Seminarski rad iz predmeta “Biohemijska analitika”

Predmetni nastavnik: prof. dr. Edhem Hasković

Studenti: Đogić Selma

Karahodžić Arnela

Sarajevo, 2012. godine

ANALITIKA LIPOSOLUBILNIH ANALITIKA LIPOSOLUBILNIH VITAMINAVITAMINA

UNIVERZITET U SARAJEVUPRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTETODSJEK ZA BIOLOGIJU

VITAMINI

Vitamini su organski spojevi različite hemijske strukture potrebni organizmu u malim količinama (od µg do mg vrijednosti po danu), a nužni su za održavanje zdravlja, rasta i reprodukciju.

Čovječji organizam ne može sam sintetizirati vitamine, nego mora njih ili njihove prekursore unositi hranom.

Uobičajena miješana hrana redovno sadrži dovoljne količine vitamina.

Međutim, neodgovarajuća prehrana može uzrokovati manjak nekog vitamina, što dovodi do hipovitaminoze ili čak avitaminoze.

Mnoge su avitaminoze praćene poremećajem u razvoju i rastu, a česte su i promjene na koži.

Hipervitaminoze (višak vitamina) vrlo su rijetke i nikad ih ne uzrokuje prehrana. Do hipervitaminoze može doći uglavnom samo ako se predozira vitaminska terapija.

Prema topljivosti vitamini se dijele na vitamine topljive u mastima (liposolubilne) i vitamine topljive u vodi (hidrosolubilne).

U mastima su topljivi vitamini A, D, E, F i K.Koncentracija vitamina relativno se rijetko određuje u

kliničke svrhe, iako bi to trebalo češće činiti, kako za utvrđivanje hipovitaminoza, kad obično još izostaju klinički simptomi koji se pojavljuju tek kod avitaminoza, tako i u praćenju vitaminske terapije da ne bi došlo do hipervitaminoze.

VITAMIN A (RETINOL)Vitamin A se susreće u tkivima životinja i čovjeka, dok ga biljke

ne sadrže.Međutim, u biljkama se nalaze karotinoidi koji su izvor ovog

vitamina, odakle se obrazuje pod uticajem odgovarajućeg enzima (karotinaze).

Nalazi se u jetri morskih i slatkovodnih riba, u mrkvi, puteru, ribljem ulju.

Dnevna potreba za vitaminom A u čovjeka iznosi 2-3 mg.Iz digestivnog trakta i karotin i vitamin A odlaze u jetru gdje se

karotin prevodi u vitamin A, a vitamin A putem krvi biva transportovan do tkiva gdje utiče na tok metabolizma.

U krvnoj plazmi zdravih ljudi vitamin A je vezan za albumine i gamaglobuline (oko 50 mg na 100 ml plazme).

Kad se unosi malo vitamina A nastaje hipovitaminoza A, a ako se uopšte ne unosi nastaje avitaminoza koja se liječi konzumiranjem ribljeg ulja.

Hipovitaminoza A- niktalopija (noćna sljepoća)- kseroftalmija (“suho oko”)

Hipervitaminoza A - gubitak kose, - glavobolja,- pospanost, - abdominalne tegobe, - jako znojenje, - pucanje noktiju. Hipervitaminoza se obično pojavljuje pri konzumiranju više od 30

mg retinola na dan. Manje doze (oko 10 mg) mogu također uzrokovati hipervitaminozu

A ako se uzimaju duže vrijeme (više od 6 mjeseci).

Akutna trovanja sa smrtnim ishodom u čovjeka su zapažena pri konzumiranju jetre polarnog medvjeda, koja sadrži više od 12 mg retinola po 1 g jetre.

Oralna kontraceptivna sredstva povećavaju koncentraciju vitamina A u serumu.

Koncentracija karotena povećana je u djece s hipotireozom, jer jetra ne može pretvarati karotene u vitamin A.

Isto je i kod prehrane s mnogo karotena (mrkva, paradajz) i hiperlipoproteinemije u šećernoj bolesti.

METODE ODREĐIVANJA VITAMINA AStarije hemijske metode za određivanje vitamina A se koriste

samo ako HPLC nije dostupna.Hemijske metode uključuju Carr-Price spektrofotometrijsku

metodu koja se koristi antimon-trihloridom u hloroformu kao reagensom i Neeld-Pearson metodom pri kojoj se koristi trifluorooctena kiselina kao reagens.

Trifluorooctena kiselina reaguje s elektronima u konjugiranim dvostrukim vezama vitamina A (i karotenoida) i stvara plavo obojeni spoj.

Obje se metode koriste reagensima koji su korozivni i nespecifični, dugotrajne su i ne mogu se automatizirati, te trebaju veliki volumen uzorka za analizu.

S HPLC-om su znatno poboljšane specifičnost, tačnost i reproducibilnost određivanja vitamina A te je smanjena granica detekcije (manje od 0,07 µmol/L).

Referentni interval za vitamin A u serumu izmjeren HPLC-om iznosi 1,05-2,80 mol/L, za β-karoten 0,19-1,58 µmol/L.

VITAMIN D (KALCIFEROL)Vitamin D se zbog historijskih razloga svrstava među

vitamine, iako je po većini obilježja riječ o hormonu (steroidna struktura, mehanizam djelovanja).

Postoje dva tipa vitamina D, životinjski kalciferol ili kolekalciferol ili vitamin D₃, i biljni ergokalciferol ili vitamin D₂.

Odrasle, zdrave osobe dnevne potrebe organizma za vitaminom D nadoknađuju izlaganjem suncu ili ga dobivaju hranom.

Dnevna preporučena količina vitamina D potrebna za održavanje normalnog zdravlja iznosi 5- 10 µg.

Ima ga u ulju iz jetre tune i drugih riba, mesu tune, maslacu i malo u mlijeku.

U plazmi se nalaze razni hidroksi-derivati vitamina D₃.Određivanje koncentracije vitamina D primjenjuje se u

diferencijalnoj dijagnostici hipokalcijemija i hiperkalcijemija te koštanih bolesti.

Pravu, kliničku sliku daje određivanje koncentracije 25(OH)D₃ i 1,25(OH)₂D₃ u krvi.

Smanjena koncentracija 25(OH)D₃ nalazi se pri nedovoljnoj izloženosti sunčevom svjetlu, nedovoljnom unosu vitamina D hranom, malapsorpciji vitamina D, povećanom gubitku (nefrotički sindrom), a povećane koncentracije 25(OH)D₃ se nalaze kod intoksikacije s 25(OH)D₃.

Smanjena koncentracija 1,25(OH)₂D₃ postoji pri oštećenju bubrega, hiperfosfatemiji, hipomagnezijemiji, hipoparatireoidizmu i hiperkalcijemiji, a povećana koncentracija 1,25(OH)₂D₃ kod primarnog hiperparatireodizma, limfoma i intoksikacije s 1,25(O H)₂D₃.

METODE ODREĐIVANJA VITAMINA D

Za određivanje koncentracije 25(OH)D₃ i 1,25(OH)₂D₃, razvijene su specifične i osjetljive metode koje većinom uključuju 3 glavna stepena.

To su:

a) deproteinizacija zbog oslobađanja vitamina ili njegovih metabolita od DBP-a, najčešće uz acetonitril;

b) hromatografija na koloni zbog odjeljivanja raznih oblika vitamina D, lipida i interferirajućih spojeva te

c) kvantifikacija metodama koje ovise o obliku vitamina D koji se određuje.

Za mjerenje koncentracije 25(OH)D₃, primjenjuje se metoda kompetitivnog vezanja proteina s DBP-om (CPBA) i HPLC.

Za mjerenje koncentracije 1,25(OH)₂D₃, kojeg u serumu ima hiljadu puta manje nego 25(OH)D₃, primjenjuje se RIA nakon razdvajanja s HPLC-om i RIA nakon ekstrakcije.

Referentni interval za koncentraciju 25(OH)D₃ u serumu ili plazmi izmjeren s CPBA-om, ovisno o godišnjem dobu, iznosi 50-300 nmol/L (ljeto) i 25-125 nmol/L (zima).

Referentni interval za koncentraciju 1,25(OH)₂D₃ u serumu određen s RIA nakon ekstrakcije iznosi 75-200 µmol/L.

Koncentracija vitamina D veća je tokom trudnoće, u djece i u fazi intenzivnog rasta.

VITAMIN E (TOKOFEROL)

Vitamin E je sastavljen od osam sličnih hemijskih spojeva (optičkih izomera), tokoferola, koji svi imaju izraženo antioksidativno djelovanje koje se temelji na uklanjanju slobodnih radikala i molekularnog kisika, a također imaju ulogu u procesu ćelijskog disanja.

Tokoferola ima u pšeničnim i kukuruznim klicama, maslinovom ulju, bademima, kikirikiju, jajima i u nekim mliječnim proizvodima (mlijeko, margarin).

Dnevna potreba u čovjeka je oko 15 mg.

Tokoferoli djeluju kao antioksidansi u prevenciji lipidne peroksidacije polinezasićenih masnih kiselina u ćelijskim membranama, gdje štite membranske fosfolipide od oštećenja oksidacijom polinezasićenih kiselina vodikovim peroksidom, no njihova puna biokemijska funkcija nije još poznata.

Vitamini E i C djeluju sinergistički u smanjivanju lipidne peroksidacije.

Manjak vitamina E može se dovesti u vezu s mišićnom distrofijom.

Simptomi manjka vitamina E jesu iritabilnost, edemi i hemolitička anemija do koje dolazi zbog kraćeg vijeka eritrocita, odnosno kao rezultat oštećenja njihovih membrana.

Manjak vitamina E može se pojaviti u prematurusa i novorođenčadi koji se rađaju s malom tjelesnom masom, jer vitamin slabo prolazi posteljicu.

U serumu je tokoferol oko 80% slobodan, a 20% u obliku acetata.

U serumu se nalazi najprije u lipoproteinima niske gustoće (LDL).

Razni preparati koji sadrže vitamin E preporučuju se za prevenciju srčanih bolesti, smanjenje LDL-holesterola, podizanje imunosti te sprječavanje zloćudnih bolesti.

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE VITAMINA E

Za mjerenje koncentracije vitamina E u serumu prije su se primjenjivale direktne spektrofotometrijske ili fluorometrijske metode u kojima se tokoferol oksidira s ferihloridom u

tokoferilkinon, a nastalo dvovalentno željezo odredi se α,α'-dipiridilom, tripiridilom ili batofenantrolinom, pri čemu nastaje crveno obojenje.

U tim metodama interferira karoten, a interferirajući spojevi mogu se ukloniti hromatografijom.

Za kvantifikaciju tokoferola, HPLC je metoda izbora zbog svoje tačnosti i reproducibilnosti (referentni interval za djecu od 1 do 14 god iznosi 13,3-38,6 mmol/L, a za odrasle osobe 21,8-50,4 mmol/L).

VITAMIN K

Vitamin K čini skupina od nekoliko vitamina (K1 - K5).

U terapijske svrhe koriste se uglavnom K1 (fitomenadion) koji se sintetizira u zelenim dijelovima biljaka, K2 (menakinon) koji sintetiziraju mikroorganizmi i K3 (menadion) koji se sintetički dobiva iz a 1,4-naftokinona.

K1 i K2 su topljivi u mastima, a K3 je topljiv u vodi.

U prirodi dolaze dva vitamina: K1 i K2.

Vitamina K ima u zelenom lišću špinata, zelju, rajčici, soji i dr.Manjak vitamina K uzrokuje sklonost krvarenju i poremećaje u

koagulaciji krvi, jer se ne stvara dovoljno protrombina.Preporučuje se dnevni unos hranom od 50 do 80 mg.U krvi se prenosi vezan na β-lipoproteine.

Biološka mu je uloga u koagulaciji krvi, potreban je za sintezu koagulacijskih faktora protrombina (faktor II), prokonvertina (faktor VII), tromboplastinske komponente plazme (faktor IX) i Stuartovog faktora (faktor X).

Vitamin K je koenzim karboksilaze ovisne o vitaminu K, koja katalizira posttranslacijsku g-karboksilaciju glutaminskih ostataka više proteina plazme, uključujući faktore zgrušavanja II, VII, IX i X.

Svi se ti proteini sintetiziraju u jetri. U odsutnosti vitamina K faktori zgrušavanja ovisni o vitaminu K

inaktivni su proteini.Faktori zgrušavanja sintetizirani uz vitamin K sadržavaju 10 g-

karboksiglutaminskih ostataka u molekuli, koji imaju jaku sklonost za vezanje kalcijevih iona.

U procesu -karboksilacije vitamin K-hidrokinon prelazi u vitamin K-epoksid koji se uz reduktazu i NADH ponovno reducira u vitamin K-hidrokinon.

Antikoagulansi tipa kumarina djeluju na zgrušavanje tako što koče spomenutu redukciju pa se primjenjuju u terapiji tromboza.

Dugotrajna terapija sulfonamidima ili antibioticima uništava crijevnu floru, pa može doći do znakova manjka vitamina K.

Faktori koji mogu dovesti do smanjene apsorpcije jesu bilijarna opstrukcija, oštećenje jetre ili slaba apsorpcija masti u crijevima.

Simptomi manjka vitamina K jesu pojava krvarenja i produženje vremena zgrušavanja krvi.

METODE ODREĐIVANJA VITAMINA K

Budući da je vitamin K prisutan u plazmi u relativno malim koncentracijama (50 puta manjim nego vitamin D), dugo se status vitamina K procjenjivao funkcionalnim metodama.

Jedna od njih jest njegov učinak na protrombinsko vrijeme (PV) koje je u slučaju manjka vitamina K produženo na oko 30 sekundi (normalno PV: 10-14 sekundi).

Oko hiljadu puta osjetljiviji pokazatelj statusa vitamina K jest koncentracija des--karboksiprotrombina ili nekarboksiliranog protrombina koja se može odrediti imunohemijskim metodama.

Za izravno određivanje vitamina K postoje razne spektrofotometrijske metode.

S natrijevim etilatom vitamin K stvara crveni kompleks, a s dietil-ditiokarbamatom u alkoholnoj lužini daje plavu boju.

Ako se naftokinonski prsten katalički reducira u hidrokinon, može se mjeriti smanjenje boje 2,6-dihlorfenol-indofenola.

Metoda izbora za određivanje koncentracije vitamina K u plazmi je HPLC s elektrohemijskom ili fluorometrijskom detekcijom.

Referentni interval iznosi 0,29-2,64 nmol/l.

LITERATURA

Štraus, B. (2009). Medicinska biokemija, treće izdanje. Medicinska naklada, Zagreb.

Štraus, B. (1992). Medicinska biokemija, drugo; obnovljeno i dopunjeno izdanje. Medicinska naklada, Zagreb.