Download - Rezumat Teza Petrescu Marian
-
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007- 2013
Investete n oameni!
Universitatea de Vest Vasile Goldi din Arad
Conductor de doctorat,
Prof. univ. dr. DANIELA BRATOSIN
Doctorand,
PETRESCU
CONSTANTIN-MARIAN
- Arad-
2013
REZUMAT TEZ DE DOCTORAT
EVALUAREA ECOTOXICOLOGIC COMPARATIV
CU MICROALGE A IMPACTULUI POLUANT ASUPRA
MEDIULUI ACVATIC. APLICAII N
BIOMONITORIZAREA MEDIULUI, CONTROLUL
SIGURANEI I SECURITII ALIMENTELOR
OBINUTE DIN ECOSISTEME SUPUSE IMPACTULUI
ANTROPIC
-
CUPRINS
INTRODUCERE
PARTEA I- GENERALITI
CAPITOLUL 1.
POLUAREA ACVATIC - O PREOCUPARE GLOBAL. PRINCIPALELE CATEGORII
DE POLUANI
1.1. CONSIDERAII GENERALE PRIVIND POLUAREA
1.2. PRINCIPALELE CATEGORII DE POLUANI I COMPORTAMENTUL DINAMIC
AL POLUANILOR
1.2.1. Pesticidele
1.2.2. Metalele grele
1.2.3. Radionuclizii
1.2.4. Substanele petroliere
1.2.5. Azotaii i fosfaii
1.2.6. Poluarea termic
1.2.7. Poluarea cu suspensii
1.2.8. Poluarea apelor de suprafa
1.2.9. Poluarea apelor subterane
1.3. BIOMONITORIZAREA APELOR
1.4. BIOACUMULAREA I BIOAMPLIFICAREA POLUANILOR
CAPITOLUL 2.
TENDINE MODERNE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIA MOLECULAR.
UTILIZAREA DE TESTE CELULARE I BIOMARKERI
2.1. DEFINIREA NOIUNII DE BIOMARKERI
2.2. DESCRIEREA DIFERITELOR TIPURI DE BIOMARKERI I ROLURILE
BIOLOGICE ALE BIOMARKERILOR
2.3. FUNDAMENTELE BIOLOGICE ALE UTILIZRII BIOMARKERILOR N
ECOTOXICOLOGIE I UTILIZAREA LOR PENTRU SUPRAVEGHEREA
MEDIULUI NCONJURTOR
2.3.1. Evaluarea riscului integrat i biomarkeri
2.3.2. Poluarea marin, organismele marine i biomarkeri
2.3.2.1. Biomarkeri moleculari
2.3.2.1.1. Enzime antioxidante de aprare
2.3.2.1.2. Citocromul P4501A (CYP1A) de inducie (n principal, hepatic)
2.3.2.1.3. Inhibarea acetilcolinesterazei (AChE)
2.3.2.1.4. Metalotioneinele (MT)
2.3.2.1.5. Stabilitatea lizozomal
-
CAPITOLUL 3.
BIOTESTELE PE BAZ DE ALGE UNICELULARE - UN INSTRUMENT UTIL DE
GESTIONARE A APELOR
3.1. NOIUNI GENERALE DESPRE ALGE UNICELULARE. APLICAII ALE
ALGELOR UNICELULARE N TOXICOLOGIE I ECOTOXICOLOGIE
3.2. BIOMARKERI BIOCHIMICI N ALGE
3.2.1. Sisteme de eliminare a xenobioticelor
3.3. PROTEINE DE STRES IN ALGE
3.3.1. Mecanismele de aprare mpotriva stresului oxidativ
3.3.2. Agenii chelatori - un rspuns al algelor la metalele grele
3.4. PRINCIPIUL TESTELOR PE BAZ DE ALGE UNICELULARE I METODELE DE
EVALUARE ALE ACESTORA
CAPITOLUL 4
IMPORTANA BIOTESTELOR ECOTOXICOLOGICE N CONTEXTUL ACTUAL AL
ECOECONOMIEI I BIOECONOMIEI PENTRU SECURITATEA I SIGURANA
ALIMENTELOR I FURAJELOR DIN ECOSISTEME ANTROPICE
4.1. SECURITATEA ALIMENTAR I A FURAJELOR
4.2. SIGURANA ALIMENTAR I ROLUL SU N EVOLUIA COMERULUI CU
PRODUSE ALIMENTARE
4.2.1. Sigurana alimentar concept si definiii
4.2.2. Comerul i sigurana alimentar
4.2.3. Situaia actual a comerului cu produse alimentare
4.2.4. Sigurana alimentului sub aspect nutritiv
4.2.4.1. Substanele nutritive i calorigene din alimente
4.2.4.2. Importanta algelor n nutriia uman i animal
PARTEA II - CERCETRI PROPRII
CAPITOLUL 5
MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR PROPRII
5.1. MATERIALE I PRODUSE BIOLOGICE
5.1.1. Produse chimice
5.1.2. Produse biologice
5.2. CULTIVAREA ALGELOR N CONDIII DE LABORATOR
5.3. METODA DE LUCRU PRIVIND SUBCULTIVAREA IN VITRO A ALGELOR
UNICELULARE N REALIZAREA PRII EXPERIMENTALE
-
5.3.1. Subcultivarea in vitro a algelor de Chlorella fusca
5.3.2. Incubarea microalgelor de Chlorella cu diferite categorii de poluani
5.4. METODE DE INVESTIGARE APLICATE N REALIZAREA PRII
EXPERIMENTALE
5.4.1. Analiza prin citometrie n flux
5.4.1.1. Noiuni generale de citometrie n flux
5.4.1.1.1.nregistrarea, exploatarea i prezentarea rezultatelor
5.4.1.2 Analiza i prezentarea datelor obinute prin citometrie n flux
5.4.1.3. Metode de analiz bazate pe citometrie n flux
5.4.1.3.1. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin
msurarea absorbiei i difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux
5.4.1.3.2. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a
esterazelor cu Calcein-AM (test de viabilitate celular)
5.4.1.3.3. Msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS)
5.4.1.3.4. Determinarea potenialului de membran cu DIOC6
5.4.2. Metode de analiz pe baz de microscopie
5.4.2.1. Analiza prin microscopie n lumin direct
5.4.2.2. Analiza prin microscopie electronic
5.4.2.2.1. Microscopia electronic de scanare SEM n mod de operare ESEM
CAPITOLUL 6
STABILIREA CONDIIILOR DE ANALIZ PRIN CITOMETRIE N FLUX PENTRU
ALGELE UNICELULARE N VEDEREA REALIZRII UNOR BIOTESTE
ECOTOXICOLOGICE PRIN CITOMETRIE IN FLUX
CAPITOLUL 7
EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I METODE
COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE DE METALELE
GRELE ASUPRA ALGELOR UNICELULARE DE CHLORELLA FUSCA, CA BAZ DE
DETERMINARE A ECOTOXICITII MEDIULUI ACVATIC
7.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE
MORFOLOGIE CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI
LUMINII (LIGHT SCATTER MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC SI TEHNICI
DE MICROSCOPIE.
7.2. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE
ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE
CELULAR).
-
7.3. MSURAREA NIVELULUI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN (ROS)
7.4. DETERMINAREA POTENIALULUI DE MEMBRANE CU DIOC6
CAPITOLUL 8
EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE IN FLUX I TEHNICI
COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE ASUPRA
MICROALGEI CHLORELLA FUSCA DE NANOARTICULE, CA POLUANI ACVATICI
PRODUSI PRIN NANOTEHNOLOGII
8.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE
MORFOLOGIE CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI
LUMINII (LIGHT SCATTER MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC I TEHNICI
DE MICROSCOPIE.
8.2. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE
ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE
CELULAR).
8.3. MSURAREA NIVELULUI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN (ROS)
CAPITOLUL 9
EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE PENTACHLOROFENOL ASUPRA
MICROALGELOR DE CHLORELLA FUSCA
9.1. ESTIMAREA MODIFICRILOR DE MORFOLOGIE CELULAR PRIN TEHNICI
DE MICROSCOPIE I CITOMETRIE N SISTEM FSC/SSC (LIGHT SCATTER
MEASUREMENTS)
9.2. MSURAREA NIVELULUI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN (ROS)
9.3. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE
ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE
CELULAR)
CAPITOLUL 10
STUDIU COMPARATIV AL GRADULUI DE POLUARE ACVATIC CU CHLORELLA
SP. N VEDEREA APLICRII BIOTESTULUI PENTRU BIOMONITORIZARE
DISCUTII I CONCLUZII
BIBLIOGRAFIE
LISTA LUCRRILOR TIINIFICE REALIZATE N CADRUL TEZEI DE DOCTORAT
-
6
INTRODUCERE
Apa reprezint un element important pentru existena vieii i dezvoltarea colectivitilor umane,
resursele de ap planetare fiind de 1,37 miliarde km3, din care 97,2 % localizate n mri i oceane i 2,7 % n
apele subterane i de suprafa. Din apele dulci, doar 1,44 % sunt lichide, restul fiind gheari
Fiind o resurs n parte regenerabil, apa este necesar de a fi protejat fa de impactul
activitilor umane deoarece poluarea afecteaz capacitatea sa de autoepurare. n acest sens directiva
2000/60/CE a Parlamentului european stabilete cadrul unei politici comunitare, durabile n Europa.
Aceasta ncurajeaz statele membre pentru a proteja i a restabili calitatea resurselor de ap n scopul
de a obine un statut chimic i ecologic bun n termen de cinci ani dup intrarea n vigoare a
directivei, ncurajnd oprirea treptat a evacurii substanelor periculoase. Consecinele polurii
asupra sntii publice oblig instituiile publice de a controla i reglementa mediile acvatice
naturale, respectiv de a asigura o protecie mpotriva polurii cu ape reziduale domestice i deeuri
industriale, reducerea surselor de poluare difuz de origine agricol, protecia apelor subterane prin
crearea de zone de protecie n jurul bazinului hidrografic i gestionarea atent a resurselor de ap.
Cercetrile actuale se focalizeaz pe gsirea rspunsurilor la intrebri eseniale: Cnd este un mediu
acvatic poluat? Care sunt diferitele surse de poluare? Care sunt riscurile pentru ecosisteme i om?
De o manier general, un mediu acvatic este poluat atunci cnd echilibrul a fost modificat
permanent prin aportul de cantiti excesive, fie substane mai mult sau mai puin toxice de origine
natural sau rezultate din activitile umane. Aceti poluani pot provoca diferite tipuri de poluare
producnd creterea mortalitii pentru anumite specii de animale i plante, modificarea capacitilor
lor fiziologice, degradarea calitii apei pn la punctul de a o face inutilizabil consumului uman.
Toti poluanii nu prezint aceleai riscuri pentru ecosisteme, unii fiind biodegradabili. Bogate
n specii animale i vegetale i n microorganisme, ecosistemele sunt n mod natural capabile de a
transforma i elimina n parte sau n totalitate substanele biodegradabile, asigurnd astfel
meninerea echilibrului sau i calitatea apei.
Dac abundena acestor substane depete un prag critic, capacitile de autoepurare devin
insuficiente, agentul poluant nu poate fi eliminat destul de rapid, se acumuleaz, perturb echilibrul
dinamic natural al mediului acvatic i poate chiar deveni toxic, ceea ce permite definirea unei stri
de poluare acvatic.
Ali ageni poluani precum plasticele, metalele i anumite pesticide, nu sunt, sau sunt foarte
puin biodegradabile, procesul de auto-epurare fiind inoperant i n consecin permind acumularea
substanelor n ecosistem i intoxicarea speciilor vii care le inger. Anumite substane precum
metalele grele sau pesticidele se acumuleaz n organisme, se concentreaz n esuturi i organe la
-
7
concentraii care cteodat sunt mult superioare celor msurate n ap, datorit fenomenului
de " bioacumulare" .
Creterea populaiei, urbanizarea crescut, industrializarea i agricultura intensiv sunt
nsoite inevitabil de o mrire a polurii acvatice. n aceste condiii nu este ntotdeauna uor de
identificat sursele de poluare i nici de a estima efectele acestora care depind att de natura ct i de
concentraia poluantului precum i de ecosistemul n care acioneaz, fenomenele fiind foarte
complexe. n consecin, este adesea dificil de a determina pentru fiecare substan toxic o
concentraie maximal acceptabil pentru un ecosistem, neexistnd dealtfel nici un consens asupra
pragului ce nu trebuie depit, iar n rare cazuri cnd exist legi care fixeaz norme, acestea variaz
n funcie de ar.
Cercetrile din prezenta tez de doctorat se nscriu n preocuprile actuale de cercetare
n domeniul ecotoxicologiei, respectiv pentru imaginarea unor noi bioteste sensibile de determinare
n laborator a toxicitii i ecotoxicitii substanelor. Cercetrile s-au derulat pe alge verzi
unicelulare, respectiv pe Chlorella fusca i s-au bazat pe analiza prin citometrie n flux, metod
extrem de sensibil, statistic i foarte rapid, ceea ce permite stabilirea EC50 cu mare exactitate i
uurin fa de metodele existente n prezent, dar i pe tehnici de microscopie. Elaborarea unor noi
metode, (bioteste) de determinare a gradului de poluare acvatic s-a dorit a fi un mijloc util i uor
de aplicat pentru orientarea gestionrii poluanilor de o manier adecvat i aprecierea cu titlu
preventiv a riscului de degradare a unui ecosistem. De aceea ele vor putea servi drept complement
datelor chimice pentru stabilirea criteriilor de calitate i a concentraiilor maxime de poluani admii.
Prin cercetrile intreprinse pentru elaborarea biotestelor s-au obinut deasemeni rezultate
tiinifice n plan fundamental referitoare la efectul diferitelor categorii de poluani asupra
microalgelor n sistem de cultur prin citometrie n flux i tehnici microscopice complementare
(microscopie optic i de scanare ESEM). Noile bioteste pe baz de alge unicelulare i analiz prin
citometrie n flux vor permite determinarea n laborator a toxicitii i ecotoxicitii unor noi
substane i produse chimice (fitosanitare, pesticide, detergeni, etc.) n vederea nregistrrii i
comercializrii acestora, conform recomandrilor Organizaiei pentru Cooperare i Dezvoltare
Economic (OCDE) i Uniunii Europene, pentru evaluarea riscurilor fa de mediul nconjurtor,
pentru supravegherea apelor uzate menajere i industriale la intrarea i ieirea din staiile de epurare,
pentru stabilirea ecotoxicitii deeurilor speciale i evaluarea riscului ecotoxicologic pentru siturile
contaminate. Aceste teste vor putea fi deasemeni introduse n programe de bio-supraveghere
(biomonitorizare).
*
* *
-
8
Totalitatea cercetrilor i rezultatelor prezentate au fost realizate n cadrul Institutului de
tiine ale Vieii din cadrul Universitii de Vest Vasile Goldi din Arad, Programul
POSDRU/CPP107/DMI 1.5/S/77082, Burse doctorale de pregtire ecoeconomic i bioeconomic
complex pentru sigurana i securitatea alimentelor i furajelor din ecosisteme antropice .
Multumiri deosebite aduc pe aceasta cale Laboratorului de Algologie din Institutul de
Cercetri Biologice Cluj-Napoca pentru furnizarea cu generozitate a microalgei Chlorella fusca
Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 din propria Colecie de Cianobacterii i Alge, (singura colecie
mare de tulpini de cianobacterii i microalge eucariote din Romnia, rezultatul unor cercetri
sistematice de aproximativ 30 de ani), fr de care prezenta tez de doctorat nu ar fi fost posibil.
Aduc pe aceast cale mulumiri, n mod deosebit doamnei Prof. univ. dr. Daniela Bratosin,
pentru efortul depus i rbdarea de care a dat dovad n formarea mea profesional.
Mulumirile mele se adreseaz i doamnei Conf. univ. dr. Turcu Violeta pentru ncrederea,
susinerea, ndrumarea competent i permanent pe parcursul elaborrii i redactrii tezei de
doctorat.
Mulumiri speciale aduc colegilor din cadrul Facultii de tiine ale Naturii, Inginerie i
Informatic, Institutului de tiine ale Vieii al Universitii de Vest Vasile Goldi din Arad,
Institutului Naional de Cercetare - Dezvoltare pentru tiine Biologice din Bucureti care mi-au
oferit sprijinul lor pe ntreaga perioad de elaborare a tezei.
CAPITOLUL 1. POLUAREA ACVATIC - O PREOCUPARE GLOBAL.
PRINCIPALELE CATEGORII DE POLUANI
Apa, aerul i solul, constitueni ai biosferei, sunt cunoscui sub denumirea de factori de
mediu. n fiecare din acetia se dezvolt o faun i o flor specific care, pentru a putea supravieui,
trebuie s i se asigure un mediu ambiant ct mai curat i sntos. Pentru aceasta este necesar s se
cunoasc sursele de poluare, respectiv poluanii, care ar putea prejudicia dezvoltarea vieii i apoi
impactul lor asupra mediului i vieii, conduc la msuri de prevenire i combatere a polurii
factorilor de mediu.
Calitatea apelor este stabilit prin standarde, datorit importanei pe care o prezint pentru
sigurana vieii i pentru desfurarea activitilor economice. Calitatea apelor se exprim prin
indicatori stabilizai i calculai n urma unor analize efectuate att la apele de suprafa, ct i la cele
subterane. Organizaia Mondial a Sntii, consiliile de sntate i cercetare medical i ageniile
de protecia mediului promoveaz o abordare preventiv, n vederea protejrii apei potabile utilizate
de ctre consumatori. Calitatea apei destinate consumului uman este un obiectiv important inclus n
directivele CE, obiectiv ce vizeaz protecia sntii publice
-
9
CAPITOLUL 2. TENDINE MODERNE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIA
MOLECULAR. UTILIZAREA DE TESTE CELULARE I BIOMARKERI
Societatea uman n prezent se confrunt cu probleme care vizeaz direct calitatea vieii i a
sntii oamenilor: poluarea mediului i calitatea alimentaiei, i care de altfel se gsesc ntr-o
dependen direct. n acest context, evaluarea polurii mediului acvatic natural i a celui din
fermele piscicole n particular ca i aprecierea gradului de risc pe care l are asupra calitii viitorului
produs alimentar se impun cu mare necesitate. Evaluarea riscului ecologic trebuie s vizeze pstrarea
integritii ecosistemului. Poluarea mediului a crescut substanial n ultimele decenii din cauza unui
numr mare de deeuri industriale, agricole, comerciale i interne, a eflueni i emisiilor, precum i a
substanelor periculoase. Majoritatea poluanilor de mediu pun n pericol viaa uman i a mediului,
dar i integritatea i funcia ecosistemelor. Poluarea acvatic este forma predominant de poluare din
momentul ptrunderii poluanilor n mri, ruri, lacuri i zone umede. Ecosistemelor marine i de
coast sunt caracterizate prin complexitatea i sensibilitatea lor la diveri poluani organici i
anorganici. Domeniile prioritare de cercetare pentru evaluarea riscului uman i ecologic au
identificat i inclus diferii biomarkeri n procesul de evaluare a riscurilor cu scopul de a mbunti
integrarea si evaluarea riscurilor. Biomarkerii sunt definii ca msuri biologice funcionale aprute
din cauza expunerii la poluani sau factori de stres, care sunt exprimate la nivel fiziologic i
comportamental pentru un suborganism. n prezent se ncearc identificarea de noi biomarkeri
sensibili pentru imaginarea de noi teste biologice, biomarkeri sensibili pentru cunoaterea efectelor
imediate i a celor ndeprtate ale diverselor substane asupra vieii acvatice n general i asupra
sntii omului n particular.
CAPITOLUL 3. BIOTESTELE PE BAZ DE ALGE UNICELULARE - UN INSTRUMENT
UTIL DE GESTIONARE A APELOR
Microalgele sunt indicatori sensibili ai schimbrilor de mediu i datorit faptului c stau la
baza celor mai multor ecosisteme de ap dulce i marine, sunt utilizate pe scar larg n evaluarea
riscului de mediu. Toxicitatea unui anumit element sau compus poate fi testat la diferite niveluri de
organizare biologic. Pentru monoculturile de alge unicelulare, aciunile substanelor toxice pot fi
testate folosind una din proprietile: rata de cretere, motilitate, producia de gamei, diviziunea
celular, fluxul citoplasmatic, sinteza proteinelor, permeabilitatea membranei citoplasmatice,
blocarea zonelor de absorbie pentru un anumit nutrient, etc, producia sau fixarea de CO2,
asimilarea sau producia de O2. Chlorella este o microalg unicelular care crete n apele dulci i
exist pe Terra de aproximativ 2,5 miliarde de ani i a reuit s supravieuiasc exact n aceeai
form pn n zilele noastre datorit celor dou caracteristici extraordinare pe care le are: peretele
-
10
su celular unic i capacitatea de reproducere, microalg spre care se indreapta in prezent interesul
ecotoxicologilor.
CAPITOLUL 4. IMPORTANA BIOTESTELOR ECOTOXICOLOGICE N CONTEXTUL ACTUAL AL ECOECONOMIEI I BIOECONOMIEI PENTRU SECURITATEA I
SIGURANA ALIMENTELOR I FURAJELOR DIN ECOSISTEME ANTROPICE
Savantul american de origine romn Nicholas Georgescu Roegen, n urm cu 40 de ani, a
lansat conceptul de Bio-Economie, prin care acesta aduce n discuie rolul omului n ecosistemele
antropice, cu necesitatea demonstrat statistic privind bilanul energetic negativ n cazul
consumurilor excesive de materii prime. Chiar dac produsele de calitate au o siguran garantat
prin nsui compoziia lor ecologic, o amprent definitorie asupra evoluiei comerului cu astfel de
produse i nu numai, o are puterea de cumprare a consumatorilor finali. n ultimii ani s-a produs de
asemenea o sensibilizare a unui numr nsemnat de consumatori n ceea ce privete problema siguranei
alimentare, acetia devenind din ce n ce mai interesai, nu doar de calitatea, ci i de proveniena
produselor agroalimentare consumate. Se impune, n aceste condiii, eliminarea oricrei deficiene sau
puncte slabe din circuitul parcurs de produsele agroalimentare, de la poarta fermei la masa
consumatorului. Rezolvarea problemelor aprute presupune, ntre altele, o atent gestionare a resurselor
i a factorilor utilizai n producia agricol i alimentar, indiferent de natura acestora. Problema
siguranei alimentare capt astfel noi valene, unde biotestele de evaluare a polurii mediului acvatic
de proveniente a produsului piscicol capt un rol esenial.
CAPITOLUL 5. MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR
PROPRII
5.2. CULTIVAREA ALGELOR N CONDIII DE LABORATOR.
Subcultivarea in vitro a algelor de Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 a
impus parcurgerea urmtoarelor etape:1) Prepararea mediului de cultur BBM (Bold Basal
Medium), 2)Sterilizarea mediului de cultur, 3) Subcultivarea in vitro a algelor unicelulare n
perimentrul hotei cu flux laminar de aer steril, 4) cultivarea acestora pe rafturile din camera de
ctetere, sub lumina tuburilor fluorescente emitente de lumin alb. Culturile de alge au fost
biometrizate periodic la 7, 14 i 30 de zile prin efectuarea de observaii .
5.3.2.Incubarea microalgelor de Chlorella cu diferite categorii de poluani
n vederea evalurii efectelor toxice induse de diferite categorii de poluani (metale grele,
pesticide i nanoparticule) experimentele s-au efectuat n plcue cu 24 godeuri n care s-a realizat o
diluie serial (P1-P10) a poluanilor plecnd de la 0,5 mM/L .
5.4. METODE DE INVESTIGARE APLICATE N REALIZAREA PRII
EXPERIMENTALE
-
11
Metodologia i tehnicile de investigare utilizate n realizarea cercetrilor s-au bazat n
proporie de aproximativ 80 % pe citometrie de flux i tehnici complementare de microscopie optic
i electronic de scanare, tehnici moderne i de mare finee.
5.4.1. Analiza prin citometrie n flux
Analiza prin citometrie n flux s-a realizat pe 2 tipuri de citometre, respectiv FACScan
Becton Dickinson dotat cu Software ProCellQuest i Cytomics FC 500, cu Software CXP- Beckman
Coulter Company. Celulele au fost suspendate n mediul izoton i analizate prin citometrie n flux,
cte 10.000 de celule pentru fiecare tip de analiz. Toate analizele s-au realizat in triplicat.
5.4.1.3. Metodele de analiz bazate pe citometrie n flux utilizate au fost:
5.4.1.3.1. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin msurarea absorbiei i difuziei
luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux
5.4.1.3.2. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-
AM (test de viabilitate celular)
5.4.1.3.3. Determinarea potenialului de membran cu DIOC6
5.4.2. Analize imagistice utiliznd diferite tehnici de microscopie
5.3.2.1. Analiza prin microscopie optic n lumin direct
5.4.2. 2. Analiza prin microscopie electronic de scanare n mod de operare ESEM
CAPITOLUL 6. STABILIREA CONDIIILOR DE ANALIZ PRIN CITOMETRIE N
FLUX PENTRU ALGELE UNICELULARE N VEDEREA REALIZRII UNOR BIOTESTE
ECOTOXICOLOGICE PRIN CITOMETRIE IN FLUX
Citometria n flux este o metod rapid pentru msurarea cantitativ a celulelor individuale
aflate ntr-un fluid n micare. Mii de celule sunt trecute prin faa unei surse de lumin (de obicei un
laser) fiind efectuate msurtori de densitate celular, dispersia luminii i fluorescent, masurtori ce
sunt colectate simultan i nregistrate. Dei aceast tehnic a fost introdus nti n studii
biomedicale, astzi fiind aplicat pe scar larg, citometria in flux a fost introdus mult mai recent i
n studii oceanografice, respectiv n ceva mai mult de un deceniu.
Pentru toate aceste considerente, microalgele pot fi considerate ca celulele ideale pentru a fi
analizate prin citometrie n flux. Microalgele conin n plus pigmeni de fotosintez precum clorofila
a, carotenoizi i cteodat ficobiline care sunt taxoni specifici i care depind de condiiile de
cultivare (iluminare, compoziia n nutrieni, temperatura, pH-ul mediului, expunerea la inhibitori de
fotosintez. Deoarece compoziia n pigmeni este specific pentru speciile de microalge, analiza
prin citometrie n flux a autofluorescenei este utilizat recent pentru clasificarea fitoplanctonului
prelevat din mediul nconjurtor. Mai mult dect att, autofluorescena clorofilei fiind un biomarker
unic al organismelor fotosintetizante, ea permite stabilirea unei pori sau ferestre (flow
-
12
cytometric gate) pentru separarea microalgelor de alte particule sau microorganisme din prob. n
plus, se pot utiliza ali colorani fluoresceni specifici ce pot furniza informaii despre starea
fiziologic a microalgelor.
Clorofila a este singurul pigment prezent n toate microalgele fotoautotrofe. Ea emite n
intervalul spectral rou (> 650 nm), deci n FL3. Celelalte clorofile, b, c i d, captureaz fotoni i trec
astfel la clorofila a. n urma cercetarilor noastre se poate obine o prim concluzie, respectiv aceea
c prin citometrie n flux direct (talie celular, coninut celular i autofluorescen conferina de
clorofil a) se poate obine o analiz a heterogenitii celulare (celule non-clorotice i clorotice) ceea
ce reflect implicit starea de sntate a unei culturi de microalge.
CAPITOLUL 7. EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I METODE COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE DE METALELE
GRELE ASUPRA ALGELOR UNICELULARE DE CHLORELLA FUSCA SHIHIRA ET
KRAUSS, TULPINA AICB 25, CA BAZ DE DETERMINARE A ECOTOXICITII
MEDIULUI ACVATIC
Cercetrile ntreprinse de noi s-au focalizat cu prioritate pe identificarea efectelor produse de
metalele grele pentru stabilirea concentraiilor de risc pentru sntate i mediu prin noi metode de
investigare celular bazate n special pe tehnici de citometrie n flux.
Pentru studiile noastre de ecotoxicitate n care am dorit s utilizm ca model celular,
microalgele unicelulare de Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 ne-am propus s
analizm n primul rnd metalele grele respectiv Al i Cd, (rezultatele fiind reprezentative, ele vor fi
prezentate n continuare) Hg, Cu, Zn i Pb care au generat rezultate similare (rezultate neprezentate).
Investigarea efectului toxic produs asupra microalgelor prin aciunea metalelor grele s-a fcut prin
tehnici de citometrie n flux i metode complementare de microscopie optic i electronic de
scanare. Scopul principal al acestor analize a fost identificarea unei metode capabil s evidenieze
de o manier sensibil un factor poluant precum metalele grele i care s fie transformat ulterior
ntr-un biotest pe baz de citometrie n flux.
n acest scop s-au analizat modificrile de morfologie prin citometrie n flux direct,
determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM (test
de viabilitate celular), msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) i determinarea
potenialului de membrana cu DIOC6
7.1. ESTIMAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A MODIFICRILOR DE MORFOLOGIE
CELULAR PRIN MSURAREA ABSORBIEI I DIFUZIEI LUMINII (LIGHT SCATTER
MEASUREMENTS) N SISTEM FSC/SSC I TEHNICI DE MICROSCOPIE.
-
13
Modificrile de morfologie observate prin citometrie n flux n sistem dot-plot FSC/SSC
(talie celular/granularitate, densitate), parametrii cuantificai prin XGeoMean i respectiv
YGeoMean au fost corelate cu analiza prin microscopie optic i electronic de scanare (ESEM).
Experimentele au fost urmrite la 24h, 48h, 72h si 6 zile, n vederea identificrii perioadei de
timp optime de incubare a celulelor algale cu diluiile seriale
de metale grele, n vederea stabilirii unui protocol de aplicare
pentru biotestul (biotestele) ce dorim s l imaginm prin
citometrie in flux.
Rezultatele cele mai evidente i reprezentative au fost obinute
la 6 zile de incubare
Analiza comparativ n
sistem biparametric (dot-plot)
FSC/SSC (1) FL3/FSC
(autofluorescena conferit de
clorofila a /talie celulara) (2)
i FL3/SSC (autofluorescena
conferit de clorofila a
/coninut celular) (3) pentru
cultura de microalge de
Chlorella fusca cultivat la
momentul T0 al experienelor
de incubare cu metale grele
(A) i martorul de incubare
reprezentat de microalge
cultivate timp de 6 zile fr
metale grele (B).
Analiza prin microscopie
electronic de scanare
(ESEM) a culturii de
Chlorella fusca la momentul
T0. Rezultatele prezentate
sunt reprezentative pentru
experimentele realizate.
-
14
Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Al i Cd. Abscis: concentraia de Al i Cd. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2 din dot-ploturile de analiza.
7.2. DETERMINAREA ACTIVITII METABOLICE PE BAZA NIVELULUI DE ACTIVITATE A ESTERAZELOR CU CALCEIN-AM (TEST DE VIABILITATE
CELULAR).
Calcein-AM este o substan lipofil, non-fluorescent, care intr liber n celule, unde este
scindat de ctre esterazele nespecifice, genernd un produs fluorescent (fluoresceina), produs
Analiza prin microscopie
electronic de baleiaj a
modificrilor de morfologie
pentru probele de Chlorella fusca
expuse concentraiilor 1, 5 i 9 de
Cd (diluii seriale) timp de 6 zile.
Rezultatele prezentate sunt
reprezentative pentru
experimentele realizate
-
15
reinut de celulele cu membrana intact. Fluorescena celular conferit de fluoresceina este
proporional cu activitatea enzimatic i deci i cu inhibarea acestei activitii esterazice, exprimnd
astfel nivelul de activitate metabolic. Metoda aplicat de noi a fost conform metodei elaborate de
Bratosin et al., 2005)
Analiza citogramei biparametrice n sistem FL3/FL1 (autofluorescena conferit de
clorofila a /fluorescenta verde a calceinei) pentru determinarea activitii metabolice pe baza
nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM (test de viabilitate celular). R1-regiunea
celulelor non-clorotice, R2-regiunea celulelor clorotice, T0-cultura de Chlorella fusca la momentul
debutului experienelor, T6 zile-martorul de incubare dup 6 zile n absena metalelor
Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Al i Cd. Abscis: concentraia de Al su Cd. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2, din citogramele biparametrice FL3/FL1 corespunztoare probelor de Chlorella incubate cu diferite concentraii de Al su Cd. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.
-
16
7.3. MSURAREA NIVELULUI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN (ROS)
Generarea intracelular de specii reactive de oxigen (ROS) este produs prin stres oxidativ
care poate fi cauzat prin expunerea celulelor la metale grele. Aceast generare de ROS poate fi
monitorizat folosind dihydro-rhodamina 123 (DHR123) sau dihydroethidium
(EH), care sunt oxidate de radicali liberi, H2O2 sau NO3. O alternativ pentru msurarea lor o
reprezint 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) care este transformat de o esteraz
intracelular la un alt produs nonfluorescent, 2,7-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF). Cnd
formarea de ROS este indus n interiorul celulei, H2DCF este convertit la
2 ', 7'-diclorofluorescein (DCF), produs fluorescent ce poate fi cuantificat (Yoshida et al., 2004;
Saison et al., 2010). Stresul oxidativ n celulele microalgei Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina
AICB 25 a fost evaluat dup expunerea celulelor la diferite concentraii de metale grele, pe baza
determinrii prin citometrie n flux a nivelurilor intracelulare pentru radicalul anionic superoxid (O2
-) utiliznd ca substana fluorescent H2DCFDA.
Analiza comparativ a valorilor MFI (Mean Fluorescence Intensity) corespunztor fluorescenei
verde conferit de 2',7'-diclorofluorescein din celulele de Chlorella fusca non- clorotice/ROS+
corespunztoare probelor incubate cu diferite concentraii de Al.
7.4. DETERMINAREA POTENIALULUI DE MEMBRAN CU DIOC6
Potenialul de membran i rata respiraiei celulelor de Chlorella fusca Shihira et Krauss,
tulpina AICB 25 au fost monitorizate cu ajutorul unei sonde poteniometrice, care poate evidenia
dinamica schimbrilor n potenialul de membran ntre interiorul i exteriorul celulei. Depolarizarea
membranelor celulare poat fi detectat de colorani uor lipofili precum DiBAC4(3) sau DIOC6(3)
(Adler et al., 2007; Jamers et al., 2009). Intensitatea fluorescenei este influenat de ptrunderea i
-
17
eliminarea colorantului fluorescent prin membrana celulelor, respectiv de potenialul electrochimic
i de numrul de situri lipofile de legare din interiorul celulei. Acest tip de colorani prezentnd
dependenta de distribuia de sarcin, reprezint markeri sensibili n aprecierea viabilitii celulare.
Ca sond s-a folosit DIOC6 (3), colorant permeabil prin celul, lipofilic selectiv pentru membrane
intracelulare (Gregori et al., 2002). Emisia de fluorescent verde a acestui compus, cu un maxim la
516 nm, a fost colectata cu detectorul FL1 (505-550 nm).
Analiza prin citometrie n flux n sistem de citogram biparametric FL3/FL1
(autofluorescena conferit de clorofil a/potenial membranar conferit de fluorescen verde a
DIOC6) pentru determinarea variaiilor de potenial membranar.
Analiza % de celule non-clorotice normal polarizate din totalul de celule non-clorotice
Concentraia de
aluminiu
% Celule non-clorotice % Cellule non-clorotice/Celule
normal polarizate
24 h
expunere
6 zile expunere 24 h
expunere
6 zile
expunere
Martor 4 grade 95%
Martor de incubare
Aluminiu 1mg/ml 79,16 11,10 72,84 4,52
Aluminiu 0,5mg/ml 75,60 60,16 78,04 25,24
Aluminiu 0,25mg/ml 84,05 73,98 82,28 1,98
-
18
CAPITOLUL 8. EVALUAREA IN VITRO PRIN CITOMETRIE N FLUX I TEHNICI COMPLEMENTARE DE MICROSCOPIE A EFECTELOR INDUSE ASUPRA
MICROALGEI CHLORELLA FUSCA DE NANOARTICULE, CA POLUANI ACVATICI
PRODUI PRIN NANOTEHNOLOGII
n vederea selectrii unor metode de analiz prin citometrie n flux care s poat servi ulterior
de bioteste ecotoxicologice lund drept model celular microalga Chlorella fusca Shihira et Krauss,
tulpina AICB 25, ne-am propus s investigm i efectele induse de nanoparticulele rezultate prin
nanotehnologii, naparticule (NPs) a cror toxicitate i impact asupra mediului sunt nc incomplet
cunoscute iar n unele cazuri chiar ignorate.
Analiza prin microscopie
electronic de scanare a
modificrilor de morfologie
pentru probele de Chlorella
fusca expuse concentraiilor 1,
3 i 6 de nanoparticule
feromagnetice (P2) timp de
24h
Analiza comparativ a curbelor doz-rspuns pentru calculul EC50 pentru Pl i P2. Abscis: concentraia de Pl si P2. Ordonat: % de celule moarte corespunztoare regiunii R2, din citogramele biparametrice
FL3/FSC corespunztoare probelor de Chlorella incubate
cu diferite concentraii de P1si P2. La 24h, 48h si 6 zile.
-
19
CAPITOLUL 9. EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE PENTACHLOROFENOL
ASUPRA MICROALGELOR DE CHLORELLA FUSCA
Datorit utilizrile agricole precum i industriale, pentaclorofenolul (PCP) este omniprezent
n mediul nconjurtor i recunoscut ca un poluant prioritar n multe ri fiind unul dintre cele mai
utilizate biocide nainte de aciuni de reglementare pentru a anula i restriciona anumite utilizri.
Studiul de fa a investigat prin citometrie n flux i microscopie optic i ESEM modificrile
induse asupra microalgei Chlorella fusca Shihira et Krauss, tulpina AICB 25 n urma expunerii la
concentraii variate de pentaclorofenol (PCP). n mod particular am investigat efectul PCP asupra
inducerii de ROS i asupra activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu
Calcein-AM.
Analiza prin microscopie electronic de scanare a
modificrilor de morfologie pentru proba de Chlorella
fusca expus concentraiei 1 de PCP, respectiv 0,079
g/L (0.3mM/L PCP), timp de 6 zile
Analiza comparativ a valorilor MFI (Mean Fluorescence Intensity) obinute prin determinarea
activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor intracelulare cu Calcein-AM
pentru probele de Chlorella incubate cu diferite concentraii de PCP pentru 24h, 48h i 6 zile.
-
20
CAPITOLUL 10.
STUDIU COMPARATIV AL GRADULUI DE POLUARE ACVATIC CU CHLORELLA SP. N VEDEREA APLICRII BIOTESTULUI PENTRU BIOMONITORIZARE
n vederea verificrii metodei de determinare a ecotoxicitatii prin citometrie n flux pentru
aplicaii de biomonitorizare, am evaluat la scar de laborator dou eantioane prelevate din rul
Mure, localitatea Svrin i respectiv Ndlac, pentru a evidenia efectele induse asupra microalgei
Chlorella.
n acest context, prezenta metoda propus spre brevetare este de maxim importan,
deoarece rezolv o problem cheie n ecotoxicologie i n particular n problematica national a
Romaniei, contribuind la evaluarea gradului de poluare a apelor, printr-o soluie original, simpl,
sensibil, i foarte puin costisitoare.
CONCLUZII GENERALE.
Din ansamblul rezultatelor obinute i prezentate n prezenta tez de doctorat, pe baza
situaiei tiinifice internaionale si a ipotezelor de lucru emise de noi, pe baza modelelor
experimentale i a procedeelor de analiz aplicate, s-au evideniat urmtoarele concluzii generale cu
caracter original i de noutate:
1. Citometria n flux direct (analiza taliei celulare, a coninutului celular i autofluorescenei
conferia de clorofila a) permite o analiz a heterogenitii celulare (celule non-clorotice i
clorotice) ceea ce reflect implicit starea de sntate a unei culturi de microalge.
2. Analizele prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC a microalgelor de Chlorella incubate
pentru timpi variai (24h, 48h i 6 zile) n prezena unor diluii de poluani (metale, pesticide,
nanoparticule) permit o evideniere a modificrilor morfologice induse de factorul poluant,
modificri morfologice observate i prin tehnicile complementare de microscopie optic i
electronic de scanare.
3. Analiza prin citometrie n flux prezint avantajul posibilitii de cuantificare prin msurtori
valorice precum XGeoMean, YGeoMean, MFI, etc., precum i o prezentare statistic a
rezultatelor pe un numr foarte mare de celule (10 000 celule n cazul nostru).
4. Sistemul de analiz prin citometrie n flux a citogramelor permite obinerea % de celule vii din
regiunea R1 i moarte din regiunea R2 care comparate cu procentajele respective pentru martorul
de incubare conduc la posibilitatea trasrii curbelor doz-rspuns pentru calculul EC-50, unde
pe abscis este nscris concentraia de poluant, iar pe ordonat % de celule, moarte,
corespunztoare regiunii R2.
5. Msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) generat sub actiunea metalelor grele prin
citometrie n flux prezint avantajul determinrii cu o mare acuratee a acestora, tiut fiind c
speciile de radicali liberi au o durat de via foarte scurt, fiind n plus o metod
-
21
multiparametric care reuete s cuantifice aceast producie n interiorul celulei, cu avantajul
posibilitii determinrii acesteia pe diferite subpopulaii celulare.
6. Cu toate aceste avantaje, msurarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS) generate sub
aciunea metalelor grele aduce doar informaii n plan general, transformarea acestei metode ntr-
un biotest fiind greu de realizat.
7. Determinarea activitii metabolice pe baza nivelului de activitate a esterazelor cu Calcein-AM
(test de viabilitate celular) utiliznd ca model celular o cultur de Chlorella, reprezint o
posibilitate important de determinare a toxicitii unor poluani datorit sensibilitii i
posibilitii de cuantificare a rezultatelor.
8. Determinarea potenialului de membran i rata respiraiei celulelor de Chlorella fusca cu
ajutorul unei sonde poteniometrice demonstreaz c metalele grele induc o depolarizare a
membranei plasmatice ntr-o parte a populaiei microalgale analizate, respectiv n celulele
clorotice. Astfel, depolarizarea membranei citoplasmatice de Chlorella, dup 6 zile de expunere
la metale grele ar putea fi considerat un indicator celular de non-viabilitate, aceste efecte putnd
fi asociate cu alterri de membran provocate de peroxidarea lipidelor membranare ca o
consecin a atacului ROS.
9. Metoda original identificat de noi, de determinare prin citometrie n flux a procentului de
celule moarte pe baz de citometrie n flux sub aciunea substanelor poluante pentru calcularea
EC50 reprezint o soluie original, simpl i puin costisitoare, propus spre brevetare
(CHLORELLA-TOX biotest) care poate fi utilizat pentru aprecierea gradului de poluare a
apelor i pentru biomonitorizarea mediului acvatic.
-
22
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Bercea V., Nicoar A., Drago N., 2005, Activitatea fotochimic a fotosistemului PS II n
prezena luminii n exces i refacerea acesteia la ntuneric, la alga verde Chlorella fusca,
Studia universitatis Babe-Bolyai, Biologia, L, 1, pp. 47-58.
2. Bratosin D., 2007, Explorarea structurii si functiilor celulare prin citometrie n flux, Vasile
Goldi University Press, Arad, 245 pg., ISBN: 978- 973-664-213-5.
3. Brezeanu Gh., Zinevici V., 1984, La formation et l'volution du zooplancton du lac de
barrage Porile de Fier (le Danube inferieur) dans l'intervalle 1971-1980. Verh. Internat.
Verein. Limnol., vol. 22, pp. 1558-1561.
4. Brezeanu Gh., Roman N. Ionic D., Zinevici V., Nicolescu N., Teodorescu L., Simon-Gruia
A., 1997, Influena construciei barajelor i a lacurilor de acumulare asupra structurilor
ecosistemice din bazinul hidrografic Ialomia. Culegere de lucrri prezentate la Seminarul
ARDI, IMH, Bucureti, 31.01.1997, vol. 1, pp. 127-133.
5. Gill J.H., Dive C. Apoptosis: Mechanisms and Relevance to Toxicology. In Apoptosis in
Toxicology, edited fby Roberts R., British Library, Great Britain Ltd, ISBN 0-7484-0815-0,
2000.
6. Han X., Wong Y.S., Tam N.F., 2006, Surface complexation mechanism and modeling n
Cr(III) biosorption by a microalgal isolate, Chlorella miniata, Journal of Colloid and
Interface Science 303(2), pp. 36537115.
7. Lagadic L., Caquet T., Amiard J.C., Ramade F. Biomarqueurs en Ecotoxicologie, Aspects
fondamentaux. Masson Paris, 1997, ISBN:2-225, 1997.
8. Quiniou F., His E., Delesmont R., Caisey X. Bio-indicateur de la toxicite potentielle de
milieux aqueux: bio-essai,Editions Ifremer, INRA Editions, RD10,F-78026 Versailles Cedex,
ISSN 1637-1844, ISBN 2-84433-146-7. 2005.
9. Ramade F. Ecotoxicologie. Masson, Paris, ISBN:2-225 45530-9, ISSN:0335-7473, 1977.
10. Warren N., Allan I.J., Carter J.E., House W.A., Parker A, 2003, Pesticides and other
microorganic contaminants in freshwater sedimentary environments-A review. Appl
Geochem 18, pp.159194.
-
Titlul programului: Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Titlul proiectului: Burse doctorale de pregtire ecoeconomic i bioeconomic complex pentru sigurana i securitatea alimentelor i furajelor din ecosisteme antropice
Editorul Materialului: doctorand PETRESCU CONSTANTIN-MARIAN Data publicrii: 2013
12.pdfREZUMAT teza Petrescu final- 18,09,2013.pdf