IMPACT OF HYPERGLYCEMIA ON EARLY EMBRYO DEVELOPMENT AND

EMBRYOPATHY : IN VITRO EXPERIMENTS USING A MOUSE

MODEL

PEMBIMBING : dr. TIGOR P. SIMANJUNTAK, Sp.OG.OLEH : TATIH / 1061050159

KEPANITERAAN ILMU KEBIDANAN DAN KANDUNGAN FK UKIJAKARTA 2015

ABSTRACT

BACKGROUND: The aim of this study is to model the processes of early embryopathy seen in human pregnancy complicated by maternal hyperglycemia secondary to maternal diabetes using a mouse embryo culture system.

METHODS: Female mice were superovulated and mated in pairs. Two-cell embryos were harvested from the oviducts and cultured in vitro in KSOM medium (synthetic oviductal medium enriched with potassium) supplemented with 0.2, 5.56, 15.56 or 25.56 mM D-glucose. Cell proliferation, differentiation and apoptosis were assessed. Experiments were performed in constant, embryos exposed to a particular concentration of glucose (0.2, 5.56, 15.56 or 25.56 mM) from harvest to either Day 5 post fertilization (pf) or Day 8 pf, and fluctuating, embryos exposed to alternate high 25.56 mM and normal 5.56 mM concentrations of glucose between harvest and Day 5 pf, glycemic culture.

ABSTRACT

RESULTS: Expected levels of blastocyst formation and hatching were seen at 0.2 and 5.56 mM concentrations of glucose but both were impaired at higher concentrations (x2 , P < 0.005; P < 0.001). Total cell numbers (P < 0.002) and cell allocation to the inner cell mass (P < 0.01) were reduced, but with no evidence of enhanced apoptosis in the hyperglycemic cultures. Variation in hyperglycemic exposure of the embryos on Days 2, 3 and 4 showed no adverse effects of hyperglycemia up to 24 h, but 48 and 72 h exposures were equally embryopathic (P < 0.01).

CONCLUSIONS: Hyperglycemic exposure for >24 h is toxic to early embryo development. These findings may explain the lower than expected implantation rates and higher than expected rates of congenital abnormality and early pregnancy loss seen in patients with diabetes, particularly those with poor diabetic control.

Keywords: embryopathy; hyperglycemia; in vitro; mouse embryo; diabetes

ABSTRAK

LATAR BELAKANG : Tujuan dari penenlitian ini adalah untuk mengetahui proses awal embriopati yang terlihat pada wanita hamil dengan komplikasi hiperglikemia sekunder pada ibu diabetes menggunakan sistem kultur embrio tikus.

METODE : Tikus betina yang subur dan dikawinkan dengan pasangannya. Dua sel embrio diambil dari saluran telur dan dikultur secara in vitro pada media KSOM (media saluran telur sintesis yang diperkaya dengan potasium) dilengkapi glukosa 0.2, 5.56, 15.56 atau 25.56 mM. Proliferasi sel, diferensiasi dan apoptosis dinilai. Percobaan dilakukan dengan memberikan pajanan konsentrasi glukosa (0.2, 5.56, 15.56 atau 25.56 mM) secara terus menerus pada embrio dari pengambilan pada hari ke 5 post fertilisasi (pf) atau hari 8 pf, dan embrio diberikan pajanan konsentrasi glukosa yang tinggi 25.56 mM dan konsentrasi glukosa yang normal 5.56 mM secera bergantian.

ABSTRAK

HASIL : Diduga peningkatan pembentukan blastosis terlihat pada konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56 mM tetapi keduanya dihambat pada konsentrasi glukosa yang lebih tinggi (X2, P<0.005 ; P<0.001). Pada kultur hiperglikemia, total jumlah sel (P<0.002) dan alokasi sel inner cell mass (P<0.001) dikurangi, tetapi tanpa ada peningkatan apoptosis sel. Pada embrio variasi pajanan hiperglikemik pada hari ke 2,3,dan 4 menunjukan tidak ada efek buruk hiperglikemia hingga 24 jam, tetapi pada 48 dan 72 jam paparan dapat menyebabkan embriopati (P<0.01).

KESIMPULAN : Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia selama > 24 jam bersifat toksis. Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa terdapat peluang lebih rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat peluang lebih tinggi terjadinya kelainan kongenital dan keguguran yang tampak pada pasien diabetes, terutama dengan kontrol diabetes yang buruk.

Kata Kunci : Embriopati, hiperglikemia, in vitro, embrio tikus, diabetes

PENDAHULUAN

• Tujuan – untuk mengetahui proses awal embriopati

yang terlihat pada wanita hamil dengan komplikasi hiperglikemia sekunder pada ibu diabetes menggunakan sistem kultur embrio tikus.

• Pada Blastosis (Hari ke 4 kehamilan) lebih tinggi tingkat terjadinya :– fragmentasi inti sel, – pengurangan jumlah inner cell mass (ICM)– meningkatkan insidensi apoptosis ICM

dibandingkan dengan hewan non diabetes.

(Pampfer et al., 1990, 1997 ; Vercheval et al., 1990; De Hertogh et al., 1991a; Moley et al., 1991, 1998a).

Percobaan embrio pada kultur konsentrasi glukosa yang tinggi (20-52 mM) menunjukan adanya:– inhibisi perkembangan blastosis, – inhibisi proliferasi sel dan diferensiasi sel, – meningkatkan apoptosis dan mempengaruhi kadar

metabolit intraembrionik.

(Zusman et al., 1985; Diamond et al., 1989; Pampfer et al., 1990; Wuu et al. 1998; De Hertogh et al., 1991a; Moley et al., 1996, 2001).

HINCK ET AL. 2001.

• Peningkatan kadar ROS dan stimulasi ekpresi dari gen pro-apoptotic (p53 dan Bax) 12, 21 dan efektor apoptotic intraselular (caspase-3 dan caspase -activated deoxyribonuclease) menyebabkan pengurangan jumlah ICM.

Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De Hertogh R, Pampfer S. Identification of Caspase-3 and Caspase-Activated Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their Implication in The Induction of Chromatin Degradation (But Not Nuclear Fragmentation) by High Glucose. Biol Reprod 2001;64:555-562.

PEMBAHASAN

PENILAIAN PERKEMBANGAN TAHAP PREIMPLANTASI

• Morfologi sel• Diferensiasi sel• Proliferasi sel • Apoptosis sel

(A) Blastocyst stained using 4′,6-Diamidino-2 phenylindole (scale bar 50 µm) for assessment of cell proliferation.

(B) Blastocyst stained using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (scale bar 50 µm) for assessment of cell death (apoptosis).

(C) Dual stained blastocyst (scale bar 20 µm) for assessment of cell differentiation

Efek pada Pre-implantasi

• Konsentrasi glukosa (0.2-25 mM) Tingkat perkembangan blastosis pada hari ke 5 post fertilisasi secara signifikan lebih besar pada KSOM (61,2%) dibandingkan pada mKSOM (45.6%).

• Pada preimplantasi embrio hari ke 5 post fertilisasi dengan pajanan glukosa yang tinggi menghasilkan blastosis yang lebih sedikit dibandingkan dengan embrio kontrol (kultur dalam glukosa 5.56 mM)

EFEK HIPERGLIKEMIA PADA BLASTOSIS HARI KE 5 PF

Peningkatan konsentrasi glukosa, bagaimanpun tidak mempunyai efek yang signifikan pada persentasi apoptosis sel. Embrio kontrol positif secara konsisten memiliki mayoritas (>90%) apotosis sel.

HIPERGLIKEMIA DAN APOPTOSIS

Efek pada Peri-implantasi

• Peningkatan konsentrasi glukosa lebih sedikit embrio yang mengandung ICM (P<0.01). – kultur dengan konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56

mM, 80% embrio mengandung ICM. – kultur dengan konsentrasi glukosa 15.56 dan 25.56

mM hanya 60.5% dan 31.3% mengandung ICM.

Efek embriopati maksimal pada konsentrasi glukosa 25.56 mM.

embrio tikus hari 5 pf konsentrasi glukosa 25.56 mM (24, 48 jam) memeriksa pajanan glukosa relatif yang dapat menyebabkan embriopati. (Gambar 3)

Gambar 3. Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo Culture Media on Percentage of 2-Cell Embryos Forming Blastocysts by Day 5 pf.

*Significantly different to control culture (χ2, P < 0.001) Control embryos were cultured in 5.56 mM glucose for the duration of the experiment.

• Pada akhir percobaan proliferasi sel embrio secara signifikan terhambat oleh pajanan glukosa 25.56 mM selama 48 jam tetapi hal ini tidak terjadi pada awal percobaan.

• Selain itu, tidak ada efek signifikan pada apoptosis sel ketika embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa yang tinggi selama 48 jam antara hari ke 2 dan ke 4 pf. (Gambar 2).

Tabel 6. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for Either a 24h or a 48 h Period on The Total Cell Number and Cell Apoptosis on Day 5 pf.

Glucose concentration of medium H = 25.5 6mM, L = 5.56 mM Total cell No of apop % Apoptotic

Day 1 Day 2 Day 3 nExpt 1 Control L L L 36 52.1 ± 3.7 3.8 ± 0.6 7.1 ± 1.2

Early 24 h H L L 33 58.6 ± 3.6 3.9 ± 0.6 7.1 ± 1.2Late 24 h L L H 32 48.3 ± 3.3 3.8 ± 0.8 7.5 ± 1.5

Expt 2 Control L L L 34 50.0 ± 3.0 2.5 ± 0.4 5.3 ± 1.0Early 48 h H H L 29 52.0 ± 3.6 2.9 ± 0.9 5.1 ± 1.4Late 48 h L H H 37 41.5 ± 2.9a 2.4 ± 0.4 6.3 ± 1.1

Expt 3 Control L L L 56 57.5 ± 3.3 4.3 ± 0.9 8.1 ± 1.0Mid 24 h L H L 52 49.3 ± 3.5 3.3 ± 0.5 7.3 ± 0.9

Split 48 h H L H 32 52.8 ± 3.3 3.5 ± 0.5 7.2 ± 1.1

P < 0.05 NS NS

Values are expressed as mean ± SEM.

*aSignificantly different to Experiment 2 Control.

KESIMPULAN

Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia selama > 24 jam bersifat toksis.

Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa terdapat peluang lebih rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat peluang lebih tinggi terjadinya kelainan kongenital dan keguguran yang tampak pada pasien diabetes, terutama dengan kontrol diabetes yang buruk.

DAFTAR PUSTAKA

1. Pampfer S, de Hertogh R, Vanderheyden I, Michiels B, Vercheval M. Decreased Inner Cell Mass Proportion in Blastocysts from Diabetic Rats. Diabetes 1990;39:471-476.

2. Vercheval M, De Hertogh R, Pampfer S, Vanderheyden I, Michiels B, De Bernardi P, De Meyer R. Experimental Diabetes Impairs Rat Embryo Development During The Preimplantation Period. Diabetologia 1990;33:187-191.

3. De Hertogh R, Vanderheyden I, Pampfer S, Robin D, Dufrasne E, Delcourt J. Stimulatory and Inhibitory Effects of Glucose and Insulin on Rat Blastocyst Development In Vitro. Diabetes 1991;a40:641-647.

4. Moley KH, Vaughn WK, DeCherney AH, Diamond MP. Effect of Diabetes Mellitus on Mouse Preimplantation Embryo Development. J Reprod Fertil 1991;93:325-332.

5. Moley KH, Chi MM, Mueckler MM. Maternal Hyperglycemia Alters Glucose Transport and Utilization In Mouse Preimplantation Embryos. Am J Physiol1998;a275:E38-E47.

6. Zusman I, Yaffe P, Ornoy A. Effects of Metabolic Factors in The Diabetic State of The In Vitro Development of Preimplantation Mouse Embryos. Teratology1987;35:77-85.

7. Pampfer S, Moulaert B, Vanderheyden I, Wuu YD, De Hertogh R. Effect of Tumor Necrosis Factor Alpha on Rat Blastocyst Growth and Glucose Metabolism. J. Reprod Fert 1994;c101:199-206.

8. Pampfer S, Vanderheyden I, Wuu YD, Baufays L, Maillet O, DeHertogh R. Possible Role for TNF-Alpha in Early Embryopathy Associated with Maternal Diabetes in The Rat.Diabetes 1995;44:531-536.

9. Moley KH, Vaughn WK, Diamond MP. Manifestations of Diabetes Mellitus on Mouse Preimplantation Development: Effect of Elevated Concentration of Metabolic Intermediates. Hum Reprod 1994;9:113-121.

10. Wuu YD, Pampfer S, Vanderheyden I, Lee KH, De Hertogh R. Impact of Tumor Necrosis Factor Alpha on Mouse Embryonic Stem Cells. Biol Reprod 1998;58:1416-1424.

11. Moley KH, Chi MM-Y, Kuudson CM, Karsmeyer SJ, Muekler MM. Hyperglycemia Induces Apoptosis in Pre-implantation Embryos Through Cell Death Affected Pathways. Nat Med 1998;b4:1421-1424.

12. Moley KH. Hyperglycemia and Apoptosis: Mechanisms for Congenital Malformations and Pregnancy Loss in Diabetic Women. Trends Endocrinol Metab2001;l2:78-82.

13. Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De Hertogh R, Pampfer S. Identification of Caspase-3 and Caspase-Activated Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their Implication in The Induction of Chromatin Degradation (But Not Nuclear Fragmentation) by High Glucose. Biol Reprod 2001;64:555-562.