thực hành pipet tốt

Thực Hành Pipet T ốt

Biotechnology Centre of Ho Chi Minh City.02 June / Athena Pham

Những lỗi dùng pipets dẫn đến các thí nghiệm không thành công!

� Mục tiêu: lây nhiễm sang chuột bằng virus Cytomegalovirus ở LD50 của 1.5 x 106 PFU- Vấn đề quan trọng là lây nhiễm với nồng độ không được quá thấp, hoặc quá cao

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 1.5 2

Leth

ality

%

Viral Dose (x10 6 PFU)

Lethal Dose Curve� Trước khi thí nghiệm, virus gốc sẽ phải

được pha loãng lần lượt 10 lần để xác định nồng độ virus.

- Đây là qúa trình chịu ảnh hưởng rất nhiều của kĩ thuật pipet

- Các lỗi dùng pipet sẽ được tích lũy

10ul 10ul 10ul 10ul 10ul

100 ul 90ul 90ul 90ul 90ul 90ul

Thử nghiệm với nồng độ vừaNồng độ quá cao: loại bỏ

3

Những lỗi dùng pipets dẫn đến các thí nghiệm không thành công!

� Những lỗi tích lũy khi dùng Pipet sẽ dẫn đến nồng độ của dung dịch gốc quá thấp hoặc quá cao so với mong đợi

� Điều này dẫn đến không đúng liều tiêm, làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

Lỗi đã tích l ũy%

+5%Hệ số lỗi

củapipet H ệ số chu ẩn

-5%Hệ số lỗi

củapipet

Lỗi đã tíchlũy %

5 105000 100000 95000 -510.25 11025 10000 9025 -9.7515.76 1157.62 1000 857.37 -14.2621.55 121.55 100 81.45 -18.5527.63 12.76 10 7.73 -22.6234.01 1.34 1 0.73 -26.49

Overestimated titer leads to under-inoculationUnderestimated titer leads to over-inoculation

BOTH lead to FAILURE

Ảnh hưởng của các lỗi dùng pipet theo ước tính

4

Evaluation and Selection

� Hướng dẫn thực hành tốt pipets giúp cải thiện tính chính xác và độ lặp lại của nhiều ứng dụng khoa học và đời sống.

- Đánh giá và lựa chọn- Kỹ thuật thao tác pipet- Hiệu chỉnh và vận hành.

5

Kế hoạch và quy trình làm việc

Ứng dụng hay thí nghiệm

Quy trình làm việc —từ mẫu ban đầu kết dữ liệu cuối cùng

Số lượng mẫu yêu cầu cho việc thiết lập dữ liệu

Định dạng cần thiết để đáp ứng

nhu cầu với hiệu quả cao

Công cụ cần thiết để đáp ứng

nhu cầu công việc

Xem xét hiệu quả/ thời gian

7

Đánh giá và lựa chọn

1. Đánh giá tính ch ất của chất lỏng :

• Chất lỏng có tính ch ất tương tự như nước

• Chất lỏng đặc bi ệt: đặc, nhớt, dễ bay hơi….

Air Displacement

Pipet thông th ường

Piston với Gioăng đệm

Điểm cuối của dung dịch lỏng

Khoảng trống không khíĐầu tip

Mẫu

Positive Displacement

Pipet piston

Dung dịch lỏng

Ống mao quảnDùng một lần

Piston seal

Piston dùng một lần

Mẫu

Không có khoảng trống không khí

8

Lựa chọn

Air Displacement Positive Displacement ( Pos-D)

9

Khuyến cáo từ Rainin 10


2. Đánh giá ph ương pháp x ử lý ch ất lỏng :

Pipet điện tử đa chức năng: pipet cơ bản, xả lặp lại, trộn, chuẩn độ, pha loãng

Pipet l ặp lại – AutoRep EElectronic dispense

Pipet l ặp lại – AutoRep SManual dispense

11

Lựa chọn cho phương pháp ELISA

+

Pipet đơn kênh

Adjustable spacerPipet đa kênh, có thể thay đổi khoảng cách giữa các kênh Pipet đa kênh

13

Tối ưu hóa các quy trình làm việc

• Thời gian ch ờ giữa các gi ếng nh ư nhau

• Hoàn thành 96 gi ếng ch ỉ trong vòng 6s

Liquidator 96

15


3. Đánh giá l ượng ch ất lỏng cần xử lý :

Macropipet : 5,10,20 mlMicropipet : 0.1- 2000ul Pipet X Controller: xử lý được lượng lớn mẫu lên đến 100ml

17


1. Đánh giá tính ch ất của chất lỏng.

2. Đánh giá ph ương pháp x ử lý ch ất lỏng.

3. Đánh giá l ượng th ể tích ch ất lỏng

18

Type of Sample solution 19

For internal use - Confidential

Lựa chọn đầu tip

Lựa chọn đúng đầu tip t ăng độ chính xác và độ lặp lại

� Thiết kế

� Chất lượng

� Phù hợp

20


Thiết kế Fine Point 21


Specialty Tip Designs

Wide Orifice: đầu tip mở rộng bề mặt tiếp xúc

Gel-loading (Gel-Well): đầu tip cho các mẫu dạng gel , dùng cho các ứng dụng giải mã AND hay tách phân tử protein

Filter tip: đầu tip chống bay hơi

Filter

Low-Retention: đầu tip chống bám dính

Extended Length: đầu tip nối dài

Shaft protection (ShaftGard): đầu tip bảo vệ thân

22

Tip Physical Quality

Orifice of high-quality tip

Orifice with flashCoaxial defect Tear defect

Some poor-quality tip problems

23

Tip Biochemical Quality 24


Đầu tip phù hợp

� Đầu tip và pipet không khít với nhau có thể làm giảm độ chính xác của kết quả pipet

� Khuyến cáo: nên sử dụng pipet và đầu tip của cùng hệ thống

25


28Kĩ thuật thao tác

28

Kỹ năng cơ bản để giảm thiểu rủi ro.

1. Tối ưu dải thể tích đo

2. Cài đặt micometer

3. Rửa đầu tips trước khi hút mẫu

4. Góc nhúng đầu tips

5. Độ sâu khi nhúng đầu tips

6. Thời gian nhúng đầu tips

7. Tốc độ hút mẫu

8. Những kỹ thuật xả mẫu

9. Những ảnh hưởng của tay khi thao tác (làm ấm pipet)

2929

� Dải thể tích quy định- 10−100% thể tích pipets

� Thể tích khuyên dùng- Thông thường 35−100% thể tích

- Dưới 35% thì phụ thuộc vào kỹ thuật cao

Sử dụng pipet phù hợp với thể tích 30

% sai số

% thể tích

10 50 100

Nếu sử dụng th ể tích d ưới 10% của pipet có th ể ảnh hưởng đến độ chính xác h ơn 3%

Độ chính xác Độ đúng

Thể tích t ối đa củaPipette % thể tích µL % µL (±) % µL (≤≤≤≤)

2 µL

100% 2.0 1.5 0.030 0.7 0.014

50% 1.0 2.7 0.027 1.3 0.013

10% 0.2 12 0.024 6 0.012

30

� Điều chỉnh quá 1/3 vòng so với thể tích mình mong muốn.

� Sau đó điều chỉnh ngược lại về thể tích cần.

� Thao tác như thể với các thể tích khác nhau, với các lần khác nhau.

Cài đặt Micrometer

Correctly setting the micrometer improves accuracy up to 0.5%.

31

Thực hi ện thao tác này có th ể giảm ảnh hưởng tới 0.5%

31

� Hút mẫu vào đầu tips và sau đó xả ngược lại hoặc xả ra cốc thải để tráng rửa đầu típ.

� Rửa trước đầu tips đảm bảo cho tất cả các phần phía trong được tiếp xúc với dung dịch. Bên cạnh đó là tráng rửa đầu tips

� Rửa trước với mẫu mình cần xả

Rửa trước đầu Tips

Rửa trước 2 lần giúp t ăng độ chính xác t ới 0.2% với những mẫu nước.

33

Bấm và nh ả pipton hai hoặc ba l ần để rửa đầu tips

Góc nhúng đầu tips (đầu côn) 35

Aspirating with the pipette perpendicular improves accuracy up to 0.5%, ultramicro up to 2.5%.

Góc nhúng sai Góc nhúng đúng

Thao tác đúng có th ể giảm ảnh hưởng độ chính xác t ới 2.5%

Độ sâu khi nhúng đầu tips 36

Thao tác đúng có th ể tăng độ chính xác t ới 1%, còn v ới ultra-micro t ới 5%.

0.1 -10 µL: 1-2 mm 10 -200 µL: 2-3 mm 200-2000 µL: 3-6 mm

Over 2000 µL: 6-10 mm

Thời gian chờ cho pipets thể tích micro

� Vẫn ngâm đầu tips trong dung dịch và đợi ít nhất 1 giây sau khi hút mẫu lên.

� Sau đó từ từ rút đầu tips ra khỏi dung dịch

� Điều này rất quan trọng đối với mẫu lượng lớn (thể tích mẫu lớn) và những mẫu nhớt cao

39

Kỹ thuật xả mẫu

� Có ba kỹ thuật:1. Xả bên cạnh ống2. Xả bên trên bề mặt3. Xả trong dung dịch

� Những điểm cần lưu ý:- Tạm dừng trước khi xả với

mẫu có độ nhớt.- Nếu xả trong dung dịch, cần

giữ piton ở vị trí stop thứ 2 cho đến khi đầu tips đượclấy ra khỏi dung dịch. Tránhlàm mẫu bị hút ngược vàopipets.

40

1 2 3

Việc xả mẫu đúng cách có th ể giảm ảnh hưởng tới 1%

42

� Sử dụng tính thống nhất (nhất quán)

- Sử dụng pipet nhịp nhàng- Áp lực lên piton phải đồng đều

- Tốc độ và êm ái

� Để nhất quán tốt nhất: Sử dụng pipet điện tử

- Sẽ đem lại tính nhất quán tối ưu

- Yêu cầu ít nhất kỹ năng của người dùng

Tính nhất quán

Hạn chế ảnh hưởng của việc làm ấm pipet khi cầm

To avoid hand warming the pipette, use a high-quality instrument and place it on a stand when not in use.

43

Để hạn ch ế ảnh hưởng làm ấm pipet khi c ầm, ta sử dụng pipet có ch ất lượng cao. Và dùng giá treo khi không s ử dụng.

Kĩ thuật pipet xuôi

44

� Load tip

� Touch off � Hold 1s

44

Pipet ngược là gì?

� Pipet ngược là quá trình bắt đầu bằng việc ấn plunger xuống vị trídừng thứ 2, do đó sẽ bao gồm thêm một lượng thể tích dư trongquá trình hút mẫu, mà không bao gồm trong lúc xả cuối.

� Pipet ngược thường được sử dụng vào việc liên quan đến mẫumáu, mẫu ngưng tụ và vật liệu có độ nhớt.

46

What is Reverse Pipetting? 47

Tổng quan các lỗi thường gặp trong pipet 48

Lỗi nhỏ là quan tr ọng hơn đối với những kỹ thu ật hi ệu chu ẩn Với người dùng nên h ạn ch ế những lỗi trung bình và l ỗi lớn..

Mức độ nghiêmtrọng Kỹ thuật

Lỗi nhỏ

<1%

� Cách cài đặt Micrometer (nếu việc lựa chọn thểtích là tối ưu.)

� Góc nhúng đầu tip

� Rửa trước đầu tip

� Cầm nắm pipet (làm ấm pipet)

Lỗi trung bình

1-5%

� Dải thể tích tối ưu

� Độ sâu nhúng đầu tip.

� Tốc độ hút mẫu (không đồng nhất)

� Kỹ thuật xả mẫu

Lỗi lớn

5-25%

� Độ ngập đầu tip / góc nghiêng (đối với ultra-micro)

� Tốc độ hút mẫu (splash-up tạo bọt khí..)

� Sử dụng pipet air displacement cho những mẫuđặc biệt (nhớt, bay hơi, nóng , lạnh..)

Trò chơi nhỏ

Ma sát nhỏ

Điểm dừng trong đầu tip

Lực ma sát lớn

LTS tip Traditional tip

Đầu Tip LTS giảm lực ấn đầu tip từ 3kg xuống còn 0.6kg

49

Tư thế thao tác

Tác động theo th ời gian có th ể ảnh hưởng cơ, gân và dây th ần kinh

50


Khuyến cáo từ Rainin

� Đầu tip được thiết kế để sử dụng 1 lần. Không nên làm sạch và tái sử dụng vì đặc tính đo lường của nó sẽ không còn đáng tin c ậy.

� Tránh lau hoặc thấm đầu tip bằng bất kỳ cách nào, thậm chí từ bên ngoài, trong khi chất lỏng đang ở bên trong đầu tip. Điều này làm cho dung dịch có xu hướng chảy ra khỏi đầu tip, dẫn đến giảm độ chính xác

� Thường xuyên kiểm tra phần đầu pipet xem còn khít với đầu tip không

51


Khuyến cáo từ Rainin

� Sử dụng găng tay để tăng độ chính xác

� Luôn treo pipet thẳng đứng trên giá để nước / khí ngưng tụ có thể chảy ra

� Luôn gắn 1 đầu tip ( với pipet 10ul hoặc nhỏ hơn) vào pipet, kể cả khi không s ử dụng để bảo vệ phần đầu pipet

� Với pipet đa kênh: sau khi hút phải kiểm tra mực chất lỏng trên tất cả các kênh

52


55Kiểm tra và hiệu chỉnh

� Module 4 & 5: Hiệu chuẩn và vận hành

� Bảo trì

� Kiểm tra định kì

� Hiệu chuẩn

56Cấu tạo pipet

56

Bảo trì pipet tại phòng thí nghiệm

Bảo trì pipet th ường xuyên t ăng t ỉ lệ Đạt khi hi ệu chu ẩn lên 25- 35%

� Vệ sinh pipet

- Kiểm tra phần shaft, piston, seals và o-rings. Vệ sinh bằng dung dịch de-ion, lau khô toàn bộ bên trong và bên ngoài

- Loại bỏ các chất nhiễm bẩn lo ngại như DNA và RNAse, bằng các nhiều giải pháp kể cả dung dịch 10% thuốc tẩy hoặc RNAse Zap.

- Tránh làm sạch bằng các dung môi có tính ăn mòn

� Khuy ến cáo :

- Dù không có nứt gãy vẫn nên thay thế o-ring hàng năm

- Hiệu chuẩn là không cần thiết nếu pipet được bảo trì thường xuyên, ngoại trừ trường hợp thay thế piston ( bởi nhà cung cấp)

57


58

Có 2 phương pháp kiểm tra pipet :

�Gravimetric Quick Check : cân khối lượng

�Leak testing: kiểm tra rò rỉ

Kiểm tra định kì

58

Verification results specify whether calibration is necessary.Kết qu ả sẽ xác định xem vi ệc hi ệu chu ẩn có c ần thi ết hay không

59Tỉ lệ hiệu chuẩn

Khuyến cáo:

� Kiểm tra định kì hàng ngày/ tuần/ tháng/ quý tùy theo nhu cầu để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm

� Hiệu chuẩn tại phòng thí nghiệm của bạn để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của pipet

Accuracy và Precision

Độ chính xác- Accuracy

độ chính xác là lượng sai khác giữa giá trịtrung bình của rất nhiều phép thử với giá trịdanh nghĩa. Một kết quả đo được gọi làchính xác khi nó gần với giá trị đúng.

Độ đúng (độ lăp lại)- Precision

là sự đánh giá bằng số của sự thay đổicủa một số phép đo lặp lại như- độ lệchchuẩn hay hệ số biến thiên.

63


Thông số kĩ thuật của pipet

Data from manufacturers specifications: this data can vary dependent on the user technique and many other factors

Độ chính xácAccuracy

Độ đúngPrecision

Thể tích t ối đa % thể tích µL % µL (±) % µL (≤≤≤≤)

2 µL

100% 2.0 1.5 0.030 0.7 0.014

50% 1.0 2.7 0.027 1.3 0.013

10% 0.2 12 0.024 6 0.012

10 µL

100% 10 1 0.1 0.4 0.04

50% 5 1.5 0.075 0.6 0.03

10% 1 2.5 0.025 1.2 0.12

20 µL

100% 20 1 0.2 0.3 0.06

50% 10 1.5 0.15 0.5 0.05

10% 2 7.5 0.15 2 0.04

100 µL

100% 100 0.8 0.8 0.15 0.15

50% 50 0.8 0.4 0.24 0.12

10% 10 3.5 0.35 1 0.1

200 µL

100% 200 0.8 1.6 0.15 0.3

50% 100 0.8 0.8 0.25 0.25

10% 20 2.5 0.5 1 0.2

64

Thông số kĩ thuật của nhà sản xuất và ISO 8655

ISO 8655

� Với các nhà cung cấp : là cơ sở cho việc kiểm soát chất lượng và công bố chất lượng của nhà cung cấp

� Với các cơ quan kiểm tra : là cơ sở để cấp một chứng chỉ độc lập

� Với người sử dụng : cho phép kiểm tra định kì chính xác

65


Hiệu chuẩn

� Tiêu chuẩn đánh giá : ISO 8655

� Tiêu chuẩn môi trường

� Nhiệt độ: [± 0,5 ° C], 15-30 ° C

� Độ ẩm tương đối - ˃50%

� Gió - ~ 0

� Tỉ lệ bay hơi - ~ 0

� Rung - ~ 0

� Độ cao - ~ 0

66


67Tiêu chuẩn cân dùng để hiệu chuẩn

68Cân và các thiết bị hiệu chuẩn pipet

Pipette calibration

MCP2-5

MCP1-S

XP26PC

Phần mềm hi ệu chuẩn

XP Analytical & XP Micro + evaporation trap

Weighing table

SAG-P +evaporation trap AX + evaporation trap

thực hành pipet tốt

Documents