizą – wyniki zawyżone

białka osocza, składniki surowicy (w tym leki) mogą być aktywatorami/inhibitorami

reakcji enzymatycznych

antykoagulanty (heparyna, fluorek) – pływ +/- na akt. enzymów

izoenzymy – różne powinowactwo do substratu i maks. aktywność przy różnych

stężeniach substratu

niekiedy krótki czas, w którym obserwuje się zmiany akt. enzymatycznej związane

ze stanem chorobowym

Jednostki aktywności enzymatycznej

Katal (kat)

ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy

układ SI; [mol/s]

duża jednostka → używane mikro- , nano-, pikokatal

Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna,

międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit)

ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu (lub odpowienich

grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych

(30°C, optymalne pH, maksymalne wysycenie enzymu substratem)

1U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala

Jednostki aktywności enzymatycznej

Aktywność właściwa

liczba jednostek enzymu na 1 mg białka

określa czystość preparatu enzymatycznego

Aktywność molekularna

liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych)

przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy

optymalnym stężeniu substratu)

Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze – kat(lub U)/1 ml roztworu

Test optyczny Warburga

wykorzystuje różnice w absorpcji światła o dł. fali 340 nm między formą utlenioną a zredukowaną NAD i NADP

utenianie/redukcja NAD+/NADH → proporcjonalny spadek/wzrost

absorbancji przy 340 nm

Pierścienie purynowy i pirmidynowy

Pierścień pirydynowy w amidzie kw. nikotynowego w NADH – układ dihydropirydy

Test optyczny Warburga

ilościowa analiza dehydrogenaz zależnych od NAD+ i NADP+

lub innych enzymów o reakcjach sprzężonych z dehydrogenazami

aktywność heksokinazy proporcjonalna do wzrostu absorbancji przy 340 nm