AnalitiAnalitiččke metode separacijke metode separacijee i i odreñivanjodreñivanjaa izoenzimaizoenzima

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

Razlike u osobinama Razlike u osobinama multiplihmultiplih formi formi enzimaenzima• Katalitičke razlike

– Izoenzimi sa multiplim genskim lokusima• Km za supstrate se razlikuje

• Osetljivost na inhibitore

• Aktivnost sa analozima supstrata

– Izoenzimi nastali post traslacionim modifikacijama• Slične katalitičke aktivnosti

• Antigenska svojstva

• Rezistencija na denaturaciju– Toplotom

– Koncentrovanim rastvorima ureje

• Naelektrisanju molekule– Zonska elektroforeza

– Jonoizmenjivačka hromatografaija

– Izoelektrofokusiranje

• Molekulskoj veličini

• Molekularno prosejavanje

• Gel filtracija

Metode separacije Metode separacije izoenzimaizoenzima

• Elektroforetske• Hromatografske• Hemijska i temperaturna inaktivacija• Kinetička svojstva• Imunohemijske metode

ElektroforetskeElektroforetske tehnike u analizi tehnike u analizi izoenzimaizoenzima

• Razne elektroforetske tehnike su u upotrebi za separaciju izoenzima, ali generalno one se ne koriste rutinski zato što:– dugo traju

– teško je kvantifikovati

– relativno su skupe

• Izoelektrofokusiranje se uspešno primenjuje za separaciju izoformi koje se razlikuju samo u količini kovalentno vezanih ostataka šećera, kao što je sijalinska kiselina.

• Jonoizmenjivačka hromatografija omogućava da se izoenzimske molekule razdvajaju na osnovu naelektrisanja molekule pri odreñenom pH

• Tipičan jonoizmenjivački materijal je DEAE celuloza u kojoj se jonizabilne DEAE grupe vezane za matrix inertnu celulozu

• Jonoizmenjivačka hromatografija generalno ne razdvaja tako dobro kao zonska elektroforeza vrlo slične proteine, ali zato se veće količine proteina-enzima mogu razdvojiti sa dobrom enzimskom aktivnošću

– ova tehnika ima veliki značaj za prečišćavanje enzima

• Druge forme hromatografije se koriste za frakcionisanje izoenzimskihsmeša i to su HPLC i afinitivna hromatografija.

• Afinitivna hromatografija se zasniva na razlikama izoenzima u njihovom afinitetu za specifične ligande koji su vezani za inertan nerastvoranpotporni nosač koji se koristi kao stacionarna faza u hromatografskojkoloni

HromatografskeHromatografske tehnike u analizi tehnike u analizi izoenzimaizoenzima

Hemijska i toplotna Hemijska i toplotna inaktivacijainaktivacija

• Selektivna inaktivacija izoenzima pod kontrolisanim uslovima

• Metoda se zasniva na razlikama u stabilnosti koja proističe iz malih

promena u strukturi proteinskih molekula.

• Denaturacija enzima:

– Povišena temperatura

– Koncentrovani rastvor ureje ili drugih reagenasa

• Brzina enzimske inaktivacije ovim agensima je kritično zavisna od

uslova eksperimenta.

• Uslovi se moraju strogo kontrolisati ukoliko se uzorci žele porediti

– Primer: razdvajanje izoenzima i izoformi ALP toplotnom inaktivacijom

KatalitiKatalitiččka svojstva ka svojstva izoenzimaizoenzima

Razlike u katalitičkim svojstvima izoenzima:1. Razlike u vrednostima Km relativnim brzinama reakcija sa

analozima supstrata– Kada specifičnost enzima omogućava varijacije u strukturi

supstrata

2. pH optimum

3. Uticaj inhibitora- Razlike izmeñu izoenzima produkata multiplih genskih lokusa

• Razlike predstavljaju osnovu za metode identifikacije i merenja odreñenog izoenzima

• Ove tehnike se generalno ne koriste rutinski i uglavnom su zamenjene sa imunohemijskim metodama

ImunohemijskeImunohemijske metode odreñivanja metode odreñivanja izoenzimaizoenzima

• Imunohemijske metode analize izoenzima se praktično mogu primeniti za izoenzime produkte multiplih genskih lokusa

– antigenski različiti izoenzimi

– Primena monoklonskih antitela je uvelo imunohemijske metode u odreñivanju multiplih formi enzima jer je veća moć razdvajanja

• Dve vrste imunohemijskih metoda:

1. Merenje mase2. Merenje aktivnosti

– Neke metode koriste katalitičku aktivnost izoenzima

– Na primer rezidualna aktivnost izoenzima se meri posle reakcije sa antitelima

• Radioimunoesej– Kompeticija radioaktivno obeleženih izoenzima sa neobeleženim izoenzimima

za vezujuća mesta na antitelima

– Ne zavise od katalitičke aktivnosti odreñivanog izoenzima

• Automatizovane imunohemijske metode za merenje izoenzima– uobičajene rutinske metode za merenje izoenzima– primer: merenje masene koncentracije izoenzima CK-MB ELISA na čvrstoj fazi

ElektroforetskeElektroforetske tehnike razdvajanja tehnike razdvajanja izoenzimaizoenzima

Različiti potporni medijumi• Razdvajanje na osnovu naelektrisanja• Celuloza acetata• Agaroza• Razdvajanje na osnovu naelektrisanja i veličine

molekule• Skrobni gel• Poliakrilamidni gel

• Razdvajanje slično razdvajanju proteina seruma

Aparatura za Aparatura za elektroforetskoelektroforetsko razdvajanje razdvajanje izoenzimaizoenzimaHorizontalna Horizontalna elektroforezaelektroforeza

ElektroforetskiElektroforetski sistem za analizu sistem za analizu izoenzimaizoenzimaVertikalnaVertikalna elektroforezaelektroforeza

Vertikalna elektroforezaSistem nanošenja uzoraka

ispravljač struje

kada za elektroforezu

sudovi za bojenje i odbojavanje

aplikator

ElektroforetskiElektroforetski sistem za analizu sistem za analizu izoenzimaizoenzima

DenzitometriranjeDenzitometriranje

Metode detekcije razdvojenih Metode detekcije razdvojenih izoenzimaizoenzima

• Hromogene metode bojenja

– Kisela fosfataza bojenje za fenolftalein fosfatom

• Fluorogene metode bojenja

– 4-metilumberiferil

– NADH i NADPH

• Radioaktivno bojenje

• Hemijsko bojenje derivatima alfa i beta-naftola

• Enzimske reakcije gde dolazi do prenosa elektrona

U upotrebi su dva sistema bojenje:

– MTT metil tiazolil tetrazolijum kao akceptor za dehidrogenaze

– 3-amino-9-etilkarbazol kao akceptor za oksidaze i peroksidaze

FluorogeneFluorogene metode bojenjametode bojenja

Hemijska Hemijska detekcijadetekcija

Hemijske formule alfa i betaHemijske formule alfa i beta--naftolanaftola za hemijsko za hemijsko bojenje bojenje izoenzimaizoenzima

Druga komponenta Druga komponenta diazodiazo bojenjabojenja

Hemijska detekcija sa diazo reakcijom:alfa-naftol i FAST GARNET

Esteraza 3

Beta naftil acetataFast blue RR

Dehidrogenaze

DetekcijaDetekcija reakcija sa transferom elektronareakcija sa transferom elektrona

U upotrebi su dve boje:1. MTT metil tiazolil tetrazolijum akceptor za dehidrogenaze2. 3-amino-9-etilkarbazol akceptor za za oksidazeoksidaze i i peroksidazeperoksidaze

Reagens rastvor sadrži MTT i PMS (Fenazin metosulfat)Redukcijom MTT donorom elektrona nastaje tamno plavi, nerastvoran formazan

Bojenje Bojenje tetrazolijumtetrazolijum solimasolimaStvaranje nerastvornog formazana redukcijom:a) MTT metiltiazolil blueb) NBT nitroblue tetrazolium

Boje sa transferom elektronaBoje sa transferom elektrona

3-amino-9-etilkarbazol akceptor za oksidaze i peroksidaze

Metode separacije i Metode separacije i kvantifikacijekvantifikacije izoenzimaizoenzima LDLD

1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu je metoda koje se najčešće koristi za razdvajanje izoenzima LD

• Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva preko potpornog medijuma.

• Reakciona smesa: L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L, pufer pH 8,0. Osloboñeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje:

– fluorescencijom na UV 365 nm

– redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan.

Referentne vrednosti• LD-1 4-26%• LD-2 29-39%• LD-3 20-26% • LD-4 8-16%• LD-5 6-16 %

DenzitometriranjeDenzitometriranje izoenzimaizoenzima laktatlaktatdehidrogenazedehidrogenaze

Analiza zimogramaA normalni serum (1)B akutni infarkt miokarda LD1↑ (8)C malignitet LD3 ↑ (4)D kongestivno oštećenje srca i LD5 ↑ povećan zbog kongestivnog

oštećenja jetre (5)