DNA analysis for thalassemia diagnosis

โครงการอบรมวชิาการเทคนคิการแพทย ์คร ั�งที� 1 ปี 2558 “เรยีนรูก้า้วทนัโรค...กบัเทคนคิการแพทย”์

ธเนตร ประจนัตะเสนคณะเทคนคิการแพทย ์มหาวทิยาลยัสงขลานครนิทร์

29 ก.ค. 2558

Content

ความหมายและความผดิปกตทิี�ทําใหเ้กดิ Thalassemia

วัตถปุระสงคข์องการตรวจดเีอ็นเอสําหรับธาลัสซเีมยี

แนวทางการสง่ตรวจดเีอ็นเอสําหรับธาลสัซเีมยี

วธิกีารตรวจดเีอ็นเอสําหรับหอ้งปฏบิัตกิารธาลัสซเีมยี Gap-PCR Gap-PCR

Real-time PCR

Allele specific PCR (ASPCR)

Reverse dot blot (RDB) hybridization

Automated sequencing

Maternal contamination

การควบคมุคณุภาพ

Thalassemia

- เป็นหนึ�งในโรคที�ถ่ายทอดทางพนัธุกรรมพบบ่อยที�สุด- แบบยีนด้อย (autosomal recessive)- อาการที�สาํคัญ คือมีภาวะโลหติจาง- การสังเคราะห์สายโกลบนิผิดปกติ

- ไม่มีการสร้าง หรือ สร้างได้ลดลง - ไม่มีการสร้าง หรือ สร้างได้ลดลง - มีโครงสร้างผิดปกติ

http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/autorecessivehttp://thalassemia.com/what-is-thal-alpha.aspx#gsc.tab=0

Thalassemia

การผิดปกตริะดับยีนโกลบนิ

mRNA

transcription

5’Cap Splicing

α-globin gene Chromosome 16

β-globin geneChromosome 11

mRNA

สายโกลบินผิดปกต ิ(protein)

translation

SplicingPoly A tail

α-thalassemia Abnormal Hemoglobinβ-Thalassemia

เชิงปริมาณ เชิงคุณภาพ

Thalassemia

ความผดิปกตริะดบัโมเลกลุα-thalassemia

α0-thalassemia หรือ α-thal 1 ส่วนใหญ่เกดิจาก Large deletion

α+-thalassemia หรือ α-thal 2 α+-thalassemia หรือ α-thal 2เกิดจาก Large deletion และ non-deletion

β-thalassemia (point mutation)

β0-thalassemia β+-thalassemiaβ-thalassemia เกิดจาก base substitution หรือ small deletion หรือ small insertion

α0-thalassemia (Large deletion)

พบบ้าง

อัลฟาโกลบนิหาย 2 ยนีในขา้งเดยีวกนัของโครโมโซมHarteveld CL, Higgs DR. Alpha-thalassemia.Orphanet J Rare Dis. 2010 May 28;5:13.

พบบ่อย

พบบ้าง

α+-thalassemia (Large deletion)

อัลฟาโกลบนิหาย 1 ยนีในขา้งเดยีวกนัของโครโมโซม

Harteveld CL, Higgs DR. Alpha-thalassemia.Orphanet J Rare Dis. 2010 May 28;5:13.

ชนดิ 3.7 kb และ 4.2 kb พบบอ่ยในคนไทย

α+-thalassemia (non-deletion)

*Terminal codon mutation

α2 α1

TAANormal

α-globin gene Chromosome 16

Hb Constant Spring

Hb Pakse’

TAA

CAA

TAT

Stop codon (141 amino acid)

Glutamine สรา้งตอ่จนได ้172 amino acid

Tyrosine สรา้งตอ่จนได้ 172 amino acid

Normal

*Unstable Hb and small amount (< 1%)

> 200 mutationsส่วนน้อยเกิดจาก deletion

β-thalassemia (point mutations)

http://www.cixip.com/index.php/page/content/id/558

Objective of DNA analysis

1.สําหรบัพาหะ (Carrier)- Confirmatory test of α-thalassemia 1- β-thalassemia genotype (β0-thal or β+-thal)

2.สําหรบัการตรวจวนิจิฉยัทารกในครรภก์อ่นคลอด 2.สําหรบัการตรวจวนิจิฉยัทารกในครรภก์อ่นคลอด Prenatal diagnosis (PND)

อื�นๆ - abnormal hemoglobin- Complex syndromes

Confirmatory test of Thalassemia

ขอ้จาํกดั Hb typing-มยีนี alpha-thal 1 แฝง?-เป็น β0-thal หรอื β+-thal-PND: ทําไดเ้ฉพาะ Fetal

blood (อายคุรรภม์ากแลว้)

จําเป็นตอ้งตรวจยนีดว้ย

DNA analysis

คณะทํางานจัดทําแนวทางการวินิจฉัยและการรักษาโรคโลหิตจางธาลัซ๊เมีย.แนวทางการวินิจฉัยและการรักษาโรคธาลัสซีเมีย.2014.

When do we perform DNA analysis ?

ควรสง่ตรวจ DNA ในเมื�อใด

มยีนี α-thal 1 ?

Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Sae-ung N, Dangwibul S, Fucharoen S. A simplified screening strategy for thalassaemia and haemoglobin E in rural communities in south-east Asia. Bull World Health Organ. 2004 May;82(5):364-72.

α-thal 1

β0-thal

เสี�ยง 3 โรครนุแรงสามี ภรรยา

เมื�อไดคู้ส่มรสที�มโีอกาสกําเนดิบตุรที�เส ี�ยง 3 โรครนุแรง

α-thal 1

β0-thal Homozygous β0-thal

Hb Bart’s hydrops fetalis

β0-thal

β E

Prenatal diagnosis

β0-thal

β E

Homozygous β0-thal

β0-thal/Hb E disease

ตอ้งสง่ตรวจดเีอ็นเอ

How do we perform DNA analysis ?

Specimen

- EDTA peripheral blood

- เนื�อเยื�อทารกสําหรบัการตรวจวนิจิยักอ่นคลอด- ชิ�นเนื�อรก- นํ �าครํ�า- นํ �าครํ�า- เลอืดทารกในครรภ์

ตวัอยา่งดงักลา่วจะถกูดําเนนิการสกดัดเีอ็นเอ

Fetal tissue

Specimen ไดม้าจากจากการทําหตัการของสตูนิรแีพทย ์

Chorionic villussampling (CVS)

AmniocentesisFetal blood sampling

8 - 12 week of gestation12 – 16 week of gestation 16 – 22 week of gestation

ตรวจ DNA ได้

Hb typing

DNA analysis for thalassemiaความผิดปกติระดับยีน ชนิดยีนที�ผิดปกติ วิธีที�ใช้

Large deletion

α0-thal(SEA and THAI deletion)

Gap-PCRReal-time PCREtc.

α+-thal (3.7 and 4.2 kb) Gap-PCREtc.

β-thal (3.4 kb deletion) Gap-PCR

*ความผดิปกตริะดบัโมเลกลุของธาลสัซเีมยีที�ตา่งกนั หลกัการตรวจวเิคราะห ์DNA ก็ยอ่มจะตา่งกนัดว้ย*

*DNA analysis จะใชเ้ทคนคิ Polymerase chain reaction (PCR) เป็นหลกั*

β-thal (3.4 kb deletion) Gap-PCREtc.

Point mutation(base substitution, small deletion

and small insertion)

α+-thal (non-deletion)- Hb Constant spring - Hb Pakse’

ASPCRRDB Automated direct sequencingEtc.β-thal (β0 , β+)

DNA analysis based on PCR

สว่นประกอบหลกัในปฏกิริยิา

ปฏกิริยิาเพิ�มจํานวนดเีอ็นเอภายในหลอดทดลองตอ่เนื�องกนัเป็นลกูโซโ่ดยอาศยั DNA polymerase ทนรอ้น

http://www.extension.org/pages/32364/the-polymerase-chain-reaction-pcr#.Vah4a_ntmkohttp://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

PCR product detection

- Agarose gel electrophoresis; - Gap-PCR , allele specific PCR (ASPCR)

- Color precipitation; - Reverse dot blot (RDB)

- คา่หรอืกราฟ จากการวเิคราะหด์ว้ย Automation ; - คา่หรอืกราฟ จากการวเิคราะหด์ว้ย Automation ; - Real-time PCR , sequencing

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK190571/figure/ch05-F3/?report=objectonly

DNA analysis for α- thalassemia

สําหรบั α-thal 1- Gap-PCR- Gap-PCR- Real-time PCR

Gap-PCR for α-thal 1

- ออกแบบprimer ครอ่มสว่นบรเิวณที�ขาดหายไป- ในตวัอยา่งที�เกดิจากขาดหายไปน ั�น primer จะเลื�อนมาอยูใ่กลก้นั ทาํใหเ้กดิการเพิ�มจํานวนดเีอ็นได้- วเิคราะห ์PCR product ดว้ย agarose gel electrophoresis

Gap-PCR for α-thal 1

- ออกแบบprimer ครอ่มสว่นบรเิวณที�ขาดหายไป- ในตวัอยา่งที�เกดิจากขาดหายไปน ั�น primer จะเลื�อนมาอยูใ่กลก้นั ทาํใหเ้กดิการเพิ�มจํานวนดเีอ็นได้- วเิคราะห ์PCR product ดว้ย agarose gel electrophoresis

Gap-PCR for α-thal 1

- ออกแบบprimer ครอ่มสว่นบรเิวณที�ขาดหายไป- ในตวัอยา่งที�เกดิจากขาดหายไปน ั�น primer จะเลื�อนมาอยูใ่กลก้นั ทาํใหเ้กดิการเพิ�มจํานวนดเีอ็นได้- วเิคราะห ์PCR product ดว้ย agarose gel electrophoresis

Gap-PCR for α-thal 1

การรายงานผล; Negative for α –thalassemia 1 (–– SEA and THAI deletions)Positive for heterozygous α –thalassemia 1 (ชนดิที�ตรวจพบ)Positive for homozygous α –thalassemia 1 (ชนดิที�ตรวจพบ)

Lane 1: Normal controlLane 2: α –thalassemia 1 carriers with (–– SEA ) deletionsLane 3: α –thalassemia 1 carriers with (–– THAI ) deletionsLane 4,5: Positive for α -thalassemia 1 (–– SEA deletion ) Lane 6,7: Positive for Homozygous α –thalassemia 1 (–– SEA deletion)

Real-time PCR for α-thal 1

- อาศยั Primer ที�จาํเพาะกบัการเพิ�มจํานวนดเีอ็นเอของ normal allele , SEA และ THAI deletion - อาศยั Probe ที�มคีวามจําเพาะและตดิสารเรอืงแสงที�แตกตา่งกนั ไว้ตดิตาม PCR product ของ normal allele, SEA และ THAI deletion

(– – THAI ) deletions

α2 α1ψα1ψα2ψζ1ζ2 θ

PCR product (–– THAI )

(– – SEA ) deletions

PCR product (–– SEA )PCR product normal

normal

Probe (–– SEA ) deletions

Probe (–– THAI ) deletions

Probe normal

การอา่นผล: คา่ Ct (cycle threshold) = จํานวนรอบใด (cycle) ของปฏกิริยิา

PCR ที�เสน้กราฟสญัญาณการเรอืงแสงของตวัอยา่ง ตดักบั คา่เร ิ�มตน้ที�ต ั�งไว ้(threshold)

การตรวจพบคา่ Ct บง่ชี�วา่ มี PCR product เกดิขึ�น

Real-time PCR for α-thal 1

สนทอง ไชยบญุเรือง.การศึกษาเปรียบเทียบการใช้ DMSc α-1 ระหว่างเครื�อง Applied biosystems รุ่น 7500 กบั Biorad รุ่น IQ5.2013

Ct = ~28Ct = ~28Ct = ~28

Real-time PCR for α-thal 1

การรายงานผล

คา่ Ct (normal probe)

คา่ Ct (SEA probe)

คา่ Ct (THAI) probe

Negative for α0 -thalassemia (–– SEA and THAI deletions)

ตรวจพบ - -

Positive for heterozygous α0 -thalassemia (–– SEA deletions)

ตรวจพบ ตรวจพบ -

Positive for heterozygous α0 -thalassemia ตรวจพบ - ตรวจพบPositive for heterozygous α0 -thalassemia (–– THAI deletions)

ตรวจพบ - ตรวจพบ

สนทอง ไชยบญุเรือง.การศึกษาเปรียบเทียบการใช้ DMSc α-1 ระหว่างเครื�อง Applied biosystems รุ่น 7500 กบั Biorad รุ่น IQ5.2013

DNA analysis for β- thalassemia

- ASPCR- ASPCR- Reverse Dot blot (RDB)- automated sequencing

Allele specific-PCR (ASPCR)

5’ 3’ 5’ 3’

- ออกแบบ Primer ที�ปลาย 3’ มเีบส complementary กบั ลําดบัเบสที�กลายพนัธุ ์

5’ 3’ 5’ 3’

http://www.freepatentsonline.com/6794133.html

ม ีPCR product เกดิขึ�น ไมม่ ีPCR product เกดิขึ�น

Allele specific-PCR (ASPCR)

γ4Internal control578 bp

Gγ- Globin gene

γ5

การตรวจ Beta E mutation

การรายงานผลPositive for beta E geneNegative for beta E gene

S3400 bp

G24

β- Globin gene

β E (GAG-AAG)

400 bp

578 bp

Yamsri S, Sanchaisuriya K, Fucharoen G, Fucharoen S. Genetic origin and interaction of the Filipino β⁰-thalassemia withHb E and α-thalassemia in a Thai family. Transl Res. 2012 Jun;159(6):473-6. doi: 10.1016/j.trsl.2011.10.008. Epub 2011 Nov 17

Reverse dot blot (RDB)

1. ตรงึ probe บน nylon filter (probe ตอ้ง complementary กบั ลําดบัเบสที�กลายพนัธุ)์

2.hybirdization กบั DNA product

หลกัการ

4. ด ูColor precipitate จากการทําปฏกิริยิาจาก เอนไซม ์และ substrate ที�

เตมิเขา้ไป

2.hybirdization กบั DNA product ที�ม ี5’ biotin จาก primer

3. ปฏกิริยิา cross-linked ระหวา่ง biotin และ streptavidin- AL enzyme

Li D1, Liao C, Li J, Xie X, Huang Y, Zhong H, Wei J. Prenatal diagnosis of beta-thalassemia in Southern China. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006 Sep-Oct;128(1-2):81-5. Epub 2005 Dec 22.

Reverse dot blot (RDB)

การตรวจ Beta thalassemia

Normal probe

mutant probe

Father (Fa) and Mother (Mo): heterozygous beta codon 17 (A-T)

Fetus (Fe) : positive for homozygous beta codon 17 (A-T) mutation

Li D1, Liao C, Li J, Xie X, Huang Y, Zhong H, Wei J. Prenatal diagnosis of beta-thalassemia in Southern China. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006 Sep-Oct;128(1-2):81-5. Epub 2005 Dec 22.

Normal probe

mutant probe

mutant probe

Normal probe

Direct Sequencing

ddNTPs แตล่ะชนดิ ตดิสี

flourochromeตา่งกนั

https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing PCR product ขนาดตา่งกนั 1 bp

การสรา้งสายถกูจํากดัความยาวโดย ddNTPs

Direct Sequencing

Beta IVSI-116 (T-G) mutation

DNA analysis for maternal contaminationcontamination

VNTR analysis for detection of maternal contamination

VNTR (variable number of tandemrepeats)

-สว่นที�มลํีาดับเบสซํ�ากนัหลายๆชดุแตกตา่งกนัไปในแตล่ะโครโมโซม และแต่ละคน

-ความสั �นยาวของชิ�นสว่นดเีอ็นเอที�ศกึษาดว้ยวธิ ี PCR จะขึ�นอยูก่บัจํานวนชดุที�ศกึษาดว้ยวธิ ี PCR จะขึ�นอยูก่บัจํานวนชดุที�ซํ�าๆกนั

-ถา่ยทอดทางกรรมพันธุโ์ดยลกูจะไดร้ับการถา่ยทอดมาจากพอ่และแมอ่ยา่งละครึ�ง

http://www.edvotek.com

VNTR analysis for detection of maternal contamination

Fa M fetus Fa M fetus

วธิกีาร : ตรวจ VNTR ตาํแหนง่ locus D1S80 ดว้ยวธิ ีPCR

ตวัอยา่งFa M fetus

No maternal contamination

Fa M fetus

maternal contamination

Example: PND of Hb E-β-thal disease

ผลการตรวจวเิคราะหใ์นตวัอยา่งทารกในครรภ์ ดว้ยวธิ ีASPCR βE : Negative for beta E geneβ71/72 : Positive for beta 71/72 geneFetus : Beta-thalassemia carrier (heterozygous beta 71/72) VNTR analysis : No maternal contamination

ที�มา รูปภาพจาก Yamsri S, Sanchaisuriya K, Fucharoen G, Sae-Ung N, Ratanasiri T, Fucharoen S. Prevention of severe thalassemia in northeast Thailand: 16 years of experience at a single university center. Prenat Diagn. 2010

การควบคมุคณุภาพ

- ควรทํา positive control และ negative control ควบคู่กบัตวัอยา่งสิ�งสง่ตรวจ-เขา้รว่มโครงการทดสอบความชํานาญ -การดแูลบํารงุรกัษา และสอบเทยีบ ครภุณัฑ์-บคุคลกรที�เกี�ยวขอ้งควรไดร้บัการฝึกอบรมเป็นประจํา-บคุคลกรที�เกี�ยวขอ้งควรไดร้บัการฝึกอบรมเป็นประจํา

คณะจดัทําคู่มือทางห้องปฏิบตัิการตรวจวินิจฉัยธาลสัซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกต.ิ คูม่ือทางห้องปฏิบตัิการตรวจวินิจฉัยธาลสัซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกต.ิ2553

สรปุ

1. การตรวจยนืยนัธาลสัซเีมยี ม ี2 วธิ ีคอื Hb typing และดเีอ็นเอ2. Hb typing มขีอ้จาํกดัที�สาํคญั คอื ไมส่ามารถวนิจิฉยัพาหะ α-thal 13. การตรวจดเีอ็นเอธาลสัซเีมยีสามารถตรวจไดม้หีลายวธิ ีและขึ�นอยูก่บั

กลไกการเกดิโรคโดยใช ้เทคนคิ PCR เป็นพื�นฐาน- หากเกดิจาก Large deletion นยิมใช้ Gap-PCR หรอื real-time PCR เชน่ ยนี α-thal 1 time PCR เชน่ ยนี α-thal 1 - หากเกดิจาก Point mutation นยิมใช ้ASPCR , RDB เชน่

ยนี β-thal4. จดุประสงคห์ลกั

4.1 วนิจิฉยัยนืยนัพาหะ α-thal 1 หรอื ชนดิของ β- thal ของคู่สมรส

4.2 การตรวจวนิจิฉยัทารกในครรภก์อ่นคลอด-สามารถตรวจไดใ้นระยะแรกของการต ั�งครรภ์

สรปุ

ความผิดปกติระดับยีน ชนิดยีนที�ผิดปกติ วิธีที�สามารถใช้

Large deletion

α0-thal(SEA and THAI deletion)

Gap-PCRReal-time PCREtc.

α+-thal (3.7 and 4.2 kb) Gap-PCREtc.

β-thal (3.4 kb deletion) Gap-PCRβ-thal (3.4 kb deletion) Gap-PCREtc.

Point mutation

α+-thal (non-deletion)- Hb Constant spring - Hb Pakse’

ASPCRRDB Automated direct sequencing

β-thal

Referenceกลุนภา ฟู่ เจริญ. การตรวจทางห้องปฏิบตัิการเพื�อวินิจฉยัธาลสัซีเมียและฮีโมโกลบินที�พบบ่อยในประเทศไทย. พิมพ์ครั �ง

ที� 1: 2549:19คณะจดัทําคู่มือทางห้องปฏิบตัิการตรวจวินิจฉัยธาลสัซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกต.ิ คู่มือทางห้องปฏิบตัิการตรวจ

วินิจฉัยธาลสัซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกติ.2553