guio practiques sanitaria 2009

Unitat de Microbiologia (Facultat de Ciències)

Microbiologia Sanitària

Departament de Genètica i de Microbiologia Universitat Autònoma de Barcelona

Editat pels professors de la Unitat de Microbiologia del Departament de

Genètica i Microbiologia i amb la col·laboració del Gabinet

de Llengua Catalana de la UAB

UAB

Departament de Genètica i de Microbiologia

Unitat de Microbiologia (Ciències)

Bellaterra, 1997

11ena edició, 2009

Professors curs 2008 / 09

Dra. Marina Luquin

Dra. Esther Julián

Elisabeth Rodríguez Güell

NORMATIVA DE TREBALL I DE BIOSEGURETAT MICROBIOLÒGICA. Aquesta normativa s’ha de cumplir en totes les pràctiques impartides pels professors de la Unitat de Microbiologia. Els professors responsables de les diferents pràctiques han de vetllar pel seu cumpliment.

1. És obligatori l’ús de bata de laboratori i portar els cabells recollits.

2. No està permès beure, menjar o fumar. Tampoc es guardaran aliments.

3. Durant la realització de les pràctiques, l’accés als laboratoris serà restringit als alumnes que facin les pràctiques i al personal de la Unitat de Microbiologia. No és permès sortir del laboratori sense causa justificada. Es prega la màxima puntualitat.

4. S’utilitzarà algun sistema que eviti l’ús de pipetes amb els llavis quan els

microorganismes siguin: • d’origen hospitalari • desconeguts • quan es consideri que són potencialment clars patògens.

5. S’utilitzaran sistemes volumètrics automàtics quan el producte químic sigui perillós.

6. En cas de que sigui necessari per la pràctica es suministrarà equipament de protecció (guants, màscares, etc,..) a l’alumne.

7. Es descontaminarà amb autoclau el material reutilitzable que hagi estat en contacte amb

microorganismes: • d’origen hospitalari • desconeguts • quan es consideri que són potencialment clars patògens.

8. Hi haurà una zona clarament rotulada en el laboratori perquè l’alumne dipositi el material que s’ha de descontaminar.

9. Se separaran ordenadament els residus en contenidors adequats segons el residu que sigui: • Material biològic per descontaminar • Material biològic amb productes tòxics • Vidre trencat no contaminat • Vidre trencat contaminat • Plàstic contaminat per incinerar • Paper • Productes químics • Colorants

10. És obligatori netejar-se les mans amb sabó desinfectant al sortir del laboratori de pràctiques.

11. Al finalitzar les pràctiques, cada alumne ha de desinfectar amb etanol les superfícies on ha estat treballant.

12. En cas de qualsevol incident l’alumne s’allunyarà de la zona i avisarà immediatament al

professor.

13. El professor responsable de les pràctiques durà un control escrit dels possibles accidents o incidències que afectin a l’higiene i a la seguretat.

AMPLIACIÓ DE LA NORMATIVA DE TREBALL I DE BIOSEGURETAT MICROBIOLÒGICA 1. El professor responsable de les pràctiques exposarà el procediment a seguir per a la

manipulació dels microorganismes utilitzats en cada una de les sessions de pràctiques.

2. L’alumne haurà de manipular els microorganismes, utilitzats en cada una de les sessions de pràctiques, seguint escrupulosament les indicacions del professor.

3. Els alumnes que tinguin ferides a les mans o que pateixin algun tipus de malaltia

immunosupressora hauran de comunicar-ho al professor abans de començar les pràctiques.

MICROBIOLOGIA SANITÀRIA

1

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5

Pràctica 1 -Sembra en Agar Sang de la solució problema -Gram

-Gram diferents colònies -Sembra en Agar Xocolata (24 h)

-Prova catalasa -Prova oxidasa -Maltosa i tributirina (24 h a 37ºC)

Lectura

Pràctica 2 Suspensió de micobacteris en solució esterificant

Extracció àcids micòlics

Elució placa CCF Revelat placa CCF Discussió resultats

Pràctica 3 Banc de silucions de la solució problema (24 h a 37ºC)

Lectura

Pràctica 4 -Sembra solució problema en MacConkey i EMB -Gram

-Lectura plaques -Sembra en Kliger i LIA (48 h)

-Lectura Kliger i LIA -Prova oxidasa -Ureasa (24 h a 37ºC)

Lectura

Pràctica 5 Observació fongs filamentosos

Pràctica 6 -Sembra solució problema en Agar Sang (48 h) -Gram

-Gram diferents morfologies colonials -Test CAMP

-Lectura CAMP -Sembra en Agar Sang

Test aglutinació en làtex

Pràctica 7 Diagnòstic infecció parasitària EXAMEN


1

Índex

Pàg.

Pràctica 1. Aïllament i identificació de patògens respiratoris. 2

Pràctica 2. Identificació d’espècies del gènere Mycobacterium per cromatografia en capa fina.

10

Pràctica 3. Diagnòstic serològic de la brucel·losi.

14

Pràctica 4. Aïllament i identificació d’enteropatògens.

18

Pràctica 5. Observació de fongs ambientals i dermatòfits.

24

Pràctica 6. Identificació d’Streptococcus agalactiae.

30

Pràctica 7. Diagnòstic d’una infecció parasitària intestinal.

34


2

Aïllament i identificació de patògens respiratoris

Introducció

Moraxella catarrhalis, forma part de la microbiota comensal del tracte respiratori superior de persones sanes. Per factors encara desconeguts, pot invair, entre d’altres territoris, l'oïda mitjana, els sinus maxilars o la regió broncopulmonar produint: otitis, sinusitis o pneumònia. L'espècie Moraxella catarrhalis està formada per cocs gramnegatius aeròbics que habitualment es disposen en parelles formant diplococs. El gènere Moraxella pertany a la família Neisseriaceae, la qual conté altres tres gèneres: Neisseria, Acinetobacter i Kingella.

L'objectiu de la present pràctica és aïllar i identificar bacteris de l'espècie Moraxella catarrhalis, a partir d'una mostra respiratòria simulada. Material -Solució problema

Solució salina que conté una barreja de bacteris que es troben habitualment formant part de la microbiota comensal de les vies respiratòries superiors.

-Medis de cultiu i de dilució Tubs d'assaig que contenen 0,25 ml. de solució salina estèril. Agar Sang i Agar Xocolata.

-Reactius Reactiu de l'oxidasa Reactiu de la catalasa Tauletes Rosco de maltosa i tributirina Reactius per a la tinció de Gram

-Altre material Pipetes Pasteur estèrils Portaobjectes Pi-pums de goma Microscopi Estufa de cultiu


3

Protocol Dia 1

Amb una pipeta Pasteur estèril dipositar una gota de la suspensió problema en la placa d'Agar Sang i en un portaobjectes. Esgotar les plaques de cultiu i incubarles a 37 ºC fins el dia següent. Amb la nansa de Kölle estendre la gota dipositada en el portaobjectes, fixar-la a la flama i realitzar la tinció de Gram. Observar la tinció al microscopi amb l'objectiu de 100X i oli d'immersió. Dibuixar les diferents morfologies que s'observin. Dia 2

Treure les plaques de cultiu de l'estufa i observar les diferents morfologies colonials, fer tincions Gram de les colònies sospitoses de pertànyer a bacteris de la família Neisseriaceae. Si alguna de les colònies pertany a diplococs gramnegatius, fer una sembra per esgotament d'una d'aquestes colònies en una placa d'Agar Xocolata. Incubar la placa d'Agar Xocolata a 37 ºC fins al dia següent. Dia 3

A partir de les colònies crescudes en Agar Xocolata realitzar la prova de la catalasa i de l'oxidasa. Fer una suspensió espessa en dos tubs amb 0,25 ml. de solució salina estèril. Afegir les tauletes Rosco de maltosa i tributirina i desfer-les amb el vòrtex. Incubar els tubs a 37 ºC i llegir a les 4 i 24 hores. Lectura de les tauletes Rosco (veure Annex I)

Maltosa i Tributirina: Reacció positiva: color groc, groc-taronja Reacció negativa: color vermell

Dia 4

Realitzar la identificació segons les taules de l’Annex II. Bibliografia - Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed.,1993. American Society for Microbiology. - Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C. i Winn, W.C. Jr. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Fifth Edition, 1997. J.B. Lippincott Company. - Murray PR, Kobayashi GS, Pfaller MA, Rosenthal KS. Microbiología Médica, 2ª edición, 1997. Harcourt Brace.


4

ANNEX I


5

ANNEX I


6

ANNEX I


7

ANNEX II

Característiques que diferencien els gèneres de la família Neisseriaceae.

Característiques Neisseria Moraxella Acinetobacter Kingella Morfologia cel·lular: cocs + + - - bacils +a + + + Oxidasa + + - + Catalasa + + + - Producció d'àcid a partir de glucosa + - V - Reducció del nitrat + V - + a, només una espècie N. elongata està formada per bacils. V, variable


8

ANNEX II


9

ANNEX II


10

Identificació de diferents espècies del gènere Mycobacterium per cromatografia de capa fina Introducció

La cromatografia és una tècnica que permet separar per mètodes físico-químics els diferents components de barreges complexes. En el camp de la taxonomia i identificació bacterianes s’ha utilitzat fonamentalment per a estudiar compostos lipídics (fosfolípids, glicolípids i diferents tipus d'àcids grassos). Aquests compostos poden formar part de l’estructura del bacteri o be ser productes derivats del metabolisme. L’estudi per cromatografia de compostos lipídics està indicat en la identificació de determinades espècies bacterianes que són difícils d’identificar pels mètodes bioquímics tradicionals o per mètodes genètics.

L'objectiu de la present pràctica és identificar diferents espècies del gènere Mycobacterium analitzant per cromatografia de capa fina el seu contingut en àcids grassos de cadena llarga (àcids micòlics). Material -Material biològic

Cultius en Agar de Sauton de Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium alvei, Mycobacterium brumae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium mucogenicum, i/o Mycobacterium chubuense.

-Material per cromatografia

· Tubs amb taps de rosca amb coixinet de tefló que contenen 2 ml. de la solució esterificant. · Tubs amb taps de rosca amb coixinet de tefló. · Plaques de cromatografia de capa fina.

-Reactius

· Solució esterificant: barreja de 30 ml. de metanol, 15 ml. de toluè i 1 ml. d’àcid sulfúric. · Solvent d'elució: barreja d'hexà i èter etílic en les proporcions 85:15. · Reactiu de revelació: solució etanòlica al 10 % d’àcid fosfomolíbdic.


11

-Altre material: · Pipetes Pasteur no estèrils · Micropipetes calibrades · Pi-pums de goma · Cubeta de cromatografia · Vòrtex · Pulveritzador · Bany maria · Forn Pasteur · Rotavapor · Cabina de pulverització

Protocol Dia 1

Fer una suspensió el més espessa possible d’un cultiu d’un micobacteri en el tub de rosca que conté la solució esterificant. Agitar un mínim de 30 segons en el vòrtex. Tancar bé el tub i posar-lo al bany maria 8 hores o tota la nit. Dia 2

Treure el tub del bany maria i afegir-li 2 ml. d’hexà. Agitar, esperar a que es separin dues fases, recuperar la fase superior i passar-la a un tub net. Repetir la mateixa operació una segona vegada. Evaporar els 4 ml. d’hexà recuperats. Dia 3 Resuspendre l’extracte sec en 0,5 ml. d’hexà i amb una micropipeta dipositar 10 µl. sobre una placa de cromatografia. Eluir la placa en el solvent d’elució tres vegades. Dia 4 Visualitzar els àcids micòlics per pulverització de la placa amb el reactiu de revelació i escalfament a 120 ºC. Per a la interpretació dels resultats veure l’Annex III. Bibliografia - Hinrikson HP, Pfyffer GE. Mycobacterial mycolics acids. Med. Microbiol. Lett. 1994; 3: 49-57. - Minnikin DE. Lipids, complex lipids, their chemistry, byosintesis and roles. En The Biology of Mycobacteria. vol.1. Ratledge C, Stanford J. eds., 1982. Academic Press.


12

- Muñoz M, Julián E, Garcia-Barceló M, Ausina V, Luquin M. Easy differentiation of Mycobacterium mucogenicum from other species of the Mycobacterium fortuitum complex by thin-layer and gas chromatography of fatty esters and alcohols. Journal of Chromatography B, 689 (1997), 341-347.

ANNEX III


13

Taula 5. Classificació dels micobacteris en funció del seu patró d’àcids micòlics determinat per cromatografia en capa fina.

Grup Tipus d’àcids micòlics

I II III IV V VI VII

A + - - - - - -

B + + - - - - -

C + - - + - - -

D + - + + - - -

E + + - + - - -

F + + - - + - -

G + + + - - - -

H + - - + - + -

I + + - + - + -

J + + + + - - -

K + + - - + - +

L + - - - - - + Espècies que composen aquests grups: A: M. triviale, M. fallax B: M. chelonae C: M. bovis BCG, M. leprae, M confluentis D: M. africanum, M. asiaticum, M. bovis, M. cooki, M. gastri, M. gordonae, M.

kansasii, M. marinum, M. microti, M. tuberculosis, M. szulgai, M. ulcerans E: M. simiae, M. malmoense, M. genavense F: M. chitae, M. farcinogenes, M. fortuitum (ATCC 6841T i TMC 1545T), M. pulveris G: M. agri H: M. achiense, M. aurum, M. avium, M. flavescens, M. gadium, M. intracellulare, M.

lepraemurium, M. nonchromogenicum, M. neoaurum, M. paratuberculosis, M. phlei, M. rhodesiae, M. scrofulaceum, M. terrae, M. xenopi, M. tokaiense, M. poriferae, M. komossense, M. moriokaense

I: M chubuense, M. duvalii, M. gilvum, M. parafortuitum, M. vaccae, M. obuense J: M. termoresistible K: M. fortuitum, M. porcinum, M. senegalense, M. smegmatis L: M. alvei


14

Diagnòstic serològic de la brucel·losi Introducció

La brucel·losi (denominada també febre ondulant o febre de Malta) és una infecció genitourinària de les ovelles, vaques, porcs i d’altres animals, causada per diverses espècies del gènere Brucella. L’home s’infecta de forma directa per contacte laboral amb els animals (ramaders, treballadors dels escorxadors, veterinaris) o indirectament pel consum de productes animals contaminats. A l’home, la brucel·la infecta les cèl·lules del sistema reticuloendotelial produint una malaltia febril prolongada. Les espècies que amb més freqüència infecten l’home són: B. abortus, B. melitensis i B. suis.

El diagnòstic de la malaltia es fa habitualment per mètodes serològics. Es mesura, en el sèrum del pacient, la presència i quantitat d’anticossos en front de la brucel·la per un mètode d’aglutinació directa.

L'objectiu de la present pràctica és establir el títol d’anticossos aglutinants en front a B. abortus, en un sèrum problema. Material -Solució antigènica

Suspensió bacteriana que conté bacteris de l’espècie B. abortus, morts i colorejats.

-Aglutinin-Control positiu

Conté antiserum polivalent, no titolat de conill (sèrum problema). -Medis de dilució

Solució salina isotònica (0,85% NaCl). -Altre material

Tubs d'assaig Pipetes d’1 ml, 0,5 ml i 0,1 ml. Bany termorregulable

Protocol Dia 1

Disposar 8 tubs d’assaig en una gradeta. Utilitzant solució salina com diluent, preparar una fila de dilucions dobles progressives del sèrum problema segons la taula de l’Annex IV. Afegir a cadascun dels tubs 0,5 ml. de la suspensió bacteriana i barrejar. Incubar a 37 ºC durant 24 hores.


15

Dia 2 Examinar macroscòpicament la presència d’aglutinació. La reacció

positiva es caracteritza per diversos graus d’aglutinació i pel corresponent aclariment del sobrenedant. El títol del sèrum correspon a la màxima dilució del mateix a la qual s’observa aglutinació. La següent dilució ha d’ésser negativa. En poblacions que no siguin endèmiques, títols iguals o superiors a 1:40 es consideren significatius. És a dir, indiquen que probablement el pacient que estem estudiant té una infecció per brucel·la. Bibliografia - Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. eds. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed.,1993. American Society for Microbiology. - Sherris J. C. et al. Microbiología Médica. 1993. Ediciones Doyma.


16

ANNEX IV


17


18

Aïllament i identificació d’enteropatògens Introducció

La família Enterobacteriaceae constitueix el conjunt més gran i

heterogeni de bacils gamnegatius (BGN) amb significació clínica. Alguns membres d’aquesta família (Shigella, Salmonella, Yersinia pestis) sempre van associats amb malaltia quan són aïllats de l’home, i d’altres (Escherichia coli, Proteus mirabilis...) són membres de la microbiota comensal del tracte digestiu que poden produir infeccions oportunistes. Els enterobacteris són els agents etiològics de la major part de les infeccions nosocomials als hospitals. Els enterobacteris que produeixen infeccions en el tracte gastrointestinal són Shigella, Salmonella, Yersinia i Escherichia. Els efectes de les infeccions del tracte gastrointestinal oscil·len des de diarrees lleus i autolimitades fins la diarrea greu, de vegades mortal. La diarrea és el resultat d’un augment de la pèrdua de líquid i electròlits cap al llum intestinal donant lloc a femta no formada. Aquesta és la manifestació més comú d’una infecció gastrointestinal.

L’objectiu d’aquesta pràctica és l’aïllament i identificació de bacils gramnegatius com a possibles causants d’una infecció gastrointestinal a partir d’una mostra simulada d’un coprocultiu.

Material -Solució problema

Solució salina que conté una barreja de bacils gramnegatius que en aquest cas seran Yersinia sp., Proteus mirabilis i Escherichia coli. -Medis de cultiu

Agar MacConkey, Agar EMB (Eosin Methylene blue Agar), Agar de Kliger (Kliger Iron Agar), Agar Ferro i Lisina -Reactius

Tauletes Rosco per a la determinació de l’activitat ureasa/indol. Reactiu de l’oxidasa

-Altre material

Pipetes Pasteur Portaobjectes Microscopis Estufa de cultiu Tubs de vidre de 13 mm ∅


19

Protocol Dia 1

Amb la nansa de Kölle estèril dipositar una gota de la solució problema en una placa d’Agar MacConkey, en una placa d’EMB, i en un portaobjectes. Esgotar les plaques de cultiu i incubar-les a 37 ºC durant 24 hores. Amb la nansa de Kölle estendre la gota dipositada en el portaobjectes, fixar-la a la flama i realitzar la tinció de Gram. Observar la tinció al microscopi amb l’objectiu de 100X i oli d’immersió. Dia 2

Treure les plaques de cultiu de l’estufa i observar si tenim colònies diferents. Llegir els resultats obtinguts a les sembres de les plaques. Haurem de tenir una especial atenció amb les colònies de bacteris que siguin lactosa negatives degut a que són aquests microorganismes els que tenen significació clínica. “Picar” una colònia aïllada que sigui lactosa negativa i fer una sembra de la mateixa en dos tubs amb Agar de Kliger i Agar Ferro i Lisina en superfície i en profunditat, i incubar-les a 37 ºC durant 24 hores. Dia 3

Procedir a la lectura dels resultats obtinguts als tubs amb l’Agar de Kliger i l’Agar Ferro i Lisina segons ens indica l’annex V. Fer la prova de l’oxidasa, i fer la determinació de la activitat ureasa/indol per a identificar el bacteri problema. Bibliografia - Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C. i Winn, W.C. Jr. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Fifth Edition, 1997. J.B. Lippincott Company. - Murray P., Drew W., Kobayashi G., i Thompson, J. Microbiología Médica. 2ª edició. 1997. Mosby-Year Book de España S.A.


20

ANNEX V


21

ANNEX V


22

ANNEX V


23

ANNEX V Taula IV. Identificació pressumptiva mitjançant els medis de Kligler i Lisina

Soques productores de Ac. sulfhídric en el medi de Kligler. KIA: Medi de Kligler; LIA: Agar de Ferro i Lisina; FDA: fenilalanina-desaminasa; B-g: Beta-galactosidasa; LDC: Lisina-descarboxilasa; + : positiu; -: negatiu; P.R.: pendent vermella en LIA; P.V.: pendent violeta en LIA. Les soques detectades com a possibles enteropatògenes han de confirmar-se mitjançant estudis metabòlics i serològics estàndard.


24

Observació de fongs ambientals i dermatòfits amb la tinció de blau de lactofenol

Introducció

Els fongs són extremadament comuns a la natura on es troben en forma de sapròfits de vida lliure. Amb freqüència es poden trobar a les superfícies corporals com a colonitzadors ambientals sense obtenir un benefici evident d’aquesta relació. Com que són tan difosos, de vegades es troben en mostres clíniques, i és difícil aclarir el paper que juguen en determinades infeccions. Un nombre relativament petit de fongs són capaços de produir una malaltia en persones sanes i immunocompetents. Les malalties micòtiques es classifiquen en superficials, cutànies, subcutànies i sistèmiques. Les superficials serien produïdes pels dermatòfits. Els dermatòfits limiten la seva acció als teixits queratinitzats de l’epidermis, cabell i ungles, però tenen una gran capacitat d’invasió i segons l’espècie que sigui poden provocar una reacció intensament inflamatòria a l’hoste.

Els fongs filamentosos produeixen conidis especialitzats i creixen lentament. Són identificats al microscopi d’acord amb la grandària i forma dels conidis i com es desenvolupen.

L’objectiu d’aquesta pràctica és la identificació de diferents espècies de fongs filamentosos ambientals i dermatòfits, mitjançant l’estudi microscòpic i macroscòpic de les seves colònies i formacions aèries. Material -Material biològic

Estudiarem la morfologia macro i microscòpica de diferents espècies de fongs filamentosos a partir de colònies crescudes en plaques d’Agar de Saboraud amb cloramfenicol.

-Reactius

Blau de lactofenol. Tween 80

-Altre material

Pinces metàl·liques “Cel·lo” Pipetes Pasteur Portaobjectes i cubreobjectes Microscopis Tubs de vidre de fons rodó


25

Protocol Dia 1

Mirar les diferents morfologies colonials que presenten els fongs i tot seguit, amb un bocí de “cel·lo”, tocar suaument la part superficial de la colònia per tal d’enganxar les hifes aèries. Dipositar el “cel·lo” a sobre d’un cubreobjectes on ja hi ha d’haver una gota de blau de lactofenol, posant en contacte la part del “cel·lo” que ha tocat la part superficial de la colònia amb el reactiu. A continuació mirar al microscopi a 40X augments. Agafar amb les pinces part d’una de les colònies crescudes i resuspendre-la en un tub amb una solució al 0,03% de Tween en Ringer estèril. Posar directament una gota en un portaobjectes i mirar al microscopi. Les diferents morfologies colonials i estructures microscòpiques observades en el microscopi ens serviran juntament amb l’annex VI per identificar els diferents fongs que observem. Bibliografia - Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C. i Winn, W.C. Jr. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Fifth Edition, 1997. J.B. Lippincott Company. - Larone DH. Medically important fungi. A guide for identification. Third Edition.


26

ANNEX VI


27

ANNEX VI


28

ANNEX VI


29


30

Identificació de Streptococcus agalactiae mitjançant un test d’aglutinació per làtex

Introducció

Els estreptococs del grup B o Streptococcus agalactiae es varen reconèixer en principi com a causants de sepsi puerperal. Tot i que es segueixen associant a aquesta malaltia han adquirit una gran notorietat com els agents causants de septicèmia, pneumònia i meningitis en nadons. Són cocs grampositius que formen cadenes curtes en les mostres clíniques i més llargues en cultius, i presenten antígens específics de grup. Donen lloc a colònies envoltades per una zona estreta de β-hemòlisi. Els estreptococs del grup B colonitzen el tracte respiratori alt, el tracte gastrointestinal baix i la vagina. La infecció amb el subseqüent desenvolupament de la malaltia al nadó pot tenir lloc dintre de l’úter, al moment del naixement o durant els primers mesos de vida. Aproximadament el 60 % dels fills de mares colonitzades són també colonitzats. La probabilitat de colonització en el moment del part augmenta si la mare presenta una colonització intensa.

L’objectiu d’aquesta pràctica és realitzar la identificació d’ Streptococcus agalactiae a partir d’una mostra simulada d’un exsudat vaginal mitjançant partícules de làtex sensibilitzades per anticossos dirigits front dels antígens específics de grup. Material -Solució problema

Solució salina que conté una barreja de diferents microorganismes.

-Medis de cultiu Plaques d’Agar Sang.

-Slidex Strepto-B Es un test d’aglutinació de partícules de làtex que conté un control positiu i l’enzim d’extracció.

-Altre material Micropipetes Tubs d’hemòlisi Nansa de Kölle.


31

Protocol Dia 1

Amb una pipeta Pasteur estèril dipositar una gota de la suspensió problema en la placa d'Agar Sang i en un portaobjectes. Esgotar les plaques de cultiu i incubar-les a 37 ºC 48 hores. Amb la nansa de Kölle estendre la gota dipositada en el portaobjectes, fixar-la a la flama i realitzar la tinció de Gram. Observar la tinció al microscopi amb l'objectiu de 100X i oli d'immersió. Dibuixar les diferents morfologies que s'observin. Dia 3

Examinar les plaques d’Agar Sang i realitzar la tinció de Gram de les diferentes morfologies colonials que trobem. De la colònia que identifiquem com a estreptococ realitzar un esgotament en Agar Sang i fer un diagnòstic de presumpció mitjançant la detecció del factor CAMP. Dia 5

Examinar les plaques d’Agar Sang per a veure el resultat del diagnòstic presumptiu per una banda i per l’altra amb les plaques de l’esgotament, realitzar el test d’aglutinació. Per a realitzar el test d’aglutinació introduir 0,4 ml d’enzim d’extracció dins d’un tub d’hemòlisi. Agafar 2 ó 3 colònies i fer una emulsió amb els 0,4 ml de l’enzim d’extracció. Agitar amb el vòrtex i deixar incubar de 10 a 15 minuts a 37 ºC, així tindrem preparat l’extracte antigènic. Un cop passat el temps d’incubació dipositar una gota de cada làtex en les caselles corresponents i amb una pipeta Pasteur posar a sobre del làtex una gota de l’extracte antigènic i barrejar amb un escuradents. Un resultat positiu queda indicat per l’aparició d’una aglutinació nítida en menys de 2 minuts. Bibliografia - Facklam, R.R., Cooksey, R.C. y Wortham, E.C. Evaluation of a commercial latex agglutination reagent for grouping streptococci. (1979). Journal of Clinical Microbiology, 10, 641. - Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. Manual of Clinical Microbiology. Sixth Edition. (1995) American Society for Microbiology, Washington, D.C.


32

ANNEX VII


33

ANNEX VII


34

Diagnòstic d’una infecció parasitària intestinal mitjançant el mètode de MIF directe

Introducció

Les parasitosis es poden classificar segons la seva localització en hemohístiques o intestinals. A les primeres els paràsits es localitzen a la sang i els teixits, i a les segones en el tracte digestiu.

A les parasitosis intestinals, amb excepció dels casos en els que es poden observar macroscòpicament els helmints en femta (tènies, oxilurs i àscaris), el diagnòstic es realitza per examen microscòpic d’una mostra de femta per a visualitzar els ous dipositats pels helmints o els protozous i els seus quists (formes de resistència). Per a observar les formes vegetatives (trofozoits) dels protozous es deuen estudiar mostres recentment emeses, abans que s’alterin. Els trofozoits de protozoo es llisen ràpidament a mesura que la massa fecal es refreda un cop emesa. Per això es procedeix a la fixació d’una part de la femta després de la seva emisió, per a conservar la morfologia dels paràsits intacta i evitar la seva alteració.

L’examen en fresc de la suspensió d’una petita quantitat de femta en solució salina, malgrat que ens permeteix la visualització de les formes trofozoiques dels protozous és normalment insuficient per a poder realitzar un diagnòstic específic. Per això es deuen realitzar tècniques de tinció per a poder efectuar un diagnòstic correcte. El reactiu MIF (Mertiolat, Iode i Formol) és una solució que fixa la femta, de manera que el material es pot conservar durant anys si es guarda en recipients tancats hermèticament. A més, el lugol i l’eosina presents en la solució tenyeixen els protozoaris facilitant d’aquesta manera el seu reconeixement i identificació.

L’objectiu d’aquesta pràctica és l’observació microscòpica de formes protozoàries a partir de mostres de femta fixades amb el mètode del MIF directe. Material -Mostres problema

Diferents mostres de femta fixades amb el mètode de MIF.

-Altre material Pipetes Pasteur Microscopis


35

Protocol Dia 1 Amb una pipeta Pasteur dipositar una gota de la mostra fixada i tenyida en un portaobjectes, colocar un cubreobjectes i observar al microscopi a 40X, la identificació es realitzarà d’acord amb l’annex VII.


36

ANNEX VIII


37

ANNEX VIII


38

ANNEX VIII


39

ANNEX VIII

guio practiques sanitaria 2009

Documents