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Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com

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RECOLECCION DE LOS EMBRIONES G. A. Palma Introducción Los embriones bovinos, destinados a un programa de TE pueden ser obtenidos del útero por medios no quirúrgicos. Su recolección y transferencia con éxito dependen de varios factores. En primer lugar de la resistencia de éstos para sobrevivir y llegar a término después de ser recolectados del tracto genital, evaluados in vitro y transferidos a un genital receptor, con cambios de medio y temperatura. En segundo lugar depende de que la técnica de obtención no ponga en peligro la integridad del tracto genital, a fin de poder repetirla tantas veces como sea deseable y conveniente. La primera técnica de recolección de embriones bovinos usada hace aproximadamente dos décadas, fue quirúrgica. La misma requería anestesia general, inducida por medio de barbitúricos y mantenida por medio de inhalación (halotano). Por medio de una incisión de 15 cm de longitud en la línea media, por delante de la glándula mamaria, se extraían los cuernos uterinos con los ovarios. El lavaje de los cuernos y oviductos se llevaba a cabo el día 5-7 introduciendo catéteres de goma a través de la pared dorsal del cuerno uterino y en la ampolla del oviducto. Cada cuerno era lavado con volúmenes variables de 40-60 ml de una solución buffer (M 199). La manipulación quirúrgica del útero y de los ovarios conduce a lesiones que provocan formación de fibrina y adherencias. Para minimizar ese efecto fue necesario trabajar con buenas condiciones de asepsia, lavando el útero y los órganos adyacentes con solución fisiológica estéril, conteniendo heparina. Con estas precauciones era posible llevar a cabo el lavaje a una vaca sólo tres veces como máximo, lo que constituye una seria limitante en el uso repetido de esta técnica. La tasa de éxito varió entre 50 y 70% de embriones y ovocitos obtenidos, en función del número de cuerpos lúteos presentes. Otra variante de la recolección quirúrgica fue el by-pass propuesto por TESTART y GODARD-SIOUR (1975), colocando la sonda a través de la pared uterina por medio de vaginotomía (Fig. l) bajo anestesia epidural.

Fig. 1: Método transvaginal (TESTARD y

GODARD SIUR, 1975) Después de la colocación, el catéter de goma era fijado por medio de un balón inflable. El útero era lavado con 50-70 ml de medio. Esta técnica permitió obtener 40-50% de embriones. Las infecciones y adherencias en los cuernos uterinos y oviductos constituyeron las desventajas que limitaron, como en el caso anterior, la repetibilidad de la recolección e impidieron su difusión en la práctica. Ello provocó uno de los mayores cambios en la técnica de transferencia de embriones de la década del `70. Aunque las

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primeras experiencias con la recolección no quirúrgica de embriones se remontan a la década del cuarenta (ROWSON y DOWLING, 1949), recién a partir del trabajo de SUGIE y col. (1972) se obtuvieron resultados satisfactorios y repetibles (SEIDEL y col., 1977). Métodos no quirúrgicos de recolección La posibilidad de colocar en la especie bovina la sonda a través de la cérvix abrió nuevas posibilidades a la recolección de embriones, simplificando el procedimiento y disminuyendo el trauma uterino. Para ello se crearon diferentes modelos de catéteres: rígidos (SUGIE y col., 1972), semirígidos (RASBECH, 1976) y flexibles (DROST, 1976; NEWCOMB y col., 1978; HAHN, 1978). Los mismos podían tener 2 vías, una para insuflar el balón de goma e inmovilizar el catéter y la segunda para inyectar y recolectar el medio. RASBECH desarrolló en 1976 un sistema semirígido de recolección, a partir de una sonda Foley de 2 vías. El volumen de aire a insuflar oscilaba entre 12-15 ml. La inyección de medio se llevaba a cabo con una jeringa de 60 ml. La sonda Foley era introducida en un tubo rígido, quedando libre el extremo anterior, a partir del balón para el aire y el extremo posterior. Los resultados obtenidos por el autor (tabla 1) indican el éxito de la técnica propuesta, que constituyó el punto de partida de los catéteres flexibles de 2 vías, empleados actualmente. Las experiencias y recomendaciones de RASBECH siguen aún vigentes. Tabla 1: Resultados obtenidos con la recolección no quirúrgica de embriones con el catéter semirígido de RASBECH (1976)

Vaca

CL (n)

Ovocitos/embriones recolectados (n)

Medio de lavaje recolectado (%)

Nr. izq. der. izq. der. izq. der.

1 7 6 7 4 86 96

2 2 3 2 3 100 100

3 9 7 7 4 100 100

4 6 3-4 5 3 100 100

Los catéteres de 3 vías permiten inyectar el medio por la segunda vía mientras la tercera conduce el líquido fuera del útero. En la actualidad se emplean catéteres rígidos y flexibles, de 2 y 3 vías, y 3 métodos de recolección (PALMA y col., 1991): Circuito cerrado con flujo continuo Circuito cerrado con flujo discontinuo Circuito abierto con flujo discontinuo Circuito cerrado con flujo continuo Con este método (ELSDEN, 1976; GREVE y col. 1977) se emplean catéteres de 3 vías, rígidos (CASSOU, 1984, Foto 1) o flexibles (BRAND y col., 1978). Una vía, destinada a la inyección del medio de lavaje, se conecta al frasco que contiene la solución por medio de una tubuladura de goma látex o silicona. La solución puede inyectarse por gravedad, colocando el frasco con el medio a aproximadamente 1 m por encima del frasco recolector o con una jeringa, con el mismo procedimiento que el método de flujo discontinuo (Fig. 2 y 3). Por la segunda vía se inyecta aire o medio para llenar el balón y por medio de una tercera vía se recolecta la solución de lavaje, sin interrumpir la descarga.

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Fig. 2: Esquema del circuito cerrado con flujo continuo adaptado de ELSDEN (1976) Circuito cerrado con flujo dicontinuo Con este método se usa el catéter de 2 vías (Foto 3, Fig. 3a), una jeringa de 50-60 ml (Fig. 3b), una válvula automática o manual (Fig. 3c), una unión de vidrio o plástico en forma de T o Y (Fig. 3d) y las tubuladuras (Fig. 3 I y II). La válvula, que se coloca a la salida del frasco (Fig 3 c), permite extraer el medio e inyectarlo en el interior del cuerno uterino. Luego de la inyección de un volumen variable de medio (30-50 ml) se interrumpe el flujo de llenado para proceder a la segunda maniobra; el cuerno es vaciado por la misma vía. Al ocluir la tubuladura de inyección (Fig. 3) la unión de vidrio en Y desvía el medio a la segunda tubuladura (Fig. 3 II) que lo conduce al frasco recolector.

Fig. 3: Esquema de circuito cerrado con flujo discontinuo (adaptado de

BRAND y HOOGEKAMP, 1986)



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Circuito abierto con flujo discontinuo Inyección y recolección con una jeringa. Esta técnica se emplea con los catéteres flexibles de 2 vías (Fotos 3, 4, 5 y 7) y no requiere de tubuladuras (Fig. 4). El medio se inyecta y recolecta por la misma vía y con la misma jeringa (50 ml). Con ésta se descarga un volumen de medio fijado por el operador (Fotos 1 y 2) quien, como en el caso anterior, debe palpar el cuerno uterino determinando y controlando su llenado a fin de evitar lesiones de la pared uterina por exceso de medio. Las maniobras siguientes variarán de acuerdo al tipo de técnica de lavaje que se aplique. Algunos operadores fijan y masajean el útero durante la inyección del medio. Esta operación es particularmente importante cuando el animal no está fijado con una elevación del tren anterior, que facilite el retorno del líquido de lavaje. Las dimensiones y peso del útero requieren que éste sea elevado por el operador. Cuando la donante es fijada con una elevación anterior algunos operadores no manipulan los cuernos uterinos, sólo verifican una vez el llenado. Luego retiran el brazo del recto y continúan con la inyección de medio hasta completar el volumen preestablecido de líquido. La recolección de los embriones en esta posición facilita el lavaje en animales con pariciones múltiples, aun cuando se emplee además el masaje de útero. Esta forma es aplicada en los Centros de TE donde ya se cuenta con la infraestructura necesaria. Presenta la ventaja que la manipulación no irrita al animal y facilita la operación. Mientras se descarga la jeringa en el frasco recolector el catéter es ocluido con una pinza hemostática o un clamp.

Fig. 4: Esquema del circuito abierto con flujo discontinuo. Inyección y recolección con una jeringa

Foto 1: Recolección por medio del sistema del sistema abierto. El operador inyecta el medio de lavaje

regulando el volumen de inyección y masajeando suavemente el cuerno uterino

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Foto 2: La recolección del medio inyectado se lleva a cabo aspirando el medio con ligera presión

negativa y elevando simultáneamente el cuerno uterino por su pared ventral Ventajas y desventajas de tres métodos de recolección Todas las técnicas, con sus diferentes modificaciones, como así también los catéteres mencionados se emplean en la práctica con el mismo éxito. Por lo tanto, las diferencias entre ellos, como así también las ventajas y desventajas observadas, no constituyen elementos de juicio excluyentes de uno u otro. El operador será el que determine, en función de su experiencia, medios e infraestructura disponible, qué técnica es la más adecuada para su modus operandi. Independientemente de esos factores, su destreza es el factor más importante en la tarea de obtener los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo (fig. 5) permite, en su concepción teórica, un lavaje más aséptico frente al método de inyección y extracción con jeringa, ya que el medio es conducido desde el útero hasta el filtro o el frasco de recolección sin solución de continuidad. Ello es particularmente importante cuando los lavajes se llevan a cabo en lugares abiertos. Sin embargo la tubuladura no es fácil de lavar y secar, lo que puede provocar en la práctica, contaminaciones bacterianas, como consecuencia de un lavado insuficiente o químicas, provocadas por un mal enjuagado o por la deposición de sustancias esterilizantes (dióxido de etileno) en los restos de humedad.

Fig. 5: Circuito cerrado de 3 vías (Cassou, IMV, Francia)



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El sistema de circuito abierto con jeringa no emplea tubuladuras y las jeringas son descartables o de fácil lavado y esterilización, razón por la cual el riesgo de falta de limpieza e insuficiente secado es mínimo. Con este sistema se debe tener siempre la precaución de obturar el catéter a fin de no perder el líquido que pueda quedar en el útero mientras la jeringa con el medio recolectado es descargada en el frasco recolector. Esta maniobra es sencilla y rápida si la donante es un animal manso y/o está bien preparado (anestesia epidural, tranquilizante etc.). Sin embargo debe repetirse entre 14 y 20 veces por animal, de acuerdo al volumen de lavaje empleado. Ello, en una vaca indócil o intranquila puede conducir a complicaciones con pérdida de medio. Los programas de TE ambulantes constituyen una limitante adicional para este método, dado que la infraestructura disponible en condiciones extensivas es muy variable y en muchos casos inadecuada para la recolección de los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo, como ya fue mencionado, facilita el lavaje por que la entrada y salida del medio se realiza en forma automática y continua, disminuyendo el tiempo de lavaje. El riesgo de pérdida de medio como consecuencia de movimientos bruscos de la donante es considerablemente menor. El sistema de circuito cerrado con catéteres rígidos (3 vías) es tan costoso que no se emplea uno por animal sino el mismo para varios lavajes sucesivos. Ello aumenta el riesgo de contaminación bacteriana siendo esa, posiblemente, la razón por la cual su uso no está extendido. Por otra parte el catéter es de acero y permanece en el cuerno uterino durante el lavaje. Su empleo es especialmente riesgoso en animales indóciles o intranquilos por peligro de lesiones de la pared uterina. La vía destinada al retorno del medio posee orificios de reducida dimensión. Para evitar que ésta pueda taparse con el mucus cervical se recomienda inyectar 10-20 ml de medio cuando el catéter atravesó la cérvix. Otra forma que además evita el pasaje del mucus cervical al útero es aspirando el mucus con una pipeta de inseminación por medio de una jeringa antes de introducir el catéter de recolección. La sonda puede también taparse con coágulos de sangre o restos de mucosa, como consecuencia de la laceración del endometrio, lo que impide el retorno del medio. En ese caso se deberá conectar una jeringa a la tubuladura de esa vía para destaparla mediante la inyección del líquido de lavaje. El circuito cerrado con flujo discontinuo tiene menos riesgos de taparse al disponer de una vía común de inyección y recolección. El catéter de doble vía que se emplea para ello dispone además de orificios considerablemente mayores. Si éstos se taparan con mucus o coágulos, la siguiente inyección de medio los liberará. Los catéteres, disponibles en el mercado, constituyen también un tema per se en cuanto a sus precios. El catéter de 3 vías de acero es el más costoso. Su precio pone en duda su empleo si el profesional destina un catéter por donante como lo dispone la Asociación Internacional de Transferencia de Embriones. Los catéteres flexibles de 2 vías, que se ofrecen específicamente para TE (Foto 3), son más accesibles que los primeros, pero constituyen una inversión de importancia de acuerdo a la cantidad que se disponga. El catéter armado a partir de una sonda Foley (Foto 4) reduce los costos sensiblemente sin disminuir el éxito de recolección con respecto a los anteriores. SUBRAMANIAN y DEVARAJAN (1991) presentaron un método "vagino-cornual" de recolección para las vaquillonas donantes cruza Bos indicus x Bos taurus. El mismo tiene como objeto mejorar la recolección de los embriones de donantes que por la edad o la raza (Bos indicus) permiten obtener tasas de éxito menores que vacas adultas y razas europeas. La colocación del catéter se lleva a cabo por medio de un by-pass a través de la pared antero-lateral de la vagina (fornix) a los cuernos uterinos (antes de la bifurcación), con una vaina rígida, que permite atravesar las paredes vaginal y uterina según el método de TERSTARD y GODARD-SIUR. La recolección se lleva a cabo con un catéter flexible. Los autores concluyen en la aplicabilidad de la técnica para el tipo de donantes descrito, acentuando la ausencia de un efecto negativo sobre la fertilidad de las mismas. Sin embargo recomiendan el entrenamiento en la práctica de la técnica antes de aplicarla en animales de valor. Queda por establecer la repetibilidad de la misma teniendo en cuenta las perforaciones de la pared uterina.

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Foto 3: Catéter flexible de 2 vías, modelo Minitüb, Alemania

Foto 4: Catéter flexible de 2 vías, armado a partir de una sonda Foley (LAMPETER, 1977)

Foto 5: Punta metálica (según LAMPETER) de un catéter flexible. Antes del lavaje debe controlarse la

integridad del balón



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Preparación de la donante, anestesia epidural La preparación del animal dependerá de varios factores, entre los que se encuentran la infraestructura disponible de acuerdo al tipo de establecimiento ganadero (producción intensiva o extensiva), la docilidad del animal como así también la destreza y experiencia del operador. Antes de la operación de lavaje es necesario vaciar el contenido rectal, precisar la posición y dimensiones del útero y la respuesta ovárica al tratamiento superovulatorio (No de cuerpos lúteos, presencia de folículos). El vaciado del recto y la toilette de la región peri anal son las primeras maniobras. Usualmente se continúa con la tranquilización y anestesia local de la donante (PETERS y BALL, 1986; MAPLETOFT, 1986). A fin de contar con una buena relajación del recto se puede aplicar anestesia epidural baja (HALL, 1974; LUMB y JONES, 1979), administrando 4-6 ml de Lidocaina (2%), en el espacio comprendido entre la primera y segunda vértebra coccígea. La cánula se coloca en una posición de 90o para atravesar la piel. Luego en un ángulo de 45o desde la piel hacia craneoventral. Cuando la aguja ingresa al canal medular circula aire en su interior, que provoca, en algunos casos, un ligero zumbido. Una prueba más segura es la aplicación de unas gotas de anestésico en la entrada de la aguja, que serán aspiradas al interior del canal vertebral, si ésta está bien colocada. Si la aguja llegase a topar una superficie ósea significa que llegó al piso de la 1o vértebra coccígea. En ese caso retirar la aguja aproximadamente 0,5 cm (WESTHUES y FRITSCH, 1960). La inyección debe aplicarse lentamente y sin resistencia alguna. El inicio del bloqueo sensitivo y motor se hace evidente por la flaccidez de la cola, por la falta de respuesta del esfínter anal y de la vulva al pellizco. A pesar que la relajación de la cola es inmediata, la acción anestésica sobre el recto y el esfínter del ano requiere 10 minutos aproximadamente. Por otra parte puede producirse un efecto anestésico incompleto, con una buena anestesia de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de los órganos de interés, causado por lo general por una incorrecta administración. En ese caso deberá suplementarse o repetirse la dosis. Es importante destacar que una insuficiente anestesia epidural puede ocasionar el fracaso del lavaje en animales indóciles. Al levantar la cola para inmovilizarla, después de la administración del anestésico, ocurre -en algunos casos- el ingreso de aire al recto. Ello constituye una seria complicación por que el mismo pierde sensibilidad y capacidad de expulsar el aire. Si este fuera el caso se recomienda hacer caminar al animal a fin de que la prensa abdominal ejerza presión sobre el recto y expulse el aire retenido. Otra alternativa es eliminar el aire por medio de aspiración con un tubo flexible (RUBIN, 1991), para lo cual se emplean una bomba aspirante de pequeño poder. Levantar y fijar la cola sólo después que el operador introdujo el brazo en el recto. La vulva y la región que la rodea deberán ser lavadas, desinfectadas (iodo povidona, alcohol 70%) y secadas. Cuando se trabaja con hembras indóciles es conveniente emplear una combinación tranquilizante y relajante de 100-200 mg de clorhidrato de ketamina y 0,5-1,5 ml de xilazina (0,1%) totales, según el peso del animal. También es posible la administración de sólo uno de ambos productos. Después de su aplicación es importante dejar a la vaca tranquila durante 10-20 minutos, a fin de que los ruidos y el contacto con el animal no perjudiquen el efecto de los medicamentos. Por esta razón el tranquilizante se aplica en general después de la rectalización y antes del resto de los preparativos (toilette perianal, anestesia epidural, materiales etc.) Previo a la introducción del catéter de lavaje se puede aspirar el mucus cervical con una pipeta de inseminación y una jeringa de 20 ml y aumentar la luz cervical con ayuda de un dilatador de acero inoxidable (foto 6). Este instrumento es, además, de utilidad para determinar el diámetro de la luz cervical a través del grado de dificultad para atravesar la cérvix. Los operadores, que adecuan diferentes modelos y/o tamaños de catéteres según el diámetro del cuello del útero, podrán determinar

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con ayuda del dilatador cual será el instrumento más adecuado para el lavaje. Si la cérvix presentó resistencia al pasaje, el dilatador se deja colocado en la luz cervical -no en el cuerpo del útero - durante 2-5 minutos. Mientras tanto se puede llevar a cabo la palpación diagnóstica del útero y los ovarios, a fin de determinar dimensión, forma, y respuesta superovulatoria (No de cuerpos lúteos y folículos), datos de importancia para el protocolo de cada donante. Algunos operadores no emplean el dilatador y otros lo hacen cuando el grado de oclusión cervical es tal que no permite la introducción del catéter de lavaje. La desventaja de esta forma de trabajo es la extracción del catéter de la vagina con el riesgo de arrastrar impurezas en el segundo intento. No es necesario esterilizar el dilatador ni el mandril, bastará con un buen lavado y posterior tratamiento con un desinfectante de superficie (alcohol etílico 70%, isopropílico 70%, etc.).

Foto 6: Dilatador cervical Colocación del catéter y lavaje del útero Antes de colocar el instrumento, éste debe ser enjuagado con la misma solución destinada el lavaje (PBS + 1% SFB). Ello contribuirá a lubricar y eliminar las impurezas que pudieran haber quedado después de una esterilización con gas (óxido de etileno). El catéter es introducido en el vestíbulo de la vulva, separando sus labios. Los catéteres de goma o silicona, a diferencia de los de acero, requieren para ello un mandril. Para atravesar la cérvix el operador debe fijarlo por delante de la punta del catéter modificando su posición hacia arriba y abajo como así también en forma lateral sucesivamente, empujando suavemente el instrumento hacia craneal simultáneamente. Al llegar al último anillo se deberá presentar el cuerno uterino, ligeramente elevado, frente a la punta del catéter. En este momento es imprescindible tener especial precaución de controlar la fuerza que se ejerce sobre el catéter, a fin de no atravesar bruscamente la cérvix y perforar la pared uterina. Cuando el instrumento alcanzó el cuerno del útero, éste último se endereza levantándolo de su cara ventral mientras se avanza el catéter muy suavemente hasta el 1/3 medio del órgano. No deberá existir resistencia alguna, si así ocurriera se debe retroceder el instrumento, presentar el cuerno uterino (estirarlo suavemente) y avanzar nuevamente. El ligamento intercornual, la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno deben ser puntos de referencia permanente del grado de avance del catéter. Una vez alcanzada la posición próxima a la deseada (por ejemplo borde del ligamento intercornual) se libera el catéter del mandril, se desplaza este último unos centímetros hacia caudal y se deslizan ambos suavemente hacia craneal, unos 5 cm. Repetir la operación un par de veces hasta comprobar una óptima colocación del catéter en el cuerno uterino. De esta forma es posible colocar el catéter sin manipular excesivamente los cuernos. Después de esta maniobra se procede a inyectar con aire el balón del catéter. El volumen de inyección varía en función del diámetro de esa porción del útero y esto depende de la edad y tamaño del animal, como así también de las pariciones previas. En general el volumen varía entre 15 y 20 ml. El operador es el que determinará, por medio de la palpación, el volumen a inyectar. Se debe tener en cuenta que su exceso produce aplastamiento de la mucosa endometrial con hemorragias, y en casos más graves, desgarro de la pared uterina. Con el catéter ya fijado, el operador deberá comprobar la correcta posición del instrumento. Si fuera necesario se retirará el aire del balón de goma y se avanzará más hacia craneal. Suele ocurrir que el operador inexperto cree fijar el catéter en un cuerno y no recolecta medio con las sucesivas inyecciones de medio. Ello ocurre cuando el instrumento fue fijado en el cuerpo del útero y el líquido fluye a ambos cuernos o si el balón desgarró la pared uterina. En ambos casos se podrá comprobar por palpación la



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ubicación del balón de goma o de la punta del catéter (si ésta es de acero, modelo LAMPETER, 1977a y b). Si el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno uterino y éste no se ingurgita al inyectar la solución significa que el exceso de aire del balón desgarró la pared uterina o que ésta fue perforada con la punta del catéter. El medio es expulsado en dirección a la cavidad abdominal, en algunos casos sólo un reducido volumen sanguinolento es recuperado. La presencia de la herida no significa que se deba renunciar al lavaje del cuerno, particularmente si se trata de embriones de gran valor. Resolver este problema requiere, sin embargo, destreza y sobre todo mucha delicadeza para trabajar con el útero perforado y no agravar la lesión. Ello constituye una seria limitante sobre todo si se tiene en cuenta que esos problemas son producto de la inexperiencia. El operador deberá decidir de acuerdo a su criterio cual será la actitud a tomar. El catéter debe ser colocado delante de la lesión, si es que su ubicación lo permite. Ello requiere buena sincronización entre el operador y su asistente. Dado que la lesión sólo puede ser determinada por crepitación en el momento de la inyección del medio de lavaje, junto con la baja o nula recuperación del líquido ya mencionadas, no es posible fijar su posición después que el balón fue desinflado. En consecuencia el operador deberá estar preparado para avanzar con el catéter cuando el asistente vacíe el balón. El instrumento deberá ser colocado por lo menos 5 cm por delante de la lesión (de acuerdo al tipo de catéter), para evitar el aumento de la lesión de la pared del útero al inflar el balón. En los casos en que el catéter no pueda avanzar más (genital muy largo o posición anterior de la lesión provocada por el extremo anterior del catéter) se recomienda renunciar a ese cuerno para evitar complicaciones de gravedad. Si la rápida evaluación indica que el catéter está bien colocado se procede a inyectar el medio de lavaje. El volumen de líquido a inyectar varía de acuerdo a la dimensión del cuerno y en función con la proximidad del catéter a la unión útero-tubárica. En consecuencia, la cantidad de medio debe ser regulada cuidadosamente por el operador, a fin de inyectar la suficiente cantidad para producir en el interior del cuerno uterino, la presión de retorno sin que su exceso provoque dolor, que intranquiliza al animal, o lesiones. El volumen a inyectar varía entonces entre 30-50 ml. El volumen total empleado para cada cuerno uterino variará según el criterio del operador entre 500, 700 (MUNAR y col., 1989) y 1000 ml (KÖNIG y ROMMEL, 1987). Este puede ser recolectado en diferentes tipos de recipientes y filtrado durante o después de la recolección. La recuperación óptima no es inferior al 90% del volumen inyectado. Algunos autores sostienen que la mayor parte de los embriones y ovocitos se obtienen después de haber recuperado 200 ml. La temperatura del medio de lavaje debe ser de 37-39o C, los frascos a tal fin deben mantenerse en baño María (foto 10). Una vez terminado el lavaje se repite la misma operación en el otro cuerno uterino. De acuerdo al grado de flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno uterino sin sacarlo del tracto genital. Para ello es conveniente retirar el catéter flexible hasta la cérvix e introducir lentamente el mandril. El modelo LAMPETER (1977, foto 4 y 7), con punta metálica (foto 5), se adecua muy bien a esta operación, por que cuando el mandril llega a la punta se produce un chasquido (LAMPETER, 1978). Catéteres muy flexibles (goma látex) son deformados por los anillos de la cérvix, lo que impide la colocación del mandril, razón por la cual es necesario sacarlos del tracto genital, al menos hasta el segundo anillo de la cérvix, para introducirles el mandril. Una exitosa maniobra de lavaje no garantiza siempre la recolección del número esperado de embriones/ovocitos en función de la cantidad de CL palpados. Las razones que motivan estas diferencias cuantitativas pueden ser variadas y no se conocen con exactitud. No siempre es posible explicarse este fenómeno a través de un mayor número de ovocitos no fertilizados, embriones retardados o degenerados que pueden quedar atrapados en el oviducto o ser reabsorbidos. La falta de experiencia puede ser una razón válida, como así también problemas de lavaje aún en grupos experimentados. La repetición del lavaje el mismo día (6-12 h después) o al día siguiente (LANDSVERK

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y col., 1991) ha dado, en algunos casos, buenos resultados para aumentar la tasa de recolección, razón por la cual debe tenerse en cuenta un segundo lavado.

Foto 7: Catéter de 2 vías con punta metálica según Lampeter, Minitub®, Alemania Formas de obtención y búsqueda de los embriones Luego del lavaje por medio de las técnicas no quirúrgicas, la aislación de los embriones de los grandes volúmenes de medio se puede hacer por medio de sedimentación o filtración del medio recuperado. Para la sedimentación de los embriones se emplean recipientes con forma de embudo y un cierre hermético en su fondo, probetas o frascos de 0,5-1,0 l. Los recipientes deben estar a una temperatura constante de 37 C ó 20 C (baño María, foto 11, o temperatura ambiente) y protegidos de la luz solar directa. La sedimentación de los embriones requiere 20-30 minutos. Cumplido este tiempo se elimina el sobrenadante por medio de un tubo flexible (tipo sondas pediátricas nasogástricas) que, por capilaridad elimina lenta y progresivamente (de arriba hacia abajo) el volumen recolectado, a fin de evitar turbulencias que hagan ascender a los embriones. El tiempo necesario para eliminar el sobrenadante varía, en función de su volumen y del tamaño de la sonda, entre 15-25 minutos. La forma y velocidad de eliminación del medio de lavaje es por goteo rápido. Para acortar el tiempo que demandan las 2 operaciones mencionadas se emplean actualmente filtros estériles con malla de acero inoxidable o plástico de 60-90 m de diámetro de poro. Estos se pueden presentar en recipientes con forma de embudo (foto 8) donde se vuelca el medio recolectado del frasco (después del lavaje) o directamente del catéter (durante el lavaje). Por medio de este último procedimiento el filtro se va vaciando por su parte inferior a medida que se llena con el medio recolectado, ahorrando de esta forma el tiempo de sedimentación, dado que los embriones quedan contenidos en el recipiente filtrante. Otros dispositivos de filtración están unidos a un tubo de silicona, se colocan en el recipiente con el medio recuperado (probetas) y eliminan el sobrenadante por capilaridad (foto 9). Los embriones quedan, de esta forma, retenidos en la probeta por medio de su malla filtrante intercambiable. La firma que los comercializa recomienda sin embargo un tiempo de sedimentación de 20 minutos. Recientemente fue presentado un nuevo filtro (Genetro, México, foto 10) que presenta la particularidad de recolectar el medio de lavaje, la filtración y la búsqueda de los embriones sin pasos intermedios. Su base plana y transparente permite retirar los embriones bajo observación microscópica con el ahorro consecuente de tiempo. El volumen de solución conteniendo los embriones (40-50 ml) se vuelca en 4-5 vidrios de reloj o en 2-3 placas de Petri (de 130 mm de diámetro) con divisiones. Para garantizar una completa observación visual de la superficie total de la placa, la búsqueda deberá hacerse en forma de guarda griega, tanto en el sentido de las abscisas como de las ordenadas (orientándose de acuerdo a la disposición de los



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cuadrados, Fig. 6). Para ello existen en el mercado placas cuadriculadas como la de la figura. El cuadriculado puede trazarse, además, en las placas plásticas con un marcador fino indeleble o una aguja hipodérmica, en la parte externa del piso como también en la tapa, colocando ésta bajo la placa durante la búsqueda.

Foto 8: Filtro plástico en forma de embudo, Em-com EE.UU. Los embriones encontrados deberán ser transportados a una placa de Petri más pequeña (3 mm) o a una placa de cuatro celdas Nunc, con medio enriquecido con suero. Esta operación deberá repetirse a fin de "lavar" los embriones antes de la transferencia o de la congelación, según lo establecido en el reglamento de la IETS.

Foto 9: Filtro plástico con malla intercambiable (Minitüb, Alemania), combinado con una probeta

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Foto 10: Filtro Malinche I (Genetro, México)

Fig. 6: Procedimiento de búsqueda de los embriones El pasaje de los embriones entre las placas se realiza con distintos tipos de tubos v capilares. Algunos microcapilares (50 µl, Unopette®) se emplean con jeringas de 1 ml (Foto 12), otros (5-20 µl) con micropipetas especiales (Transferpettor®, Foto 13) o simplemente tubos de vidrio estirados con el fuego de un mechero Bunsen. En todos los casos se deberá tomar la precaución de redondear, con la llama de un mechero, los bordes del tubo que toman contacto con el embrión, a fin de evitar lesiones de la zona pelúcida o de su masa celular. Una vez que los embriones fueron lavados se puede llevar a cabo la evaluación morfológica de los mismos.



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Foto 11: Baño María transportable

Foto 12: Capilar hecho con ayuda de un mechero Bunsen (1) y Unopette® (2) combinado con una

jeringa de 1 ml

Foto 13: Transferpettor® de 5 µl, Brand, Alemania

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Foto 14: La búsqueda y evaluación de los embriones no sólo requiere de microscopios con buenas

ópticas sino también con una buena superficie de apoyo, a fin de evitar accidentes con las placas. Microscopio Zeiss con mesa diseñada por Palma y Hoffmann (1992)

Material necesario para efectuar un lavado y seis transferencias Lavaje Dilatador cervical 1 Catéter recolección de embriones 2 Mandril 2 Jeringa 60 ml 2 20 ml 2 Clamps 2 Botella para el medio de recolección 3 Tubo de recolección del medio, con peso y adaptador 2 Filtro 2 Recipiente de vidrio 500 ml 3 Lubricante 1 l PBS 2 l Suero fetal bovino Toallas de papel Agujas 18 descartables x 11/2 6 Baño de agua con temperatura controlada portátil 1 Incubadora portátil 1 Procaína al 2% 10 ml Maleato de acepromacina 2 ml Clorhidrato de xilaxina 1 ml



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Agua destilada 20 ml Frasco estéril con tapón de goma, 20 m 1 Prostaglandina F2 1 dosis Alcohol Algodón Tijera Balde y fuentón de material plástico Etiquetas Marcadores Aislación de los embriones Lupa estereoscópica Pipetas para manipulación de embriones (Capilar, Unopette o Transferpettor®) Filtros 0,22 µm de poro, tamaño: 26 mm 2 Cajas de Petri 130 mm diámetro, 6 35 mm " 5 o vidrios de reloj 6 Jeringas descartables: 1 ml 2 5 ml 3 10 ml 2 Marcadores Etiquetas Transferencia Catéteres de transferencia 6 Vaina protectora Minipajuelas (pajillas) 0,25 ml Guantes de tacto Procaína al 2% Tijera Lubricante Toallas de papel Desinfectante Bibliografía BRAND, A. und HOOGEKAMP, P. 1982. Embryotransfer. En: GRUNERT, E. und BERCHTOLD. Fertilitätstörungen

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