Yayma TeknikleriH.Ezgi D kaya

Yayma ; 3:1 oran nda metanol-asetik asit ile fikse edilmi hcrelerin cam lamlara damlat lmas ve en uygun kromozom yay l m ve morfolojisini sa layacak ortam ko ullar nda kurutulmas d r.

Ba ar l bir yayma i lemi gerekle tirmek iin ok farkl teknikler olmas na ra men henz kesin bir prosedr belirlenememi tir. Laboratuvarda al an ki i ortam ko ullar na gre en iyi sonu verecek kararlar verebilecek kadar tecrbeli olmal d r.

Yayma tarihi

Yayma ilk olarak 1950li y llarda ortaya km t r. Bu y llarda yayma %50 %60 oran nda suland r lm asetik asit kullan larak hcrelerin lam ve lamel aras na s k mas eklinde yap lmaktayd . Daha sonra lamel kald r l r ve bantlama i lemine geilirdi. Fakat burada materyalin lamele yap ma sorunu vard ve bu sorun so uk lam kullan m gibi e itli yntemlerle a lmaya al ld . 1960lardan sonra bu yntem kullan lmamaya ba land .nk fiksatif olarak suland r lm asetik asitin kullan m bantlama a amas n olumsuz etkiliyordu.

Fiksatifin ilk kullan m 3:1:1 metanol-asetik asit-kloroform eklindeydi ve Carnoys fiksatif olarak adland r lmaktayd . Daha sonralar kloroformun genetik ara t rmalar iin gereksiz oldu u anla ld ve fiksatif,metanol ve asetik asit ile haz rlanmaya ba land .

Hava ile kurutma i lemi ilk olarak Rothfels ve Siminovichin preparatlar unutmas ile ortaya km t r. Bu sayede kromozomlar n,preparatlar buharla ma ile kuruduktan sonra herhangi bir i lem gerektirmeden tek bir dzlem zerine yay ld fark edilmi tir.

Kurutma

3:1 oran nda metanol:asetik asit muamele edilmi hcrelerin,fiksatif nedeniyle bym ve membranlar n n incelmi olmas lama yap malar n kolayla t r r ve kolay kurumay sa lar.

Normal bir gnde yayma yap lan preparatlar 20-30 derece a ile kurutma ka d zerine dizmek kurutma i lemi iin uygun olabilir. Belki ok az fiksatif damlat larak suyun buharla mas kolayla t r labilir. Yap lan denemelerle kromozomlar istenilen ekilde elde edilemeyebilir. Ortam ko ullar n n d nda kltrde bir sorun olabilir veya k i leminden kaynaklanan problemler olabilir.

Hcreler cam lam zerine yay ld ktan birka saniye sonra fiksatif damlat l r,hcreler zerinde bir fiksatif katman olu ur ve bu fiksatif katman buharla p incelirken hcre iskeleti hcrenin u k s mlar na do ru ekilmeye ba lar hcre byr ve membran gszle ir. Bu yay lan hcrenin metafaz dnemi kromozomlar alt ve st membran aras nda preslenir ve yay l r.

Bu fiziksel gev eme ve hcre membran n n y k lmas zaman al r. E er fiksatif sitoplazman n zay f hale gelmesinden ve hcrelerin yay lmas ndan daha nce kurursa hcrelerin arkas nda belirgin bir sitoplazma tabakas kal r. Kromozomlar daha kal n(faz kontrast mikroskobunda daha koyu) Yay l mlar daha seyrek

Do ru ekilde kurumu hcrelerde stoplazmik membran hcre etraf nda bozulmam bir ekilde fakat olduka ince bir yap da bulunur.

E er kuruma i lemi ok uzun zaman al rsa zay flam stoplazmik membranda delikler olu abilir,y rt lma gerekle ebilir ve kromozomlar n bir k sm veya hepsinin hcre d na kmas ile sa lma gerekle ir.

Baz preparatlarda ise hcrelerin seyrek yay ld n gryoruz Bunun nedeni hcrelerin fiksatif tabakas ndaki ak nt dan etkilenerek kaymas d r.Bu kayma i lemi,kurutman n son a amas nda gerekle irse,hcreler gev eyemez ve s k durumda kal r.Bu teoriyi ortaya atan Spurbeck, u istisnalar n da olabilece ini belirtmi tir.

Yksek nem bazen sitoplazmik tabakan n olu mas na neden olur. Kurutma sresinin azalt lmas ile bu durum hafifletilebilir. Bazen de d k nemli ortamda hcrelerde sa lmaya neden oldu u belirlenmi tir. Ayr ca henz bilinmeyen baz etkenlerinde yaymada al nan sonucu etkiledi i d nlmektedir.(rn:barometrik bas n)

Yayma i leminde zet olarak ; Metanol ve asetik asit ile fikse edilmi hcreler fiziksel olarak yok olmadan lam zerine yap r Hcreler lam zerinde kurutulur Kurutma i lemi gerekle tikten sonra yaymada bir de i iklik yapmak mmkn de ildir

De i ik fiksatiflerle fikse edilmi hcreler (rne in formalin-parafin gibi) cam lam zerine yap mamaktad r. Kromozomlar n boylar n n da kurutma i leminden etkilendi i,hcrenin farkl k s mlar n n farkl ekillerde kurumas yla ispatlanm t r. Hcrenin bir k sm uygun derecede ba ka bir k sm ise ok h zl kurutulmu tur ve h zl kuruyan k s mda kromozomlarda k salma oldu u belirlenmi tir.

Yayma preparatlar faz kontrast mikroskobu ile incelenebilir. ncelenen kromozomlar n morfolojilerine gre farkl yayma tekniklerine ba vurulabilir. Kromozomlar kuruma durumlar na gre gri ya da siyah grlebilir. S radan bir k mikroskobuyla bak ld nda ise,boyanmam kromozomlar n glgelerini grmek mmkndr. Bantlama i lemi de gerekle tikten sonra olu an bantlar n kalitesi yayma i leminin de erlendirilmesine de yard mc olur.

Yayma yapan ki inin amac faz mikroskobunda a a daki zelliklere sahip kromozomlar elde etmektir: Koyu gri kromozomlara nazaran orta derecede gri kromozomlar tercih edilir.A k gri kromozomlar tripsine duyarl hcreler ve bantlar aras nda zay f kontrast olmas na neden olur.

Siyah kromozomlar ise sitoplazmik tabaka arka plan n n olu mas na neden olabilir ve tripsine direnli hcreler meydana getirir. Kk kromozom sa lmalar zaman zaman mozaizm ile kar t r labilir.rne in; mozaizmden pheleniyorsak tan sal bir probleme neden olabilir.Ayr ca,d k yzdelerde gerek mozaizmleri maskeleyebilir.

Kromozom say m ve bant analizinin kesin bir ekilde yap labilmesi iin kromozom ak malar n n minimal dzeyde olmas na dikkat edilir. Stoplazmik arka plan n ok ince olmas Hcre fiksatif sspansiyonun uygun konsantrasyonda olmas nemlidir.A r seyrek hcre konsatrasyonu olmas tarama a amas nda zaman kayb na neden olur. Konsantrasyonun fazla olmas ise G bantlama a amas nda engel te kil eder.

Pipetten veya lamdan gelen cam k r nt lar n n,ve doku paralar n n olmamas .

Fazla gri Az kontrast ok koyu Yksek kontrast

Kaliteli,koyu kromozomlar yi kontrast ve kaliteli kromozom morfolojisi

Nemli lamlar

Nemli lamlar suyun s cakl ayarlanarak kuruma sresini etkileyebilece imiz iin kuru lamlara gre daha avantajl d r. S cak su ile slat lan lamlara yay lan hcreler daha abuk kurur So uk nemli lamlar ise daha ge kurumaktad r. Ortam ko ullar na gre bir seim yap larak nemli lamlar kullan labilir.

Nem ve s cakl

n etkisi

Kuru havalarda fiksatif h zl , nemli havalarda ise yava buharla r Bu iki durumda yayma iin uygun de ildir. Kuruma sresi 30-45 saniye olmal d r.

Kuru havalarda kurumay yava latmak nemli havalarda ise h zland rmak mmkndr. Kurumay yava latmak,ortam nemlendirmek iin bir buhar makinesi kullan labilir. Preparatlara s cak nefes flemek de kuru havan n etkisini azaltmak iin nerilebilecek bir yntemdir. A r nemli havalarda ise kurumay h zland rmak amac yla 6:1 metanol-asetik asit oran nda fiksatif kullan labilir.

Ba ar l bir yayma i lemi gerekle tirebilmek iin ortam ko ullar na ayak uydurmak gerekmektedir. Bu gerekle emedi inde ise ko ullar sabitlenene kadar beklenilmelidir.

Fiksatif oran

Fiksatif ierisindeki alkol hcrelerin sertle mesine asetik asit ise yumu amas na neden olmaktad r. Bu oran n de i mesi hcrelerin yay l m n da etkiler. rne in baz laboratuarlar yay l m g olan kemik ili i rnekleri iin 2:1 oran nda fiksatif kullanmaktad r.

Veya sa l m problemi oldu unda 6:1 asetik asit kullan lmaktad r. Fakat nerilen 3:1 oran nda kullanmakt r nk bu ekilde bantlama i lemi en ba ar l ekilde gerekle mektedir.

Hava ak m

Hava ak m genellikle insanlar n gz ard etti i fakat kuruma a amas iin nemli bir konudur. Hcrelerin kuruma sreleri lam zerindeki hava ak m azalt larak veya art r larak de i tirilebilir.

Bu,preparatlar sallayarak ,bir fan yard m ile veya hava pompas ile sa lanabilir. Hava pompas n n bir di er avantaj ise nemlendirme yetene idir. Preparat kurutmada en etkili yntem kk bir fan kullan lmas d r

Seyreltmek

Yaymada yap lan yanl lardan birisi de lam zerine ok fazla hcre yay lmas d r. Bu durumda preparatta ok fazla metafaz olu ur ve bu kalabal k hcreler yay lamaz ve seyreltilmi hcreler kadar iyi bantlanamaz.

Lam temizli iYayma yap lmadan nce preparatlar n temizlenmesi ;

Dzenli yay lmay sa lar. Kromozom ve bant kalitesini art r r. %95 etanol Etiketleme i lemi 3 numaral veya daha kal n kalem ile yap lmal d r. Kalemin akmamas na dikkat edilmelidir.

Lam kalitesi

Su tabakas n dzgn bir ekilde zerinde tutan eritler olu turmayan zerinde ukurlar olmayan kaliteli lamlar kullan lmal d r.

Ya lanma

G bantlama tekni i laboratuarlarda uygulanmaya ba land nda kromozomlar n bantlanmaya uygun hale gelmesi iin 3-4 gn beklemesi gerekti i d nlyordu Fakat zamanla 20 dakika 90-95 derecede bekletilmesinin kromozomlar n kolayca boyanmas na yeterli oldu u fark edildi. G bantlama iin hcreler 90 derecede 2 saat bekletilebilir.

Bu prosedr henz tam olarak anla lamam t r fakat suyun uzakla t r lmas ile ilgili oldu u bilinmektedir. Protein slfidril gruplar n n oksidasyonu ya lanman n nemli etkilerinden biridir. Ya lanma sreci hcrelere daha kaliteli kontrast ve canl l k kazand r r.

FISH preparatlar nda ya lanma i lemi uygulanmaz Ya lanman n kromozomal DNA degredasyonuna neden oldu u bu nedenle baz bantlama yntemlerinde ve FISH tekni inde kullan lmad d nlmektedir.