09 validacion de metodos analiticos unido ics (n. de...

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21-25 Nov 2005 ICS-UNIDO 1

Validación de Métodos Analíticos

Nilka M.G. de Solís, M.Phil.Validación y Desarrollo de MétodosInstituto Especializado de Análisis


Validación

Según la norma ISO 8402:1994, validación es:

“Confirmación por examinación y provisión de evidencia objetiva que los requerimientos particulares para un uso específico se cumplen”

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¿Por qué Validar?Virtualmente, casi todos los aspectos en la sociedad están fundamentados en mediciones analíticas.


¿Qué requiere la Validación?

Instrumentos calificados y calibrados.Métodos documentados.Estándares de Referencia confiables.Analistas calificados.Integridad de la muestra.

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Calificación del Instrumento

Fabricante, modelo y manuales.Modificaciones.Instalación y calificación operativa.Programas de calibración.Programas de mantenimiento.


Equipos para Análisis

BalanzasUltravioleta-VisibleCromatógrafo LíquidopHmetrosCromatógrafos de Gas

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BalanzasLa balanza es un equipo fundamental en todo laboratorio.Calibración.Fluctuación.


Balanzas

Asegúrese que la balanza está encendida y que la burbuja del nivel está en el centro del indicador.La primera persona que utilice la balanza cada día, debe anotar el peso del peso-patrón en la bitácora de la misma para comparar con datos previos.Si ocurre una desviación mayor que la indicada la balanza debe ser reportada.

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Ultravioleta-Visible

Calibración con:Dicromato de PotasioLuz ReflejadaResoluciónPrecisión de la Longitud de Onda(Vidrio de Holmio)


Calibración con K2Cr2O7

Las soluciones de dicromato de potasio son utilizadas para calibrar la escala fotométrica del equipo y es otro paso importante para determinar el buen funcionamiento del mismo.

Solución Madre: K2Cr2O7 al 0.02% en H2SO40.005N

Soluciones a preparar:0.002, 0.006 y 0.01%

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Procedimiento: Determinar las absorbancias de

cada una de las diferentes concentraciones a las

siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313 y

350nm. Grafique los datos obtenidos y calcule

el A1%1cm para determinar si coincide con los

valores teóricos. Calcule también la

Absortividad

Calibración con K2Cr2O7


λ 235 257 313 350

A1%1cm 124.9 145.2 48.8 107.1

ε 3271 3803 1278 2794

Calibración con K2Cr2O7Control de Absorbancias

4-Abr-05

y = 144.3x - 0.0y = 124.1x

y = 106.8x

y = 48.4x - 0.0

-0.20

0.20.40.60.8

1

0 0.002 0.004 0.006 0.008Concentración (%)

Abs

orba

ncia

Abs 235

Abs 257

Abs 313

Abs 350

Lineal (Abs 257)

Lineal (Abs 235)

Lineal (Abs 350)

Lineal (Abs 313)

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Vidrio de HolmioHo, es un metal perteneciente a las tierras raras en la tabla periódica.El filtro de óxido de Holmio provee discretas y exactas bandas de absorción que son útiles para revisar la precisión de los espectrofotómetros.Las bandas ayudan a detectar la luz visible reflejada y determinar la resolución.


El uso del filtro para obtener un registro, es recomendado una vez instalado, durante la operación y, durante tiempos posteriores. Esta práctica permite la comparación de las características de operación del instrumento, cuando se sabe que está en buenas condiciones.Revisiones ocasionales de los registros ayudarán a detectar cualquier deterioro en el funcionamiento del instrumento.

Vidrio de Holmio

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Precisión de la Longitud de Ondaλteórica

637.5 ± 3.8536.2 ± 2.3453.2 ± 1.4419.0 ± 1.1360.9 ± 0.75333.7 ± 0.35287.5 ± 0.33278.4 ± 0.3241.5 ± 0.2192.3 ± 0.2190.2 ± 0.2


Cromatógrafo LíquidoEquipo indispensable para la cuantificación de los componentes de una muestra.

Calibración inicial.Revisiones programadas.Bitácoras.

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pHmetrosEl pH se define como el valor dado por una unidad adecuada, apropiadamente estandarizada capaz de reproducir valores de 0.02 unidades, utilizando un electrodo indicador sensible al ión hidrógeno (electrodo de vidrio) y un electrodo de referencia.


DisoluciónEquipo para determinar in vitro la biodisponibilidad de una formulación.El tamaño de los ejes de paleta y canasta está especificados en la farmacopea.Las distancias de los ejes al fondo del vaso también están especificadas.

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Disolución

Para asegurar que el equipo de disolución estátrabajando óptimamente se debe realizar una prueba de adecuación del sistema.


Disolución

Una vez calibrado el equipo, no debe moverse del lugar en que está.

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Absorción Atómica


Cromatografía de Gas

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Metodología de Validación de Pruebas

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) es nuestro principal libro de consulta.Procedimientos analíticos para determinar los niveles de calidad de los productos farmacéuticos.Éstos deben reunir ciertos estándares de precisión y veracidad.


Metodología de Validación de Pruebas

Los usuarios de los métodos farmacopéicos no requieren la validación de la precisión y veracidad.Los métodos farmacopéicos sólo requieren verificación de son “adecuados” en las condiciones de uso (Suitability Tests).

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Adecuación del Sistema

Detección de Ibuprofén en tabletas:

ResoluciónPlatos teóricosColeoRSD


Adecuación del SistemaDetección de Clindamicina fosfato en tabletas:

ResoluciónPlatos teóricosColeoRSD

min0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

VWD1 A, Wavelength=210 nm (NDES\06450010.D)

3.9

21

6.2

33

Clindamicina fosfato

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Adecuación del Sistemaconcentration: 1060.1364 ug/mL

before test retention Theoretical PeakInjection peak area time Plates Tailing

1 18383 5.299 4128 1.4482 18295 5.300 4129 1.4473 18325 5.297 4124 1.4554 18239 5.296 4124 1.4645 18295 5.296 4123 1.455

average : 18310 average : 5.298 average : 4126 average : 1.454stdev: 60 stdev: 0.002 stdev: 3 stdev: 0.007

RSD %: 0.33 RSD %: 0.034 RSD %: 0.07 RSD %: 0.470

summary: The relative standard deviation of the Standard Preparation was 0.33% (required: not more than 2.0%)Peak tailing of the Standard Preparation was 1.454 (required: not more than 2.5)Theoretical plates of the Standard Preparation was 4126 (required: not less than 1700)

Amoxicilina patrón


Validación

La validación de un método analítico es el proceso por medio del cual se establece, por estudios de laboratorio, que las características del mismo cumplen con los requerimientos para los que se propone la aplicación.

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ValidaciónValidar un método requiere la determinación de los siguientes puntos:

ExactitudPrecisiónEspecificidadLímite de DetecciónLímite de CuantificaciónLinearidad y RangoReproducibilidad (Ruggedness)Robustez


Validación

Diferentes tipos de Pruebas Analíticas.Categoría I: Cuantificación de componente mayoritario.Categoría II: Detección y cuantificación de impurezas.Categoría III: Determinación de desempeño.Categoría IV: Identificación.

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Parámetros necesarios para Validación de Ensayos

*XXRangoXXLinearidad

XLímite de Cuantificación

XLímite de Detección

XXXXEspecificidadXXXPrecisión

*XXExactitud

IVIIIII

límiteII

cuant.IPARAMETRO


ExactitudDefinición: La exactitud de un método analítico es la cercanía de los resultados obtenidos por el método al valor real.Determinación: Se lleva a cabo utilizando un patrón de pureza conocida o, comparando los resultados del método con aquellos de otro bien caracterizado, cuya exactitud esté definida o, añadiendo cantidades del analito a una mezcla sintética del producto.

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Exactitud

mi0 1 2 3 4 5 6 7 8

Norm.

0

5

10

15

20

25

30

35

VWD1 A, Wavelength=220 nm (NDES\USPIBU10.D)

2.4

55

6.8

50

8.2

25

Muestra de Levonorgestrel e Ibuprofén.

Levo

norg

estre

l

Áre

a: 2

92.3

Ibup

rofé

n

Áre

a: 4

41.8

7


Exactitud

C1 = Concentración determinada en la muestra fortificada.C2 = Concentración determinada en la muestra no fortificada.C3 = Concentración utilizada para fortificar.

100/)((%)Re 321 xCCCcuperación −=

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PrecisiónDefinición: Es el grado de congruencia entre resultados de pruebas individuales cuando el método es aplicado repetidamente a muestreos múltiples de una muestra homogénea. Se puede medir por el grado de reproducibilidad o repetibilidad del método analítico.Determinación: Es necesario ensayar un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea (al menos 9).


ReproducibilidadDefinición: Es el grado de congruencia de los resultados obtenidos del análisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones (diferentes laboratorios, diferentes lotes de reactivos, diferentes temperaturas de ensayo, diferentes analistas, diferentes días, etc.)

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Precisión

min0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

VWD1 A, Wavelength=210 nm (NDES\33B14024.D)

6.3

29 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

30 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

31 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

26 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

24 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

21 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o


Precisión: valor real 14.06

Réplica analista 1 Analista 2 Analista 31 14.3 14.6 14.92 14.3 14.7 15.13 14.2 14.5 15.24 14.3 14.5 155 14.1 14.8 15

Promedios 14.24 14.62 15.04s 0.09 0.13 0.11V 0.008 0.017 0.013

0.01266667Repetibilidad 0.11

Promedio de Promedios 14.63 Sesgo 0.57Reproducibilidad (s) 0.40

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Relación entre Exactitud y Precisión

Inaccurate &imprecise

Inaccurate butprecise

Accurate butimprecise Exacto y Preciso


Especificidad

Definición: Es la habilidad de determinar sin ninguna equivocación, al analito, en presencia de otros componentes que se espera estén presentes, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.

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Especificidad

Perfil de Anamú

Minutes0 10 20 30 40 50 60

mA

U

-250

0

250

500

750

mA

U

-250

0

250

500

750

3,9 4,6

5,6

6,9

9,1

11,5

13,3

14,1

15,3 17

,819

,321

,3 22,6

24,1

25,1

26,2

29,8

31,4

32,7

33,9

36,8

39,1

40,5

42,0

44,2

44,9

46,4

48,1 49

,751

,553

,055

,6

Detector A-190 nmAnamuanamu10002

Retention Time

Perfil de Anamú

Minutes0 10 20 30 40 50 60

mA

U

-200

0

200

mA

U

-200

0

20011

,012

,013

,714

,817

,5

24,5

31,1

33,5

36,5

38,9

41,9

48,2 49

,7

Detector A-190 nmAnamuanamu10001

Retention Time


Límite de DetecciónDefinición: Es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada (2:1 ó 3:1).Determinación: Análisis de muestras con concentraciones conocidas del analito, para establecer el mínimo nivel al cual éste puede ser verazmente detectado.

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Límite de Cuantificación

Definición: Es característico de los ensayos cuantitativos para compuestos de bajos niveles en matrices de muestras, tales como impurezas y productos de degradación. Es la cantidad más baja de analito que puede ser determinada con precisión aceptable (10:1).


Límites de Detección y Cuantificación

Límite de Detección

Límite de Cuantificación

Razón Señal/Ruido

Pico B

LOQ

Pico A

LOD

Línea Base Ruido

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Límite de DetecciónRéplicas Conc % positivos Resultados +/

10 200 100 10+/0-10 100 100 10+/0-10 75 50 5+/5-10 50 10 1+/9-10 25 0 0+/10-

Límite de Detección

020406080

100120

0 50 100 150 200 250

Conc. (mcg/mL)

% d

atos

pos

itivo

s


Linearidad y RangoLinearidad: Es la habilidad para producir resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en muestras dentro de un rango dado.Rango: Es el intervalo entre los niveles inferior y superior del analito, que han demostrado pueden ser determinados con un apropiado nivel de precisión.

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Curva de Ringbom-Método UV294 nm-Moxifloxacino HCl

Solvente: água

12

34 5

5030242018

16141210 119876

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100

log concentração (µg/mL)

100-

%T


Linearidad y Rango

Cuantificación de Fusafungina en inhaladores:

El rango lineal está entre los 200 y 450ppm.

Amount[mg/vial]0 200

Area

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

23

1

Fusafungina 1, VWD1 A

Correlation: 0.99865

Rel. Res%(2): -2.999

Area = 7.95763468*Amt -63.121544

25


Linearidad y Rango

Rango lineal para el Candesartáncilexetilo: 3 a 18ppm

Amount[% disuelto]0

Area

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

3

2

1

Candesartán cilexetilo, VWD1 A

Correlation: 0.99952

Rel. Res%(3): 2.482

Area = 107.250196*Amt +22.471283


Robustez

Definición: Es la medida de la capacidad para no ser afectado por pequeñas, pero deliberadas variaciones en los parámetros del método, lo cual provee una indicadión de su veracidad durante el uso cotidiano.

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Robustez

m0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


6.3

29 -

Can

desa

rtán

cile

xetil

o

mi0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

100

200

300

400


4.9

10 -

Fus

afun

gina

1

5.2

87 -

Fus

afun

gina

2

5.7

17 -

Fus

afun

gina

3

6.2

08 -

Fus

afun

gina

4

m0 5 10 15 20 25 30 35

Norm.

0

5

10

15

20

25

30

35

VWD1 A, Wavelength=210 nm (NDES\06030001.D)

6.2

00 7.2

80

10.

043

13.

196

16.

824

18.

088

20.

249

21.

131


Robustez

Se puede hacer de dos maneras:Variando una a una las variables o factores que se consideran sospechosos (estudio incompleto).Realizando variaciones sistemáticas para determinar cómo varía el resultado del ensayo (estudio completo).

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Determinación de pH con electrodos de vidrio:

A, temperaturaA-: 30º A+: 25º

B, agitaciónB-: No B+: Si

C, dilución de la soluciónC-: N C+: Si


Diseño de Plackett-Burman

2.993Promedio

2.949+---+++8

3.049-++--++7

3.055-+-++-+6

2.999+-++--+5

2.964--++++-4

3.006++-+-+-3

3.015+++-+--2

2.904-------1

GFEDCBAResultado

EnsayoFactor

No.

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Robustez

Si realizamos la estimación del efecto del factor A

041.044

)( =−

−+

= ∑∑ AAAEfecto

041.044

)( =−

−+

= ∑∑ AAAEfecto


Re-Validación

La Farmacopea establece que se debe hacer una re-validación si:

Existe un cambio en la composición del producto farmacéutico.Se realiza un cambio en la síntesis de un principio activo.Cuando hay cambios en el procedimiento analítico.

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BibliografíaUSP 28 Artículo <1225> Validationof Compendial Methods, 2005.Validación de Métodos para Análisis Químico, Celia Puglisi y Fernando Kornblit, Buenos Aires, Marzo, 2005.Manual de Calibración de la Instrumentación Analítica, Laboratorio de Disolución, I.E.A.


BibliografíaSupplementary Training Modules on Good Manufacturing Practice. Validation Part 4: QC Related Validation, WHO-EDM, 1/2002.The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Eurachem, Teddington Ltd., 1998.

30


A Todos los Presentes

Gracias por su atención!

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