Composti ad attività ormonale nell’ambiente e negli alimenti: quali rischi?Bologna, 25 febbraio 2009

Effetti molecolari e cellularidelle sostanze bioattive non nutrienti

presenti negli alimenti di origine vegetale

Stefano LORENZETTI, Francesca MARANGHI

stefano.lorenzetti@iss.it

ISS - Istituto Superiore di SanitàTossicologia Alimentare e Veterinaria

Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare

Introduzione -dai non nutrienti alla nutrigenomica

i non nutrienti

ALIMENTI - componenti nutrizionali:

Ømacro-nutrienti (carboidrati, lipidi e proteine);Ømicro-nutrienti (vitamine, sali minerali).

* Carenze e/o eccessi nutrizionali di macro- e micro-nutrienti hanno ben noti effetti sulla salute umana e sono spesso associati a ben definite malattie.

Ma Anche ALIMENTI - molecole biologicamente attive: (bioactive compounds) diverse dai micro-nutrienti e definite come non nutrienti (p.es. i

fitoestrogeni)…

* … a differenza dei micro-nutrienti non se ne conoscono malattie da carenza!!!

CLASSE COMPONENTE BIOATTIVA FONTE ALIMENTARE

VITAMINE Vitamin D Dairy products

Folic acid ; Vitamin A Vegetables

Vitamin E (-tocopherol) Vegetable oils

Ascorbic acid Vegetables, fruits

MINERALI Calcium Dairy products, vegetables

Selenium Cereal grains, meat, fish

Zinc Meat, vegetables

CAROTENOIDI Lycopene Tomatoes

Lutein Dark green vegetables

ß-Carotene Orange-yellow vegetables

FLAVONOIDI Genistein Soybeans, soy products

Resveratrol Grapes, red wine

Quercetin Vegetables, fruits

(-)-Epigallocatechin-3-gallate Green tea

ISOTIOCIANATI Allyl isothiocyanate Cabbage

Benzyl isothiocyanate Garden cress

Sulforaphane Broccoli

Indole-3-carbinol Cruciferous vegetables

MONOTERPENI D-Limonene Citrus fruit oils

ACIDI FENOLICI Curcumin Turmeric, curry, mustard

Caffeic acid Fruits, coffee beans, soybeans

Ferulic acid Fruits, soybeans

Chlorogenic acid Fruits, coffee beans, soybeans

alcuni composti bioattivi

Ada

pted

from

: Hua

ng, O

saw

a, H

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Ros

en, 1

994

interazioni biologiche complesse non nutrienti

Davis CD, Exp. Biol. Med., 2007Le molecole alimentari biologicamente attive possono influenzarediversi “bersagli molecolari” associati a molti processi biologici

e a diverse condizioni fisio-patologiche.

Modelli di interazione complessiStrumenti potenti (da perfezionare): le “omics”

Davis & Milner, 2004, Mutation Res.

Categorie geniche funzionali modulateda dietary selenium in human prostate cancer cells

Modelli di interazione complessi

Milner, J. Nutrition , 2004

MICROARRAY ANALYSIS

Dong et al., Cancer Res., 2003

Introduzione –dalle definizioni ai meccanismi di azione

molecole bioattive e recettori nucleari

Diverse molecole bioattive non nutrienti (fitoestrogeni, isotiocianati, …) presenti negli alimenti così come contaminanti (pesticidi, composti industriali, cadmio) della filiera agro-alimentare sono definiti endocrine disrupters (ED) o interferenti endocrini (IE) in quanto capaci di modulare il metabolismo endocrino, soprattutto mediante il loro legame con i recettori nucleari (nell’uomo 48): ERs, AR, AhR, ThR, PxR, etc…

Dietarysoy-derived isoflavone (ISP)

supplement

113-genes su >17,000 significativamente regolati (80 UP-, 33-DOWN)

INTERFERENTI ENDOCRINI o endocrine disrupters (EDs)

“ …any plant substance or metabolite that induces biological responses in vertebrates and can mimic or modulate the actions of endogenous oestrogens usually by binding to estrogen receptors.”

(COT Report 2003 on Phytoestrogens and Health - UK Food Standard Agency)

FITO-ESTROGENI. Molecole derivanti da piante che, strutturalmente e/o funzionalmente, assomigliano agli estrogeni di mammifero. Ruolo naturale: proteggere le piante dallo stress/ meccanismo di difesa delle piante. Potenziali effetti benefici sulla salute: ampiamente reclamizzati MA scarsi/controversi dati tossicologici: Assenza valutazione rischio-beneficio3 classi principaliflavonoidi, lignani e cumestanipiù di 5000 sostanze.

Binding to the estrogen receptor (ER)ü Induction of specific estrogen responsive gene productsü Stimulation of ER-positive breast cancer cell growth

FLAVONOIDI

Isoflavoni: Genisteina, DaidzeinaFlavonoli: QuercetinaFlavanoli: Luteolina e ApigeninaFlavanones: Naringenina

Molecole bioattive come interferenti endocrini

molecole bioattive e recettori nucleariNon solo piante: carry-over mangime-consumatore

Isoflavoni nel latte materno

Setchell et al., 1998 (USA) about 5.6 + 4.4 µg/L

Isoflavoni (IF) in latte bovinoAntignac et al., 2003 (F) IF range 1 - 30 ng/ml

King et al., 1998 (AUS) genisteina range 2 - 30 ng/mldaidzeina < 5ng/mlequol 45 (+ 10) - 293 (+ 10) ng/ml

Isoflavoni (IF) in latte ovo-caprinoSakakibara et al., 2004 (F) equolo 250 µg/L

equolo-simili 1120 mg/Lp-ethyl fenolo 250 µg/Lformononetina 50 µg/L

On the basis of our findings for 4-mo-old infants, the plasma total isoflavone concentration in infants fed soy-based formula is 13000–22000 times higher than the plasma concentration of estradiol in early life (< 2 yr), which is 147–294 pmol/L (40–80 pg/mL)

Molecole bioattive come interferenti endocrini

ü La loro azione in realtà è spesso mediata da uno o più recettori nucleari (NRs),non necessariamente o non solo dai recettori per gli estrogeni !

XENO- IE. Sostanze di origine sintetica prodotte dall‘industria agro-alimentare e chimica, la cui introduzione nell‘ambiente sarebbe responsabile di notevoli alterazioni dei meccanismi riproduttivi delle specie viventi (nell‘uomo, TDS/testicular dysgenesis syndrome).

bis(2-ethylhexyl) ftalatoDEHP

bisfenolo A / BPA lindano: γ-esaclorocicloesano / γ-HCH

Esempi: plasticizzanti: bispenol A / BPA; ftalati (DBP, DEHP) ERs, AR; PPARsinsetticidi, fungicidi: linuron, lindano, vinclozolina AR, ERsdiossine: TCDD AhR

di-n-butyl ftalatoDBP

vinclozolina

Interazioni a livelli multipli:interferenti della funzione tiroidea

Gli IE possono alterare il sistema tiroideo (De Vito et al., 1999) : MOLTI BERSAGLI

(1) a livello della ghiandola tiroidea, influenzando l’uptake intracellulare di iodio, il suo legame alla tiroglobulina, il suo trasferimento dalla tireoglobulina alle iodotirosinasi e il loro coupling per la formazione degli ormoni tiroidei nonché il rilascio di T3 e T4 nel flusso sanguigno (Hadley, 1996);

(2) a livello del legame degli ormoni tiroidei con le proteine di trasporto nel sangue (THBPs) che mantengono costante le concentrazioni libere di ormoni tiroidei e regolano la loro disponibilità per gli organi bersaglio periferici (Robbins, 1996);

(3) a livello dell’uptake degli ormoni tiroidei nelle cellule bersaglio (Hennemann et al., 2001);

(4) a livello del legame degli ormoni tiroidei con le THBGs intracellulari che agirebbero come modulatori della nuclear-receptor-mediated transcription (Ashizawa & Cheng, 1992; Mori et al., 2002);

(5) a livello degli enzimi metabolici che attivano o inattivano gli ormoni tiroidei (St. Germain, 1994);

(6) a livello dei recettori tirodei e dei loro cofattori che controllano l’espressione genica modulando l’interazione con le consensus di riconoscimento nei promotori dei geni bersaglio (McKenna et al., 1999);

(7) Effetti INDIRETTI sull’ipotalamo e la ghiandola pituitaria sono anche possibili (Hadley, 1996).

IE e tiroide: meccanismi d’azione generale (1)

Siti bersaglio: ricadute multiple a livello periferico (2)

Thyrotropinreleasing hormone

TRH

H2O2

Hypothalamus

Pituitary glandanterior

Thyroid glandfollicular cells

Thyroid stimulating hormone

TSH

Tri-iodothyronine T3

Thyroxine T4

Blood stream T3- & T4-binding proteins THBPs (TBG & TBPA)

Thyroid hormonereceptors (T3-binders)

THRs

ThyroglobulinTG

Mono-iodotyrosineMIT +

Iodide I-

Iodine I2

Thyroid peroxidaseTPO

Di-iodotyrosineDIT

+

T3 hTHRA ->TRα-1; TRα-2hTHRB ->TRβ-1; TRβ-2; TRβ-3

Target cellspituitary gland,

gonads,heart, skeletal muscle

brain, prostate,thyroid,…

TRβ-2

? TRα ? dwarfism

? TRβ ? resistance to thyroid hormone (RTH)

D2 D1 D3

D1

THRE

trascrizionegene bersaglio

nitratiNH4-perclorato(iso)tiocianatiPEs (genisteina, …)

Sodium/Iodide symporterNIS

fitoestrogeni ed inibizione della tiroide perossidasi/TPO (1)

ü La genisteina, l’isoflavone principale della soia, inibisce l’attività della TPO a concentrazioni prossime a quelle fisiologiche massime riscontrabili nell’uomo (Divi et al., 1997, Biochem. Pharmacol. 54:1087-1096).

q L’interazione negativa tra consumo di soia e bassi livelli di assunzione di iodio è stata inizialmente dimostrata in modelli animali da Kimura et al. (1976), il quale aveva evidenziato l’alta insorgenza di carcinomi tiroidei in ratti alimentati con una dieta iodio-carente a causa degli estratti di soia presenti.

q L’assunzione mediante la dieta di genisteina diminuisce l’attività della TPO nei ratti, sia di sesso femminile che maschile, in modo significativo anche a livelli bassi (5 ppm).

fitoestrogeni ed inibizione della tiroide perossidasi/TPO (2)

Doerge & Sheehan (2002) Environmental Health Perspectives (EHP) 110:349-353

male

female

Sostanze di origine vegetale ed inibizione della tiroide perossidasi/TPO (3)

q In concomitanza di carenza di iodio anche il consumo di Crucifere (Brassica species) può risultare in effetti negativi sulla tiroide (sia negli uomini che negli animali) a causa dell’attività goitrogenica degli isotiocianati (derivati bioattivi dei glucosinolati):

ü La supplementazione di iodio riduce ma non neutralizza completamente tale attività.

ü NB: La cottura riduce l’attività goitrogenica degli isotiocianati.

Germogli di bambù

RapaRafano

Senape

CavolfioreCavolo

Chandra et al., (2004) Indian J Med Res 119:180-185

TPOIC50 inhibition by fresh plant foods

ANCHE NEL FUMO DI SIGARETTA SI FORMANO TIOCIANATI !!!

I livelli plasmatici di una molecola bioattivasono proporzionali ad un effetto benefico funzionale ?

Interazioni tra sostanze bioattivee legami aspecifici con proteine presenti negli alimenti

Total Antioxidant Capacity (TAC)as ferric-reducing antioxidant potential

Mean (-)epicatechin levels

Nature (2003) 424:1013Plasma antioxidants from chocolate

In soggetti umani in buona salute, valutazione della capacità antiossidante totale (TAC) e dei livelli dell’epi-catechina confrontando cioccolato puro (DC), cioccolato puro+latte (DC + MK) e cioccolato al latte (MC)

DC

MC

Risultati:

Ø Dopo 1 hr dall’ingestione di DC, la TAC plasmatica è del 20% superiore a quella di MC e DC+MC;

Ø I livelli plasmatici di epicatechina si abbassano di circa il 46% in DC+MC e di circa il 69% in MC.

Interazioni tra sostanze bioattive presenti negli alimenti fortificati (o arricchiti): mantengono l’effetto biologico?

Risultati HPLC analisi:ü La concentrazione plasmatica di vit. C aumentata in maniera analoga.Risultati esperimento DNA damage (dopo vit.C intake):Ø Significativamente diminuito dopo 3 ore dall’assunzione del succo di frutta d’arancia (circa 18 %; P < 0.01) e costante per circa 24 ore (circa 16 %; P < 0.01).Ø Nessun effetto osservato nella bevanda supplementata.

“Orange juice vs vitamin C:effect on hydrogen peroxide-induced DNA damage

in mononuclear blood cells”.Br J Nutr. (2007) 97(4):639-643

In soggetti umani in buona salute, valutazione dell’effetto antiossidante confrontando l’assunzione di vit.C da una singola porzione di succo di frutta d’arancia (300 ml contenente 150 mg vit. C) e da una bevanda supplementata della stessa quantità di vit. C.

Effetto antiossidante considerato: danneggiamento in vitro del DNA indotto da perossido di idrogeno in cellule mononucleari del sangue (MNBC).

ü Effetto protettivo non spiegabile con la sola presenza di vit. C:altre sostanze bioattive coinvolte o effetto matrice ?

Importanza di valutare l’ALIMENTO nella sua interezza:

Veicolo di sostanze bioattive potenzialmente protettive

potenzialmente dannose

Veicolo potenziale di contaminanti

Che possono interagire con le sostanze bioattive

Soprattutto con stessi meccanismi/bersagli

Es. xeno-estrogeni e fito-estrogeni (non necessariamente protettivi)

(Banca dati EDID, http://www.iss.it/inte)

Inoltre

Importanza della valutazione Rischio-Beneficio in sicurezza alimentare à alimenti “controversi” come il pesce, programmi di fortificazione-supplementazione (acido folico, sale iodato…)

SPUNTI DI DISCUSSIONE

francesca.maranghi@iss.it