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Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe - Innenstadt
Ludwigs-Maximilians-Universität München
Direktor: Prof. Dr. med. K. Friese
Untersuchungen zur Expression von Interleukin-15 an der feto-maternalen Grenzzone und seine Bedeutung für
vermehrte Aborte
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der medizinischen Fakultät der Ludwigs-Maximilians-Universität München
vorgelegt von
Thomas Haufe
aus Wasserburg a. Inn
-2011-
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Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. Udo Jeschke
Mitbereichterstatter: Prof. Dr. Andreas Holzinger
PD Dr. Albrecht Bergner
Mitbetreuung duch den
promovierten Mitarbeiter: PD Dr. Bettina Toth
Dekan: Prof. Dr. med. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR
Tag der mündlichen Prüfung 13.10.2011
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Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das maternale Immunsystem während der Schwangerschaft 1 1.2 Definition und Epidemiologie des Aborts 2 1.3 Das Interleukin-15 6 1.4 Das Th1/Th2 Paradigma und die T-Zellen 11 1.5 Die natürlichen Killerzellen 13 1.6 Die Trophoblasten und die Ausbildung des feto-plazentaren Kreislaufs 16 2 Fragestellung 20 3 Material und Methoden 3.1 PCR Versuchsteil 3.1.1 RNA-Isolierung 21 3.1.2 DNAse Verdau und Transkription in cDNA 23 3.1.3 Real Time RT-PCR 26 3.1.4 Quantitative RT PCR 27 3.2 Immunhistochemischer Versuchsteil 3.2.1 Aufbereitung für die immunistochemische Färbung 28 3.2.2 Die Immunhistochemische Färbung 29 3.2.3 Durchführung der Immunhistochemischen Färbung 29 3.2.4 Auswertung der Immunhistochemischen Färbung 34 3.2.5 Die Immunfluoreszenz-Doppelfärbung 35 3.2.6 Durchführung der Immunfluoreszenz-Doppelfärbung 36 3.3 Statistik 38 4 Ergebnisse 4.1 RT2 Profiler PCR Array 39 4.2 Immunhistochemie 39 4.2.1 Extavillöse Trophoblasten 39 4.2.2 Synzytiothrophoblasten 42 4.3 Real Time RT-PCR 44 4.4 Immunfluoreszenz Doppelfärbung 44 5 Diskussion 5.1 IL-15 im Wandel der Zeit 46 5.2 IL-15 als ein Modulator und Stimulator des Th1 Systems 48 5.3 Die erhöhte IL-15 Expression als Selbstschutz der Trophoblasten 51 5.4 IL-15 und sein Einfluss auf die NK-Zellen in Bezug auf Aborte 54 6 Therapeutische Ansätze 58 7 Zusammenfassung 63 8 Anhang 64 9 Literaturverzeichnis 69 10 Danksagung 77 11 Curriculum Vitae 78 12 Publikation
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Abkürzungsverzeichnis ___________________________________________________________________
Abkürzungsverzeichnis AK Antikörper
Aqua dest. destilliertes Wasser
C Celsius
CD Cluster of differentiation
cDNA komplementäre DNA
CK Cytokeratin
CT Treshhold Cycle (Schwellenwertzyklus)
DAB 3,3-Diaminobenzidin
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamentetraacetat
et al. und andere (Et alii)
EVT Extravillöser Trophoblast
Fa. Firma
g/dL Gramm / Deziliter
HLA Human Leukocyte Antigen
G-CSF Granulozyten colony-stimulating factor
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen colony-stimulating factor
hCG humanes Choriongonadotropin
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
GvHD Graft versus Host Deseas
Ig Immunglobulin
IFN Interferon
IL Interleukin
IRS Immunoreaktiver Score nach Stegner
IT intermediärer Trophoblast
JAK Janus Kinase
kDa Kilo Dalton
L Liter
min Minute
MHC Major Histocompatibility Complex
µL Mikroliter
mRNA messenger RNA
mU/ml Milliunits / Milliliter
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Abkürzungsverzeichnis ___________________________________________________________________
Na Natrium
NK-Zellen natürliche Killerzellen
p.c. post conceptionem
PBS phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)
PCOS polyzystisches Ovarialsyndrom
PCR Polymerasekettenreaktion
pH Potentia hydrogenii
-R Rezeptor
RNA Ribonukleinsäure
RSA rezidivierender spontaner Abort
RT Raumtemperatur
SA Spontanabort
SSW Schwangerschaftswoche
STAT signal transducers and activators of transcription
ST Syncytiotrophoblast
Th T-Helferzelle
TNF Tumor Nekrose Faktor
uNK-Zellen Uterine Natürliche Killer Zellen
VT Villöser Trophoblast
WHO World Health Organization
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Einleitung ___________________________________________________________________
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1. Einleitung Der Verlust einer Schwangerschaft durch eine Fehlgeburt ist ein sehr
schmerzliches und gravierendes Ereignis. Besonders tragisch und belastend für die
Eltern sind wiederholte Implantationsversagen, bei denen es zwar jeweils zu einer
Befruchtung der Eizelle kommt, die Schwangerschaft dann jedoch wiederholt in
einem Abort abgeht. Die medizinischen Fortschritte in den letzten Jahrzehnten
erlauben eine zunehmend bessere Aufklärung der Ursachen und basierend auf
diesen Erkentnissen in manchen Fällen sogar eine rationelle Therapie. Aber auch
heute noch kann etwa die Hälfte aller habituellen Aborte ätiologisch nicht geklärt
werden. In letzter Zeit treten jedoch zunehmend immunologische Aspekte der
Schwangerschaft bei der Ursachenforschung dieser ungeklärten habituellen Aborte
in den Vordergrund.
1.1 Das maternale Immunsystem während der Schwangerschaft Die erfolgreiche Implantation stellt eine der Grundvoraussetzungen für die
Reproduktion einer Spezies dar (van Mourik, Macklon et al. 2009). Anhand der
hohen Spontanabortraten der befruchteten Blastozyste von bis zu 75% (Hatasaka,
Varner et al. 1994) und somit fehlgeschlagener potentieller Schwangerschaften
lässt sich bereits erahnen, dass es sich hierbei um einen sehr komplexen und
schwierigen Prozess handelt, bei dem das Zusammenspiel und eine strenge
Regulation vieler verschiedener mechanischer und biochemischer Vorgänge
zwischen dem maternalen und fetalen Organismus notwendig ist. Das mütterliche
Immunsystem nimmt hierbei eine zentrale Rolle ein. Es steht vor der schwierigen
Aufgabe einen semi-allogenen eigentlich “feindlichen“ Organismus, der halb
väterliche, halb mütterliche Antigene trägt, zu akzeptieren und eine
immunologische Toleranz gegenüber diesem zu etablieren (van Mourik, Macklon et
al. 2009). Bei diesem Prozess handelt es sich tatsächlich um eine „aktive“ Toleranz
gegenüber dem semi-allogenen Fötus durch das maternale Immunsystem. So
konnten Thellin et al. die These, dass bei schwangeren Frauen eine
Immunsuppression besteht, widerlegen (Thellin, Coumans et al. 2000). Der
maternale Organismus ist sogar an Vorgängen wie der Adhäsion, Invasion und
Implantation der Blastozyste sowie der weiteren Entwicklung der Schwangerschaft
aktiv mitbeteiligt. Am Anfang sind die Adhäsionsmoleküle und bestimmte Klassen
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von MHC Molekülen von Bedeutung. Diese stellen eine primäre Verbindung
zwischen der Blastozyste und dem maternalen Endometrium her. Im weiteren
Verlauf der Implantation tritt das Zusammenspiel des maternalen Immunsystems
und der fetalen Trophoblasten in den Vordergrund (van Mourik, Macklon et al.
2009).
Bereits vom Beginn der Schwangerschaft an herrscht an der feto-maternalen
Grenzzone eine dichte Infiltration von maternalen Immunzellen, wie beispielsweise
Populationen von T-Zellen, aber auch den uterinen natürlichen Killer-Zellen (uNK-
Zellen). Von fetaler Seite her sind die trophoblastären Zellen von großer
Bedeutung. Diese bilden die Plazenta und stehen im direkten Kontakt mit den
mütterlichen Immunzellen. Aufgrund dieser trophoblastären Ummantelung des
Fötus, die häufig mit einer Art Kokkon verglichen wird, kommt der Fötus selbst
niemals in unmittelbare Berührung mit dem mütterlichen Blut und folglich auch nicht
mit den maternalen Immunzellen. Die Etablierung der immunologischen Toleranz
spielt sich folglich vornehmlich zwischen dem maternalen Immunsystem und den
fetalen trophoblastären Zellen ab. Für eine erfolgreiche Schwangerschaft ist jedoch
mehr von Nöten, als eine einfache Toleranz des „fremden semi-allogenen
Organismus“ durch das maternale Immunsystem, vielmehr ist es von
herausragender Bedeutung, dass sich eine aktive immunologischen
Kommunikation zwischen der Mutter und dem sich entwickelnden Kind etabliert
(van Mourik, Macklon et al. 2009).
In der folgenden Arbeit werden Aspekte dieser immunologische Kommunikation an
der feto-maternalen Grenzzone erläutert und deren fehlregulierte Etablierung in
einen Kontext mit bisher ungeklärten rezidivierenden Aborten gestellt.
1.2 Definition und Epidemiologie des Aborts Definition Als Abort wird eine Schwangerschaft definiert, welche vor dem Erreichen der Lebensfähigkeit des Kindes zum Ende kommt. Die Grenze liegt
heute bei der 24. Schwangerschaftswoche (SSW) bzw. 500g Geburtsgewicht.
Innerhalb der Aborte wird der Frühabort (bis zur 13. SSW) von dem Spätabort
(nach der 13. SSW) unterschieden (Kiechle 2007). Grundsätzlich werden
Fehlgeburten aus natürlicher Ursache als Spontanaborte bezeichnet und von
artifiziellen Aborten, der vorsätzlichen Beendigung einer Schwangerschaft mit
medikamentöser, chemischer oder anderer Unterstützung
(Schwangerschaftsabbruch), unterschieden.
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Des Weiteren können verschiedene Formen des Aborts unterschieden werden, die
v.a. klinische Relevanz haben. Als Abortus imminens (drohender Abort) bezeichnet
man ein Abortgeschehen, bei dem der Zervikalkanal noch geschlossen und die
Gravidität intakt ist. Es kommt allerdings zu vaginalen Blutungen. Dagegen ist beim
Abortus incipiens (in Gang befindlicher Abort) der Zervikalkanal bereits geöffnet
(Griebel, Halvorsen et al. 2005). Der Abortus incompletus beschreibt die
Ausstoßung von manchen, aber nicht allen, Teilen des Schwangerschaftproduktes
(Chen, Creinin et al. 2007). Der Abortus completus tritt meist in fortgeschrittener
Schwangerschaft auf, die dann schon entwickelte Plazenta wird deshalb meistens
vollständig ausgestoßen (Stauber et al. 2005). Die sogenannte missed abortion ist
definiert als nicht lebensfähige Schwangerschaft, die nach dem Ableben im Uterus
verblieben ist, ohne dass sie ausgestoßen wurde (Griebel, Halvorsen et al. 2005).
Definitionen und Einteilung
Abortus completus (kompletter Abort):
Alle Schwangerschaftsprodukte wurden ausgestoßen ohne nötige chirurgische oder medizinische Intervention
Abortus incompletus (inkompletter Abort):
Einige, aber nicht alle Schwangerschaftsprodukte wurden ausgestoßen; verbliebene Produkte können Teile des Fötus sein, der Plazenta oder der Eihäute
Abortus imminens (drohender Abort):
Eine Schwangerschaft mit Blutungskomplikation bei geschlosssenem Zervikalkanal
Abortus incipiens (beginnender Abort):
Der Muttermund ist geöffnet, aber die Schwangerschaftsprodukte verbleiben noch in der Gebärmutter
Missed abortion (verhaltender Abort):
Schwangerschaft mit fetalem Absterben (meist schon vor Wochen) aber keiner uterinen Aktivität, die zum Ausstoß führt
RSA (Recurrent spontaneous abortion):
Drei oder mehr aufeinanderfolgende Fehlgeburten
Septischer Abort: Ein Spontanabort kompliziert durch eine uterine Infektion
Tabelle 1 Definition Abort modifiziert nach Griebel, 2005
Epidemiologie Die Zahl der spontanen Fehlgeburten kann lediglich geschätzt werden, da sie in den ersten Schwangerschaftswochen oft subklinisch verlaufen,
d.h. als Unregelmäßigkeit des Menstruationszyklus fehlinterpretiert werden. Es wird
angenommen, dass in der Gruppe der 20–29-jährigen Frauen 40–70% der
befruchteten Eizellen spontan zu Grunde gehen. Klinisch werden aus den
genannten Gründen davon jedoch nur etwa 15% als Fehlgeburten erkannt. Etwa
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30% der Frauen sind in ihrem Leben von einer oder mehreren Fehlgeburten
betroffen (Bulletti, Flamigni et al. 1996).
Abortus habitualis Ein Abortus habitualis oder auch rezidivierender spontaner Abort (RSA) wird von der WHO als ein mindestens 3-maliger Abort vor Ende der
20. SSW mit erhöhtem Rezidivrisiko definiert (Griebel, Halvorsen et al. 2005). Die
Prävalenz für einen rezidivierenden Abort liegt auf alle Schwangerschaften
bezogen bei nur etwa 0,4 bis 1,0% (Hatasaka et al. 1994). Auch wenn dies ein sehr
geringer Prozentsatz ist und es sich nur um ein begrenztes Patientenkollektiv
handelt, stellen habituelle Aborte für die einzelne Patientin oft eine große
psychische Belastung dar. Bei einem Drittel der betroffenen Frauen kommt es zu
einer klinisch signifikanten Depression (Craig, Tata et al. 2002).
Das Risiko, nach einem einzelnen Spontanabort die folgende Schwangerschaft
erneut zu verlieren, beträgt ca. 10%. Mit jeder weiteren missglückten
Schwangerschaft steigt das Risiko für erneute Schwangerschaftsverluste an. Nach
zwei aufeinander folgenden Fehlgeburten wird von Abortraten von 24% berichtet,
nach drei aufeinanderfolgenden Aborten 30% und nach vier erlittenen Fehlgeburten
wird das Abortrisiko auf ca. 40% geschätzt (Baek, Lee et al. 2007).
Ursachen Gründe für einen Abort sind meist chromosomale Anomalien, welche vor allem mit steigendem mütterlichen Alter häufiger auftreten (Toth, Lok et al.
2007). Dies wird für die Medizin immer wichtiger, da die Bevölkerung immer älter
wird und auch immer später Familien gegründet werden. In den USA stieg die
Geburtenrate bei Frauen zwischen 35 und 39 Jahren von 19,0% im Jahre 1976 auf
37,4 im Jahre 1998 an (Ventura, Taffel et al. 1988) (Guyer, Hoyert et al. 1999).
Eine ähnliche Tendenz zeigt sich auch in Deutschland. Waren 1982 nur 7% der
Mütter über 35 Jahre alt, sind es heute bereits 27% (Kiechle 2007). Doch auch bei
Frauen unter 25 Jahren besteht ein gesteigertes Abortrisiko, das niedrigste Risiko
zeigt demnach die Altersgruppe von 25-30 Jahren (Gracia, Sammel et al. 2005).
Dass besonders das erste Trimenon eine sehr kritische Phase für den Embryo
darstellt, wird duch die folgende Graphik verdeutlicht.
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Abbildung 1 Fehlgeburtenrate bezogen auf die SSW (Tien, Tan et al. 2007)
Die wesentlichen Risikofaktoren im ersten Trimenon sind chromosomale
Aberrationen, die etwa 50-60% der Fehlgeburten ausmachen. Weiter Faktoren sind
maternale Erkrankungen wie z.B. ein unkontrollierter Diabetes mellitus,
endokrinologische Erkrankungen, wie die Hyper- und Hypothyreosen sowie das
PCO-Syndrom, das Antiphospholipidsyndrom, psychologische Faktoren,
Endometriose, Nikotin, Alkohol und andere Drogen. Nach dem ersten Trimenon
treten dann anatomische Pathologien des Uterus oder der Zervix,
Plazentainsuffizienz, Infektionen, Traumata, Thrombophilien, wie die Faktor-V-
Leiden-Mutation, die Prothrombin-Mutation und ein Protein-S-Mangel in den
Vordergrund. Jedoch können auch heute noch nur etwa 50% der rezidivierenden
Aborte mit den hier benannten prädipositionierenden Faktoren erklärt werden; 50%
bleiben bisher ungeklärt (Carrington, Sacks et al. 2005). In letzter Zeit werden
jedoch zunehmend immunologische Gründe als eine der Hauptursachen für
rezidivierende Aborte erkannt.
Hierbei unterscheidet man die autoimmunologischen Faktoren und die
alloimmunologischen Faktoren. Unter autoimmunologischen Faktoren versteht man
z.B. die Prävalenz von positiven Antikardiolipin-Antikörpen im Rahmen des schon
genannten Antiphospholipid-Syndroms. Diese sind häufig mit einer
Präeklampsie/HELLP-Syndrom oder einer schwere Plazentainsuffizienz assoziiert.
Unter den alloimmunologischen Faktoren versteht man die fehlgesteuerte
immunologische Kommunikation zwischen der Mutter und dem sich entwickelnden
SSW
Pros
pekt
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Ferh
lgeb
urte
nrat
e (%
)
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Feten bzw. den extraembryonalen Membranen, der fetomaternalen Grenzzone,
(Tien and Tan 2007, AWMF).
Diese Alloimmunologie der Schwangerschaft ist der zentrale Bestandteil dieser
Arbeit.
1.3 Das Interleukin-15 Interleukine sind körpereigene Substanzen, die von verschiedenen Zellen des
Immunsystems im Rahmen der angeborenen und spezifischen Immunantwort
freigesetzt werden. Ihnen kommen dabei entscheidende Funktionen in der
Steuerung von Zellfunktionen, insbesondere von Entzündungsreaktionen und deren
Mediation zu. Man kann zwischen Interleukinen mit primär proinflammatorischer
und solchen mit anti-inflammatorischer Wirkung unterscheiden. Ihre Wirkung wird
durch Bindung an entsprechende Rezeptoren auf der Oberfläche von Zielzellen
vermittelt. Die Rezeptorbindung ist dabei hochspezifisch. Interleukine werden unter
physiologischen Bedingungen meist nur bei Bedarf produziert bzw. freigesetzt. Sie
besitzen eine kurze Halbwertszeit und eine geringe Reichweite im Organismus.
Das 1994 entdeckte IL-15 ist ein aus 4 α-Helices aufgebautes Zytokin, das beim
Menschen auf Chromosom 4q31 lokalisiert ist. Es gehört damit zu einer großen
Zytokinfamilie, zu der nicht nur Interleukine wie IL-2, IL-3, IL-4, IL-6 and IL-21,
sondern auch Wachstumsfaktoren wie der Granulozyten-Makrophagen colony-
stimulating factor (GM-CSF), der Granulozyten colony-stimulating factor (G-CSF),
Erythropoietin und klassische Hormone, wie der humane Wachstumsfaktor und
Prolaktin gehören (Budagian, Bulanova et al. 2006). Die Produktion von aktiven IL-
15 ist posttraskriptionell reguliert (Waldmann, Tagaya et al. 1998). Es ist eng
verwandt mit dem IL-2. Der IL-15-und IL-2-Rezeptor, Transmebranproteine der
Klasse I, besitzen die gleichen β-und γ-Ketten, unterscheiden sich jedoch in einer
jeweils spezifischen α-Ketten. Zu seiner spezifischen α-Kette bindet IL-15 mit einer
hohen Affinität, selbst wenn die IL-2β-und γc-Rezeptorenkette fehlen (Giri, Ahdieh
et al. 1994).
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Abbildung 2 Rezeptorweg IL-15/IL-2 (eigene Zeichnung)
Die Signalweiterleitung im IL-15/IL-15-Rezeptor System erfolgt vorwiegend über die
Induktion von JAK Kinasen, sowie der Phosphorylierung und Aktivierung von den
Transkriptionsfaktoren STAT3, STAT5, und STAT6. Außerdem spielen die
Phosphorylierung zyotoplasmatische Thyrosinkinasen der Src-Familie und die
Aktivierung von weiteren Transkriptionsfaktoren eine Rolle. Jedoch scheinen noch
weitere Formen der IL-15 Signalvermittlung zu existieren. So konnte gezeigt
werden, dass IL-15 auch in membrangebundener Form existiert und somit Signale
zusätzlich juxtakrine vermittelt werden können (Budagian, Bulanova et al. 2006).
IL-15 besitzt weitreichende regulatorische Einflüsse auf verschiedene Zellen des
angeborenen und des erworbenen Immunsystems (Lin, Cheng et al. 2006). So hat
es beispielsweise Einfluss auf das Überleben, die Proliferation und die
Differenzierung von T-Zellen. Hier sind die Signalwege überwiegend über eine
Aktivierung der Jak1/3 und STAT3/5 vermittelt (Kovanen, Leonard et al. 2004).
Studien mit IL-15 und IL-15-Rezeptor knock out Mäusen (IL-15-/-) konnten eine
Regulierung besonders von den CD8+ T-Zellen durch IL-15 darlegen. Die IL-15-/-
Mäuse zeichneten sich hierbei durch eine verminderte Anzahl von naiven CD8+ T-
Zellen, mit reduzierten Proliferationspotential und ein fast vollständiges Fehlen von
CD8+ T-Gedächtniszellen aus. IL-15 scheint einen entscheidenden Einfluss auf die
Homeostase von naiven CD8+ T-Zellen, Effektor T-Zellen und CD8+ T-
Gedächtniszellen zu haben (Lodolce, Boone et al. 1998) (Kennedy, Glaccum et al.
2000). Diese Erkenntnis wird durch die hohe Expression der IL-15
Rezeptoruntereinheiten IL-2Rβ (CD122) und IL-15Rα auf den T-Gedächtniszellen
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unterstützt (Rochman, Spolski et al. 2009). Obwohl der proliferative Effekt auf CD4+
T-Zellen begrenzter zu sein scheint, führt eine experimentelle Verminderung der
CD8+ T-Zellen jedoch zu einem verbesserten Ansprechen der CD4+ T-Zellen auf IL-
15 (Purton, Tan et al. 2007).
Außerdem hat IL-15 weitreichende antiapoptotische Fähigkeiten (Bulfone-Paus,
Ungureanu et al. 1997). So ließ sich am Mausmodell nachweisen, dass IL-15 über
STAT6 zu einer erhöhten Expression des Apoptoseinhibitors BCL2L1/BCL-x(L)
führt und somit antiapoptotisches Potential besitzt (Masuda, Matsuguchi et al.
2001). Des Weiteren übt IL-15 indirekte Einflüsse, vermittelt durch autokrine und
parakrine Regulation von dendritischen Zellen, auf die T-Zellen aus. So führt IL-15
zu einer Erhöhung der Überlebensrate der dendritischen Zellen, die ihrerseits
wiederum eine verstärkte Antigenpräsentation an CD4+ und CD8+ T-Zellen zur
Folge hat (Rochman, Spolski et al. 2009).
Die besondere Bedeutung von IL-15 für die T-Zellen verdeutlicht die folgende
Zusammenstellung, die die Expressionsstärke der drei Untereinheiten des IL-15
Rezeptors auf verschiedenen T-Zellentitäten wiedergibt.
Rezeptor Kette Expression
naive T-Zelle Effektor T-Zelle Gedächtnis T-Zelle
γc (CD132) mittel mittel mittel
IL-2Rβ (CD122) niedrig hoch hoch
IL-15Rα niedrig hoch hoch
Tabelle 2 Expressionsstärke von Untereinheiten des IL-15 Rezeptors auf verschiedenen T-Zellentitäten (Rochman, Spolski et al. 2009)
Auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) werden durch IL-15 stimuliert (Bodnar,
Nizsaloczki et al. 2008), ihre Differenzierung reguliert (Allen, Nilsen-Hamilton et al.
1998), ihre Sekretion zytolytischer Mediatoren beeinflusst (Ye, Young et al. 1996)
und ihr zytolytisches Potential durch Stimulierung der Sekretion von Granulozymen
und Perforinen gefördert (Allen, Nilsen-Hamilton et al. 1998). Bei knock-out
Mäusen, die kein IL-15 mehr bilden konnten, zeigte sich eine starke Verminderung
der NK-Zellen im Thymus und der peripheren NK-Zellen (Kennedy, Glaccum et al.
2000). Zhang et al. (2008) konnten nachweisen, dass IL-15 die Zytotoxizität der
NK-Zellen über die Hochregulierung von NKG2D und zytotoxischen
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Effektormolekülen sowie über die STAT1 und ERK1/2 Phosphorylierung verbessert
(Zhang et al. 2008). Auch bei den NK-Zellen spielt die IL-15 induzierte
Signalvermittlung über eine Aktivierung der Jak1/3 und STAT3/5 eine wichtige
Rolle (Kovanen, Leonard et al. 2004). Studien weisen darauf hin, dass IL-15 auch
den Erhalt und die sekretorischen Aktivitäten von bestimmten B-Lymphozyten
beeinflusst. Bei diesen B-Zellen wurde eine erhöhte Ausschüttung von IgA, IgG1
and IgM durch IL-15 beschrieben (Armitage, Macduff et al. 1995). Zusätzlich spielt
IL-15 eine Rolle im Zell-Zell- Kontakt von dendritischen Zellen und B Zellen. In
diesem Zusammenhang ist es mitverantwortlich für die B-Zell Proliferation (Park,
Yoon et al. 2004). Weitere Zellen, die von IL-15 beinflusst werden, sind Mast-
Zellen, Monozyten/Makrophagen, Neutrophile und Eosinophile (Budagian,
Bulanova et al. 2006). So wirkt IL-15 als ein Wachstumsfaktor auf Mastzellen im
Knochenmark und besitzt antiapoptotische Eigenschaften. Des Weiteren gehören
Monozyten und Makrophagen zu den IL-15 produzierenden Zelllinien. Hier konnte
eine verstärkte Transkription und Translation von IL-15 RNA durch Zugabe
infektionsassoziierten Stimulie wie IFNγ und LPS, sowie bei direkten viralen und
bakteriellen Infektionen induziert werden. Auch für die Interaktion zwischen
dendritischen Zelle und Makrophagen ist IL-15 von Bedeutung. Des Weiteren spielt
IL-15 eine Rolle für die Transformation von Monozyten in dendritischen Zellen.
Ähnliche proliferationsfördende und antiapoptotische Effekte konnten z.B. auch bei
Neutrophilen und Eosinophilen gezeigt werden (Budagian, Bulanova et al. 2006).
In der folgenden Tabelle sind auszugsweise für einige der genannten Zellen des
Immunsystems die IL-15 bedingten Wirkungsspektren und die entsprechenden
Signalwege zusammengefasst.
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Tabelle 3 Wirkung von IL-15 im Organismus (Budagian, Bulanova et al. 2006)
Aufgrund dieses breiten Wirkungsspektrums von IL-15 lässt sich vermuten, dass IL-
15 besonders bei Krankheiten, die im Zusammenhang mit einer Fehlregulierung
des Immunsystems stehen, eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Und
tatsächlich wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt etliche Krankheiten, überwiegend
aus dem autoimmunen Formenkreis beschrieben, bei denen ein verändertes IL-15
Profil gezeigt werden konnte. Vor allem zu nennen ist hier die Rheumatoide
Arthritis, für die IL-15 eine herausragende pathophsiologische Bedeutung hat und
Zelle
Signalweg Funktion und Effekt
B Lymphozyten Aktivierung der Syk Kinase und PLCγ
Schutz vor Apoptose, Proliferations-und Differenzierungsinduktion , Ig Produktion
Mastzellen
Aktivierung von STAT3, Jak2/STAT5, Tyk2/STAT6 und Syk, Induktion von Bcl-xL und c-Myc Expression
Schutz vor Apoptose, Proliferation, IL-4 Sekretion
Neutrophile
Aktivierung von Jak2, Syk, p38, ERK1/2, NF-κB. Downregulierung von Bax, Erhöhung der Mcl-1 Stabilität, Verminderung der Caspase-3 and -8 Aktivierung
Schutz vor Apoptose, Aktivierung von Phagozytose, Produktion of IL-8 und IL-1R Antagonist, Aktivierung von antimikrobiellen Funktionen
Eosinophile Induktion von NF-κB Expression
Schutz vor Apoptose , Stimulation von GM-SCF Produktion
Monozyten/ Makrophagen
Aktivierung von Lck, ERK1/2 in U937 Zellen Reverse Signaling: Aktivierung von FAK, Rac3, p38, ERK1/2
Erhöhung der Phagocytose, Induktion von IL-8, IL-12, MCP-1, und Superoxide Produktion. Stimulation von IL-6, IL-8, TNFα Sekretion und Migration via Reverse Signaling
Dendritische Zellen ?
Schutz vor Apoptose, erhöhte Expression von CD86, CD40 und MHC II, IFNγ Abgabe und T Zellstimulation
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auch schon pharmakologische Therapieversuche in Phase I und II mit IL-15
Antikörpern laufen (McInnes et al. 2004). Weitere Krankheiten die mit einem
erhöhten IL-15 Serumspiegel assoziiert sein können, sind z.B. chronisch
entzündliche Darmerkrankungen, systemischer Lupus Erythematosus, entzündliche
Synovitis, Psoriasis, Diabetes Mellitus, Asthma bronchiale und autoimmune
Vaskulitis (Budagian, Bulanova et al. 2006).
1.4 Das Th1/Th2 Paradigma und die T-Zellen Die T-Zellen entwickeln sich aus pluripotenten haematopoetischen Stammzellen.
Die Reifung erfolgt im Thymus (Raulet 1999). In der Dezidua, der entwickelten
Funktionsschicht des Endometriums, lassen sich zwei wesentliche T-Zellentitäten
unterscheiden: Die CD4+ T-Helferzellen und die CD8+ T-Zellen.
Für die Hypothese Th1/Th2 Paradigmas nimmt die Zytokinproduktion der T-Zellen
eine zentrale Rolle ein. Das Th1/Th2 Paradigma wurde über Jahre hinweg als die
Basis für die Etablierung einer Immuntoleranz gegenüber den semi-allogenen
Fötus angesehen (Chaouat et al. 2007). Die T-Zellen produzieren unterschiedliche
Interleukine und spielen unterschiedliche Rollen in der Immunantwort (Raghupathy,
Makhseed et al. 2000). Je nach der spezifischen Produktion und Sekretion werden
hierbei zwei Hauptsäulen dieses Systems unterschieden: die Th1 und Th2 Zellpopulation. Den vom Th1 Pol sezernierten Zytokinen wie z.B. IL-2, TNF-α, und
IFN-γ werden vorwiegend proinflammatorische Eigenschaften zugesprochen
(Raghupathy, Makhseed et al. 1999). Im Rahmen dieses Paradigmas kann eine
erhöhte Sekretion von proinflammatorischen Th1 Interleukinen somit einer
erfolgreichen Implantation entgegenwirken und zu einem Abortgeschehen
beitragen. So hemmt TNF-α beispielsweise die Trophoblastenmotilität (Todt, Yang
et al. 1996). Dagegen werden den antiinflammatorischen Zytokinen aus der Th2 Population wie z.B. IL-4, IL-5, IL-6, und IL-10 positive, schwangerschaftserhaltende
Effekte zugesprochen werden (Lin, Mosmann et al. 1993). Es wurde davon
ausgegangen, dass das Überleben des Fötus von einer Inhibierung des Th1 Systems durch das Th2 System abhängig ist (Wegmann, Lin et al. 1993). Das
klassische Th1/Th2 Paradigma stützt sich v.a. auf Studien im Mausmodell. So
konnte von verschiedenen Gruppen gezeigt werden, dass die Th2-Zytokine IL-4, IL-
10 und IL-3 in normaler muriner und humaner Schwangerschaft in hohen Mengen
exprimiert werden (Lin, Mosmann et al. 1993) (Arck, Ferrick et al. 1999) und ihre
Injektion einen Abort in Mäusen verhindern kann (Chaouat, Assal Meliani et al.
1995). Zusätzlich konnten Th1-Zytokine wie TNF-α, IFN-γ und IL-1 bei der
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Untersuchung von Aborten in hohen Mengen beobachtet werden (Krishnan,
Guilbert et al. 1996) (Raghupathy, Makhseed et al. 1999). Dies konnte durch
Ergebnisse in denen die Injektion von Th1-Zytokinen die Abortrate drastisch
steigert, untermauert werden (Chaouat, Menu et al. 1990) (Clark, Merali et al.
1997). Des Weiteren wurden Studien, in denen man die Wirkung von TNF-α und IL-
1 mittels Antikörperapplikation neutralisierte, veröffentlicht. Hiermit ließ sich die
Abortrate deutlich reduzieren (Arck, Troutt et al. 1997).
Über mehrere Jahre hinweg wurde ein relativ strenges Modell, bei der die
Dominanz der Th2 Zytokine über die Th1 Zytokine im Mittelpunkt stand, vertreten.
Die von Wegmann postulierte „erfolgreiche Schwangerschaft als ein Th2 Phänomen“ (Wegmann, Lin et al. 1993) wurde als maßgebend betrachtet. Neue
Forschungsergebnisse legen jedoch nahe, dass dieses bestehende Th1/Th2 Konzept die tatsächliche Komplexität der Vorgänge an der feto-maternalen
Grenzzone stark vereinfacht und nur einen Teil der Wirkungen und
Wechselwirkungen widerspiegelt (Saito, Nakashima et al. 2008). Bisher wurden
zwar viele verschiedene Zytokine im feto-maternalen Zusammenspiel beschrieben,
häufig jedoch ohne ihre genaue pathophysiologische Rolle zu kennen. Aktuelle
Foschungsergebnisse deuten auf eine wesentlich komplexere Struktur des Zytokin-
Netzwerks hin. So wird momentan eine Erweiterung, das traditionellen Th1/Th2 System, postuliert, das ein realistischeres Bild der immunologischen Prozesse
während der Implantation und der gesamten Schwangerschaft wiedergeben soll.
Die Rolle der Zytokine an der feto-maternalen Grenzzone hat sich aufgrund neuer
Erkenntnisse weit über das bestehende dogmatische Th1/Th2 Paradigma hinaus
erweitert und zeigt sich vor einem wesentlich komplexeren Hintergrund. Zusätzlich
heben aktuelle Forschungen über die embryonale Implantation die Zytokinsekretion
andere Zellpopulationen, wie z.B. den Trophoblasten und v.a. auch die spezifische
Rolle der uterinen natürlichen Killerzellen hervor.
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Einleitung ___________________________________________________________________
13
1.5 Die natürlichen Killerzellen Die NK-Zellen (natürliche Killerzellen) stellen eine der Hauptkomponenten des
angeborenen Immunsystems dar (Sun, Lanier et al. 2009). Sie entwickeln sich aus
pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen und reifen im Knochenmark (Raulet
1999). Aufgrund ihrer Fähigkeit der nichtantigenabhängigen zytolytischen Aktivität
und Zytokinausschüttung ermöglichen sie einen schnellen und effektiven Schutz
gegen virale, bakterielle und parasitäre Infektionen, ohne Notwendigkeit einer
vorausgehenden Sensibilisierung (Perricone et al. 2008). Des Weiteren haben sie
anti-neoplastische Aktivitäten, sind an der Regulation der Hämatopoesis beteiligt
und mitverantwortlich für den Graft vs. Leukemia Effekt nach einer
Knochenmarkstransplantation (Robertson, Ritz et al. 1990). Neben den NK-Zellen
mit vowiegend zytotoxischem Potential finden sich auch NK-Zellpopulationen bei
denen die sekretorischen Eigenschaften deutlich im Vordergrund stehen. Des
Weiteren kann man zwei Hauptklassen der NK-Zellen anhand ihrer
Oberflächenmarker unterscheiden (Moffett-King et al. 2002). Der überwiegende
Anteil der NK-Zellen aus dem peripheren Blut exprimiert stark den „Fc-g-Rezeptor-
III“ (CD16), das „Neuronal Cell Adhesion Molecule“ (CD56), jedoch nur sehr
schwach (CD16+CD56dim). Dahingegen exprimieren die unterinen NK-Zellen (uNK)
schwach CD16, dafür jedoch stark CD56 (CD16−CD56bright) (Dosiou, Giudice et al.
2005) (Schallhammer, Walcher et al. 1997).
Die NK-Zellen werden durch Hormone reguliert. Dies kann direkt, durch die
Expression von Hormonrezeptoren, oder indirekt, vermittelt durch T-Zellen erfolgen
(Dosiou, Giudice et al. 2005). Hier scheinen die Zytokine des Th2 Systems die
zytotoxischen Eigenschaften der NK-Zelle zu vermindern und das Zytokinprofil der
NK-Zellen selbst zusätzlich in eine Th2 gewichtete Richtung zu verschieben.
Zytokine aus dem Th1 System haben einen gegenteiligen Effekt (Robertson, Ritz et
al. 1990).
Im peripheren Blut stellen die CD16+CD56dim NK-Zellen bis zu 15% der gesamten
Leukozyten, wohingegen die zweite NK-Population, die CD16−CD56bright NK-Zellen,
hier weniger als 1% ausmachen. Die peripheren CD16+CD56dim NK-Zellen
produzieren im Ruhezustand nur wenige Zytokine (Jokhi, King et al. 1994) (Dosiou,
Giudice et al. 2005). Nach vorausgegangener Stimulation können sie jedoch auch
Interferon γ (IFN-γ), den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktor
(GM-CSF), das Makrophagen-Inflammatorische Protein (MIP)-1a und MIP-1b 21
exprimieren und so an der Regulation der Immunantwort teilnehmen (Biron,
Nguyen et al. 1999) (Shi, Ljunggren et al. 2001).
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Einleitung ___________________________________________________________________
14
Im Endometrium jedoch zeigt sich ein anderes Bild. Hier stellen die CD16−CD
56bright NK-Zellen den Hauptanteil der Leukozyten. In der Proliferationsphase steigt
ihr Prozentsatz und erreicht in der frühen Phase einer Schwangerschaft sogar
einen Anteil von bis zu 75% (Dosiou, Giudice et al. 2005). Aufgrund ihrer
Organspezifität spricht man von uterinen natürlichen Killerzellen (uNK-Zellen). Im
Gegensatz zu den peripheren NK- Zellen zeigen die uNK-Zellen nur eine geringe
lytische Aktivität (Ferry, Starkey et al. 1990) (King, Birkby et al. 1989). uNK-Zellen
haben verglichen mit den peripheren NK-Zellen eine wesentlich höhere
sekretorische Aktivität mit einem breiteren Zytokinprofil. Hierzu zählen unter
anderen CSF, M-CSF, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, TGF-β und leukemia inhibiting
factor (LIF) (Saito, Nishikawa et al. 1993) (Jokhi, King et al. 1994).
Viele Aspekte und Funktionen der uNK-Zellen sind noch nicht genau geklärt.
Jedoch legt ihre verstärkte Proliferation ab der mittleren Sekretionsphase
verbunden mit ihrer perivaskulären und stromalen Lokalisation, einen
Zusammenhang mit dem Beginn der Dezidualisation nahe (King et al. 2000). Findet
keine Befruchtung statt, gehen die uNK-Zellen zugrunde und es kommt zur
Menstruation (King et al. 2000) (Trundley, Moffett et al. 2004).
Ein grundlegender, von den uNK-Zellen mitvermittelter Vorgang, scheint jedoch
auch die lokale Immunmodulation in der feto-maternalen Grenzzone zu sein. So
exprimieren NK-Zellen immunmodulatorischen Substanzen wie Glycodelin A und
Galectin-1 (Koopman, Kopcow et al. 2003). Galectin-1 inhibiert die Proliferation von
T-Zellen und verändert das lokale Zytokinprofil indem dem Th1 System zugehörige
Zytokine wie TNF-α und IL-2 vermindert werden (Rabinovich, Baum et al. 2002).
Glykodelin, welches auch als plazentares Schutzprotein beschrieben wird, hat
weitreichende Einflüsse durch die Verminderung der T-Zell Aktivität (Toth, Roth et
al. 2008) (Rachmilewitz, Borovsky et al. 2003). Des Weiteren spielen die uNK-
Zellen eine entscheidende Rolle für die Angiogenese, den strukturellen Umbau der
Spiralarterien und viele weitere Bereiche der plazentaren Entwicklung (Anne Croy,
van den Heuvel et al. 2006). Während der Implantation dringen uNK-Zellen tief in
die Dezidua ein und zerstören gezielt Wandschichten der uterinen Spiralarterien,
um einen ausreichenden Blutfluss für den sich entwickelnden Fötus zu
gewährleisten. Die uNK-Zellen scheinen also auf die Neovaskularisation und das
vaskuläre Remodelling Einfluss zu haben (Anne Croy, van den Heuvel et al. 2006).
So begünstigt IFN-γ die Bildung neuer Blutgefäße, genauso wie der „Vascular
Endothelial Growth Factor“ (VEGF), der ebenfalls von uNK-Zellen exprimiert wird.
Zusätzlich sezernieren uNK-Zellen Stoffe, welche eine entscheidende Rolle in der
Umformung des uterinen Gewebes spielen (Ashkar, Croy et al. 1999).
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Einleitung ___________________________________________________________________
15
Außerdem treten die uNK-Zellen an der feto-maternalen Grenzzone in engen
Kontakt mit den Trophoblasten. Aufgrund dieser unmittelbaren Nähe zu den
Trophoblasten, besonders in den Wänden der Spiralarterien, beeinflussen sie mit
Hilfe ihrer sekretorischen Fähigkeiten das Wachstum und die Invasivität der
Trophoblasten. So scheinen die uNK-Zellen die Trophoblasten durch ihre
spezifischen Zytokine wie z.B. CSF, M-CSF, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, TGF-β in
verschiedenster Weise zu modulieren (Jokhi, King et al. 1994) (Saito, Nishikawa et
al. 1993). CSF1 z.B. fördert die Produktion von hCG im Trophoblasten und
stimuliert, wie auch GM-CSF, die Proliferation von dezidualen Zellen (Saito,
Motoyoshi et al. 1993) (Athanassakis, Bleackley et al. 1987). Auch IFN-γ schützt
Trophoblasten vor Zelllysis durch IL-stimulierte periphere NK-Zellen (King, Loke et
al. 1993). Dahingegen inhibiert TNF-α die DNA Synthese in Trophoblasten.
(Dosiou, Giudice et al. 2005). Weitere interessante Ergebnisse konnte nach IL-2
Stimulation gezeigt werden. Dieses proinflammatorische Interleukin ist wie schon
erwähnt eng verwandt mit Il-15. Nach IL-2 Stimulation konnte das Potential von
uNK Zellen dahingehend moduliert werden, dass sie Trophoblasten vermehrt
angriffen. Zusätzlich scheinen die uNK-Zellen die Trophoblastininvasivität auch
durch ihr zytotoxisches Potential zu regulieren, auch wenn diesem Effekt im
Vergleich zu dem sekretorischen Potential nur eine geringe Bedeutung zukommt
(King, Loke et al. 1990).
Die NK-Zellen besitzen also ein weitreichendes Spektrum an Möglichkeiten auf die
Trophoblasten an der feto-maternalen Grenzzone regulativ einzuwirken. Jedoch
werden auch die NK-Zellen durch die Trophoblasten beeinflusst. Die Migration der
NK-Zellen in das deziduale Gewebe beispielsweise ist ein von Trophoblasten
streng kontrollierter Prozess (Dorling, Monk et al. 2000).
Die NK-Zellen im peripheren Blut unterscheiden sich in ihren Eigenschaften stark
von denen im Endometrium. Nicht nur anhand ihrer Lokalisation und
Oberflächenmarker sondern v.a. aufgrund ihrer gänzlich verschiedenen Aufgaben
und Eigenschaften lässt sich klar zwischen zwei Subpopulationen in der NK-
Zellfamilie unterscheiden. Hierbei scheinen den uNK-Zellen, aufgrund ihrer
sekretorischen und angiogenetischen Fähigkeiten, wichtige
schwangerschaftserhaltende und regulatorische Aufgaben zuzukommen. Eine
weitere Eigenschaft, die die Beudeutung der NK-Zellen hervorhebt, ist ihre enge
Interaktion und ihre gegenseitige Regulation mit den Trophoblasten in der feto-
maternalen Grenzzone.
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Einleitung ___________________________________________________________________
16
1.6 Die Trophoblasten und die Ausbildung des feto-plazentren Kreislaufs Die Blastozyste erreicht den mütterlichen Uterus am 4. Tag post conceptionem
(p.c.). Zu diesem Zeitpunkt besteht sie aus den innen gelegenen Embryoblasten
und einer äußeren trophoblastären Zellschicht. Ab dem 7. Tag p.c. beginnt die
Implantation der Blastozyste. Der embryonale Pol liegt hierbei dem Endometrium
an. Bei der trophoblastären Zellschicht unterscheidet man die innen gelegenen
Zytotrophoblasten, die als Stammzellreservoir dienen und den Embryoblasten
umhüllen, von den Synzytiothrophoblasten, die außen liegen und hauptsächlich in
Richtung Dezidua proliferieren und durch Fusion benachbarter Zellen entstehen. In
den folgenden Tagen dringt die Blastozyste unter Verdrängung und Zerstörung der
Stromabestandteile stetig weiter in die Dezidua ein. Die Chorionzottenbildung
beginnt bereits etwa am 8. Tag p.c (Kiechle 2007). Im Verlauf lassen sich
histologisch Primär-Sekundär- und Tertiärzotten unterteilen. Zunächst entstehen
durch Einschmelzungen innerhalb des Synzytiums Hohlräume, sog. Lakunen. Die
einzelnen Lakunen sind durch synzytiale Trabekel voneinander getrennt. Im
Rahmen der Primärzottenbildung sprossen nun Zytothrophoblasten in die Trabekel
ein. In diesem Stadium spricht man von den Primärzotten (Schiebler, Kaufmann
1997). Diese bestehen aus zentral gelegenen Zytotrophoblasten, die von einer
dicken Schicht Synzytiotrophoblasten umgeben sind (Schmidt 2001). Durch die
Arrosion maternaler Blutgefäße, durch die voranschreitende
Trophoblasteninvasion, füllen sich die Lakunen mit maternalem Blut. Zunächst
kommt es jedoch noch nicht zu einer regulären Blutzirkulation, diese bildet sich erst
ab der 12. SSW aus. Vielmehr handelt es sich in dieser Phase um eine Art
„stehendes Gewässer“ (Kiechle 2007). Durch das Einwachsen von embryonalem
Mesenchym wandeln sich die Primärzotten in die Sekundärzotten um. Von einer
tertiären Zotte spricht man etwa ab dem 18. Tag p.c., wenn sich im Inneren der
Zotte fetale Blutgefäße ausgebildet haben. Diese tertiären Zotten sind nun
charakterisiert durch eine äußere Zellschicht aus Synzytiotrophoblasten, darunter
liegende Zytotrophoblasten, einen villösen Kern und fetale Kapillaren. Diese
verbinden sich mit den Nabelschnurgefäßen und es kommt somit zur Ausbildung
des feto-plazentren Kreislaufs (Kiechle 2007) (Schiebler, Kaufmann 1997). Von besonderer Bedeutung in der plazentaren feto-maternalen Grenzzone sind die
embryonalen extravillösen Trophoblasten (EVT). Im Rahmen der Dezidualisation,
die durch die Invasion der Trophoblasten mitgetragen wird, unterliegt das
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Einleitung ___________________________________________________________________
17
mütterliche Endometrium einer Umwandlung, wodurch sich der Uterus den
Bedürfnissen des Embryos optimal anpasst. Während der ersten 12
Schwangerschaftswochen invadieren die EVT die Dezidua, das erste Drittel des
Myometriums und die Wände der Spiralarterien. Diese, sich von Zytotrophoblasten
ableitenden Zellen, entstehen in den sog. Haftzotten. Dies sind große, nicht frei
flottierende Zotten, die der Dezidua anhaften (Kiechle 2007). In den ersten Wochen
der Schwangerschaft lösen sich die zu diesem Zeitpunkt noch als intermediäre
Trophoblasten bezeichneten Zellen aus ihrem Zellverband an der Basalmembran
und wandern durch die Synzytiotrophoblastenschicht hindurch, um die sog.
Zellsäulen zu bilden. Die von hier aus nun in Richtung Dezidua infiltrierenden
Zellen werden jetzt als extravillöse Trophoblasten bezeichnet. Generell können die
intestinalen von den endovaskulären EVT unterschieden werden. (Huppertz,
Kadyrov et al. 2006). Ausgehend von der Trophoblastenzellsäule beginnen die EVT
als intestinale EVT die Dezidua und das Myometrium zu invadieren. Das Verlassen
des Zellverbandes ist den EVT nur aufgrund einer veränderten Expression von
Zelladhäsionsmolekülen möglich. Durch die Sezernierung spezieller Matrixmoleküle
wie Fibronektin und Kollagen IV bilden sie einen „trophoblast glue“, der zur
Verankerung der Plazenta beiträgt (Kiechle 2007). Die endovaskuläre EVT Invasion
ist essentiell für die physiologische Differenzierung der Spiralarterien und somit der
Etablierung einer suffizienten Versorgung des Fötus mit Nährstoffen und Sauerstoff
im feto-maternalen System. Hierbei werden zunächst die präplazentaren
mütterlichen Arterien invadiert. Durch die EVT kommt es zu einem Umbau in den
Gefäßwänden, indem die muskulären und elastischen Fasern reduziert werden und
durch Einlagerungen von Fibrionoidmaterial ersetzt werden. Die Arterien
transformieren hierdurch in weite, relativ starre Gefäße ohne die Möglichkeit zur
Vasokonstriktion (Kiechle 2007) (Huppertz, Kadyrov et al. 2006).
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Einleitung ___________________________________________________________________
18
Abbildung 3 EVT in der Plazenta (Huppertz, Kadyrov et al. 2006)
Diese Trophoblasteninvasion durch die EVT ermöglicht somit den Anschluss an
das maternale vaskuläre System und somit die suffiziente Versorgung des Fötus
mit Nährstoffen und Sauerstoff. Das invasive Potential der EVT ist jedoch so hoch,
dass sich der maternale Organismus vor einer „Überinvasion“ schützen muss. Es
ist also notwendig ein Gleichgewicht zwischen der Akzeptanz und gleichzeitiger
Limitation der invadierenden EVT zu erschaffen. Für dieses Gleichgewicht ist das
maternale Immunsystem von großer Bedeutung. Am Beispiel von ektopen
Schwangerschaften in den Tuben verdeutlicht sich das hohe invasive Potential der
trophoblastären Zellen. Da hier keine gegenregulierenden Maßnahmen seitens des
maternalen Immunsystems ergriffen werden können, kann eine solche ektope
Schwangerschaft bis zu einer Tubenruptur führen (von Rango et al. 2008).
Die Regulation der Trophoblastenaktivität ist sehr komplex und wird über autokrine
Wege, vom Trophoblasten selbst, und parakrine Wege, durch den maternalen
Organismus, gesteuert. Wie bereits beschrieben, spielt sich also auch die
Etablierung der immunologischen Toleranz vornehmlich zwischen dem maternalen
Immunsystem und den fetalen trophoblastären Zellen ab. Die verschiedenen
Trophoblastenentitäten befinden sich also stets an vorderster Front an der feto-
maternalen Grenzzone und stehen somit auch ständig im engen Kontakt mit dem
maternalen Immunsystem. Auf ihrer Oberfläche exprimieren die Trophoblasten
nicht die klassischen „major histocompatibility complex“-Moleküle (MHC-Moleküle),
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Einleitung ___________________________________________________________________
19
sondern ein bestimmtes, sonst nirgendwo im Körper anzutreffendes Muster an
antigenpräsentierenden Molekülen. Dies schützt sie vor den maternalen
Immunzellen und moduliert sie so, dass sie die Implantation und Invasion
unterstützen (Apps, Gardner et al. 2008) (Kovats, Main et al. 1990). Die von den
Trophoblasten exprimierte Sonderklasse von Oberflächenmolekülen, wie HLA-E
und HLA-F anstatt der klassischen HLA-A,-B,-C-Moleküle, sind hierbei zu nennen
(Kovats, Main et al. 1990) (King, Hiby et al. 1997) (Verma, King et al. 1997). Von
besonderer Bedeutung ist jedoch die Expression von HLA-G (Human Leukocyte
Antigen). Dieses Oberflächenmolekül hemmt die Aktivität von CD56 positiven NK-
Zellen und T-Zellen (Le Gal, Riteau et al. 1999) und vermindert deren Sekretion
von proinflammatorischen Stoffen was wiederum einen Bogen zu den Zytokinprofil
an der feto-maternalen Grenzzone spannt (Maejima, Fujii et al. 1997).
Die Trophoblasten sind also aufgrund ihrer maßgeblichen Beteiligung an der
Implantation, der Plazentabildung und der engen Verbindung zum maternalen
Immunsystem essentieller Bestandteil einer erfolgreichen Schwangerschaft. So
stellen gerade die trophoblastären Zellen und deren Expression von IL-15 den
zentralen Teil dieser Arbeit dar.
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Fragestellung ___________________________________________________________________
20
2. Fragestellung
Die Etablierung einer immunologischen Toleranz bzw. Kommunikation zwischen
maternalem und fetalem Organismus und die hieran beteiligten Zytokine an der
feto-maternalen Grenzzone scheinen für eine erfolgreiche Schwangerschaft von
großer Bedeutung zu sein. Es stellt sich somit die Frage, ob dieses Zytokinprofil bei
Patientinnen mit vermehrten Aborten verändert ist und welche Auswirkungen dies
auf die Vorgänge an der feto-maternalen Grenzzone haben könnte.
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21 Material und Methoden ___________________________________________________________________
3. Material und Methoden Um einen allgemeinen Überblick über das Zytokinprofil der feto-maternalen
Grenzzone zu gewinnen, wurde zunächst in einer PCR Versuchsreihe mit Hilfe
eines speziellen PCR Profiler Arrays die Expression verschiedenster Zytokine und
weiterer inflammatorischer Faktoren (Tabelle 10) auf der RNA bzw. DNA Ebene
analysiert. Basierend auf den hierbei gewonnenen Erkenntnissen schlossen sich
der immunhistochemische Versuchsteil und weitere PCR Versuche an. Hiermit
konnten die Ergebnisse des PCR Versuchsteils auch auf der Proteinebene
bestätigt werden. Die Immunhistochemie ermöglichte zusätzlich eine genauere
Lokalisation bzw. Differenzierung der Expressionsorte und zellulären Subtypen, wie
z.B. die extravillösen Trophoblasten oder die Synzytiotrophoblasten. Als
Studienpopulation wurden Patientinnen in randomisierten Gruppen mit
rezidivierenden spontanen Aborten (RSA) und einem bis Dato einmaligen
spontanen Abort (in dieser Arbeit jeweils als SA bezeichnet), untereinander und mit
einer Kontrollgruppe von gesunden Frauen verglichen. Als rezidivierender
spontaner Abort wurden, gemäß der WHO, drei oder mehr stattgehabte Aborte vor
der 20. SSW definiert. Eingeschlossen wurde die 7.-12. SSW. Alle Proben wurden
in gleicher Weise gesammelt, transportiert, verarbeitet, aufbereitet und analysiert.
Eine tabellarische Zusammenstellung über demographische und klinische
Charakteristika der Studienpopulation, sowie die Anzahl der immunhistologischen
Schnitte in Bezug auf die SSW findet sich im Anhang (Tabelle 4 und 5).
3.1 PCR Versuchsteil Mit Hilfe diverser PCR Techniken ist es möglich die Transkription verschiedener
Gene und damit deren Aktivität auf RNA bzw. DNA Ebene zu analysieren. Dies
erlaubt Rückschlüsse über die jeweiligen Genprodukte, wie z.B. die in dieser Arbeit
untersuchten Zytokine der feto-maternalen Grenzzone.
3.1.1 RNA-Isolierung mit RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Gewebeproben wurde das RNeasy® Lipid
Tissue Mini Kit der Firma Qiagen (RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit, Qiagen, Cat.No.
74804) verwendet. Dieses Kit beruht auf dem Grundprinzip, dass das Gewebe,
welches mittels einer Quiazol Lysis (Phenol und Guanidin) homogenisiert wurde,
auf ein spezielles Tube mit einem semipermeablen Membransystem pippetiert wird.
Die Silicat-Gel-Membran des Tubes bindet selektiv RNA, während hingegen
Kontaminationen, DNA und Proteine effektiv ausgewaschen werden. Die an die
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22 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Membran gebundene, qualitativ hochwertige RNA kann schließlich mit RNase-
freiem Wasser eluiert werden.
Die gefrorenen (-20°C) Gewebeproben wurden zunächst mechanisch grob mit
einem Skalpell zerkleinert und anschließend zusammen mit 1 ml Quiazol Lysis
Reagenz in ein 15 ml Falcon gegeben. Mit einem Ultraschallzerkleinerer wurden
die auf Eis gekühlten Proben homogenisiert. Zur Förderung der Dissoziation der
Nukleotidkomplexe wurde das Lysat 5 min bei RT inkubiert. Nachdem
anschließend 200 µl Chloroform hinzugefügt wurden, musste die Probe 15 sek
kräftig geschüttelt werden um die komplette Auftrennung der Phasen zu
gewährleisten. Nach einer 3 minütigen Inkubation bei RT wurde das Zelllysat in
einem 5 ml Tube bei 12000xg, 15 min bei 4° zentrifugiert. Dadurch kam es zur
Auftrennung in drei Phasen.
• Oben: farblose, wässrige Phase (RNA)
• Mitte: weiße Interphase
• Unten: rote, organische Phase
Die obere Phase (ca. 600ml) wurde in ein neues Reaktionsgefäß abpippetiert und
Ethanol 70% im Verhältnis 1:1 zugegeben. 700 μl des so entstandenen
Probenmaterials (inklusive eines eventuell entstandenen Präzipitats, das die
weitere Isolierung allerdings nicht weiter beeinträchtigt) wurden auf eine RNeasy
Mini Column® aufgetragen, welche sich in einem 2 ml Sammelgefäß befand. Nach
dem Schließen des Deckels wurde die ganze Säule für 15 sek bei 8000xg und RT
zentrifugiert und das Durchflussvolumen anschließend verworfen. Diese Schritte
wurden mit dem verbliebenen Rest Zelllysat-Ethanol-Gemisches wiederholt. Die im
Lysat enthaltene RNA war nun an die Membran im Inneren der Säule gebunden.
Anschließend wurden 700 μl RW1 Waschpuffer (im RNeasy Mini Kit enthalten) auf
die Säule pipettiert und erneut für 15 sek bei 8000xg und RT zentrifugiert
(Durchflussvolumen wurde entsorgt und das Sammelgefäß erneuert). Im
Folgenden wurden 500 μl RPE Waschpuffer (ebenfalls im RNeasy Mini Kit
enthaltenen, allerdings als Konzentrat mitgeliefert und vor Gebrauch mit Ethanol
100% zu verdünnen) auf die Säule pipettiert und 15 sek bei 8000xg und RT
zentrifugiert (Durchflussvolumen wurde entsorgt). Dieser Schritt wurde nochmals
mit 500 μl RPE Waschpuffer 2 min bei 8000xg und RT wiederholt.
(Durchflussvolumen wurde entsorgt). Um die Silica-Gel-Membran vollständig zu
trocknen, wurde sie anschließend für 1 min bei 11000xg zentrifugiert
(Durchflussvolumen wurde entsorgt). Zur Eluation der so gewonnenen und
gereinigten RNA wurde die Säule in ein neues 1,5 ml Sammelgefäß gesteckt und
50 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Silica-Gel-Membran pipettiert. Durch
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23 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Zentrifugieren für eine 1 min bei 8000xg wurde die an die Membran gebundene
RNA in das Sammelgefäß ausgewaschen. Die durch diesen Prozess gewonnene
RNA wurde bis zur cDNA-Synthese bei -80°C aufbewahrt.
Schema
• mechanische Zerkleinerung
• 1 ml Quiazol Lysis Reagenz und Gewebe in ein 15 ml Falcon
• Homogenisierung mit Ultraschall Zerkleinerer
• Lysat 5 min bei RT inkubieren
• 200 ul Chloroform dazugeben
• 15 sek kräftig schütteln
• Zelllysat in einem 5 ml Tube
• 15 min mit 12000xg, bei 4° zentrifugieren
• obere Phase (ca. 600ml) in ein neues Reaktionsgefäß abpippetieren
• mit Ethanol 70% im Verhältnis 1:1 vermischen
• 700 μl Probematerials auf eine RNeasy Mini Column® pipettieren
• 15 sek mit 8000xg und RT zentrifugieren
• diese Schritte mit dem verbliebenen Rest Zelllysat-Ethanol-Gemisches
wiederholen
• 700 μl RW1 Waschpuffer auf die Säule pipettieren
• 15 Sekunden bei 8000xg und RT zentrifugieren
• 500 μl RPE Waschpuffer auf die Säule pipettieren
• 15 s bei 8000xg und RT zentrifugieren
• diesen Schritt mit 500 μl RPE 2 min bei 8000xg und RT wiederholen
• Silica-Gel-Membran für 1 min bei 11000xg zentrifugieren
• Säule in ein neues 1,5 ml Sammelgefäß stecken und
50 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Silica-Gel-Membran pipettieren
• 1 min bei 8000xg zentrifugieren
• RNA Eluat bei -80°C aufbewahren
3.1.2 DNAse Verdau und Transkription in cDNA Eine Möglichkeit, um die Aktivität eines Gens analysieren, ist zu messen, in
welchem Ausmaß dieses Gen transkribiert wird. Hierfür wird die jeweils abgelesene
spezifische mRNA untersucht. Es ist jedoch sehr schwierig, dieses Genprodukt
laborchemisch direkt darzustellen. Deshalb bedient man sich eines Umweges, der
Polymerasekettenreaktion (PCR). Mit dieser Methode können genau definierte
Abschnitte des Erbmaterials vervielfältigt und somit besser analysiert werden. Für
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24 Material und Methoden ___________________________________________________________________
die PCR werden jedoch spezifische DNA-Polymerasen verwendet, die DNA-
abhängig sind, d.h. sie sind nicht in der Lage, mRNA zu amplifizieren. Daher wird
zuerst eine Reverse Transkriptase (RT), eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
eingesetzt mit deren Hilfe mRNA in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben
werden kann. Diese cDNA kann im Anschluss als Ausgangsmaterial für die PCR
verwendet werden. Prinzipiell unterscheiden sich RNA Moleküle nur wenig von DNA Molekülen. Beide sind Polynukleotide, die aus an Zucker gebundenen
Nukleobasen bestehen. Bei der RNA handelt es sich bei dem Zucker jedoch um
Ribose und nicht um Desoxyribose, wie bei der DNA. Des Weiteren ist bei der RNA
die Nukleotidbase Uracil und nicht Thymin, wie bei der DNA, vorzufindenden. Die
anderen Nukleotidbasen sind jeweils identisch. Zusätzlich besteht die RNA, im
Gegensatz zur doppelsträngigen DNA, nur aus einem Strang. Für die Transkription
wurde das QuantiTec® Reverse Transcription Kit von Qiagen (Cat. No. 74804)
verwendet. Für die Umschreibung in cDNA wurde zunächst jeweils zwei Gruppen
aus Abort und Abruptio gepoolt. Ein Pool bestand aus 9 RNA Proben von je 13 μl.
Die Umschreibung mit diesem Kit besteht aus zwei Teilschritten. Zunächst wurden
die RNA Proben mit einem DNAse haltigen Buffer inkubiert. Dies diente dazu,
genomische DNA zu eliminieren. Eine PCR (bei der keine m-Primer verwendet
werden) ist nur sinnvoll, wenn die Ausgangsprobe ausschließlich RNA enthalten
hat. Sind noch Reste von gemomischer DNA vorhanden, so können diese bei der
folgenden PCR nicht von der aus der RNA gewonnenen cDNA unterschieden
werden. Die PCR würde durch die Kontamination mit genomischer DNA für alle
untersuchten Marker falsch-positiv und hätte keinerlei Aussagekraft. Obwohl in
diesen Versuchen genau nach dem QuantiTec® Reverse Transcription Handbook
vorgegangen wurde, zeigt sich bei der folgenden PCR jedoch eine Kontamination
mit genomischer DNA. In Folgeversuchen mit neuen Parametern, wie verlängerten
DNAse Inkubationszeiten, erhöhten DNAse Konzentrationen und die Kombination
mit dem DNAse Verdauschritt aus dem NucleoSpin Kit, konnte schließlich ein
modifiziertes Protokoll zu effektiven Elimination der genomischen DNA aus den
Proben erstellt werden.
Die Arbeitsschritte wurden, wenn nicht anders erwähnt, bei RT vorgenommen.
Zunächst wurden 50 μl aus dem RNA Pool mit 50 μl RNAse freiem Wasser
gemischt. Anschließend wurde der RA1-Ethanol Mix mit 300 μl RA1 und 300 μl
Ethanol 96% hergestellt. Der RA1-Ethanol Mix wurde zusammen mit den 100 μl
RNA-Wasser Eluat in einem Tube durch vortexen vermischt. Im Folgenden wurden
700 μl auf ein Filter Tube (NucleoSpin culumn blue) pippetiert und für 30 sek bei
8000xg zentrifugiert. (Durchflussvolumen wurde entsorgt und das Sammelgefäß
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25 Material und Methoden ___________________________________________________________________
erneuert). Nun wurden 350 μl MDB Puffer auf den Filter pippetiert und erneut für
30 sek bei 8000xg zentrifugiert. In ein 0,5 ml Tube wurde der DNAse Mix aus 10 μl
DNAse und 90 μl Reaktionspuffer angesetzt. Hiervon wurden 95 μl auf den Filter
pippetiert und 15 min inkubiert. Nun folgten drei Waschgänge. Zunächst wurden
200 μl RA2 Puffer auf den Filter pippetiert und für 30 sek bei 11000xg zentrifugiert.
(Durchflussvolumen wurde entsorgt). Im zweiten Waschgang wurden 600 μl RA3
Puffer auf den Filter pippetiert und für 30 sek bei 11000xg zentrifugiert.
(Durchflussvolumen wurde entsorgt). Im dritten Waschgang wurden nun 250 μl
RA3 Puffer auf den Filter pippetiert und für 2 min bei 11000xg zentrifugiert.
(Durchflussvolumen wurde entsorgt). Zur Eluation wurde die Säule in ein neues
1,5 ml Sammelgefäß gesteckt und 60 μl RNase-freies Wasser direkt auf den Filter
pipettiert. Durch Zentrifugieren für eine 1 min bei 11000xg wurde die an die
Membran gebundene RNA in das Sammelgefäß ausgewaschen. Anschließend
wurde der DNAse Schritt des QuantiTec® Reverse Transkription Kit angefügt.
Jedoch wurde die 4fache DNAse Konzentration verwendet. Hierfür wurden 56 μl
RNA mit 28 μl DNAse und 7 μl Wasser in ein 0,5 ml Tube pippetiert. Dieses Tube
wurde im ThermoCycler für 8 min bei 42° inkubiert.
Schema
• 50 μl aus dem RNA Pool mit 50 μl RNAse freiem Wasser gemischt
• RA1-Ethanol Mix mit den 100 μl RNA-Wasser Eluat vortexen
• 700 μl von Gemisch auf ein Filter Tube pippetieren
• 30 sek bei 8000xg zentrifugieren
• 350 μl MDB Puffer auf den Filter pippetieren
• 30 sek bei 8000xg zentrifugiert
• 95 μl DNase Mix auf den Filter pippetieren und 15 min inkubieren
• 200 μl RA2 Puffer auf den Filter pippetieren
• 30 sek bei 11000xg zentrifugieren
• 600 μl RA3 Puffer auf den Filter pippetieren
• 30 sek bei 11000xg zentrifugieren
• 250 μl RA3 Puffer auf den Filter pippetieren
• 2 min bei 11000xg zentrifugieren
• Säulenmembran mit 60 μl RNase-freies Wasser durch Zentrifugieren für
1 min bei 11000xg ausgewaschen
• 56 μl RNA mit 28 μl DNAse und 7 μl Wasser in Tube vermischen
• ThermoCycler für 8 min bei 42° inkubieren
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26 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Im zweiten Schritt erfolgte nun die eigentliche Umschreibung von RNA in cDNA.
Hiefür wurden 7 μl Quantiscript Reverse Transcriptase, 7 μl Reverse Transcriptase
Primer Mix, 28 μl Reverse Transcriptase Buffer und 84 μl RNA in einem 0,5 ml
Tube pippetiert. Dieses wurde im Folgenden für 15 min bei 42° im ThermoCycler
inkubiert um ein optimale Anlagerung der Primer zu gewährleisten. Anschließend
wurde der Ansatz auf 95° erhitzt um die Reverse Transkiptase zu inaktivieren. Die
so gewonnene cDNA konnte nun bei 4° gelagert werden.
Schema
• 7 μl Quantiscript Reverse Transcriptase +
7 μl Reverse Transcriptase Primer Mix +
28 μl Reverse Transcriptase Buffer +
84 μl RNA in einem 0,5 ml Tube pippetieren
• Tube für 15 min bei 42° im ThermoCycler inkubieren
• Ansatz auf 95° erhitzen
• gewonnene bei 4° lagern
3.1.3 Real Time RT-PCR nach TaqMan® Wie bereits erwähnt, ist die PCR eine Methode um DNA in vitro zu vervielfältigen.
Hierbei durchlaufen die einzelnen Ausgangs-DNA Moleküle in einer
„Kettenreaktion“ mit Hilfe einer DNA-Polymerase, spezifischen Primern und
Desoxy-Nukleotiden, zahlreiche, sich ständig wiederholende Vermehrungszyklen.
Die Endprodukte eines Zyklus dienen wieder als Vorlage des Nächsten. Mit dieser
Technik wird eine exponentielle Vervielfältigung der Ausgangs-DNA möglich. Die
Real Time RT-PCR ist eine Erweiterung der RT-PCR. Mit dieser Technik ist
zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Diese
Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die
während eines PCR-Zyklus in „Real Time“ erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt
proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Wenn alle PCR-Zyklen beendet
sind, wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der
exponentiellen Phase numerisch und graphisch dargestellt. Nur in der
exponentiellen Phase der PCR (die wenige Zyklen in einem Lauf dauert) ist die
korrekte Quantifizierung möglich, da während dieser Phase optimale
Reaktionsbedingungen herrschen. Diese Methode unterscheidet sich somit von
anderen quantitativen PCR-Methoden, die, meist unter Einbeziehung einer
gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Fragmente, erst nach Ablauf der PCR
eine quantitative Auswertung vornehmen. Die für diese Arbeit verwendete Real
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27 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Time RT PCR wurde in einer Mikrotiter-Platte mit insgesamt 96 Wells durchgeführt.
In jedes Well wurde ein Volumen von 20 μl pipettiert. Dieses setzte sich zusammen
aus je 1μl TaqMan® Gene Expression Assay Mix 20fach konzentriert, 10 μl
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix 2fach konzentriert (beide Firma Applied
Biosystems, Weiterstadt), 1 μl Template. Auf insgesamt 20 μl Gesamtvolumen
wurde mit H2O (DEPC behandeltes DI Wasser der Firma Sigma, Taufkirchen)
aufpipettiert.
Schema
• 1 μl TaqMan® Gene Expression Assay Mix +
10 μ TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix +
1 μl Template = Probe +
8 μl H2O zusammen pipettieren und vermischen
• die jeweils 20 μl Gesamtvolumen auf Mikrotiter-Platte 96 Wells pippetieren
Die Thermozyklen im Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-Gerät
verliefen wie folgt: 20 s bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen Amplifikation mit 3 s bei
95 °C und 30 s bei 60 °C. Um die Assays auszuwerten wurde das ABI PRISM 7500
Fast der Firma Applied Biosystems, Weiterstadt, verwandt. Die Quantifizierung
erfolgte mit der ΔΔCt-Methode mit Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase
(GAPDH) als Housekeeping-Gen. Da die GAPDH für den Zellerhalt grundsätzlich
notwendig ist und immer in konstanter Menge bereitgestellt werden muss, wird
dieses Gen weitgehend unabhängig von anderen Einflüssen, den Zelltyp und dem
Zellstadium, transkribiert. Es handelt sich hierbei also um ein konstitutiv
exprimiertes, nicht-reguliertes Gen. Verrechnet man nun zur Quantifizierung die
Werte der GAPDH und des zu analysierenden Genprodukts mit der ΔΔCt-Methode,
werden die Werte des gesuchten Gens an den Werten der GAPDH relativiert.
Pipettiert wurde davon ebenfalls 1 μl in die entsprechenden Wells.
3.1.4 Quantitative RT PCR mit dem RT2 Profiler PCR Array Die quantitative RNA Expression von insgesamt 84 inflammatorischen Zytokinen
und Chemokinen in Lösung bzw. Rezeptorform wurde mit dem RT2 Profiler PCR
Array PAHS-034 (SuperArray Bioscience Corporation, Frederick, MD) für Applied
Biosystems 7500 Fast durchgeführt. Die RNA stammte aus den oben angeführten
plazentaren Geweben aus normalen Schwangerschaften und Aborten. Jeweils die
gleiche Menge RNA jeder einzelnen Probe wurde in cDNA umgeschrieben. Die
cDNA der Proben wurden in Gruppen von gesunden Schwangerschaften,
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28 Material und Methoden ___________________________________________________________________
spontanen Aborten und redizivierenden Aborten gepoolt und die PCR Array
Analyse entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Als MasterMix wurde
der RT2 Real-Time SYBR Green PCR Master Mix (SuperArray Bioscience
Corporation) verwendet. Die eingesetzte Menge für die PCR betrug 25 µl. Als
Parameter für den Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Thermocycler
wurden zunächst 1 Zyklus 95°C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95°C für 15 s
und abschießend 60°C für 1 min Die mRNA Expression wurde entsprechend der
2-ΔΔCT Methode eingestellt.
3.2 Immunhistologischer Versuchsteil Die Immunhistochemie ist ein Verfahren, um Proteine, wie z.B. auch Zytokine, mit
Hilfe von Antikörpermarkierungen mikroskopisch sichtbar zu machen. Hierfür wurde
dasselbe Material wie schon im PCR Versuchsteil verwendet.
3.2.1. Aufbereitung für die Immunhistochemische Färbung
Das gewonnene Gewebe wurde nach Entnahme einem Fixationsprozess
unterzogen, um eine Autolyse zu verhindern und eine gute Morphologie zu
gewährleisten. Zur Fixation wurde 4%iges neutral gepuffertes Formalin verwendet.
Hierbei bildete sich ein starres Gitternetz, indem sich ein Formalinmolekül an ein
Protein anlagerte und die Proteine untereinander vernetzt wurden. Eine
Denaturierung der Proteine blieb jedoch weitgehend aus, was wichtig für den
Nachweis spezifischer Antigenstrukturen war. Die ca. 0,5x1 cm große Abradate
wurden 24 h in Formalin fixiert. Nach der Fixierung musste das Formalin
ausgewaschen werden. Zum Entwässern wurde ein organisches Lösungsmittel,
das eine hohe Affinität zu Wasser hat, benutzt. Das Gewebe durchlief dazu eine
Reihe aus einem 70%igem und mehreren absoluten Ethanolen. Als Intermedium
(Flüssigkeit, die sich sowohl mit Ethanol, als auch mit Paraffin mischt) fungierte
Xylol. Dieses wusch die letzten Reste des Alkohols aus dem Gewebe.
Anschließend wurden die fixierten Abradate in Paraffinblöcke eingebettet. Bei
diesem Vorgang durchdrang das auf 60°C erhitzte und dadurch flüssige Paraffin
das Gewebe und lagerte sich überall dort ab, wo sich ursprünglich Wasser befand,
welches im Einbettungsvorgang im vorangehenden Schritt entfernt wurde. Das
Gewebe wurde nun mit weiterem Paraffin in Form eines Blocks gegossen. Nach
dem Erkalten dieser Paraffinblöcke wurden mit Hilfe des Schlittenmikrotoms jeweils
2-3 µm dicke Gewebeschnitte gewonnen und nach Glättung im Streckbad in 45°C
warmen Aqua dest. auf speziell für die Immunhistochemie beschichtete
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29 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Objektträger (Superfrost Plus, Fa. Langenbrinck) aufgezogen. Um eine besser
Haftung zu gewährleisten, wurden die Schnitte zusätzlich zur Beschichtung über
Nacht bei 56-58°C im Brutschrank getrocknet. Bis zur eigentlichen
immunhistochemischen Versuchsreihe wurden die Schnitte nummeriert und in
Objektträgermappen aufbewahrt.
3.2.2 Die Immunhistochemische Färbung Immunhistochemische Färbeverfahren basieren auf der Bindung eines spezifischen
Primärantikörpers an ein von der Zelle exprimiertes, spezifisches Antigen. Diese
Bindung kann durch unterschiedliche Detektionsverfahren sichtbar gemacht
werden. In dieser Arbeit wurde die Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Methode
verwendet. Hierzu wurde ein spezifischer Sekundärantikörper aufgetragen. Dieser
war über eine Vitamin/Glykoproteinverbindung an eine Peroxidase gekoppelt. Nach
Hinzugabe eines Chromogens wurde eine enzymatische Reaktion zwischen
diesem und der Peroxidase gestartet, in deren Verlauf sich am Ort der Bindung des
Primärantikörpers ein Farbniederschlag bildet. Diese Farbreaktion konnte im
Lichtmikroskop analysiert werden.
3.2.3 Durchführung der Immunhistochemischen Färbung Bevor eine immunhistochemische Färbung begonnen wurde, musste zunächst das
Paraffin aus dem Gewebe entfernt werden (Entparaffinierung). Anschließend
wurden die durch Aldehydvernetzung maskierte Epitopen durch Hitzebehandlung
demaskiert (Antigendemaskierung im Schnellkochtopf) und eine unspezifische
Anlagerung der Antikörper durch ein Blockierserum verhindert (Blockierung). Nach
der Inkubation mit dem Primär-und Sekundärantikörper wurde die eigentliche
Färbereaktion zwischen dem AB-Komplex (Avidin-Biotin-Komplex) und einem
Substrat (Chromogen) durchgeführt. Anschließend wurden die Schnitte noch
gegengefärbt (Gegenfärbung) und eingedeckt (Dehydrierung und Eindeckung). Die
immunhistochemische Färbung erfolgte grundsätzlich in einer feuchten Kammer,
damit während der einzelnen Inkubationsschritte die Schnitte nicht austrocknen
konnten.
Entparaffinierung
Um mit der immunhistochemischen Färbung beginnen zu können, musste zunächst
das Paraffin aus dem Schnitt mit Xylol herausgelöst werden. Die Paraffinschnitte
wurden für 15 Minuten in Xylol (J. T. Baker, Deventer, Holland) entparaffiniert und
anschließend je 2 mal 2 Minuten in 100%igen Ethanol (Apotheke, Klinikum
Innenstadt der Ludwig-Maximilan-Universität, München, Deutschland) gespült. Die
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30 Material und Methoden ___________________________________________________________________
endogene Peroxidase wurde durch 20-minütiges Einwirken in 3%igem H2O2 in
Methanol (= 3 ml 30%iges H2O2 + 97 ml Methanol-Apotheke, Klinikum Innenstadt
der Ludwig-Maximilan-Universität München, Deutschland) blockiert, da diese bei
der späteren Färbereaktion stören und zu unspezifisch positiven Ergebnissen hätte
führen können. Im Folgenden wurden die Schnitte in einer absteigenden
Alkoholreihe von 100%igen, 96%igen und 70%igem Ethanol durch zweimaliges,
zweiminütiges Spülen rehydriert und Ethanolreste mit Aqua dest. heraus
gewaschen.
Antigendemaskierung im Schnellkochtopf
Zur Darstellung bestimmter Antigene war es unumgänglich eine hitzeinduzierte
Antigendemaskierung vorzunehmen. Durch diese Art der Antigendemaskierung
können Antikörper auch Epitope erkennen, die zuvor durch Aldehydvernetzung
maskiert waren. Die durch Formalin verursachte Proteinvernetzung wurde durch
das Erhitzen der Schnitte in einer kalziumpräzipitierenden Lösung (Citrat-Puffer pH
6,0) wieder aufgehoben. Die Antigenmaskierung erfolgte durch Hitzevorbehandlung
im Schnellkochtopf mit einem Na-Citratpuffer, pH 6,0. Der Dampfkochtopf wurde
mit Puffer gefüllt und die Platte auf maximale Temperatur gestellt. Nach 7 Minuten
fing der Puffer an zu kochen und die Schnitte wurden eingestellt, der Deckel
verschlossen. Nach 4 Minuten konnte die Herdplatte auf ein Viertel der maximalen
Temperatur heruntergeregelt werden. Nach weiteren 5 Minuten wurde der Topf in
ein Wasserbecken gestellt und konnte langsam abkühlen. Nach Öffnen des
Deckels wurde vorsichtig Leitungswasser zum Puffer gegeben. Anschließend
wurden die Schnitte in Aqua. dest gespült und 2 mal 2 Minuten in PBS (Biochrom
AG, Berlin, Deutschland) gewaschen.
Blockierung
Der Blockiervorgang sättigte mit Hilfe eines Normalserums elektrostatische
Ladungen im Gewebe und verhinderte, dass Immunoglobuline sich durch
hydrophobe Bindungen unspezifisch an Membranen oder Fettgewebe banden.
Somit wurde eine unspezifische Anlagerung der Antikörper und dadurch eine
unspezifische Anfärbung verhindert. Zunächst wurde ein Blockierserum mit einer
Einwirkzeit von 20 Minuten aufgetragen und danach wieder abgeschüttet.
Primär-und Sekundärantikörper
Anschließend wurde der Primärantikörper aufgetragen und über Nacht bei 4°C
inkubiert. Im nächsten Arbeitsschritt wurden die Schnitte 2 mal 2 Minuten in PBS
gewaschen. Nun wurde der Sekundärantikörper für 30 Minuten Einwirkzeit
aufgetragen und anschließend wieder 2 mal 2 Minuten in PBS gewaschen. Die
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31 Material und Methoden ___________________________________________________________________
optimale Antikörperkonzentration und Inkubationszeit wurde in Vorversuchen
austitriet und gemessen.
Avidin-Biotin-Komplex
Nach Waschen in PBS (2 mal 2 Minuten) wurde im Folgenden der ABC-Komplex
(Einwirkzeit 30 Minuten) aufgetragen und in PBS gewaschen (2 mal 2 Minuten). Die
ABC-Methode (Avidin-Biotin-Komplex) basiert auf der Affinität zwischen dem
niedermolekularen Vitamin Biotin und dem Glykoprotein Avidin, ein aus
Hühnereiweiß gewonnenes Tetramer. Es besitzt vier Bindungsstellen für Biotin. Da
es teilweise zu unspezifischen Reaktionen bei der Verwendung von Avidin kommt,
wurde auf gentechnischem Weg ein reineres Produkt gewonnen, das aus dem
Bakterium Streptomyces avidinii isolierte Streptavidin. Über einen gegen die
Tierspezies des Primärantikörpers gerichteten biotinylierten Sekundärantikörper
wird der Primärantikörper, wie z.B. IL-15, mit dem vorgeformten Avidin-Biotin-
Enzymkomplex (AB-Complex) verbunden. Das Avidin-Molekül hat eine sehr hohe
Affinität für Biotin. Die Bindung ist irreversibel. Der Komplex wird so produziert,
dass an drei von vier möglichen Bindungsstellen des Avidins ein Molekül Biotin
gebunden wird.
Abbildung 4 ABC-Komplex (Noll, Schaub-Kuhnen 2000)
Chromogen
Die Substratfärbung erfolgte mit dem Chromogen DAB (Dako North America,
Carinteria, USA). An den Aviden-Biotin-Komplex ist ein Enzym gekoppelt, in
diesem Fall die Peroxidase. Durch Hinzugabe der Substrat/Chromogenlösung (3-4
min) wurde eine enzymatische Reaktion mit der Peroxidase gestartet, in deren
Verlauf sich am Ort der Bindung des Primärantikörpers ein Farbniederschlag bildet.
Diese im Lichtmikroskop sichtbare Farbreaktion entstand, indem das Enzym
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32 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Peroxidase mit dem Substratpuffer H2O2 als Katalysator und dem jeweiligen
Chromogen (DAB) ein farbiges Endprodukt bildete. Im Falle von DAB war dieses in
organischen Lösungsmitteln unlöslich.
Danach wurden die Schnitte 2 mal 2 Minuten in Aqua dest. gewaschen. Die
Substrat-Chromogen-Reaktion konnte nicht unterscheiden, ob die Peroxidase
endogen, d.h. im Gewebe lokalisiert ist, oder ob sie nachträglich zugegeben wurde
(ABC-System mit Peroxidase). Um endogene Peroxidase außer Kraft zu setzten
wurden die Schnitte in H2O2 inkubiert. Das Chromogen (DAB 3,3 Diaminobenzidin)
konnte mit Hilfe des Substratpuffers und des Katalysators H2O2 einen Farbkomplex
bilden.
Gegenfärbung Um eine Übersicht über die gesamte Zellmorphologie zu erhalten, erfolgt noch eine
Gegen-bzw. Übersichtsfärbung mit saurem Hämalaun nach Mayer (Apotheke,
Klinikum Innenstadt der Ludwig-Maximilians-Universität München, München,
Deutschland). Dabei handelt es sich um einen basischen Farbstofflack in saurer
Lösung mit einem pH-Wert von 4,5. Die Schnitte wurden hierfür für 2 Minuten
gegengefärbt. In dem sauren Milieu werden nur die Kerne angefärbt, da diese
negative Ladungen besitzen. Dabei lagern sich die positiv geladenen basischen
Farbstoffe an die negativ geladene Phosphatgruppe der DNS im Kern an. Das
Auswaschen der Säurereste und das Bläuen erfolgte mit Leitungswasser
(alkalisches Milieu).
Dehydrierung und Eindecken Zum Schluss wurden die fertig gefärbten Präparate in einer aufsteigenden
Alkoholreihe mit 70%igem, 96%igem und absolutem Ethanol dehydriert.n
Anschließend erfolgte die Aufhellung in Carbolxylol (Apotheke, Klinikum Innenstadt
der Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland) und Xylol (J.T. Bakter,
Deventer, Holland). Zur Haltbarmachung wurden die Präparate luftdicht mit dem
Einschlussmittel „Consul-Mount“ (Shandon, Pittsburgh, USA) eingedeckt und
verschlossen. Für das Einschlussmittel gilt, dass es den gleichen Brechungsindex
wie Glas haben muss, damit die Färbung nicht beeinflusst wird. Positive Zellen
zeigten eine bräunliche Färbereaktion, die Negativkontrollen waren blau. Alle
Inkubationen wurden, soweit nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur und in
der feuchten Kammer durchgeführt.
(Noll, Schaub-Kuhnen 2000)
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33 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Schema • Entparaffinieren für 15 min im Xylol
• 2 x 100% Alkohol
• 20 min in 3%igem H2O2 in Methanol für Paraffinschnitte zur Blockierung
der endogenen Peroxidase
• 2 x 70% + 2 x 50% Alkohol
• Aqua dest. spülen
• Demaskierung durch Hitzevorbehandlung im Schnellkochtopf mit
Na-Citratpuffer mit Lsg. A, Lsg. B, Na-Citratpupper GebrauchsLsg, pH 6,0
(siehe: Allgemeine Chemikalien und Lösungsansätze)
• in Aqua dest. spülen
• 2x2 min in PBS waschen
• 20 min Blockierungsserum
(siehe: Allgemeine Chemikalien und Lösungsansätze)
• Abschütten des Blockierungsserums
• Primärantikörper bei 4°C über Nacht, IL-15 Verd.: 1:75 in PBS
• am nächsten Tag 2x2 min in PBS waschen
• 30 min Sekundärantikörper
(siehe: Allgemeine Chemikalien und Lösungsansätze)
• währenddessen Ansetzen des ABC-Komplexes
(siehe: Allgemeine Chemikalien und Lösungsansätze)
• 2x2 min in PBS waschen
• 30 min ABC-Komplex
• 2x2 min in PBS waschen
• 3-4 min Substratfärbung mit DAB (3,3 Diaminobenzidin)
(siehe: Allgemeine Chemikalien und Lösungsansätze)
• 2x2 min in Aqua dest. waschen
• 2 min Gegenfärbung mit saurem Hämalaun nach Mayer
• 5 min in Leitungswasser bläuen
• aufsteigende Alkoholreihe bis Xylol
• Eindecken mit „Eukitt“
IL-15 (Immunohistchemie)
Maus IgG monoklonal 1:75
R&D Systems,
Minneapolis, USA
Tabelle 4 verwendeter Primärantikörper, Immunfluoreszenz
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34 Material und Methoden ___________________________________________________________________
3.2.4 Auswertung der Immunhistochemischen Färbung
Die Auswertung der Schnitte erfolgte mit Hilfe des Lichtmikroskops (Leica, Solms,
Deutschland) durch zwei unabhängige Begutachter, einschließlich einer Pathologin
(PD Dr. Doris Mayer, Pathologische Institut der LMU, München). Zunächst wurde
das Tumorgewebe bei Lupenvergrößerung (10-fach) aufgesucht und anschließend
bei stärkerer Vergrößerung (25-fach) beurteilt. Mitgeführte Positiv- und
Negativkontrollen aus jeder Färbereihe bestätigten die immunhistochemische
Färbereaktion. Hierbei wurde Lymphknotengewebe von gesunden Frauen als
Positivkontrolle verwendet. Zur Negativkontrolle wurde der Primärantikörper durch
Negativkontroll-IgG1 in derselben Konzentration ersetzt (DARKO, Glostrup,
Denmark).
Die Auswertung der Schnitte erfolgte nach dem immunoreaktiven Score (IRS) von
Remmele und Stegner (Remmele, Stegner 1987). Dieser semiquantitative
immunoreaktive Score berücksichtigt die Parameter Färbeintensität (Staining
Intensity = SI) und den Prozentsatz der immunhistochemisch positiven Zellen (PP)
und wird aus dem Produkt dieser beiden Parameter errechnet.
Die Färbeintensität (SI) wird wie folgt unterteilt:
0 = keine Färbereaktion
1 = schwache Färbereaktion
2 = mäßige Färbereaktion
3 = starke Färbereaktion
Der Prozentsatz positiver Zellen (PP) wird eingeteilt in:
0 = keine positiven Zellen
1 = < 10% positive Zellen
2 = 10-50% positive Zellen
3 = 51-80% positive Zellen
4 = > 80% positive Zellen
Durch Multiplikation beider Parameter kann der IRS - Score einen Wert zwischen 0
und einem Maximalwert von 12 annehmen.
Die Auswertung der Ergebnisse ergab folgende Expressionsgrade:
0 = keine Expression
1 - 3 = geringe Expression
2 - 8 = mäßige Expression
9 -12 = starke Expression
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35 Material und Methoden ___________________________________________________________________
Mit Hilfe einer digitalen Kamera (Olympus, Tokyo, Japan) konnten Abbildungen
gemacht werden. Der IRS-Score von IL-15 wurde anhand des Kruskal-Wallis-Tests
nach Rangwerten (Kruskal and Wallis) verglichen. Der Mann-Whitney
Rangsummen-Test wurde genutzt, um die Mittelwerte der Färbeintensität (SI) zu
vergleichen. Die Signifikanz der Unterschiede wurde bei einem p-Wert von
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36 Material und Methoden ___________________________________________________________________
immunhistochemischen Färbeteil verwendet. Die angegebenen Inkubationen
wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.
3.2.6 Durchführung der Immunfluoreszenz-Doppelfärbung Die bei -80°C gelagerten Objektträger wurden in Alufolie zugedeckt 10 min lang bei
RT aufgetaut und dann ungefähr 20 min getrocknet. Nach der Fixierung mit Aceton
für 5 min wurden die Präparate erstmals mit PBS 3-mal für 2 min gespült.
Blockierung Die Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen erfolgte mit Ultra V Block für
15 min. Nach diesem Schritt wurden die Präparate nicht mit PBS gespül